Giáo trình sinh học cá

MỤC LỤC Chương 0 MỞ ĐẦU 7 I. Giới thiệu chung 7 1. Khái quát 7 2. Lịch sử phát triển của nghiên cứu cá 7 3. Tầm quan trọng của phương pháp nghiên cứu và mục tiêu của giáo trình 2 II. Nội dung của giáo trình 2 Chương 1 PHƯƠNG PHÁP THU VÀ XỬ LÝ MẪU 4 II. Phương pháp thu mẫu và bảo quản mẫu 4 2. Thu mẫu phân tích ở phòng thí nghiệm 6 3. Kỹ thuật bảo quản mẫu 7 4. Kỹ thuật cố định mẫu cho các nghiên cứu mô học 10 Chương 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU HÌNH THÁI CÁ 12 I. Nguyên lý trong đo mẫu cá 12 II. Đo chiều dài và trọng lượng cá 13 III. Các chỉ tiêu hình thái 13 IV. Các chỉ tiêu số lượng 17 V. Các chỉ số sinh trắc 18 VI. Tương quan chiều dài trọng lượng và hệ số điều kiện 20 Chương 3 KỸ THUẬT NGHIÊN CỨU MÔ HỌC 23 II. Phương pháp và kỹ thuật nghiên cứu mô 23 2. Cắt tỉa và định hướng cho mẫu mô đã được cố định (Trimming and Orientation) 27 3. Loại nước, làm trong mẫu, ngấm paraffin (Dehydration, Clearing, Infiltration) 27 4. Đúc khối (Embedding) 29 5. Phương pháp cắt mẫu (Sectioning) 30 6. Nhuộm màu (Staining) 32 I. Thức ăn tự nhiên của cá 36 1. Sinh vật phù du (plankton) 36 2. Sinh vật tự bơi (Nekton) 36 3. Sinh vật đáy (Benthos) 36 4. Chất vẩn (Detritus) 37 II. Phổ dinh dưỡng 37 III. Các chỉ số sinh trắc 38 1. Tương quan chiều dài ruột 38 2. Chỉ số no (index of fullness) của ống tiêu hóa và cường độ bắt mồi (feeding intensity) 40 3. Phương pháp phân tích thức ăn trong ruột cá 41 4. Sự phát triển các cơ quan tiêu hóa và mối liên hệ với tập tính dinh dưỡng 44 5. Hệ số chọn lựa thức ăn 44 6. Các chỉ tiêu đánh giá nhu cầu dinh dưỡng của cá 46 Chương 5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU SINH HỌC SINH SẢN 47 II. Các giai đoạn phát triển của tuyến sinh dục 47 IV. Hệ số thành thục 52 V. Nghiên cứu sự thành thục dựa trên đường kính trứng 52 VI. Sức sinh sản 54 Sức sinh sản tương đối (relative fecundity) 55 Sức sinh sản đặc biệt (specific fecundity) 56 VII. Mối liên hệ giữa sức sinh sản và các chỉ tiêu sinh học khác 56 Chương 6 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU TUỔI VÀ SINH TRƯỞNG 59 II. Xác định tuổi bằng phương pháp dùng vảy 60 III. Xác định tuổi bằng phương pháp dùng đá tai 61 IV. Phương pháp xác định tuổi dựa vào các phần xương khác 61 V. Phương pháp tần suất chiều dài 62 VII. Tăng trưởng tuyệt đối và tăng trưởng tương đối 64 VIII. Tính ngược chiều dài cá và sự tăng trưởng 65 IX. Phương trình đường cong tăng trưởng 66 Chương 7 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU SINH HỌC QUẦN THỂ 68 II. Ước lượng kích thước quần thể 69 III. Phương pháp đánh dấu cá 69 1. Mục đích 69 2. Các phương pháp đánh dấu 70 IV. Sự biến động quần thể và các mô hình dự báo quần thể 71 V. Sự khai thác bền vững quần thể 72 Hình 7.1: Quan hệ giữa trữ lượng và hệ số khai thác 73 Chương 8 PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ TRỮ LƯỢNG CÁ 75 II. Phương pháp đánh dấu và bắt lại 75 III. Phương pháp đếm trứng 76 IV. Phương pháp dùng sóng âm 77 V. Phương pháp dựa trên diện tích quét của lưới kéo 77 TÀI LIỆU THAM KHẢO 81

Giáo trình:

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU SINH HỌC CÁ

MỤC LỤC

Chương 0 MỞ ĐẦU 5

I Giới thiệu chung 5

1 Khái quát 5

2 Lịch sử phát triển của nghiên cứu cá 5

3 Tầm quan trọng của phương pháp nghiên cứu và mục tiêu của giáo trình 2

II Nội dung của giáo trình 2

Chương 1 PHƯƠNG PHÁP THU VÀ XỬ LÝ MẪU 4

II Phương pháp thu mẫu và bảo quản mẫu 4

2 Thu mẫu phân tích ở phòng thí nghiệm 6

3 Kỹ thuật bảo quản mẫu 7

4 Kỹ thuật cố định mẫu cho các nghiên cứu mô học 10

Chương 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU HÌNH THÁI CÁ 12

I Nguyên lý trong đo mẫu cá 12

II Đo chiều dài và trọng lượng cá 13

III Các chỉ tiêu hình thái 13

IV Các chỉ tiêu số lượng 17

V Các chỉ số sinh trắc 18

VI Tương quan chiều dài trọng lượng và hệ số điều kiện 20

Chương 3 KỸ THUẬT NGHIÊN CỨU MÔ HỌC 23

II Phương pháp và kỹ thuật nghiên cứu mô 23

2 Cắt tỉa và định hướng cho mẫu mô đã được cố định (Trimming and Orientation) 27

3 Loại nước, làm trong mẫu, ngấm paraffin (Dehydration, Clearing, Infiltration) 27 4 Đúc khối (Embedding) 29

5 Phương pháp cắt mẫu (Sectioning) 30

6 Nhuộm màu (Staining) 32

I Thức ăn tự nhiên của cá 36

1 Sinh vật phù du (plankton) 36

2 Sinh vật tự bơi (Nekton) 36

3 Sinh vật đáy (Benthos) 36

4 Chất vẩn (Detritus) 37

II Phổ dinh dưỡng 37

III Các chỉ số sinh trắc 38

1 Tương quan chiều dài ruột 38

2 Chỉ số no (index of fullness) của ống tiêu hóa và cường độ bắt mồi (feeding intensity) 40

3 Phương pháp phân tích thức ăn trong ruột cá 41

4 Sự phát triển các cơ quan tiêu hóa và mối liên hệ với tập tính dinh dưỡng 44

5 Hệ số chọn lựa thức ăn 44

6 Các chỉ tiêu đánh giá nhu cầu dinh dưỡng của cá 46

Chương 5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU SINH HỌC SINH SẢN 47

II Các giai đoạn phát triển của tuyến sinh dục 47

IV Hệ số thành thục 52

V Nghiên cứu sự thành thục dựa trên đường kính trứng 52

VI Sức sinh sản 54

Sức sinh sản tương đối (relative fecundity) 55

Sức sinh sản đặc biệt (specific fecundity) 56

VII Mối liên hệ giữa sức sinh sản và các chỉ tiêu sinh học khác 56

Chương 6 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU TUỔI VÀ SINH TRƯỞNG 59

II Xác định tuổi bằng phương pháp dùng vảy 60

III Xác định tuổi bằng phương pháp dùng đá tai 61

IV Phương pháp xác định tuổi dựa vào các phần xương khác 61

V Phương pháp tần suất chiều dài 62

VII Tăng trưởng tuyệt đối và tăng trưởng tương đối 64

VIII Tính ngược chiều dài cá và sự tăng trưởng 65

IX Phương trình đường cong tăng trưởng 66

Chương 7 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU SINH HỌC QUẦN THỂ 68

II Ước lượng kích thước quần thể 69

III Phương pháp đánh dấu cá 69

1 Mục đích 69

2 Các phương pháp đánh dấu 70

IV Sự biến động quần thể và các mô hình dự báo quần thể 71

V Sự khai thác bền vững quần thể 72

Hình 7.1: Quan hệ giữa trữ lượng và hệ số khai thác 73

Chương 8 PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ TRỮ LƯỢNG CÁ 75

II Phương pháp đánh dấu và bắt lại 75

III Phương pháp đếm trứng 76

IV Phương pháp dùng sóng âm 77

V Phương pháp dựa trên diện tích quét của lưới kéo 77

TÀI LIỆU THAM KHẢO 81

2 Lịch sử phát triển của nghiên cứu cá

Lịch sử nghiên cứu cá chưa phát triển lâu, mặc dù nghề khai thác và nuôi cá được biết là phát triển trước đó rất nhiều Có lẽ nghiên cứu sinh học cá chỉ bắt đầu sau thế kỷ 18 khởi đầu là các nghiên cứu về ngư loại học, mà lúc nầy cũng tập trung nhiều về hình thái và phân bố (Biswas, 1993) Người đầu tiên viết về các loài cá ở

Ấn Độ là Block (Day, 1878), sau đó là hàng loạt các báo cáo viết về hình thái cá như Hamilton (1822), Cuvier và Valenciennes (1824-1849)

Đến đầu thế kỷ 20 thì các nghiên cứu về ngư loại học phát triển nhanh về nhiều lĩnh vực như (i) hình thái và phân bố; (ii) phân loại; (iii) sinh lý và sinh hóa; (iv) sinh thái; (v) bệnh học; (vi) cấu trúc quần thể; (vii) di truyền; và (viii) bảo tồn, hàng loạt các nghiên cứu về sinh học các đã được tiến hành như nghiên cứu về sinh học sinh sản của nhiều loài cá khác nhau như của Hickling (1930), Clark (1934),…

về tuổi và sinh trưởng của các loài các biển và cá nước ngọt như của Van Oosten

(1929), Hickling (1933), Ford (1933), Pillay (1958),… về đánh giá trữ lượng quần thể như Ricker (1954, 1975), Welcomme (1975, 1979),…

3 Tầm quan trọng của phương pháp nghiên cứu và mục tiêu của giáo trình

Trong nghiên cứu các vấn đề về thức ăn, sinh trưởng, sinh sản, biến động quần thể,… của cá đều cần có một phương pháp phù hợp và chuẩn mực để có thể đưa ra các nhận định hay đánh giá chính xác và có thể so sánh kết quả giữa các nghiên cứu

Hiện nay có rất nhiều phương pháp nghiên cứu sinh học cá được viết trong nhiều tài liệu khác nhau ở các cấp độ khác nhau Nhiều nhà nghiên cứu làm việc ở các quốc gia phát triển (Tây Âu, Nhật Bản, Mỹ, ) luôn sử dụng các phương pháp mới, phức tạp và ứng dụng công nghệ thông tin hay thiết bị hiện đại, tất nhiên sẽ tiết kiệm thời gian, cho kết quả chính xác hơn, nhưng chi phí có thể cao hơn

Ở một số quốc gia, hay đối với một số đối tượng bắt đầu tiếp cận với phương pháp nghiên cứu cá (như sinh viên) thì rất cần các phương pháp đơn giản và dễ ứng dụng Trên ý tưởng đó, giáo trình nầy được biên soạn trên cơ sở tổng hợp nhiều phương pháp đã ứng dụng trong nghiên cứu cá và trình bày có tính logic và dễ hiểu nhằm phục vụ cho sinh viên chuyên ngành thuỷ sản bậc đại học Giáo trình nầy vì thể chỉ trình bày một số phương pháp quan trọng và phổ biến ở dạng cụ thể và ít trình bày các lý luận sâu cho từng phương pháp Học qua giáo trình nầy sinh viên có thể ứng dụng ngay vào các nghiên cứu của mình để phục vụ cho các nghiên cứu làm luận văn hay chuyên đề tốt nghiệp và có thể ứng dụng cho các nghiên cứu đơn giản trong công tác

II Nội dung của giáo trình

Giáo trình được kết cấu thành 8 chương, với những kiến thức cơ bản nhất trong nghiên cứu sinh học bao gồm:

- Chương 1: Phương pháp thu và xử lý mẫu

- Chương 2: Phương pháp nghiên cứu hình thái cá

- Chương 3: Phương pháp nghiên cứu mô học

- Chương 4: Phương pháp nghiên cứu dinh dưỡng

- Chương 5: Phương pháp nghiên cứu sinh học sinh sản

- Chương 6: Phương pháp nghiên cứu tuổi và sinh trưởng

- Chương 7: Phương pháp nghiên cứu sinh học quần thể

- Chương 8: Phương pháp đánh giá trữ lượng cá

Chương 1 PHƯƠNG PHÁP THU VÀ XỬ LÝ MẪU

I Giới thiệu

Có lẽ yêu cầu trọng nhất trong nghiên cứu về sinh học các là phải thu được số mẫu lớn và có tính đại diện Ngoài việc chọn lựa vị trí (địa điểm) thu mẫu phù hợp thì cần phải thu được số mẫu đủ lớn để kết quả phân tích phản ánh chính xác nội dung nghiên cứu mong muốn Có nhiều cách để thu được mẫu và loại mẫu thu cũng phải tùy thuộc vào nội dung của nghiên cứu, ví dụ thu mẫu để xác định giống loài, thành phần loài hay là thu để đánh giá trữ lượng,… Có những nội dung nghiên cứu đòi hỏi người thu mẫu phải có công cụ đánh bắt riêng, nhưng có nội dung có thể dựa vào thu mẫu từ ngư dân, trao đổi để ghi nhận thông tin từ ngư dân, thu từ chợ hay từ những người có liên quan khác ở địa bàn nghiên cứu Tuy nhiên, trong thực

tế thì việc thu thập các thông tin qua ngư dân không phải lúc nào cũng đầy đủ hoặc nhận được các trả lời chính xác hoàn toàn, bởi lẽ ngư dân không có ghi chép các thông tin, hoặc đôi lúc vì một lý do nào đó mà họ không thể nói thật hết những điều

họ làm hay biết Trong trường hợp nầy, người thu mẫu phải tạo ra một sự thân thiện nhất định và biết cách trao đổi để có thể khai thác được thông tin chính xác nhất về mẫu thu của mình

Bên cạnh đó, không phải lúc nào các mẫu thu đều có thể xử lý (phân tích) ngay tại chỗ mà phải mang về phòng thí nghiệm để phân tích Vì thế, vấn đề xử lý mẫu thu cũng đòi hỏi phải được thực hiện nghiêm túc và khoa học để có thể có được kết quả phân tích chính xác Phương pháp xử lý vào bảo quản mẫu vì thế tuỳ thuộc vào từng nội dung nghiên cứu

II Phương pháp thu mẫu và bảo quản mẫu

1 Nguyên tắc trong thu mẫu

a) Định danh chính xác mẫu thu

Một trong những yếu tố quan trọng nhất trong nghiên cứu sinh học cá là phải xác định chính xác loài cá nghiên cứu Nhưng đây không phải là công việc dễ dàng, nhất là khi mẫu thu là các loại cá trong giai đoạn con non Thỉnh thoảng người nghiên cứu không phân biệt được 2 loài có quan hệ gần nhau và gọi chúng với cùng

một tên loài Tùy theo địa phương, mỗi loài cá có thể có những tên gọi khác nhau, cho nên việc sử dụng tên khoa học của loài là thuận tiện và chính xác nhất

Định danh loài thường được tiến hành bằng cách xác định một loạt các đặc điểm hình thái bao gồm: (i) mô tả hình thái của loài như hình dạng cơ thể, các loại

vi, vị trí miệng, kiểu vẩy, (ii) Các chỉ tiêu số lượng (thí dụ công thức vi) như số lượng tia vi, vẩy, đốt sống Số lượng gai và tia vi thường là một chỉ số không đổi giữa các cá thể trong cùng 1 loài, vì vậy công thức vi là một công cụ quan trọng để định danh loài Ngoài công thức vi, số lượng vẩy, công thức răng hầu, số tia mang,

số đốt sống cũng là các chỉ tiêu số lượng quan trọng để định danh loài (iii) Các số

đo hình thái như chiều dài đầu, cao thân, mối tương quan của các chỉ số này với chiều dài tổng cộng hay chiều dài chuẩn Các số đo này thường được biểu hiện bằng

tỉ lệ hay phần trăm

b) Chọn địa điểm thu mẫu

Mẫu thu dùng cho nghiên cứu sinh học cá có thể thu ở chợ, cảng cá hay trực tiếp đánh bắt bằng các dụng cụ chuyên dùng (lưới kéo, lưới cào, chài,…) Tuy nhiên, vị trí thu mẫu là yếu tố quyết định đến kết quả của nghiên cứu Thông thường, thu mẫu ở các cảng cá phù hợp hơn việc thu ở chợ, bởi lẽ đó là nơi mà mẫu thu thể hiện tính đại diện cho ngư trường mà họ khai thác như biển, sông, hồ chứa,… Bên cạnh đó, việc thu mẫu ở các cảng cá cũng sẽ rất quí cho việc tính toán sản lượng khai thác vì nó phản ánh chính xác nhất lượng cá khai thác theo ngư trường hay theo ngư cụ khai thác

Vị trí thu mẫu bằng cách đánh bắt trực tiếp có ý nghĩa rất quan trọng trong việc xác định vùng phân bố, tập tính di cư, bãi đẻ, tập tính sinh sản, Các yếu tố môi trường nơi thu mẫu đôi khi cũng cần phải được xác định như độ vẫn đục, độ mặn, pH, mật độ phiêu sinh vật để có kết luận chính xác hơn về tập tính dinh dưỡng, các thích nghi sinh lý, vòng đời của đối tượng nghiên cứu

c) Chuẩn bị biểu mẫu

Khi thực hiện công tác thu mẫu thường phải chuẩn bị các biểu mẫu để có thể ghi chép một số thông tin về mẫu thu và cũng có thể xác định một số chỉ tiêu đo đạt nhanh Thông thường, mẫu thu phải có ghi đầy đủ các thông tin như:

1 Nơi khai thác (tên sông, hồ, ngư trường,…)

2 Địa điểm thu mẫu

3 Loại tàu khai thác

4 Ngư cụ khai thác và kích thước mắc lưới

5 Độ sâu ngư trường khai thác

6 Diện tích khai thác (nếu được)

7 Loài khai thác, tỉ lệ thành phần loài,

Nếu cần có thể ghi nhận nhanh kích cỡ về chiều dài và trọng lượng của cá tại nơi thu mẫu Thông thường thì có thể phân nhóm theo kích cỡ cá để đo đạt, trong trường hợp cá có kích thước lớn hơn 30 cm chiều dài thì có thể đo độ chính xác là 1

cm, cá kích cỡ nhỏ hơn 30 cm thì độ chính xác là 0,5 cm và đối với cá nhỏ có thể đo

ở độ chính xác 1 mm (Holden và Rait 1974)

2 Thu mẫu phân tích ở phòng thí nghiệm

Thu mẫu cho các phân tích ở phòng thí nghiệm yêu cầu phải có tính đại diện cho quần thể Mẫu thu cần phải được giữ càng tươi càng tốt Tùy theo yêu cầu mà mẫu thu cũng có thể khác nhau, nếu như thu mẫu cho nghiên cứu mô học phải là mẫu sống thì thu mẫu phân tích tính ăn của cá phải thu vào buổi sáng (5:00-7:00 giờ) để không bị ảnh hưởng bởi chu kỳ ăn trong ngày (diurnal rhythm) và khả năng tiêu hóa thức ăn của cá Theo Robotham (1977) đối với mẫu phân tích dinh dưỡng thì sau khi thu phải cho ngay vào dung dịch Chloral hydrate 10%, sau khi gây mê (narcotization) thì cố định trong formol trung tính 40% và sau đó pha loãng còn 5%

để bảo quản lâu dài Với cách nầy ông cho rằng sẽ giữa được tốt các thành phần trong dạy dày và ngăn cản sự biến mất một số thành phần

Hầu hết các nghiên cứu về sinh học cá được tiến hành trên một số ít mẫu thu được từ một quần thể có số lượng lớn Khái niệm quần thể ở đây là tất cả các cá thể thuộc một loài và đang sống ở một khu vực địa lý nhất định, quần thể cũng có thể được xem như một nhóm các cá thể thuộc loài đang được nghiên cứu (Moller, 1979) Toàn bộ quần thể thì quá lớn cho nghiên cứu, hơn nữa cũng không thể tiến hành các phân tích trên tất cả các cá thể đánh bắt được Vì vậy, việc chọn mẫu đại diện là cần thiết cho các nghiên cứu sinh học Có nhiều cách để thu mẫu, tuy nhiên

có thể chia ra thành 2 phương pháp chính là (i) thu mẫu ngẫu nhiên (random sampling) và (ii) thu mẫu có chọn lọc (non-random sampling) Tuy nhiên phương pháp thu mẫu ngẫu nhiên được áp dụng nhiều nhất, trong phương pháp này tất cả các mẫu trong quần thể đều có khả năng được chọn lựa bằng nhau

Phương pháp thu mẫu ngẫu nhiên lại được chia là 2 phương pháp là (i) thu mẫu hoàn toàn ngẫu nhiên (simple random) và (ii) thu mẫu ngẫu nhiên có giới hạn (restricted random) Trong phương pháp thu mẫu hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi cá thể trong quần thể sẽ được gán cho một số (gọi là số ngẫu nhiên – random numbers) khi

đó những cá thể nào được thu làm mẫu sẽ được xác định bằng các bảng số ngẫu nhiên (random table) Phương pháp thu mẫu ngẫu nhiên có giới hạn lại có 2 cách thu mẫu: (i) thu mẫu phân tầng (stratified sampling) đối với quần thể không đồng nhất, khi đó quần thể sẽ được chia thành các phần đồng nhất và mẫu sẽ được thu độc lập từ các phần đồng nhất đó; và (ii) thu mẫu nhiều giai đoạn (multi-stage sampling), khi quần thể quá lớn (thậm chí số lượng rất lớn cho một mẫu đại diện) khi đó việc thu mẫu được chia thành 2 giai đoạn Trước tiên quần thể muốn thu mẫu được chia thành các quần thể đại diện (sub-population) và mẫu sẽ được thu từ các quần thể đại diện (mẫu cấp 1) Bước tiếp theo, từ các mẫu thu của các quần thể đại diện, tiến hành thu các mẫu đại diện (mẫu cấp 2) Mẫu cấp 2 có thể được thu nhiều hơn 2 giai đoạn tùy thuộc vào nghiên cứu và kích cỡ của quần thể, do vậy phương pháp này được gọi là phương pháp thu mẫu nhiều giai đoạn

Vấn đề quan trọng nhất của việc thu mẫu là xác định số lượng mẫu thu Có nhiều ý kiến cho rằng số lượng mẫu nên dao động từ 1-25% kích cỡ quần thể Khi

số lượng mẫu quá nhỏ có thể sẽ không đại diện được cho toàn bộ quần thể, trái lại

số lượng mẫu quá lớn sẽ tốn rất nhiều thời gian để phân tích và làm gia tăng chi phí

Số lượng mẫu thu cũng phụ thuộc vào từng nghiên cứu, tuy nhiên số lượng từ 80-

100 mẫu với các kích cỡ khác nhau cho mỗi tháng là thích hợp cho các nghiên cứu thông thường về sinh học cá

3 Kỹ thuật bảo quản mẫu

Yêu cầu mẫu cho nghiên cứu sinh học phải còn tốt, những mẫu hư sẽ rất khó cho các phân tích vì thế mẫu cần được bảo quản càng nhanh càng tốt Mẫu sau khi thu cần được rửa ngay bằng nước ngọt để mẫu được sạch đồng thời loại bỏ các vi sinh vật có thể bám theo mẫu, nhất là mẫu thu từ ngư dân Mẫu sau khi rửa sạch thì cần đánh dấu và cân trọng lượng và chiều dài, và tất nhiên chi tiết của mẫu cần được ghi chép cẩn thận trong sổ Đối với các mẫu cá có kích cỡ lớn rất cần thiết phải gắn các thẻ hay phiếu có ghi các chi tiết như nơi đánh bắt, chiều dài, trọng lượng và giới tính Mẫu không ghi rõ sẽ khó sử dụng trong nghiên cứu

Mẫu thu có thể cố định ngay trong dung dịch formol Mẫu dùng cho phân tích

dạ dày cần phải được cố định ngay sau khi thu Dung dịch cố định mẫu thường dùng là formol 10% (1 phần formol và 9 phần nước) cho những mẫu có kích thước

lớn (lớn hơn 15 cm) và 5% cho các mẫu có kích thước nhỏ Dung dịch được dùng cho cố định mẫu phải là dung dịch trung tính, thông thường borax sẽ được thêm vào trong formol (1:1000)

Phần bụng của mẫu cá có kích thước lớn nên được mổ và cắt sâu vào trong cơ hai bên thân cá để dung dịch cố định có thể thấm vào bên trong Những cá nhỏ hơn

15 cm dài chỉ cần mổ phần dụng cá là đủ Mẫu cá thường được cố định khoảng 7-10 ngày, sau đó rửa sạch và cố định lại trong dung dịch formol 10% hay cồn 70% (ethyl alcohol) Nếu như giữa mẫu trong dung dịch cồn thì trước tiên nên giữ trong cồn 50% từ 5-7 ngày trước khi chuyển sang cồn 70% Trong trường hợp muốn giữa mẫu lâu, nếu dùng formol thì phải thay hàng tháng còn nếu giữa trong cồn (alcohol) thì thay mỗi 3 tháng Tuy nhiên, tùy từng cơ quan của cá mà cách bảo quản mẫu có thể khác nhau để có thể giúp cho quá trình phân tích mẫu đạt kết quả tốt nhất

Vảy, đá tai, gai vi lưng hay gai vi ngực thường được sử dụng để xác định tuổi

cá Vảy cá thường được thu từ 5-10 vảy cho mỗi cá thể Thông thường vảy tròn (cycloid scale) được lấy ở vùng giữa của vi lưng và đường bên, trong khi vảy lược (ctenoid scale) được thu ở vùng vi ngực Trước khi thu vảy, mẫu cần phải được rửa sạch để loại bỏ các vảy dính trên thân cá (các vảy này có thể là của các mẫu cá khác dính vào), và chỉ thu các vảy còn đính chặt vào thân cá Cũng có thể dễ dàng nhận biết các vảy tái sinh do sự sắp xếp không theo trật tự và thiếu các vòng đồng tâm gần, các vảy này không nên thu mẫu Nên chọn thu đủ số lượng mẫu với các vảy đồng dạng Khi lấy vảy cần cẩn thận tránh làm tổn hại phần rìa của vảy Mẫu vảy của mỗi cá thể có thể được chứa riêng trong các túi (giấy hay nilon) có dán nhãn với đầy đủ các thông tin về mẫu

Mặt cắt thẳng đứng của đá tai cũng được sử dụng để xác định tuổi của cá Đá tai thì nằm trong một khe của tai trong Cách thu đá tai dễ dàng nhất là thu qua một đường mở nằm ngang trên đầu phía sau mắt, hoặc mở nắp hộp sọ Một phương pháp khác để thu đá tai mà vẫn giữ nguyên hình dạng mẫu vật là lấy từ phần vòm miệng, tuy nhiên phương pháp này khó thực hiện hơn Trước khi cắt mẫu, đá tai phải được đúc thành khối trong polyester hay nhựa thông Có thể bảo quản đá tai bằng các phương pháp sau:

- Giữ trong dung dịch glycerin và nước theo tỉ lệ 1:1

- Giữ đá tai trong creosol hay terpineol (Gibson và Ezzi, 1978)

- Ngâm trong dung dịch 1% potassium hydroxide (KOH) để loại trừ hết các

mô liên kết sau đó làm khô và giữ trọng lọ kín (Strum, 1978)

Gai cứng của vi lưng (hoặc vi ngực) cũng được sử dụng để xác định tuổi cá Gai vi được cố định trong dung dịch formal-calcium ít nhất 24 giờ Cách chuẩn bị dung dịch này như sau:

Calcium chloride khan 10 g

Sau khi cố định, mẫu được rửa sạch bằng nước cất và chuyển vào dung dịch khử canxi trong thời gian từ 6-12 giờ tùy thuộc vào chiều dài của gai vi Dung dịch khử canxi được chuẩn bị bằng cách trộn lẫn 2 loại dung dịch A và B (Perry, 1967) Dung dịch A gồm 50 g sodium citrate và 250 mL nước cất, dung dịch B gồm 125

mL acid formir và 125 mL nước cất

Các phần khác của bộ xương như xương nắp mang, cột sống, xương gốc vi đuôi, có thể được thu bằng cách đun mẫu trong nước sôi khoảng 5 phút, khi đó các cơ bám vào xương sẽ dễ dàng tách ra Mẫu xương được làm khô ở nhiệt độ phòng trong thời gian khoảng 24 giờ Sau đó giữ mẫu trong các túi có dán nhãn với các thông tin về mẫu cá

Cố định tuyến sinh dục đúng phương pháp là khâu rất quan trọng cho các nghiên cứu về sinh học sinh sản Theo Gibson và Ezzi (1978) thì sau khi thu mẫu tinh sào cần phải đo chiều dài (tính bằng mm), cân trọng lượng và cho vào cố định trong cồn 70% Buồng trứng sau khi thu cũng cần phải cân và đo sau đó xẻ dọc để cho dung dịch cố định thấm vào Để cố định trứng thì Simpson (1951) đề nghị dùng dung dịch “Gilson’s fluid” Dung dịch nầy không những có tác dụng cố định trứng

mà còn giúp phá vỡ các mô liên kết trong buồng trứng và làm tách rời trứng Để tách rời trứng khỏi các mô liên kết có thể cần giữ mẫu vài tuần trong dung dịch Gilson, lắc nhẹ lọ chứa trứng đến khi thấy hầu hết các trứng tách ra khỏi các mô của buồng trứng Loại bỏ các mô của buồng trứng và nếu như trứng còn dính nhau thì tiếp tục giữ trong dung dịch cố định Trứng đã tách rời phải được rửa sạch bằng cồn tuyệt đối và sau đó bảo quản trong cồn tuyệt đối cho các phân tích về sau (đo và đếm số trứng) Cách chuẩn bị dung dịch “Gilson’s fluid” như sau:

để trứng tách rời ra khỏi các mô cơ liên kết Dung dịch cố định cần được thay định

kỳ đến khi mẫu trứng được đem ra phân tích

4 Kỹ thuật cố định mẫu cho các nghiên cứu mô học

Đây là kỹ thuật rất cần thiết cho các nghiên cứu mô học trên các cơ quan khác nhau của cá Ống tiêu hóa và tuyến sinh dục là 2 cơ quan được nghiên cứu phổ biến nhất vì sự khác biệt về tổ chức mô của 2 cơ quan này sẽ giúp người nghiên cứu hiểu biết hơn về sự phát triển, tập tính dinh dưỡng và giai đoạn thành thục sinh dục của từng loài cá Kỹ thuật này cũng rất cần thiết cho các nghiên cứu về bệnh trên các loài thủy sản

Mẫu thu cho các nghiên cứu mô học phải là mẫu tươi được lấy từ cá mới được giết chết hay cá được gây mê Tùy loại mô và kích thước mẫu mà có các loại dung dịch cố định và thời gian cố định mẫu khác nhau Với các nghiên cứu về ống tiêu hóa, mẫu ống tiêu hóa của cá trưởng thành có thể được cố định bằng dung dịch Bouin trong thời gian 12 giờ sau đó chuyển sang bảo quản trong cồn 70%, với cá bột hay cá hương thì có thể cố định bằng dung dịch formol trung tính 10% Đối với mẫu buồng trứng thì cố định bằng dung dịch Bouin ít nhất 24 giờ sau đó chuyển sang bảo quản trong cồn 70% Mẫu cố định bằng dung dịch Bouin, khi bảo quản trong cồn 70% cần thay cồn nhiều lần cho đến khi màu vàng của dung dịch bảo quản được loại bỏ Một loại dung dịch cố định cũng thường được sử dụng (nhất là trong các nghiên cứu mô học trên tôm) là dung dịch AFA (alcohol – formalin – acid acetic), hàm lượng formalin và acid acetic có thể thay đổi tùy thuộc vào loại mẫu

- Dung dịch Bouin được chuẩn bị như sau:

Dung dịch axit picric bão hòa 750 mL

- Cách chuẩn bị dung dịch formol trung tính:

Sodium phosphate (NaH2PO4.H2O) 4 g Sodium phosphate (Na2HPO4) 6,5 g Hòa tan trong 750 mL nước cất, thêm vào 100 mL formol (37- 40%); sau đó thêm nước vào cho đủ 1000 mL

Chương 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU HÌNH THÁI

sự tương quan của các chỉ tiêu sẽ được trình bày trong chương này

I Nguyên lý trong đo mẫu cá

Đo mẫu cá là một trong các phương pháp của nghiên cứu hình thái cá, tùy theo kích cỡ cá mà có các phương pháp đo thích hợp để có được các số liệu chính xác Phương pháp căn bản dùng dùng bàn đo (board) (Hình 2.1), bàn đo được thiết kế gồm bàn bằng gỗ hay kim loại, bên trên bàn có gắn cố định một thước và phần đầu của bàn đo có một tấm chắn để khi đo đầu cá đặt chạm vào tấm chắn nầy Chiều dài của bàn đo tùy vào kích thước cá dự kiến sẽ đo

Hình 2.1: Dụng cụ dùng để đo cá (bàn đo cá)

Đối với các mẫu có lớn (lớn hơn 50 cm) thì có thể dùng thước để đo, tuy nhiên đối với cá có kích thước nhỏ có thể dùng thước đo (caliper) hay thước có phân cỡ Thông thường nên đo cá ngay tại nơi thu mẫu, lúc nầy cá còn tươi và ẩm, những mẫu cá bị khô có thể rất khó đo chính xác vì hình dáng của cá có thể bị biến dạng, nhất là không thể kéo thẳng để đo Trong trường hợp đo mẫu cá sống có kích cỡ lớn

Thanh chắn

Thước đo

thì rất cần thiết phải gây mê cá trong dung dịch Sandoz Ms 222 ở nồng độ thường dùng là 1/1.000, hoặc có thể dùng dung dịch 2 - phenoxy ethanol với hàm lượng từ

20 – 30 mL/100 L nước

II Đo chiều dài và trọng lượng cá

Thuật ngữ chiều dài của cá thường để chỉ chiều dài tổng cộng (chiều dài toàn thân) của cá Ngoài ra còn có các khái niệm khác như chiều dài chuẩn và chiều dài fork Chiều dài chuẩn thường được nhiều nhà nghiên cứu sử dụng, tuy nhiên khi thu mẫu với số lượng lớn và cần phải đo nhanh cá ở hiện trường thì khó thực hiện chính xác Chiều dài fork thường không thể dùng trong trường hợp các loài cá có vây đuôi không phân thùy như cá rô đồng chẳng hạn Chọn loại chiều dài nào để sử dụng tùy thuộc rất nhiều vào ý đồ của người nghiên cứu Phương pháp đo thường dùng là để sát đầu cá vào tấm chắn (phía tay trái), sau đó vuốt cá thẳng ra về phía tay phải và xác định chiều dài của cá dựa vào thước đã gắn trên bàn đo

Phương pháp xác định khối lượng cá thường dùng là cân, có thể cân đĩa hay cân thăng bằng và tùy theo trọng lượng của cá mà dùng cân có mức cân tương thích Cân thăng bằng thường ít được sử dụng do mất nhiều thời gian và độ chính xác cũng thấp Cân điện hiện đang được áp dụng phổ biến và cho kết quả chính xác hơn Xác định khối lượng cá cũng phải tùy vào tình trạng của cá (tươi hay đã qua cố định), trong trường hợp cá đã được cố định thì thường bị mất nước nên khối lượng thực của cá bị thay đổi và trong trường hợp nầy phải tìm hệ số qui đổi để có thể chuyển từ khối lượng cá đã cố định sang cá tươi Ngoài ra, trong một số trường hợp khi cân khối lượng cá cũng phải xem xét tính đồng nhất của mẫu cá cân (mức độ ẩm chẳng hạn) để giảm sai số Trong trường hợp không thể cân trực tiếp khối lượng cá thì có thể cân qua dụng cụ chứa cá, chẳng hạn dùng một dụng cụ chứa cá và cân khối lượng dụng cụ trước, sau đó cho cá vào cân lại Trọng lượng cá chính là phần chênh lệch giữa khối lượng dụng cụ và cá so với khối lượng dụng cụ

III Các chỉ tiêu hình thái

Các chỉ tiêu đo theo đề xuất của Lowe-McConnel (1971) và Grant & Spain (1977) trong nghiên cứu sinh học các gồm:

1 Chiều dài tổng cộng (total length): thể hiện giá trị lớn nhất của chiều dài

cơ thể cá từ đầu đến cuối cơ thể Nó là khoảng cách được xác định theo đường thẳng từ mút đầu (miệng cá) đến cuối của vi đuôi Trong trường hợp

cá có vi đuôi dạng phân thùy thì đo đến điểm mút cuối cùng của vi đuôi

2 Chiều dài fork (fork length): chiều dài fork được tính từ mút đầu (miệng

cá) đến giới hạn ngoài (điểm giữa) khía chữ V hoặc vị trí phân thùy của vi đuôi cá

3 Chiều dài chuẩn (standard length): chiều dài chuẩn được đo từ mút đầu

của cá (miệng) đến cuống vi đuôi (khớp vi đuôi và cơ thể cá) Vị trí này có thể nhận biết rõ khi bẻ đuôi cá sang 2 bên, một rãnh nhỏ sẽ được hình thành

4 Chiều dài đầu (head length): chiều dài đầu được xác định từ mút đầu

mõm (xương trước hàm) đến điểm cuối của xương nắp mang

5 Chiều dài trước vi lưng (pre-dorsal fin): chiều dài nầy được tính từ mút

đầu (miệng cá) đến gốc tia (gai) vi lưng đầu tiên

6 Chiều dài phần trước mắt hay dài mõm (pre-orbital hoặc snout length): khoảng cách từ mút đầu cơ thể đến rìa trước ổ mắt

7 Chiều rộng giữa 2 mắt (inter-orbital width): được xác định từ mặt lưng

của cơ thể, là khoảng cách từ rìa trên của ổ mắt trái đến rìa trên của ổ mắt phải Khoảng cách này còn được gọi là khoảng cách nhỏ nhất giữa 2 mắt

8 Chiều dài sau mắt (post-orbital length): Khoảng cách từ rìa sau ổ mắt

đến điểm cuối của xương nắp mang

9 Đường kính mắt: Khoảng cách từ mép trước đến mép sau của mắt theo

trục chiều dài thân

10 Chiều dài hàm trên (upper jaw length): khoảng cách giữa điểm mút

xương trước hàm và điểm cuối của xương hàm trước

11 Chiều dài hàm dưới (lower jaw length): khoảng cách giữa 2 điểm cuối

(điểm giao nhau của hàm trên và hàm dưới) dọc theo mép của hàm dưới

12 Chiều dài trước hậu môn (anal length): khoảng cách từ mút đầu cơ thể

đến giới hạn trước của lỗ hậu môn

13 Chu vi thân (girth length): vòng đo tại điểm rộng nhất của cơ thể (không

tính vi) Chỉ số này thỉnh thoảng được dùng để xác định mức độ thành thục của cá (đặc biệt là cá cái)

14 Chiều cao thân (body depth): là khoảng cách giữa mặt lưng và mặt bụng

tại điểm rộng nhất của cơ thể

15 Chiều cao đầu (head depth): khoảng cách thẳng đứng tính từ điểm sau

gáy (gốc sau của xương trên chẩm) đến mặt bụng của đầu

16.Độ rộng miệng (gape width): còn được hiểu như chiều rộng miệng, là

khoảng cách giữa 2 góc khi miệng cá đóng lại

17 Chiều cao vi lưng (dorsal fin height): chiều dài của tia vi lưng lớn nhất

hay của gai vi lưng

18 Chiều dài gốc vi lưng (dorsal fin base): khoảng cách giữa giới hạn trước

và sau của vi lưng dọc theo chiều dài của cơ thể

19 Chiều dài vi ngực (pectoral fin length): chiều dài lớn nhất của tia vi

ngực

20 Chiều rộng gốc vi ngực (pectoral fin base): khoảng cách giữa điểm trên

và dưới gốc vi ngực nơi các tia vi ngực đính vào

Hình 2.2: Một số chỉ tiêu hình thái của cá

21 Chiều dài vi hậu môn (anal fin length): chiều dài tia vi hậu môn dài

nhất

22 Chiều dài gốc vi hậu môn (anal fin base): khoảng cách từ điểm trước

đến điểm sau gốc vi hậu môn

23 Chiều dài vi bụng (ventral fin length): Chiều dài tia vi bụng dài nhất

24 Rộng gốc vi bụng (ventral fin base): khoảng cách giữa 2 giới hạn ngoài

gốc vi bụng

25 Chiều cao qua miệng (depth at mouth): khoảng cách giữa mặt lưng và

mặt bụng của đầu, xác định tại đường kẻ thẳng đứng qua góc sau miệng

26 Chiều cao qua mắt (depth at eye): khoảng cách giữa mặt lưng và mặt

bụng của đầu, xác định tại đường kẻ thẳng đứng qua mắt

27 Chiều cao thân qua vi lưng (depth at dorsal fin): chiều rộng cơ thể xác

định bằng đường kẻ thẳng đứng qua giới hạn trước gốc vi lưng

28 Chiều cao thân qua vi ngực (depth at pectoral fin): chiều rộng cơ thể

qua gốc vi ngực

29 Chiều cao thân qua hậu môn (depth at anus): chiều rộng cơ thể tại

đường kẻ thẳng đứng qua hậu môn

30 Chiều cao vi đuôi (caudal fin height): chiều rộng khi kéo căng các thùy

của vi đuôi ra

31 Chiều dài cuống đuôi (length of caudal peduncle): khoảng cách từ

điểm cuối gốc vi hậu môn đến điểm giữa khớp vi đuôi

32 Chiều cao nhỏ nhất cuống vi đuôi (least height of the caudal peduncle): cũng là thuật ngữ chỉ chiều cao nhỏ nhất của cơ thể Là chiều

cao nhỏ nhất của cuống vi đuôi trong khoảng giữa điểm cuối gốc vi hậu môn và điểm xuất phát của vi đuôi Thực tế, nó là chiều rộng của cuống đuôi tại vị trí xương gốc vi đuôi

Sơ đồ minh họa cho các chỉ tiêu đo được thể hiện trong hình 2.2 và 2.3

Hình 2.3: Các chỉ tiêu đo ở cá

Trong đó:

TL: chiều dài tổng cộng; FL: chiều dài fork; SL: chiều dài chuẩn; BD: chiều cao thân; HL: chiều dài đầu; PD: chiều dài trước vi lưng; PO: dài mõm; PtO: dài đầu sau mắt; ED: đường kính mắt; AL: chiều dài trước hậu môn; IW: chiều rộng giữa 2 mắt; HPC: chiều cao nhỏ nhất cuống vi đuôi; HD: chiều cao vi lưng; BDF: chiều dài gốc vi lưng; PFL: chiều dài

vi ngực; PFB: chiều rộng gốc vi ngực; VFL: chiều dài vi bụng; BV: chiều dài gốc vi bụng; AFL: chiều dài vi hậu môn; AFB: chiều dài gốc vi hậu môn

IV Các chỉ tiêu số lượng

Các chỉ tiêu số lượng là các chỉ tiêu sinh học có thể đếm được như số đốt sống, tia vi, vảy, sức sinh sản (Holden và Raitt, 1974) Để thuận tiện cho việc minh họa, chúng ta hãy xét trường hợp đơn giản là đếm số lượng tia vi (công thức vi) và vảy

Có 2 dạng tia vi – tia vi đơn hay gai vi và tia vi kép (phân nhánh) hay tia vi mềm Với các mẫu cá lớn, có thể dễ dàng phân biệt các gai và tia vi, tuy nhiên với các mẫu cá nhỏ việc quan sát bằng kính hiển vi là cấn thiết để phân biệt tia vi mềm

và gai cứng Các ký tự như D, P, V, A, C, Ll, L.tr được sử dụng để biểu thị cho vi lưng, vi ngực, vi bụng, vi hậu môn, vi đuôi, vảy đường bên, và vảy ngang đường bên Dấu gạch chéo (/) được dùng để tách biệt giữa gai vi cứng và tia vi mềm Thỉnh thoảng những gai cứng được biểu thị bằng chữ số La mã và tia vi mềm được biểu thị bằng chữ số A rập Thông thường phần phân nhánh của tia vi cuối cùng của

vi lưng và vi hậu môn kéo dài đến tận gốc vi, như vậy cả 2 nhánh này phải được tính như 1 tia vi Hãy xem một số thí dụ minh họa về công thức vi được trình bày dưới đây:

i) D 2/9 – 11: nghĩa là vi lưng có 2 gai cứng và có từ 9-11 tia vi mềm

ii) D1 1/4, D2 5: nghĩa là vi lưng thứ I có 1 gai cứng và 4 tia vi, vi lưng thứ II

có 5 tia vi và không có gai cứng

iii) D 2/15/0: Nghĩa là vi lưng thứ nhất có 2 gai cứng và 15 tia vi trong khi vi lưng thứ II thì không có gai và tia vi

iv) P 12 – 14: nghĩa là vi ngực có từ 12 đến 14 tia vi nhưng không có gai cứng

Vảy đường bên (Ll) là các vảy có lỗ (hoặc răng cưa) nằm dọc theo đường bên (từ góc trên nắp mang đến gốc vi đuôi) Thông thường vảy đường bên không liên tục, trong trường hợp này L.r sẽ được dùng biểu thị công thức vảy thay thế cho Ll Vảy ngang đường bên (L.tr.) được đếm như sau: các vảy bên trên đường bên được đếm từ trên xuống và về phía sau bắt đầu từ khởi điểm gốc vi lưng cho đến vảy đường bên; các vảy dưới đường bên được đếm từ dưới lên trên và về phía trước bắt đầu từ khởi điểm gốc vi hậu môn (Hình 2.2) Thí dụ L.tr 14 có thể được viết thành 8/1/5 hoặc 8½ /5½

V Các chỉ số sinh trắc

Theo Tobor (1974) mỗi chỉ tiêu cơ thể (dài đầu, đường kính mắt, cao thân, ) trong một mối tương quan với chiều dài cơ thể được xem như một chỉ số sinh trắc (biometric index) Trong mỗi chỉ số liên hệ giữa chỉ tiêu cơ thể với chiều dài (chiều dài đầu/đường kính mắt; chiều dài tổng cộng/chiều dài đầu ), giá trị trung bình của chỉ số sinh trắc sẽ được xác định Theo Bayagbona (1963), nếu trong tất cả các

nhóm kích cỡ cá nghiên cứu, chỉ số sinh trắc của mỗi đặc điểm riêng (chỉ tiêu) biểu hiện một tỉ lệ giảm liên tục, lúc đó đặc điểm khảo sát thể hiện một mối tương quan thuận (+), trái lại thì đặc điểm khảo sát thể hiện mối tương quan nghịch (-) Nếu chỉ

số sinh trắc không biến đổi nghĩa là sự phát triển của chỉ tiêu khảo sát trong mối liên hệ với chiều dài là một tương quan đồng đẳng (Hình 2.4)

Hình 2.4: Chỉ số sinh trắc của cá Labeo pangusia

Trong đó:

A: Tương quan thuận (+) B: Tương quan nghịch (-) C: Tương quan đồng đẳng

Khi nghiên cứu về trắc lượng hình thái và các chỉ tiêu số lượng, phương pháp hồi qui sẽ được sử dụng với phương trình hồi qui dạng:

8

HL/ED TL/HL TL/BD

Giá trị a và b được xác định bằng công thức sau:

n: tổng số nhóm chiều dài khảo sát

x : giá trị trung bình của x y: giá trị trung bình của y

VI Tương quan chiều dài trọng lượng và hệ số điều kiện

1 Tương quan chiều dài và trọng lượng

Có một nguyên lý chung đó là sự tăng trưởng của cá và các sinh vật khác có ảnh hưởng đến chiều dài của chúng Vì thế, có thể nói rằng chiều dài và tăng trưởng của của loài có mối tương quan với nhau Huxley (1924) đã đề xuất công thức sinh truởng của cá qua mối quan hệ giữa chiều dài và trọng lượng theo công thức:

W = aLb

Trong đó:

W: là trọng lượng L: chiều dài a: là hằng số tăng trưởng ban đầu b: hệ số tăng trưởng

Le Cren (1951) đã chuyển đổi phương trình trên thành dạng log như sau:

log W = log a + b log L

Giá trị a và b được xác định bằng công thức sau:

Vì thế khi biết được giá trị của a và b có thể tìm được trọng lượng của cá và ngược lại Đường hồi qui của log W theo log L phải được tính bằng phương pháp bình phương nhỏ nhất (least squares) bằng cách chia các số liệu khảo sát thành các nhóm nhỏ theo các nhóm kích cỡ Số lượng nhóm phụ thuộc vào sự biến động về kích cỡ của mẫu thu được Tuy nhiên số lượng nhóm không được dưới 10 nhóm Số liệu phải được thu trọn năm và sự phân chia có thể theo nhóm chiều dài, nhóm giới tính và mùa vụ,… để có thể thấy được sự thay đổi

Hệ số tương quan r được dùng để kiểm tra mức độ chặt chẽ của đường hồi qui

Bên cạnh mối tương quan giữa chiều dài và trọng lượng, thì từng cá thể cũng

có những biến động trong quá trình sinh trưởng Sự biến động cá thể được phân tích thông qua một chỉ số gọi là hệ số điều kiện (condition factor hay K-factor) và có

nhiều cách tính toán khác nhau Tuy nhiên, Hile (1936) và Beckman (1948) đề nghị công thức dưới đây để tính hệ số điều kiện :

K = (W x 105) / L3

Trong đó:

K: hệ số điều kiện W: khối lượng cá L: chiều dài của cá

105 là hệ số làm cho hệ số điều kiện K trở nên gần đồng nhất (Carlander, 1970) Hệ số điều kiện của cá bị ảnh hưởng bởi sự thay đổi của tuyến sinh dục theo mùa và lượng thức ăn Vì thế, khi tính toán hệ số điều kiện không nên dùng tổng khối lượng mà nên dùng khối lượng không nội tạng (nominal body weight), vì nó không bị ảnh hưởng bởi tuyến sinh dục và dạ dày (Papageorgiou, 1979) Khối lượng không nội tạng (Wn) được tính toán bằng cách lấy tổng khối lượng trừ đi khối lượng tuyến sinh dục (Wg) và dạ dày (Ws):

Wn = W – (Wg + Ws)

Hệ số điều kiện nên được tính toán theo mùa, theo giới tính và theo nhóm kích

cỡ để xem có hay không sự biến động về giá trị của hệ số K

23

Bài giảng Phương pháp nghiên cứu sinh học cá

Chương 3 KỸ THUẬT NGHIÊN CỨU MÔ HỌC

I Giới thiệu

Việc nghiên cứu tế bào và mô học bắt đầu từ thế kỷ XVII nhưng mãi đến gần cuối thế kỷ XIX, Tế bào học và Mô học mới thực sự được coi là ngành khoa học Cuối thế kỷ XIX, sau khi học thuyết tế bào ra đời thì ngành Mô học mô tả bắt đầu phát triển mạnh Những thành phần cấu tạo khác nhau của các cơ quan và các mô đã được nghiên cứu cẩn thận Những thành công lớn lao trong kỹ thuật mô học nữa thế

kỷ XIX như việc chế tạo ra máy cắt lát mỏng (microtone), cho phép người ta nghiên cứu tỉ mỉ cấu trúc vi thể của tế bào và mô Những kết quả đạt được trong lĩnh vực nghiên cứu cấu tạo vi thể tế bào đã cho phép người ta tách việc nghiên cứu tế bào thành một phần riêng biệt trong Mô học gọi là Tế bào học Học thuyết tế bào không chỉ là cơ sở của việc nghiên cứu cấu tạo mô bình thường mà còn là cơ sở của viêc nghiên cứu những thay đổi bệnh lý của mô, cơ quan và đồng thời nó cũng là cơ sở của việc nghiên cứu những hoạt động sinh lý

Mô học, một môn học của Sinh học và là khoa học nghiên cứu của sự phát triển, cấu tạo và hoạt động của các mô, các cơ quan, các bộ máy của cơ thể Mô học

có quan hệ qua lại với nhiều môn học khác trong ngành Sinh học như Hình thái học, Sinh lý học, Phôi học Trong chương này giới thiệu những kỹ thuật cần thiết để nghiên cứu mô, và mức độ nhỏ hơn là tế bào

II Phương pháp và kỹ thuật nghiên cứu mô

Tế bào và mô phải được quan sát bằng các loại kính hiển vi, do đó khi nghiên cứu mô và tế bào cần phải cắt mẫu với các độ dầy thích hợp đảm bảo cho ánh sáng xuyên qua trong quá trình quan sát dưới kính hiển vi Qui trình xử lý mẫu và tạo tiêu bản bắt đầu từ cố định mẫu, cắt tỉa định hướng mẫu, khử nước, ngấm mẫu trong paraffin, đúc khối và cắt lát mỏng, dán lát cắt vào lam và nhuộm màu Phủ lamelle lên tiêu bản, lúc này lát cắt có thể quan sát được dưới kính hiển vi Tương tự, qui trình xử lý mẫu bằng kỹ thuật lạnh cũng có thể được áp dụng Qui trình này tương đối đơn giản hơn, mẫu được đông lạnh nhanh, cắt, nhuộm, phủ lamelle lên tiêu bản Phương pháp này được ứng dụng trong các nghiên cứu về các enzyme nội tiết vì các enzyme dễ bị mất đi trong phương pháp xử lý mẫu thông thường, nhưng kết quả xử

24

Bài giảng Phương pháp nghiên cứu sinh học cá

lý mẫu thường không ổn định và khó nhận biết được các cấu trúc chi tiết, qui trình

xử lý mẫu vì thế phụ thuộc vào từng trường hợp nghiên cứu cụ thể

Sơ đồ các bước xử lý mẫu trong nghiên cứu mô học như trong hình 3.1

QUI TRÌNH XỬ LÝ MẪU

Hình 3.1: Sơ đồ các bước trong qui trình xử lý mẫu (Hinton, 1990)

Đúc khối Cắt mẫu Dán tiêu bản Khử nước

Nhuộm Hoàn tất tiêu bản

25

Bài giảng Phương pháp nghiên cứu sinh học cá

Mẫu mô hay cơ quan của cá hoặc tôm sau khi tách ra khỏi cơ thể sẽ chết đi và trải qua quá trình hoại tử (tự phân hủy) và nhanh chóng tan rã (Trump và ctv, 1980)

vì vậy cần phải ngăn chặn sự hoại tử và tan rã đó bằng việc cố định nhanh và ít gây

ra sự thay đổi cấu trúc nhất Ngoài tác dụng ngăn chặn quá trình hoại tử, việc sử dụng các loại hóa chất cố định còn giúp cho các tổ chức mô giữ vững cấu trúc trong suốt quá trình xử lý và nhuộm mẫu bằng nhiều loại hóa chất khác nhau

Một mẫu mô được cố định tốt khi những tế bào cấu tạo nên mô đó vẫn giữ nguyên hình dáng, không có sự thay đổi bào tương, không bị trương lên, không bị

co lại, làm thể hiện được nhiều chi tiết và cấu trúc, đồng thời giữ được mối liên quan tương hỗ trong tế bào và trong mô giống như còn sống

Các loại hóa chất cố định mẫu

Có thể cố định tế bào và mô bằng nhiều cách như phương pháp vật lý (bằng nhiệt độ), phương pháp hoá học (bằng hoá chất) Cố định tế bào và mô bằng hóa chất là tốt hơn cả Có nhiều loại dung dịch hóa chất dùng để cố định mẫu, trong đó một số dung dịch hoá chất thường sử dụng là:

- Formalin trung tính 10%

- Dung dịch cố định Bouin

- Và hỗn hợp của cồn, acid acetic, và formalin với các tỉ lệ pha trộn khác nhau (Hopwood, 1977; Coolidge và Howard, 1979; Humason, 1979; Clark, 1981)

Chọn dung dịch cố định

Các dung dịch cố định có rất nhiều, mỗi loại dung dịch cố định thích hợp cho việc cố định loại mô và cơ quan khác nhau Vì vậy việc chọn dung dịch cố định phụ thuộc mô cần cố định và vào mục đích nghiên cứu Thí dụ như khi nghiên cứu sự phát triển của tuyến sinh dục của cá hoặc tôm hoặc cua dung dịch Bouin thường được sử dụng; khi nghiên cứu nhân tế bào người ta thường dùng dung dịch có chứa acid acetic, đối với tôm sử dụng dung dịch cố định Davidsion' AFA là tốt nhất Mặc khác cũng tùy thuộc vào loại thiết bị quan sát (kính hiển vi quang học hay kính hiển vi điện tử) mà dung dịch cố định mẫu cũng sẽ khác nhau Với kính hiển vi điện

tử dung dịch cố định thường được sử dụng là hỗn hợp của formalin và các aldehyde

26

Bài giảng Phương pháp nghiên cứu sinh học cá

khác Aldehyde có tác dụng liên kết protein, trong khi hỗn hợp cồn và acid acetic (được gọi là coagulant) là protein biến dạng hoặc kết tủa protein thành một dạng như bọt xốp hay dạng lưới để liên kết các thành phần khác của tế bào

Phương pháp cố định: Tuỳ theo từng loại mô mà có cách xử lý khác nhau

Kích thước của mẫu mô có ảnh hưởng đến kết quả cố định Đối với loại dung dịch cố định có khả năng ngấm kém, chiều dầy mẫu mô không quá 1-2 mm Nếu dung dịch có khả năng ngấm mạnh và sâu thì chiều dài của mô cũng không quá 5

mm Theo Gabe (1976) chiều dầy của mẫu mô tốt nhất là nhỏ hơn 3 mm Diện tích

bề mặt mẫu mô không ảnh hưởng tới sự cố định

Khối lượng dung dịch cố định: thể tích dung dịch cố định cần lớn hơn nhiều lần so với thể tích mẫu mô (ít nhất 50 lần)

Thời gian cố định: Thời gian cố định phụ thuộc vào từng loại dung dịch, thường dao động từ 4-24 giờ Trên nguyên tắc kéo dài thời gian cố định tốt hơn rút ngắn Đối với dung dịch làm giòn mô thì phải đúng thời gian cố định Cố định quá dài làm thay đổi tính bắt màu của tế bào Cố định lâu quá làm nhân kém bắt màu

Nhiệt độ cố định: Nhiệt độ cao làm tăng và lạnh làm chậm khả năng ngấm của dung dịch cố định Đối với loại dung dịch cố định dễ bay hơi nên tiến hành ở nhiệt

độ thấp

Khi thực hiện các bước của qui trình mô học cần phải có sự cẩn thận để đảm bảo sự an toàn Quá trình cố định, pha chế hóa chất và nhuộm mẫu tốt nhất thực hiện trong tủ hút Cần mang găng tay, khẩu trang trong suốt quá trình làm việc trong phòng thí nghiệm Acid piric, thành phần chủ yếu trong dung dịch cố định Bouin, là chất dễ nổ khi ở trạng thái khô vì vậy cần giữ trong điều kiện ẩm ướt, tốt nhất là là bảo quản trong nước cất (Brown 1969)

Rửa mô sau khi cố định

Rửa mô sau khi cố định có tầm quan trọng lớn vì chất cố định có ảnh hưởng đến quá trình nhuộm màu và bảo tồn phiến đồ Thời gian rửa bằng thời gian cố định nếu rửa bằng nước; hoặc rửa trong cồn 50%; sau đó chuyển sang cồn 7% để bảo quản trong thời gian dài

27

Bài giảng Phương pháp nghiên cứu sinh học cá

2 Cắt tỉa và định hướng cho mẫu mô đã được cố định (Trimming and

Orientation)

Mẫu mô đã cố định thường phải được cắt tỉa trước khi đúc khối, việc xác định chính xác mẫu (tổ chức mô) cần quan sát không những tiết kiệm được thời gian, chi phí, mà còn làm nổi bật lên cấu trúc của mẫu vật Mẫu mô đã được cố định phải rắn chắc, từng cơ quan riêng biệt hoặc cả một mẫu cá nhỏ có thể được cắt tỉa bằng lưỡi dao cạo hoặc dao mổ để đạt được kích cỡ mong muốn và cắt bỏ những mô không có

ý định nghiên cứu hoặc dành cho các nghiên cứu khác Mẫu mô có thể được cắt đôi theo chiều nằm ngang, hoặc cắt thẳng đứng dọc ở giữa

3 Loại nước, làm trong mẫu, ngấm paraffin (Dehydration, Clearing,

mô

Sau khi hoàn thành quá trình khử nước, cồn cũng cần phải loại ra khỏi mẫu

mô bởi vì cồn không thể hoà lẫn với paraffin (Drury và Wallington 1980, Gabe 1976) Nếu không loại bỏ hết cồn, phần mô đó sẽ bị co rút lại, khối mẫu đúc trong paraffin sẽ không đồng nhất, tạo nên những lỗ hỗng trên lát cắt Do đó cần làm ngấm vào trong mẫu mô một loại dung môi trung gian có thể hoà tan được parffin

và cồn Quá trình này được gọi là quá trình làm trong (clearing) mẫu vì phần lớn các loại hóa chất sử dụng cho mục đích này thường có chỉ số khúc xạ cao và làm cho mẫu trở nên trong suốt Mục đích chính của bước này là dùng dung môi hoà tan paraffin để đẩy cồn ngấm trong mô ra Dung môi được sử dụng thường là các dung môi hữu cơ như, xylen, toluen, benzen Xylen là loại dung môi thường được sử dụng nhất do tính thấm nhanh Thời gian làm ngấm dung môi hoà tan paraffin tuỳ thuộc vào kích thước mẫu mô, thông thường mẫu mô cần ngâm trong 3 lọ khoảng

từ 30 phút đến 2 giờ

28

Bài giảng Phương pháp nghiên cứu sinh học cá

Sau khi làm trong, mẫu mô sẽ được chuyển sang bước ngấm paraffin (infiltration) Mẫu được ngâm trong các lọ paraffin nóng chảy (57 – 60o) với thời gian thay đổi từ 1 đến 3 giờ tuỳ theo kích thước mẫu mô Đối với những mô ngấm chậm phải kéo dài thời gian ngâm trong paraffin có thể ngâm từ 6 đến 12 giờ Sự ngấm paraffin sẽ không thành công nếu quá trình khử nước, khử cồn trong mô không tốt Việc chuyển mẫu mô qua nhiều lọ paraffin là nhằm mục đích để cho dung môi của paraffin trong miếng mô được đẩy ra hết

Bảng 3.1: Qui trình xử lý mẫu

Từ giai đoạn cố định mẫu đến giai đoạn ngấm paraffin, mẫu mô có thể được

xử lý bằng một trong 2 qui trình: xử lý bằng tay hoặc xử lý tự động bằng máy Trong các bước xử lý, mỗi bước lập lại có nghĩa là phải có sự thay đổi dung dịch xử

lý Nhiệt độ xử lý mẫu là nhiệt độ trong phòng, trừ các giai đoạn cần thiết xử lý ở nhiệt độ cao

1 Qui trình xử lý bằng tay (Brown 1969)

29

Bài giảng Phương pháp nghiên cứu sinh học cá

2 Qui trình xử lý mẫu bằng máy tự động (Coolidge và Howard, 1979)

30

Bài giảng Phương pháp nghiên cứu sinh học cá

trí) việc làm lạnh khuôn có thể được thực hiện trong quá trình đúc khối Khi miếng

mô đã được vùi vững chắc vào paraffin, làm rắn paraffin lại bằng cách đặt khuôn vào trong tủ lạnh, sau đó tách khối paraffin ra khỏi khuôn Ngoài paraffin, một vài chất khác cũng được dùng để đúc khối, thí dụ epoxy resin cũng dùng để đúc khối khi cần quan sát mẫu dưới kính hiển vi điện tử

Trở ngại chính trong quá trình đúc khối paraffin là làm miếng mô co lại, nguyên nhân là do nhiệt độ nóng chảy của paraffin (Bennett & ctv, 1976) Các nhà nghiên cứu đã so sánh mức độ ảnh hưởng của chất dùng để đúc khối đến sự thay đổi của mẫu mô, thí dụ trường hợp của gan cá hồi nếu được đúc khối theo kỹ thuật thường sử dụng là bằng paraffin thì mức độ co của mẫu mô so với ban đầu khoảng 25%, trái lại nếu đúc khối bằng glycol methacrylate thì mẫu mô chỉ co lại khoảng 1- 2% (Hampton 1986)

Khi cần phân tích các thể huyền phù trong tế bào bằng kính hiển vi quang học thì một số kỹ thuật trong qui trình xử lý mẫu sẽ được thay đổi Thí dụ như khi nghiên cứu tế bào máu người ta sử dụng phương pháp xét nghiệm kính phết (mẫu của một chất được phết lên phiến kính để soi trên kính hiển vi) khi đó thì mẫu được

cố định và nhuộm trực tiếp trên phiến kính (Humason 1979) Khi nghiên cứu dịch huyền phù của tế bào (thí dụ trong nuôi cấy mô), thì quá trình cố định được thực hiện bằng việc thêm một lượng chất cố định bằng thể tích của mẫu cần cố định Sau mỗi bước của quá trình khử nước, dịch huyền phù được ly tâm nhẹ để cô đặc tế bào

và nước được gạn chắt khỏi dịch huyền phù Với qui trình này, dịch huyền phù trong tế bào được loại nước, làm trong, và được đúc khối trong môi trường thích hợp Tất cả các qui trình tiếp theo được thực hiện theo các bước của qui trình truyền thống

5 Phương pháp cắt mẫu (Sectioning)

Mục đích của bước này là nhằm cắt mẫu mô thành những lát thật mỏng có khả năng cho ánh sáng xuyên qua để có thể quan sát bằng kính hiển vi Có nhiều phương pháp và nhiều loại máy (microstome) để cắt mẫu Máy cắt quay với lưỡi dao thép, hay lưỡi dao mỏng đặc biệt thường được sử dụng nhất Có 2 phương pháp cắt mẫu thường được áp dụng

Cắt lạnh (frozen sectioning)

Đây là phương pháp chuẩn bị mẫu mô nhanh nhất và hạn chế được các khiếm khuyết nhân tạo hình thành trên mẫu mô do ảnh hưởng của quá trình xử lý mẫu

31

Bài giảng Phương pháp nghiên cứu sinh học cá

Mẫu được cắt bằng máy cắt lạnh (freezing microtome), thường thì khí CO2 hóa lõng được dùng để làm lạnh mẫu và máy cắt Tuy nhiên trong phương pháp cắt lạnh, các lát cắt không tạo thành một dãy băng như khi cắt mẫu đúc trong paraffin, mặt khác khó có thể cắt thành các lát cắt mỏng hơn 3 m Formal-saline là chất cố định tốt nhất cho mẫu cắt lạnh, khối mẫu có thể đặt trực tiếp vào máy cắt mà không cần đúc khối Tuy nhiên, trong vài trường hợp, để tránh làm lát cắt vỡ vụn, mẫu mô có thể được đúc khối trong gelatine hay agar (Drury và Wallington, 1980)

Cắt mô đúc trong khối paraffin

Với máy cắt quay người ta có thể điều chỉnh độ dầy của lát cắt và điều chỉnh hướng của lưỡi dao Lưỡi dao là phần quan trọng nhất trong việc cắt mẫu Muốn có những lát cắt đẹp phải có lưỡi dao sắc, nên dùng lưỡi dao có sống dầy để tránh sự rung động khi cắt Quá trình cắt gồm các giai đoạn đoạn:

Chuẩn bị máy cắt

Đặt dao vào máy cắt, vặn ốc thật chặc Độ lệch của lưỡi dao với mặt cắt của khối mẫu tạo thành một góc khoảng 15-300 Khối mẫu sẽ được cắt thành các lát cắt khi tay quay của máy cắt xoay tròn, mỗi một vòng xoay thì một lát cắt được hình thành

Cắt mẫu

Trước khi tiến hành cắt, phải điều chỉnh độ dầy của lát cắt Có thể bắt đầu bằng những lát cắt 10-12 m Sau khi đã cắt bằng mặt khối nến và đạt đến vị trí mong muốn, điều chỉnh độ dầy theo từng nghiên cứu cụ thể, thông thường là từ 4-6

m Độ dầy lát cắt của hệ thần kinh kể cả tủy sống là 10-20 m, của thận là 1-2 m Nếu việc đúc khối với paraffin được thực hiện tốt, lưỡi dao sắc, nhiệt độ trong phòng thích hợp, các lát cắt sẽ nối tiếp sẽ dính vào nhau thành một dãy băng dài Sự dính thành dãy băng thể hiện sự thành công của kỹ thuật cắt mẫu và là ưu điểm của phương pháp cắt mẫu đúc trong khối paraffin, đặc biệt là trong các trường hợp cần nghiên cứu những phiến đồ nối tiếp nhau theo thứ tự

Dán lát cắt vào phiến kính (slide)

Khi dãy băng các lát cắt dài từ 10-15 cm, chúng sẽ được lấy ra khỏi lưỡi dao một cách nhẹ nhàng, cẩn thận bằng cách chèn kim giải phẩu vào giữa lát cắt và dao cắt Đặt tạm cả phiến băng lên giấy vẽ đen và tách các lát cắt ra với độ dài thích hợp

32

Bài giảng Phương pháp nghiên cứu sinh học cá

(phụ thuộc vào phiến kính hay vào mục đích của nghiên cứu) Sau đó đặt lát cắt nổi trong một chậu nước ấm (40 - 44oC) để giúp các lát cắt giãn thẳng ra trước khi dán vào phiến kính

Có nhiều cách để dán lát cắt vào phiến kính, cách thông dụng nhất là dán bằng dung dịch Mayer's albumen hoặc gelatin (Luna, 1968; Humason, 1979; Coolidge và Howard, 1979) Đối với dung dịch albumen, cho một giọt rất nhỏ dung dịch lên phiến kính, dùng tay xoa đều để tạo thành một màng mỏng albumen trên phiến kính Sau khi làm giản thẳng lát cắt trong chậu nước ấm, nhúng phiến kính vào chậu nước

ấm ngay bên dưới lát cắt Cẩn thận đính một đầu của lát cắt vào phiến kính, điều chỉnh lát cắt đúng hướng, từ từ rút phiến kính khỏi nước, lát cắt sẽ được dán chặt vào phiến kính Đối với dung dịch gelatin thì đơn giản hơn, cho dung dịch gelatin vào thẳng trong chậu nước ấm (40 - 45oC) lát cắt sẽ được thả nổi trong dung dịch này và cách dán lát cắt được thực hiện tương tự

Cách chuẩn bị các dung dịch để dán mẫu như sau:

i) Dung dịch Mayer's albumen: lòng trắng trứng và glycerol với tỉ lệ 1:1

theo theo thể tích Trộn đều sau đó lọc qua giấy lọc thô hay bông gòn, quá trình lọc có thể thực hiện nhanh bằng cách nâng nhiệt độ của hỗn hợp lên

55 – 60oC Thêm vào một ít tinh thể thymol để ngăn vi sinh vật phát triển (Kiernan, 1990)

ii) Dung dịch gelatin: Dung dịch 1% gelatin và 1% potassium dichromate

được trộn đều với nhau theo tỉ lệ 1:1 Cho dung dịch này vào chậu nước ấm

để tạo thành dung dịch 0,002% cho mỗi chất (Drury và Wallington, 1980)

Phiến kính cần phải được làm sạch trước khi dán lát cắt vào Sau khi dán lát cắt vào tiến hành làm khô phiến kính bằng cách sấy khô phiến kính 12 giờ (1 đêm) trong tủ sấy ở nhiệt độ 37oC, hoặc sấy khô bằng bàn sấy ở nhiệt độ 58-60oC để loại

bỏ paraffin

6 Nhuộm màu (Staining)

Nhuộm màu là một kỹ thuật quan trọng để nghiên cứu tế bào và mô bằng kính hiển vi Ở tế bào sống, các thành phần cấu tạo tế bào và mô có chỉ số chiết quang gần giống nhau nên khó phân biệt dưới kính hiển vi quang học Khi nhuộm màu, các thành phần này bắt màu khác nhau, tạo ra độ tương phản giữa các thành phần Mặt khác, mỗi thành phần của tế bào và mô có ái lực đối với một loại thuốc nhuộm

33

Bài giảng Phương pháp nghiên cứu sinh học cá

nên khi được nhuộm màu, mỗi thành phần có một màu đặc biệt, căn cứ vào đó người nghiên cứu sẽ phân biệt được chúng

Có nhiều phương pháp để nhuộm mẫu, tuỳ thuộc mục tiêu nghiên cứu và loại

tổ chức (mô, tế bào) mà có thể áp dụng phương pháp thích hợp Qui trình chung cho việc nhuộm mẫu gồm các bước sau:

i) Loại bỏ paraffin: do paraffin rất khó thấm (hoặc không thấm được) các

loại thuốc nhuộm, nên cần phải loại chúng ra khỏi mẫu Xylen là loại hóa chất thường được sử dụng cho mục đích này, mẫu sẽ được nhúng qua các

lọ xylen trong vài phút

ii) Loại bỏ xylen bằng cồn tuyệt đối: xylen không hòa tan được trong các

dung dịch có nước do đó cần loại xylen ra khỏi mẫu

iii) Xử lý mẫu qua cồn với nồng độ giảm dần: nhằm làm giảm các dòng

nước khuyếch tán, tránh sự co giản đột ngột có thể làm cho mẫu bị vỡ vụn

và tách rời khỏi phiến kính, mẫu sẽ được nhúng qua một loạt dung dịch cồn với nồng độ giảm dần từ 95, 70, 50% (có thể đến 30%)

iv) Làm cho mẫu ngậm nước: là bước trung gian để chuyển mẫu về cùng

điều kiện với dung môi hòa tan loại thuốc nhuộm được sử dụng đầu tiên Thông thường nước cất được sử dụng cho mục đích này Trong trường hợp dung môi hòa tan thuốc nhuộm là cồn, chuyển mẫu trực tiếp từ bước (iii) sang dung dịch thuốc nhuộm tại điểm có nồng độ cồn tương đương

v) Nhuộm màu: mẫu được nhuộm bằng 1 dung dịch (đơn chất hay hỗn hợp)

hoặc bằng nhiều loại thuốc nhuộm khác nhau Thời gian nhuộm mẫu có thể từ vài phút đến vài giờ tùy vào loại thuốc nhuộm

vi) Khử nước: Hầu hết các trường hợp, lát mẫu cắt trong paraffin phải được

cố định và bảo quản trong một môi trường có thể hòa tan với xylen Vì vậy, cần thiết phải loại nước ra khỏi mẫu bằng cồn trước khi chuyển mẫu sang xylen Hơn nữa lát cắt cũng sẽ không trong suốt nếu việc khử nước không tốt, các vết mờ đục và các giọt nước nhỏ xung quanh lát cắt là biểu hiện của việc khử nước không hoàn chỉnh

vii) Làm trong mẫu: Mẫu được làm trong và cồn được loại hoàn toàn ra khỏi

lát cắt khi nhúng mẫu vào trong xylen Nếu lát cắt vẫn còn vết mờ đục hay

34

Bài giảng Phương pháp nghiên cứu sinh học cá

việc khử nước chưa tốt, cần thiết phải chuyển mẫu trở lại cồn tuyệt đối Một vài loại thuốc nhuộm như eosin thì có thể hòa tan một ít trong xylen mặc dù không thể quan sát rõ ràng cả sau khi ngâm mẫu vài giờ trong xylen

viii)Đóng khung: Sau khi nhuộm, phủ một phiến kính mỏng lên trên lát cắt để

bảo quản và duy trì mẫu lâu dài Dung môi dùng để đóng khung thường là loại chất lõng sánh đặc, dễ đông cứng lại và phải thỏa mãn các điều kiện (i) giữ mẫu sạch và trong suốt, (ii) không làm đổi màu sắc hay phản ứng với phẩm nhuộm và (iii) giữ cố định phiến kính phủ trên mẫu Độ chiết quang của dung môi thì tương đương với độ chiết quang của thủy tinh Keo Canada là loại dung môi thường được sử dụng nhất

Bảng 3.2: Kỹ thuật nhuộm mẫu bằng Mayer's Hematoxylin và Eosin (Hinton, 1990)

1 Mayer's H&E là phương pháp nhuộm thường được áp dụng cho hầu hết các loại tổ chức mô

2 Áp dụng cho mẫu mô được cố định bằng các loại dung dịch cố định thông thường

3 Qui trình nhuộm được tiến hành với mẫu cắt trong paraffin, lát cắt được loại paraffin bằng cách sấy qua đêm ở nhiệt độ 56 – 60oC

4 Phiến mẫu sau khi loại paraffin sẽ được làm ngậm nước theo các bước sau

a Nhúng phiến mẫu vào xylen 2 – 3 phút

b Chuyển sang xylen sạch 1 – 2 phút

c Nhúng trong cồn tuyệt đối 1 – 2 phút

d Chuyển lần lượt sang các dung dịch cồn 95%, 70%, và 50%, 1 phút cho mỗi dung dịch

e Rửa mẫu trong nước cất

5 Chuẩn bị phẩm nhuộm (cần thiết chuẩn bị trước) và nhuộm mẫu

a Mayer's Hematoxylin: Hòa tan 1 g tinh thể hematoxylin trong 750 mL nước cất Thêm vào 0,2 g sodium iodate (NaIO3); 1 g acid citric và 50 g chloral hydrate Thêm nước vào cho đủ 1 lít

35

Bài giảng Phương pháp nghiên cứu sinh học cá

b Dung dịch chuẩn 1% eosin: 1 g eosin Y, 20 mL nước cất và 80 mL cồn (ethanol) 95% Dung dịch nhuộm eosin được chuẩn bị như sau: 1 thể tích dung dịch chuẩn 1% eosin + 3 thể tích cồn 80% Trước khi sử dụng thêm vào 0,5 mL acid acetic cho mỗi 100 mL dung dịch nhuộm eosin

c Nhúng phiến mẫu trong Mayer' s hematoxylin 15 phút

d Rửa phiến mẫu dưới vòi nước 20 phút

e Nhúng phiến mẫu vào dung dịch nhuộm eosin từ 15 giây đến 2 phút tùy vào mức

độ bắt màu của mẫu

6 Chuyển phiến mẫu sang 2 lần cồn 95% (chuyển sang dung dịch mới cho mỗi lần lập lại), mỗi lần 2 phút để rửa hết eosin thừa Quan sát phiến mẫu bằng kính hiển vi, mẫu đạt yêu cầu khi nền mẫu trong và tế bào chất bắt màu từ hồng nhạt đến cam

7 Rửa phiến mẫu lại trong cồn 95% , sau đó chuyển phiến mẫu sang 2 lần cồn tuyệt đối, mỗi lần 2 phút Làm trong mẫu bằng xylen 2 lần mỗi lần 2 phút Sau khi nhuộm, dán phiến kính mỏng lên trên

8 Với phương pháp nhuộm này, nhân tế bào sẽ có màu xanh dương (blue) Vùng tế bào chất với lưới nội chất (tế bào gan, tuyến tụy ngoại tiết) có màu xanh nhạt hay tím Phần tế bào chất còn lại sẽ dao động quanh màu hồng sậm

36

Bài giảng Phương pháp nghiên cứu sinh học cá

Chương 4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU DINH DƯỠNG CÁ

I Thức ăn tự nhiên của cá

Biswas (1993), chia thức ăn tự nhiên của cá ra thành 4 nhóm chính: sinh vật phù du (plankton), sinh vật tự bơi (nekton), sinh vật đáy (benthos) và chất vẩn (detritus)

1 Sinh vật phù du (plankton)

Là các loài vi sinh vật (tảo hay động vật có kích thước rất nhỏ) sống trôi nổi trong nước Tùy vào sự hiện diện hay vắng mặt của diệp lục tố (chlorophyll) mà có thể chia thành 2 nhóm chính: thực vật phù du (phytoplankton) và động vật phù du (zooplankton)

Tùy thuộc vào kích thước, sinh vật phù du lại được chia thành các nhóm (i) sinh vật nổi cực nhỏ (nannoplankton) kích thước nhỏ hơn 0,03 mm; (ii) sinh vật nổi nhỏ (microplankton) có kích thước từ 0,03-3 mm; và sinh vật nổi lớn (macroplankton) với kích thước lớn hơn 3 mm (Biswas, 1993)

Plankton thì khác biệt với nhóm neuston (sinh vật màng nước), nhóm các loài động vật sống quanh màng nước chúng có thể sống ở bên trên (epineuston) hay bên dưới (hyponeuston) màng nước Nhóm sinh vật này một số sống thường xuyên ở màng nước, một số chỉ sống một thời gian (ấu trùng của nhiều loài động vật)

2 Sinh vật tự bơi (Nekton)

Đây là nhóm động vật có kích thước lớn, sống và bơi lội tự do trong các tầng nước của thủy vực Nhóm này bao gồm giáp xác, thân mềm, cá, rắn, cá sấu

3 Sinh vật đáy (Benthos)

Là nhóm sinh vật sống ở nền đáy của các thủy vực, sinh vật đáy có thể là thực vật đáy (phytobenthos) hay động vật đáy (zoobenthos)