Phương pháp đo các gốc oxi hóa tự do

Các phóng xạ ion hóa có thể phản ứng với nước và gây nên tổn thương ngay lập tức cho sinh vật, một quá trình được gọi là sự phân ly do phóng xạ.. II.1 DPPHƯu điểm, han chế và tính ổn địn

PHƯƠNG PHÁP ĐO CÁC GỐC OXI HÓA TỰ DO

TRONG HỆ THỐNG SINH HỌC

Trương đai hoc sư pham ky thu t tp.hcm â

Khoa đi n – đi n tư ê ê

B môn : SINH HỌC ĐẠI CƯƠNG ô

Dương Thanh Toàn

16129073

Pham Thị Diễm My 16129039

I Gốc tự do

I.2 Nguyên nhân

Các gốc tự do luôn được hình thành từ nhiều con đường khác nhau, được chia thành 2 loại: nội sinh và ngoại sinh

Nội sinh :

- Từ chuỗi chuyền điện tử trong ty thể (các phản ứng phosphoryl oxy hóa của mitochondria): superoxide anion (O2●), peroxynitrate (ONO-), hydrogen peroxide (H2O2), gốc hydroxyl (●OH)

 - Từ hoạt động hô hấp của leucocyte, gốc tự do hình thành để giết vi khuẩn

 - Từ quá trình tự chết của tế bào (apoptosis): bằng in vitro, người ta thấy chất oxy hóa nội sinh AXO có thể   ngăn trở apoptosis

Ngoại sinh (phát sinh do các tác động từ môi trường sống):

Các yếu tố môi trường tác động sinh ra gốc tự do: có rất nhiều như tia tử ngoại (UV), các loại bụi kim loại, khói thuốc lá, bụi, khói công nghiệp (khói thải từ nhà máy, xe,…), thuốc trừ sâu, các chất phụ gia, chất bảo quản thực phẩm, thức ăn nước uống có chứa nấm mốc, độc tố vi khuẩn, các chất phóng xạ, các hành vi, thói quen cá nhân như hút

thuốc, uống rượu, ăn uống nhiều loại đồ ăn sinh axit, v.v…

I.3 Cấu trúc

Phân tử gồm một số nguyên tử dính với nhau do tác dụng của các cặp đôi điện tử (electron) Vì một lý do nào đó, một điện tử

bị tách rời khỏi nhóm nên phân tử có số điện tử lẻ và khi đó được coi là một gốc tự do

I.6.1 ROS ngoại sinh

ROS ngoại sinh có thể được tạo ra từ chất ô nhiễm, thuốc lá, khói bụi, các chất độc hóa học hoặc phóng xạ

Các phóng xạ ion hóa có thể phản ứng với nước và gây nên tổn thương ngay lập tức cho sinh vật, một quá trình được gọi là sự phân ly do phóng xạ Vì nước chiếm tới 55-60% cơ thể nên khả năng xảy ra sự phân ly do phóng xạ là rất cao trong trường hợp có sự hiện diện của các phóng xạ ion hóa Trong quá trình này, nước bị mất một electron và trở nên rất hoạt động

I.6.1 ROS nôi sinh

ROS nội bào được sản xuất từ nhiều nguồn khác nhau, các nguồn chính gồm có ti thể, peroxisome,

hệ võng nội bào và phức hợp NADPH oxidase (NOX) ở màng tế bào

I.7 Vai trò của ROS

Không chỉ liên quan đến sự chết theo chương trình của tế bào mà còn tạo ra các kháng thể trong cơ thể và khởi động các bơm ion Điều này làm ROS trở thành 1 chất kiểm soát chức năng của

tế bào Đặc biệt, các tiểu cầu tham gia vào việc làm lành vết thương và duy trì cân bằng của máu tiết ra ROS để tạo thêm các tiểu cầu mới tại vị trí vết thương Chúng cũng nói lên sự liên quan đến các đáp ứng miễn dịch thông qua việc tạo mới thêm các bạch cầu

I.7 Vai trò của ROS

ROS cũng liên quan đến các hoạt động của tế bào trước mỗi đáp ứng viêm khác nhau

II Phương pháp xác định hoat tính chống oxi hóa

• Phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH

• Phương pháp thu hoạt tính ức chế gốc tự do NO

• Phương pháp đo MDA

II.1 DPPH

Nguyên tắc:

Các chất có khả năng kháng oxy hoá sẽ trung hoà gốc DPPH bằng cách cho hydrogen, làm giảm

độ hấp thụ tại bước sóng cự đại và màu của dung dịnh phản ứng sẽ nhạt dần, chuyển từ tím sang vàng nhạt

Phương trình phản ứng :

II.1 DPPH

Ưu điểm, han chế và tính ổn định

của phương pháp DPPH

Ưu điểm :

• DPPH được phép phản ứng với toàn bộ mẫu và đủ thời gian nhất định trong phương

pháp này cho phép DPPH để phản ứng chậm ngay cả với chất chống oxy hóa yếu DPPH có thể được sử dụng trong các dung môi hữu cơ và dung dịch nước không phân cực và

có thể được sử dụng để kiểm tra cả hai chất chống oxy hóa ưa nước và ưa mỡ

• Có độ chính xác cao , dễ dàng và kinh tế

Hạn chế

• Do DPPH tương tác cơ bản với các gốc khác và đường cong đáp ứng thời gian

• Phương pháp DPPH có những hạn chế trong việc phản ánh các phân vùng của

chất chống oxy hóa trong các hệ thống nhũ tương và không phải là hữu ích để

đo lường các hoạt động chống oxy hóa của huyết tươngDPPH là nhạy cảm với một số căn cứ Lewis và các loại dung môi cũng như oxy

• Độ hấp thụ của DPPH trong methanol và acetone giảm dưới ánh sáng

II.2 Ức chế gốc tự do NO

Hóa chất – dụng cụ:

Dung dịch natri nitroprussid 10 mM: pha trong đệm phosphat pH 7.4 (20 mM) trước khi tiến hành thí nghiệm và được bảo quản trong chai tối màu.

Thuốc thử Greiss :bao gồm 2 dung dịch A và B:

+ Dung dịch A: sulfanilamide 2% trong acid phosphoric (H3PO4) 4%.

+ Dung dịch B: N-(1-napthyl)-ethylendiamin 0.2% trong nước cất.

Hai dung dịch này được trộn với cùng tỉ lệ thể tích trước khi thí nghiệm.

Quercetin và các hợp chất thử nghiệm được cô lập từ hoa cúc trắng, độ tinh khiết của các chất này được xác định theo phương pháp HPLC.

Máy UV-Vis.

Khả năng ức chế gốc tự do NO được xác định dựa trên phần trăm ức chế I (%) Từ đó, ta tính được giá trị IC50, đại lượng đánh giá khả năng ức chế mạnh hay yếu của các hoạt chất, IC50 (Inhibitory concentration) được định nghĩa là nồng độ của một mẫu mà tại đó nó có thể ức chế được 50% gốc tự do NO Để có cơ sở đánh giá hoạt tính của những mẫu chất khảo sát, chúng ta sử dụng quercetin và acid caffeic làm chất đối chứng để so sánh, vì đây là những chất có hoạt tính mạnh đối với gốc tự do NO được sử dụng làm chất đối chứng trong các tài liệu tham khảo.

Cơ sở phương pháp

II.3 Do MDA

MDA (Malonyl dialdehyde) là sản phẩm cuối cùng của quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào nên

được áp dụng rộng rãi trong thực tế để nghiên cứu quá trình peroxy hóa lipid của màng tế bào Nguyên tắc MDA được sinh ra trong quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào, khi cho phản ứng với acid

thiobarbituric, một phân tử MDA phản ứng với hai phân tử acid thiobarbituric tạo phức màu hồng hấp thu cực đại ở bước sóng 532 nm, phản ứng được thực hiện ở môi trường pH bằng 2-3, nhiệt độ là 90-100 độ C trong thời gian từ 10 đến 15 phút Dựa trên sự giảm cường độ hấp thu của phức ta tính được khả năng kháng oxy hóa của chất cần nghiên cứu

Phương trình phản ứng :

III Các phương pháp xác định g ốc tự do

• Phương pháp xác định trực tiếp

• Các phương pháp dấu vân tay

• Đo các tổn thương của AND

III.1.1 ESR và bẫy Spin

Quang phổ cộng hưởng ESR là kỹ thuật duy nhất xác định các gốc tự do, còn gọi là cộng hưởng thuận từ electron (ESP) ESR đặc hiệu với các gốc tự do vì phương pháp này phát hiện sự có mặt của các electron độc thân

Bẫy spin :

DVPO (5,5-DimethVipyrroline-Noxide)

PBN ( [alpha]-phenyl-t-butyl nitrone)  

III.1.2 Phát hiên gốc hydroxyl

3.1.2.1- Hydroxyl hóa các hợp chất thơm

Sản phẩm ban đầu của sự tấn công OH’ trên các hợp chất thơm là các gốc tự do và cuối cùng tạo ra các sản phẩm hydroxyl hóa Phản ứng hydroxyl hóa các “hợp chất thơm” đã được sử dụng để phát hiện OH’ bằng cách đo các sản phẩm hydroxyl tạo thành Chúng có thể được đo bằng các thiết bị đo màu, nhưng các phản ứng tạo màu thường không thể phát hiện tất cả các dạng đồng phân hydroxyl và do đó là phương pháp bán định lượng

Phương pháp sắc ký khí (GC)

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

III.1.2 Phát hiên gốc hydroxyl

3.1.2.2- Phương pháp deoxyribose

Sự tấn công của OH’ vào phần tử dương 2-deoxyribose tạo ra rất nhiều sản phẩm khác nhau Một số mảnh sản phẩm khi bị đun nóng ở nhiệt độ cao sẽ bị phân hủy tạo thành dạng

III.1.3Phát hiên gốc Superoxide

Ngoài bẫy spin, DMPO kết hợp với ESR là một phương pháp phát hiện Oxi hiệu quả (mục 2.1.1), các bẫy spin khác cũng được sử dụng Những chất phát hiện có khả năng huỳnh quang như lucigenin được sử dụng rộng rãi để phát hiện sự tạo thành *cr2 bởi các thực bào, nhưng dễ tạo ra sự giả mạo

Thông thường, *cr2 được phát hiện bởi khả năng khử cytochrome c hoặc nitrobirtue tetretojium (NBT) Về mặt hóa học, phản ứng khử cytochrome c đơn giản hơn phản ứng khử NBT

Tuy nhiên, nhiều chất khác cũng có thể khử cytochrom c (đặc biệt ascorbate và các thiol) cản trở việc phát hiện O2 Khắc phục bằng việc sử dụng một điện cực *O~2 để đo sự khử cytochrom c Thông thường thêm SOD để thấy

dự khử gián tiếp của *O~2 Sự khử NBT diễn ra phức tạp hơn, và *O~2 có thể được sinh ra trong quá trình khử Do vậy, việc thêm NBT vào một hệ sinh học không tạo ra *O~2 nhưng có thể khử NBT có thể tạo ra sự phát sinh *O~2 Một số phương pháp dễ phát hiện *O~2 trong mô: ví dụ làm ngập mô với muối tetrazolium có thể dẫn tới tạo kết tủa formazan quan sát được dưới kính hiển vi tại vị trí mô sinh ra *O~2

III.1.4Phát hiên nitric oxide NO’

III.1.5 Phát hiên peroxynito (ONOO)

Oxy hóa thuốc nhuộm dihydroergotamine (DHE):

III.1.5 Phát hiên peroxynito (ONOO)

Phương pháp nitro hóa :

ONOO nitro hóa rất nhiều các hợp chất thơm gồm các acid amin tyrosin, triptophan và phenylalanin, trong đó chú ý đến tyrosin Quá trình nitro hóa phụ thuộc ONOO được thúc đẩy bằng cách thêm ion Fe(III) hoặc Cu2+ và một

số metalloprotein, gồm CuZnSOD, MnSOD Sự nitro hóa các tyrosin có thể được đo bằng phương pháp quang phổ (3nitrotyrosin có màu vàng ở pH kiềm) Các phương pháp sắc ký khí, phổ khối, HPLC với phổ hấp thụ hoặc detector điện hóa cũng đã được sử dụng

III.1.6Phát hiên dạng clor hóa (UOC)

Phương pháp taurine: dựa trên sự biến đổi laurine thành taurme chloramine

Taurin chloramin giống HOC1 oxy hóa acid lhinitrobenzoic có màu vàng thành sản phẩm không màu 5,5-dithiobise

(2-nitrobenzoic acid) (DNTR, thuốc thử Ellmun) Quá trình clo hóa monohchlodimedon thành dichlodomedon, với sự mất hấp thụ là 290nm, đã được sủ dụng để đo sự tạo thành HOC1 bởi myeloperoxidase Vì nói chung HOC1 phản ứng với nhiều các phân tử sinh học, nên nói chung các phép định lượng này không hữu ích để đo sự tạo thành của nó trong cơ thể HOC1 clor hóa tyrosin ở dạng tự do hoặc trong protein tạo thành sản phẩm 3-elorotyrosin, sản phẩm này được coi là chất đánh dấu sinh học của sự sinh ra HOC1 Tuy nhiên, NQ2C1 cũng có thể clor hóa lyrosin tạo thành các sản phẩm nitrat hóa và clor hóa,

do đó hữu ích trong việc phân biệt tác dụng của ONOO (nitro hóa), HOC1(clor hóa) và NO2C1 (cả hai loại phản ứng).

III.1.7 Phát hiên hydrogen peroxid (H2O2)

Phương pháp được sử dụng phổ biến nhất là sử dụng sự oxy hóa phụ thuộc của spocolectin bởi horseradish peroxidase tạo thành sản phẩm không phát huỳnh quang Đo sự mất huỳnh quang của scopeletin là 460nm Đôi khi

sử dụng các cơ chất khác của peroxidase ( ví dụ sự biến đổi guaicol thành một chất có màu nâu) Superoxide có thể làm giảm hoạt tính của peroxidase và có thể ảnh hưởng đến phép đo H2O2 trong các hộ sinh ra O2 Điều này có thể tránh được bằng cách thêm vSOD

III.2 Các phương pháp dấu vân tay

ROS và RNS phản ứng theo những cách riêng với ADN, protein, lipid và một số chất chống oxy hoá khối lượng phần tử thấp( ví dụ ascorbic, urat) Do đó các sản phẩm tạo thành được coi như những ‘dấu vân tay’ của sự tấn công oxy hoá.Các phương pháp này không do các dạng hoạt động ROS/RNS mà do các sản phẩm của sự tổn thương oxy hoá gây bởi ROS/RNS

và các sảnphẩm này phải là các chất đánh dấu đặc trưng của sự tổn thương do oxy hoá Và phải đảm bảo chắc chắn rằng các sản phẩm được xác định chỉ do sự tấn công oxy hoá chứ không phải được tạo ra bởi các quá trình sinh học thông

thường

III.2 Các phương pháp dấu vân tay

3.2.1 Đo quá trình peroxyd hóa lipid (POL)

Quá trình peroxyd hoá các lipid màng, các lipoprotein hoặc các acid béo chưa no do sự tấn công của các gốc tự do tạo ra các sản phẩm cuối Mỗi kỹ thuật đo một sản phẩm của quá trình POL và không một kỹ thuật nào đo được chính xác toàn bộ quá trình POL Dưới đây là một số phương pháp đo các sản phẩm của quá trình POL

III.2 Các phương pháp dấu vân tay

3.2.1.1Đo sự mất các acid béo chưa no

III.2 Các phương pháp dấu vân tay

3.2.1.2 Đo sự hấp thụ UV cấu trúc điện liên hợp với sự sắp xếp liên kết đôi- đơn- đôi

III.2 Các phương pháp dấu vân tay

3.2.1.3Đo các khí hydrocarbon

III.2 Các phương pháp dấu vân tay

3.2.1.4- Do các isoprostan (isoPs)

Các mô dộng vật và các dịch cơ thể (gồm cả nước tiểu) chứa một lượng nhỏ các F2- Tsopiostan

III.2 Các phương pháp dấu vân tay

3.2.1.5 Đo các aldehyd khác ngoài MDA

Có rất nhiều sản phẩm cuối của quá trình peroxvd hóa lipid ngoài cácisoprotane, các peroxyd, các khí hydrocarhon và MDA Các aldehyd có thể phản ứng với dinilrophenylhydrazin cho sản phẩm là các dinitrophenylhydrazon, chất có thể được tách bằng HPLC Hoặc, chúng cũng cố thể bị biến đổi thành các sản phẩm dể bay hơi có thể được tách bằng GC vàđược xác định bời MS Các aldehyd hoạt động bị chuyển hoá bởi các tế bào Khi sinh ra trong tế bào chúng nhanh

chóng liên kết với các protein mà GC-MS không tách được các phức hợp đã liên kết với protein này Do đó, các phương pháp dựa vào kháng thể đổ phát hiện các phức hợp

III.2 Các phương pháp dấu vân tay

III.2 Các phương pháp dấu vân tay

3.2.2 Đo các tổn thương của ADN

Sự tổn thương ADN do oxy hoá gây đứt mạch ADN, tổn thương đường deoxyribose và gâv biến đổi các base purin và pyrimidin tạo ra nhiều sản phẩm 8- hydroxydeoxyguanosin (8-OHdG) là sản phẩm được coi như là chất chỉ thị của sự tổn thương ADN do oxy hoá Do đó một phương pháp để định

lượng sự tổn thương ADN do oxy hoá là định lượng trực tiếp 01 IdG trong ADN Trước tiên giải phóng OHdG từ ADN bằng cách thuỷ phân bằng enzym, sau đó định lượng 8-OHdCr bằng phương pháp HPLC kết hợp với detector điện hoá (ECD), đây là một kỹ thuật rất nhạy thường hay được sử dụng.

8-3.2.2.1 Định lượng trực tiếp 8-hydroxydeoxyguanosin trong AON bằng HPLC

III.2 Các phương pháp dấu vân tay

3.2.2 Đo các tổn thương của ADN

Đánh giá sự tổn thương base do oxy hoá Sau khi phân giải các tế bào, cho tiếp xúc với các enzym phục hồi ADN ADN bị phá vỡ tại các vị trí base biến đổi, tạo ra nhiều đoạn hơn Phương pháp này có thể kết hợp với phương pháp khác để đo lường mức độ phá vỡ ADN Gồm đánh dấu đồng vị 31P trên các

nucleotid ở một ADN đã thuỷ phân, bằng enzym, sau đó tách bang sắc kỷ và phát hiện bàng cách do bức

xạ, sử dụng kháng thể trực tiếp kháng lại 8-OHdG hoặc các tổn thương khác Nhuộm màu kháng thể kháng lại 8-OHdG có thể ứng dụng cho toàn bộ ADN hoặc kháng thể có thể đưa vào các cột để loại hết 8- OHdG từ sự thuỷ phân ADN hoặc từ nước tiểu.

3.2.2.2 Phương pháp điện ly gel đơn tế bào phương pháp comet, phương pháp "sao chổi')

III.2 Các phương pháp dấu vân tay

3.2.2 Đo các tổn thương của ADN

Các aldehyd độc tế bào dược tạo ra trong quá trình peroxvd hoá lipid và cũng có nhiều trong môi trường Nếu gặp ADN, aldehyd có thể liên kết với các base của ADN Đo các sản phẩm này bằng phương pháp GC-MS hoặc HPLC/ECD sau khi thuỷ phân ADN bằng acid hoặc các thử nghiệm miễn dịch

3.2.2.3 Do các hợp chất gốc aldehyde kết hợp với ADN

III.2 Các phương pháp dấu vân tay

3.2.2 Đo các tổn thương của ADN

3.2.2.4 Đo các tổn thương của protein

Một phương pháp phổ biến đánh giá sự tổn thương protein do oxy hoá là phương pháp carbonyl được sử đụng rộng rãi Dựa trên sự tấn công của một số ROS vào các gốc amino acid trong các

protein đặc biệt histidin, arginine, lysin và prolin) để tạo ra các sản phẩm cố chứa các nhóm carbonyl, các sản phẩm này có thể được đo sau phản ứng với 2,4- dinitrophenylhydrazine tạo sản phẩm hấp thụ ở bước sóng 360-390 nm

Hãy chống lai gốc tự do

Hãy chống lai gốc tự do