Sử dụng Koji và protease trong nước mắm

SỬ DỤNG KOJI VÀ PROTEASE TRONG LÊN MEN NƯỚC MẮM SỬ DỤNG KOJI VÀ PROTEASE TRONG LÊN MEN NƯỚC MẮM SỬ DỤNG KOJI VÀ PROTEASE TRONG LÊN MEN NƯỚC MẮM SỬ DỤNG KOJI VÀ PROTEASE TRONG LÊN MEN NƯỚC MẮM SỬ DỤNG KOJI VÀ PROTEASE TRONG LÊN MEN NƯỚC MẮM

SỬ DỤNG KOJI VÀ PROTEASE TRONG LÊN MEN NƯỚC MẮM

Tóm tắt

Theo truyền thống, trong khu vực Đông Nam Á, nước mắm được sản xuất bằng cách lên men cá trộn với muối Thông thường, quá trình lên men truyền thống có thể mất đến một hoặc hai năm để hoàn thành Một nghiên cứu đã được tiến hành để điều tra khả năng của việc sử dụng soya sauce koji (starter mash) và enzyme protease thương mại để đẩy nhanh quá trình lên men trong chế biến nước mắm từ các loài cá sống bề mặt mà không ảnh hưởng đến hương vị đặc trưng và chất lượng dinh dưỡng của nước mắm so với khi sản xuất bởi quá trình lên men truyền thống Các thông số như pH, formol-N, tổng chất rắn hòa tan, độ chua I và II được theo dõi thường xuyên trong suốt quá trình lên men Sản lượng nước mắm, natri clorua, nitơ cơ bản dễ bay hơi (VBN), tổng N và thành phần acid amin được đo ở cuối quá trình lên men Quá trình lên men nhanh này có thể sản xuất nước mắm có chất lượng tương đương (theo tiêu chuẩn nước mắm Nam pla Thái Lan,) so với nước mắm lên men truyền thống, nhưng chỉ trong khoảng 10 tuần

Giới thiệu

Cá là nguồn cung cấp protein động vật chính ở nhiều nước trong khu vực Đông Nam Á Tuy nhiên, cá trải qua sự hư hỏng nhanh chóng, đặc biệt là trong điều kiện nhiệt đới - nhiệt độ cao và độ ẩm cao Lên men cá truyền thống là một trong những phương pháp bảo quản có chi phí thấp, được sử dụng rộng rãi trong khu vực Đông Nam Á Có rất nhiều sản phẩm cá lên men, trong đó nước mắm có lẽ là một trong những sản phẩm nổi tiếng nhất

Tại khu vực Đông Nam Á, nước mắm được làm từ các loại cá khác nhau, từ cả cá sông

và cá biển, theo các phương pháp khác nhau Mỗi loại có hương vị độc đáo và đặc trưng riêng Nước mắm được gọi là “nam pla” ở Thái Lan, “patis” ở Philippines, “kecap ikan” ở Indonesia,

“budu” tại Malaysia, “nước mắm” tại Việt Nam và Campuchia và 'ngan pya ye' ở Myanmar (Putro, 1993; Ismail, 1977; Baens-Arcega, 1977; Phithakpol và cộng sự, 1995; Tyn, 1993, Tran, 2002) Các phương pháp chế biến nước mắm có thể khác nhau ở mỗi nước, nhưng nguyên tắc cơ bản là gần như tương tự Các thành phần chính của nước mắm là cá và muối Cá được rửa sạch

và trộn với muối với tỷ lệ khoảng 1:1 – 1:5 Hỗn hợp này được để lên men ở nhiệt độ phòng trong khoảng thời gian từ 5 – 24 tháng Sau khi lên men, nước mắm sẽ được lấy bằng cách gạn lọc trên bề mặt hoặc rút ra từ bên dưới thùng chứa Trong quá trình lên men, cá sẽ trải qua quá trình thủy phân, sử dụng cả vi khuẩn và enzyme “Nước mắm”, theo Amano (1962) giải thích rõ ràng là: “chất lỏng màu nâu, được thủy phân từ cá muối”

Nước mắm ngày càng được biết đến nhiều hơn trên thế giới cùng với sự phổ biến của các món ăn truyền thống, ví dụ như món ăn Việt Nam và Thái Lan

Theo FAO, sản lượng xuất khẩu trên toàn thế giới của các sản phẩm cá lên men, bao gồm nước mắm trong năm 2000 là 336.213 tấn, trị giá hơn 800 triệu đô la mỹ Số lượng này ngày càng tăng từ 311.006 tấn trong năm 1998 và 312.995 tấn vào năm 1999, và nó được dự kiến

sẽ tăng hơn nữa trong tương lai

Vì quá trình lên men cá truyền thống có thể mất đến 24 tháng để hoàn thành, người ta đã

cố gắng để đẩy nhanh quá trình lên men mà không ảnh hưởng đến hương vị đặc trưng và chất lượng dinh dưỡng của nước mắm, ví dụ, bằng cách tăng nhiệt độ lên men (Mabesa etal, 1989), thêm các chất kháng khuẩn thay vì muối (Amano, 1962), sử dụng protease thực vật như bromelain, papain, ficin (Ooshira et al, 1981, Beddows và Ardeshir, 1977), hoặc thậm chí sử dụng soya sauce koji (Chaeet al, 1989)

Koji là một thành phần thiết yếu trong quá trình lên men trong sản xuất nước tương Thuật ngữ “koji” xuất phát từ các nhân vật Trung Quốc, có nghĩa là mốc ngũ cốc Trong quá

trình lên men, koji cung cấp một loạt các enzyme xúc tác cho sự phân rã của các chất rắn để sản phẩm có thể hòa tan, cung cấp môi trường lên men nấm men và vi khuẩn trong các giai đoạn lên men tiếp theo (Mheen 1972)

Các nước Đông Nam Á chủ yếu đánh bắt cá ở bề mặt.Tuy nhiên, do kích thước nhỏ và hàm lượng chất béo cao, cá biển sống bề mặt có xu hướng giảm chất lượng nhanh chóng nếu không được xử lý và lưu trữ Ở một số nước Đông Nam Á, 30% số lượng cá đánh bắt được sử dụng như là bột cá có giá trị thấp hoặc phân bón

Sẽ là thuận lợi cho sản xuất nước mắm, (a) nếu thời gian lên men có thể được rút ngắn để giảm chi phí vốn và tăng sản lượng, (b) nếu cá được sử dụng đúng mức và có giá trị thấp có thể được sử dụng Nghiên cứu này tiến hành điều tra việc sử dụng soya sauce koji với Aspergillus oryzae và protease thương mại để đẩy nhanh sản xuất nước mắm từ các loài cá biển sống bề mặt

mà không ảnh hưởng đến hương vị đặc trưng và chất lượng nước mắm sản xuất truyền thống

Nguyên liệu và phương pháp

Nguyên liệu

Koji:

Đậu nành khô và bột mì được mua từ siêu thị địa phương Môi trường Aspergillus oryzae mua từ Công ty TNHH Konno Moyashi

Nước mắm

Cá biển sống bề mặt, cá nục tròn (macrosoma Decapterus) và đuôi cứng (Megalaspis cordyla) được mua từ chợ Geylang Serai Muối ăn được mua từ siêu thị địa phương Protease, từ Aspergillus oryzae được thu nhận từ Công ty TNHH Nagase Enzyme Acid lactic thực phẩm được mua từ Merck (Darmstadt, Đức)

Phương pháp

Chuẩn bị koji:

Đậu nành được rửa sạch, hấp khoảng 30 phút Đồng thời, bột lúa mì được nung ở 150ºC trong một giờ Sau khi làm nguội tới nhiệt độ thấp hơn 40ºC, đậu nấu chín và lúa mì rang được trộn lẫn trong tỷ lệ 1:1 (w/w) và cấy môi trường Aspergillus oryzae, tỷ lệ 1:16000 Hỗn hợp này được nhào trộn tới khi thành bột nhão, được đặt trong khay nhựa và ủ trong một buồng nhiệt độ-độ ẩm (Hotpack, Model 435314) Nhiệt độ đã được điều chỉnh, theo giai đoạn tăng trưởng của môi trường nuôi cấy Aspergillus oryzae, đó là:

1.Giai đoạn nảy mầm Aspergillus, nhiệt độ tối ưu 35ºC

2.Giai đoạn phát triển ban đầu của Aspergilus

Trong giai đoạn này, sự tăng trưởng của Aspergilus sẽ tạo ra nhiệt Sự gia tăng nhiệt độ của bột

sẽ được theo dõi Tuy nhiên, enzyme sẽ không được kích hoạt nếu nhiệt độ tăng quá cao Do đó, trong giai đoạn này, cần thiết giảm nhiệt độ của căn phòng đến 30oC và phết koji để độ dày khoảng 30 cm Bề mặt của koji nên được phủ bằng một miếng vải ướt để duy trì độ ẩm bão hòa 100% Làm ẩm lại vải thường xuyên vì vải sẽ bị khô bởi sức nóng được tạo ra

3.Giai đoạn tăng trưởng logarit

Giai đoạn này, bề mặt của koji sẽ được bao phủ bởi sợi nấm màu trắng Ta bỏ lớp vải ướt đi và chia lớp koji ra làm nhiều mảng nhỏ và được phết lại Nhiệt độ của căn phòng nên được duy trì ở

30oC

4.Giai đoạn cuối cùng

Koji được duy trì ở độ ẩm 95% từ 18 đến 20 giờ Ở giai đoạn này, nhiệt độ của buồng nên được duy trì ở 25ºC để ngăn chặn sự bất hoạt của peptidase

Biểu đồ chuẩn bị Koji:

Đậu nành Bột mì Rửa

Hấp 30 phút

Nung ở 150oC, 1h

Trộn đều, tỉ lệ 1:1 Cấy môi trường VSV, tỉ lệ 1:16000

Ủ

Koji Chuẩn bị nước mắm

Thành phần nguyên liệu cho việc chuẩn bị của nước mắm được thể hiện trong Bảng 1 Cá nục tròn cá hard-tail đã được rửa sạch bằng nước lạnh Cá cắt thành hai hoặc ba miếng, tùy thuộc vào kích thước của cá Cá được nấu chín trong nước sôi khoảng năm phút cho đến khi thịt thay đổi màu sắc Bước này là cần thiết để loại bỏ các thành phần lipid để tránh bị ôi trong sản phẩm cuối cùng Sau đó để ráo nước Sau khi cá được làm lạnh, protease và nước được thêm vào Độ

pH của hỗn hợp sau đó đã được điều chỉnh đến 6,5 bằng cách thêm axit lactic Hỗn hợp được ủ ở 45ºC trong bốn giờ và sau đó làm nguội đến 28ºC Sau đó, koji và muối được thêm vào hỗn hợp

cá, sau đó lên men ở nhiệt độ phòng (28ºC) trong 2,5 tháng Trong quá trình lên men, hỗn hợp được khuấy thường xuyên để hòa tan đồng đều muối Việc khuấy: trong 5 ngày đầu tiên, 1lần/ngày; sau đó, 1 lần/3 ngày

Vào cuối quá trình lên men, toàn bộ hỗn hợp sau lên men được lọc vải, đem chất lỏng thu được đun nóng đến 80oC trong 15 phút, sau đó lọc tiếp với giấy lọc Whatman No.35 để thu được nước mắm

Bảng 1: Thành phần nguyên liệu chuẩn bị nước mắm:

MS mẫu Loại cá Protease(%khố

i lượng cá)

Nước (%khối lượng cá)

Koji (%khối lượng hỗn hợp cá–nước)

Muối (%khối lượng hỗn hợp cá–nước)

Quy trình chuẩn bị nước mắm:

Cá → cắt thành 2 – 3 miếng → luộc chín → để ráo nước và làm lạnh → thêm protease và nước

→ chỉnh pH đến 6.5 bằng acid lactic → ủ tại 45oC, 4h → làm nguội đến 28oC → thêm muối và

koji vào hỗn hợp cá – nước → cho hỗn hợp vào thùng chứa, đậy kín nắp → lên men tại 28oC, 2,5 tháng → đun nóng 80oC trong 15 phút → lọc → nước mắm

Kiểm soát quá trình lên men

Một loạt các thử nghiệm hóa học đã được thực hiện để theo dõi quá trình lên men Thường xuyên lấy mẫu từ hỗn hợp lên men đem phân tích hóa học Độ chua I, II, formol-N và tổng chất rắn hòa tan được kiểm tra hàng tuần; pH được đo 2 tuần/lần Vào cuối quá trình lên men, tiến hành xác định sản lượng nước mắm và phân tích nito tổng (Total-N), nitơ cơ bản dễ bay hơi (VBN), clorua natri và thành phần acid amin của nước mắm

PH được đo bằng đồng hồ đo pH Istek, Model 725P Độ chua I và II đã được xác định theo phương pháp phân tích nước tương Nhật Bản (Okuhara,1985) Hàm lượng nitơ amin được xác định theo phương pháp Formol-N (Phương pháp chính thức của Miso Analysis, 1968) Tổng chất rắn hòa tan được đo bằng cách sử dụng khúc xạ tay (Atago, Loại N1 (0 - 32%) và N2 Loại (28 - 62%))

Sản lượng nước mắm được đo bằng cách lọc toàn bộ hỗn hợp lên men vào cuối giai đoạn lên men.Trọng lượng của chất lỏng thu được sau lọc sẽ được tính so với trọng lượng cá Hàm lượng Natri clorua xác định bằng cách chuẩn độ potentiometric với 0,1 N bạc nitrat (AOAC, 1980).Nito tổng được xác định bằng phương pháp Kjeldahl và VBN được xác định bằng phương pháp microdiffusion Conway (Conway, 1950).Thành phần acid amin được xác định bằng cách sử dụng sắc ký lỏng cao áp của Chi nhánh thực phẩm và Dinh dưỡng, Phòng Y tế công cộng thú y, nông nghiệp thực phẩm và Cơ quan Thú y Singapore

Kết quả và thảo luận

Sự thay đổi thành phần hóa học trong suốt quá trình lên men:

pH, độ acid I

Độ pH giảm từ 5,51 và 5,67 tương ứng với cá hard-tail và cá nục tròn ở giai đoạn đầu của quá trình lên men đến 5,15 và 5,06 vào cuối lên men (Hình 3) Lưu ý rằng trong chế biến nước mắm, hầu hết xảy ra quá trình lên men là quá trình lên men acid lactic Điều này được thể hiện bằng cách đo độ acid I, tương quan với lượng axit lactic trong quá trình lên men nước mắm (Hình 4) Độ acid I đã được sử dụng để theo dõi tiến trình lên men, tức là quá trình lên men có thể chấm dứt một khi độ acid đạt 10 ml NaOH

Độ acid II, Formol-N

Độ acid II đo tổng acid amin và các kiểm tra formol-N đo nitơ amin Trong quá trình lên men, protein bị thủy phân thành các acid amin, ảnh hưởng đến hương vị của sản phẩm Hàm lượng axit amin tăng lên, vị ngon hơn, mặc dù tổng thể thành phần acid amin vẫn đóng một vai trò quan trọng trong việc xác định sự cân bằng hương vị tổng thể Trong quá trình lên men, độ axit II và giá trị formol-N tăng cho đến khi một mức độ nhất định, sau đó ổn định Giá trị dộ axit

II ở đầu và cuối của quá trình lên men là 11 ml dung dịch NaOH và 13,8 ml dung dịch NaOH tương ứng với cá hard-tail và 19,6 ml dung dịch NaOH và 21,3 ml dung dịch NaOH cho cá nục tròn (Hình 5) Các giá trị formol-N cũng tăng từ 0,840 đến 1,540 g/100 ml cho hard-tail và 1,092 đến 1,596 g/100 với cá nục tròn (Hình 6)

Tổng chất rắn hòa tan

Hàm lượng tổng chất rắn hòa tan tăng từ 39,0% và 38,2% tương ứng cho nước mắm được chế biến từ cá hard-tail và cá nục tròn, đạt 49,0% và 43,7% tương ứng, khi các sản phẩm được thu hoạch (Hình 7) Việc đo tổng chất rắn hòa tan bằng cách đo khúc xạ có thể được sử dụng để ước tính mức độ thủy phân protein trong quá trình lên men Chỉ số khúc xạ của dung dịch phụ thuộc vào số lượng các axit amin tự do và peptide nhỏ sinh ra do thủy phân protein

Thành phần hóa học của sản phẩm nước mắm sản phẩm từ phòng thí nghiệm và nước mắm thương mại Thái Lan.

Năng suất của cả hai nước mắm từ cá hard-tail và cá nục tròn được thể hiện trong Bảng 1 Thành phần hóa học của cả nước mắm phòng thí nghiệm sản xuất và nước mắm thương mại Thái Lan được thể hiện trong Bảng 2

Cả hai loại nước mắm phòng thí nghiệm sản xuất có giá trị tổng chất rắn hòa tan, độ acid

I, II, formol-N, hàm lượng VBN và nito tổng cao hơn; có hàm lượng muối và tỉ lệ formol-N/nito tổng thấp hơn của nước mắm thương mại

Độ pH của hai loại nước mắm phòng thí nghiệm sản xuất gần như tương tự của nước mắm thương mại Giá trị này lưu ý rằng hầu hết nam pla được thêm chất phụ gia trong quá trình chín với các phụ gia thực phẩm như axit citric và axit sorbic để giảm pH và điều chỉnh màu sắc (Mabesa et al, 1972)

Cả hai loại nước mắm phòng thí nghiệm sản xuất có năng suất tương tự, dựa trên 4.000 g cá sử dụng Năng suất của nước mắm phụ thuộc vào phần tiêu hóa được của cá, cụ thể là thịt và nội tạng

Thành phần amino acid

Trong quá trình lên men truyền thống nước mắm, protein của mô cá được thủy phân nhờ các enzyme đường ruột và các enzyme từ vi khuẩn, sinh ra các acid amin và các phân tử peptid nhỏ Saisithi (1994) nói rằng số lượng các axit amin được sinh ra trong quá trình lên men của nam pla tăng dần từ 2,9 đến 12,5g/100ml vào cuối 12 tháng lên men Những axit amin tạo hương

vị cho nước mắm

Thành phần các axit amin tự do của nước mắm phòng thí nghiệm sản xuất và nước mắm thương mại được thể hiện trong Bảng 3 Tổng hàm lượng acid amin tự do của nước mắm phòng thí nghiệm sản xuất cao hơn so với nước mắm thương mại Thái Lan (10,58 và 11,14 g/100 ml nước mắm cá hard-tail và cá nục tròn vs 8,23g/100 ml) Trong số tất cả các axit amin, axit glutamic gây nên vị umami, nhiều nhất trong tất cả các nước mắm phân tích Nó chiếm 17 đến 21% của tổng hàm lượng axit amin của nước mắm

Các axit amin góp phần gây hương vị umami là axit glutamic và acid aspartic Serine, glycine, alanine, threonine và proline có liên quan với vị ngọt Histidine, arginine, tyrosine, cystine, valine, methionine, phenylalanine, isoleucine, leucine, lysine có liên quan đến vị đắng (Funatsu năm 2001) Mặc dù nước mắm thương mại có tổng hàm lượng acid amin thấp nhất, nó

đã có tỷ lệ nhóm axit amin umami cao nhất (33%) và tỷ lệ nhóm axit amin đắng (37%) so với nước mắm phòng thí nghiệm sản xuất (tỷ lệ umami và tỷ lệ đắng lần lượt là 29,71% và 45,42% trong nước mắm cá nục tròn và 28,83% và 43,67% trong nước mắm cá hard-tail)

Hương vị tổng thể của nước mắm phụ thuộc vào sự cân bằng của tất cả các axit amin, đó

là những nhóm gây vị umami, ngọt, đắng Như hương vị là chủ quan, không có công thức tiêu chuẩn của một "cân bằng" thành phần acid amin.Tuy nhiên, đáng để lưu ý rằng vị đóng góp của các các axit amin trong những oligopeptides có thể che khuất độ mặn của nước mắm (Funatsu năm 2001)

So sánh với các tiêu chuẩn của Thái Lan

Thái Lan là nước sản xuất nước mắm lớn nhất trên thế giới, cung cấp hơn 20% tổng sản lượng nước mắm Việc sản xuất nước mắm Thái Lan, nam pla, được quy định bởi hai tiêu chuẩn được thành lập bởi các Cục quản lý Thuốc và Thực phẩm Thái Lan (FDA) và Viện Tiêu chuẩn Công nghiệp Thái Lan (TISI) Trước đây là bắt buộc trong khi sau này là tự nguyện Các yêu cầu của cả hai tiêu chuẩn được thể hiện trong Bảng 4 và 5

Việc so sánh của nước mắm phòng thí nghiệm sản xuất và nước mắm thương mại với các yêu cầu do FDA Thái Lan và TISI được thể hiện trong Bảng 6

Nói chung, cả hai loại nước mắm phòng thí nghiệm sản xuất có thể đáp ứng các tiêu chuẩn quy định của Thái Lan FDA và TISI