Hóa chất sử dụng trong phòng thí nghiệm sinh học phân tử phần lớn là những chất độc hại vì thế, luôn xem kỹ tên hóa chất trước khi sử dụng và cần ghi chú rõ ràng bên ngoài bao bì mỗi loại hóa chất. Trước khi sử dụng một loại hóa chất mới, cần phải tham khảo thông tin của chúng từ các tài liệu của nhà sản xuất. Ví dụ: Phenol – rất dễ gây cháy Acrylamide – tác động độc lên hệ thần kinh Ethidium bromide – tác nhân gây ung thư Luôn đeo găng tay khi làm việc với các hóa chất và không bao giờ được hút chúng bằng miệng. Nếu tiếp xúc trực tiếp với những chất độc này phải nhanh chóng rửa vùng tiếp xúc dưới vòi nước và tuân theo chỉ dẫn của người hướng dẫn. Các hóa chất cần phải được bảo quản đúng nhiệt độ quy định: nhiệt độ phòng, trong tủ mát (40C) hoặc tủ lạnh âm (-200C) và được ghi nhãn cẩn thận. 2. Đèn tử ngoại (UV) Tiếp xúc trục tiếp với tia UV có thể gây hại mắt. Luôn luôn đeo kính bảo vệ khi sử dụng đèn UV. 3. Nguồn điện Điện thế sử dụng trong quá trình điện di có thể gây giật điện. Đậy nắp bồn điện di trong suốt quá trình điện di để tránh bị điện giật. Luôn tắt nguồn điện trước khi lấy bản gel ra khỏi bồn điện di. 4. Các vật dụng Vật dụng thủy tinh và nhựa dùng trong sinh học phân tử phải sạch và vô trùng. Ống nghiệm bẩn như nhiễm khuẩn hoặc dính các chất tẩy đều có thể ức chế phản ứng hoặc làm hỏng vật liệu di truyền (nucleicacid). Vật dụng thủy tinh (ống nghiệm, bình tam giác…) tốt nhất cần được rửa bằng nước cất, hấp thanh trùng hoặc sấy 1500C trong vòng 1 giờ. Đối với thí nghiệm liên quan RNA, vật dụng thủy tinh cần được xử lý bằng diethyl-pyrocarbonate để ức chế enzyme RNases là một loại enzyme rất bền đối với việc hấp thanh trùng. Vật dụng nhựa (pipets và ống nuôi cấy, ống nghiệm nhỏ…) cần được thanh trùng trước khi sử dụng. 5. Rác thải và hóa chất thừa Ethidium bromide là một tác nhân gây ung thư vì thế khi thao tác với những vật dụng có dính chất này cần phải đeo găng tay bảo hộ. Gel agarose có chứa Ethidium bromide cần phải được vứt bỏ trong một túi riêng có đánh dấu. Quy định túi rác cho từng khu vực, từng công đoạn Hóa chất nguy hiểm cần có túi để riêng
Trang 1Viện Nghiên Cứu Và Nuôi Trồng Thủy Sản II
Trung Tâm Quốc Gia Quan Trắc, Cảnh Báo Môi Trường
Và Phòng Ngừa Dịch Bệnh Thủy Sản Khu Vực Nam Bộ
TÀI LIỆU TẬP HUẤN KỸ THUẬT PCR CHẨN
ĐOÁN BỆNH TRÊN TÔM CÁ
Lưu hành nội bộ
Tp Hồ Chí Minh 2007
Trang 2CHƯƠNG I: LÝ THUYẾT PHÒNG THÍ NGHIỆM
Trước khi sử dụng một loại hóa chất mới, cần phải tham khảo thông tin của chúng từ cáctài liệu của nhà sản xuất Ví dụ:
Phenol – rất dễ gây cháy
Acrylamide – tác động độc lên hệ thần kinh
Ethidium bromide – tác nhân gây ung thư
Luôn đeo găng tay khi làm việc với các hóa chất và không bao giờ được hút chúng bằngmiệng Nếu tiếp xúc trực tiếp với những chất độc này phải nhanh chóng rửa vùng tiếp xúcdưới vòi nước và tuân theo chỉ dẫn của người hướng dẫn
Các hóa chất cần phải được bảo quản đúng nhiệt độ quy định: nhiệt độ phòng, trong tủmát (40C) hoặc tủ lạnh âm (-200C) và được ghi nhãn cẩn thận
4 Các vật dụng
Vật dụng thủy tinh và nhựa dùng trong sinh học phân tử phải sạch và vô trùng Ốngnghiệm bẩn như nhiễm khuẩn hoặc dính các chất tẩy đều có thể ức chế phản ứng hoặclàm hỏng vật liệu di truyền (nucleicacid)
Vật dụng thủy tinh (ống nghiệm, bình tam giác…) tốt nhất cần được rửa bằng nước cất,hấp thanh trùng hoặc sấy 1500C trong vòng 1 giờ Đối với thí nghiệm liên quan RNA,vật dụng thủy tinh cần được xử lý bằng diethyl-pyrocarbonate để ức chế enzyme RNases
là một loại enzyme rất bền đối với việc hấp thanh trùng Vật dụng nhựa (pipets và ốngnuôi cấy, ống nghiệm nhỏ…) cần được thanh trùng trước khi sử dụng
Trang 35 Rác thải và hóa chất thừa
Ethidium bromide là một tác nhân gây ung thư vì thế khi thao tác với những vật dụng códính chất này cần phải đeo găng tay bảo hộ Gel agarose có chứa Ethidium bromide cầnphải được vứt bỏ trong một túi riêng có đánh dấu
Quy định túi rác cho từng khu vực, từng công đoạn
Hóa chất nguy hiểm cần có túi để riêng
II PHA CHẾ DUNG DỊCH
Nồng độ mole, % và dung dịch mẹ "X"
Nồng độ mole Dung dịch có nồng độ mole 1 M là một dung dịch có thể tích 1 lít và chứa
số gram hóa chất tương đương với trong lượng phân tử của chất đó
Ví dụ: Chuẩn bị 100ml dung dịch NaCl 5M (trọng lượng phân tử: 58.456 đvc)
Cân 29.29 g NaCl (cách tính: 58.456 g/mol x 5 moles/lít x 0.1 lít)
Pha trong 100ml nước cất hoặc dung dung môi
Nồng độ phần trăm: Nồng độ phần trăm (trong lượng/thể tích) = trọng lượng chất tan(g) pha trong 100 ml nước cất hoặc dung dung môi
Ví dụ: Chuẩn bị dung dịch agarose 0.7% trong đệm điện di TBE
Cân 0.7 g agarose
Thêm dung dịch TBE 1X sao cho thể tích cuối cùng là 100ml
Dung dịch mẹ "X". Nhiều loại hóa chất, dung dịch cần được chuẩn bị ở nồng độ cao(dung dịch mẹ) 5 lần (5X) hoặc mười lần (10X) so với nồng độ cần thiết khi sử dụng.Trước khi sử dụng chúng sẽ được pha loãng thích hợp để đưa về nồng độ cần thiết (1Xcủa dung dịch làm việc)
Ví dụ: Chuẩn bị dung dịch điện di TBE 1X:
100ml dung dịch TBE 10X
Thêm 900ml nước cất để thể tích cuối cùng là 1000 ml dung dịch TBE 1X
Chuẩn bị dung dịch làm việc từ dung dịch mẹ
Nhiều dung dịch trong nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử đòi hỏi sử dụng cùngmột thành phần hóa chất nhưng lại khác nhau về nồng độ Vì thế để tránh ph ải phức tạpkhi pha chế riêng rẽ các hóa chất này chúng ta tốt nhất nên chuẩn bị sẵn một vài dungdịch gốc để dễ dàng pha loãng chúng khi cần thiết
Ví dụ: có thể pha đệm TBE (10 mM Tris, 1 mM EDTA) bằng cách phối hợp 1ml dungdịch Tris 1M và 2 ml dung dịch EDTA 0.5 M cộng với 98.8 ml nước cất vô trùng
Trang 4Ci x Vi = Cf x Vf
C i = nồng độ ban đầu, hoặc nồng độ của dung dịch mẹ;
V i = thể tích ban đầu, hoặc lượng dung dịch mẹ cần thiết,
C f = nồng độ cuối, hoặc nồng độ mong muốn sau khi pha;
V f = thể tích cuối, hoặc thể tích mong muốn sau khi pha III SỬ DỤNG THIẾT BỊ
Yêu cầu học viên giữ gìn các vật dụng trong phòng thí nghiệm cẩn thận
Không được tự ý sử dụng các thiết bị khi chưa được sự đồng ý hoặc chưa được hướngdẫn sử dụng của người hướng dẫn
Không di dời dụng cụ, thiết bị từ khu vực này đến khu vực khác mà chưa có ý kiến củangười hướng dẫn
Thông báo ngay bất kỳ hỏng hóc của thiết bị
Máy ly tâm
Khi ly tâm, cần phải cân bằng rotor trước khi ly tâm
Lau chùi rotor của máy ly tâm sau khi sử dụng nếu bị vấy bẩn
Đậy nắp máy ly tâm khi sử dụng xong
Micropipettors
Mỗi pipette đều có giới hạn thể tích do vậy cần phải kiểm tra giới hạn thể của từngpipette trước khi sử dụng Không được điều chỉnh pipette quá mức giới hạn Không
để rơi pipette xuống đất
IV NGUYÊN TẮC PHẢN ỨNG PCR TRONG CHẨN ĐOÁN
PCR là phản ứng nhân tạo tổng hợp vàkhuếch đại một đoạn DNA nằm giữa hai
trình tự gọi là mồi (primer) Mồi (primer)
là những đoạn DNA ngắn(oligonucleotides) có khả năng bắt cặp bổsung chính xác với trình tự đích (trình tựDNA hoặc cDNA) của đối tương cần xácđịnh (ví dụ như DNA của WSSV hoặccDNA của YHV) Sau khi mồi (primer)bắt cặp vào trình tự đích, một enzyme có
tên DNA polymerase sẽ tiến đến đầu 3’
của mỗi mồi (primer) để thực hiện tiếntrình sinh tổng hợp đoạn DNA cần thiết
Trang 5- Dịch trích DNA mẫu
- Dung dịch đệm của phản ứng PCR (PCR buffer hoặc Taq buffer)
- Ion Mg2+ (MgCl2 )
- Deoxy nucleotide triphosphate (dNTP’s: dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
- Các mồi (mồi xuôi: F và mồi ngược : R)
- Enzym Taq polymerase
Phản ứng PCR gồm có ba quá trình trong một chu kỳ khuếch đại: Biến tính, bắt cặp và kéo dài , chúng được lặp lại nhiều lần để khuyếch đại trình tự DNA mong muốn Sau
mỗi chu kỳ khuếch đại số lượng phân tử
DNA đích được nhân lên gấp đôi: từ 1phân tử lên 2, lên 4 lên 8, lên 16 phân tử…
2n
Chi tiết ba quá trình trên trong mỗi chu kỳ khuếch đại như sau:
Biến tính: Phân tử DNA sợi đôi được hình
thành bởi mối liên kết hydro giữa haimạch đơn Trong quá trình biến tính, nhiệt
độ phản ứng gia tăng lên nhanh chóng đến
95oC và giữ ở nhiệt độ này trong khoảng
15-50 giây Ở nhiệt độ này mối liên kết hydro giữa hai mạch đơn của phân tử DNA sợi đôi bị phá vỡ Trong giai đoạn bắt cặp tiếp theo, nhiệt độ phản ứng giảm nhanh chóng
làm cho mối liên kết hydro ban đầu không hình thành lại được kết quả làm tạo thành haiphân tử DNA mạch đơn
Bắt cặp: Trong giai đoạn bắt cặp, nhiệt độ lai thường duy trì khoảng 50- 600C, trong thờigian 15-60 giây Quá trình này giúp cho các mồi (primer) tìm kiếm và bắt cặp bổ sungđặc hiệu với trình tự đích (DNA hoặc cDNA) tại vị trí mong muốn Nhiệt độ bắt cặp phụthuộc vào số lượng G,C có trong mồi (primer)
Kéo dài: Sau khi mồi (primer) tìm kiếm và bắt cặp bổ sung với trình tự đích, nhiệt độ của phản ứng lại nhanh chóng chuyển về nhiệt độ thích hợp với hoạt động của enzyme DNA
Trang 6nucleotide (A,T,G,C) từ môi trường phản ứng để gắn vào đầu 3’ của mồi (primer) theo
nguyên tắc bổ sung với trình tự trên phân tử DNA hoặc cDNA đích Năng lượng dùngtrong quá trình gắn kết này là ATP cũng có trong môi trường phản ứng Kết quả quá trìnhnày phản ứng PCR đã tạo ra hai phân tử DNA mạch đôi mới từ một phân tử DNA mạchđôi ban đầu
Như vậy sau nhiều chu kỳ khếch đại (thường từ 30-40 chu kỳ) từ một phân tử đích ban
đầu phản ứng PCR đã tạo ra vô số phân tử bản sao có kích thước xác định mong
muốn
Cuối cùng sản phẩm PCR được nhuộm với Ehididum bromide và đem quan sát sự phátquang dưới tia UV sau khi phân tách sản phẩm PCR trên gel agarose theo kích thước
Các yếu tố ảnh hưởng đến kỹ thuật PCR
Kỹ thuật PCR có độ nhạy rất cao, tuy nhiên, phương pháp này cũng có một số hạn chếsau:
Sự ngoại nhiễm: người ta đã chứng minh được rằng việc mở nắp ống nghiệm sau mỗi
lần khuếch đại trong khoảng không gian kín như phòng thí nghiệm sẽ làm cho 1 phần cácphân tử DNA được khuếch đại vào không khí và nhiễm vào các phản ứng sau làm chophản ứng PCR về sau có những sản phẩm khuếch đại không mong muốn
Trang 7Các sai sót gây ra do Taq polymerase: Sự sao chép bởi Taq DNA polymerase cho tỉ lệ
sai khá cao trung bình 104 Nucleotide thì enzyme gắn sai một nucleotide Tuy nhiên đặctính này không nghiêm trọng nếu ta không cần xác định chính xác trình tự của DNA
VI PHÂN TÍCH SẢN PHẨM PCR BẰNG ĐIỆN DI GEL AGAROSE
Điện di agarose thường được sử dụng để xác định sản phẩm PCR dựa trên khả năng phântách các đoạn DNA có kích thước khác nhau khi sản phẩm PCR di chuyển qua mang lưới
các vi lỗ có trong gel agarose
Do phân tử DNA tích điện âm cao Khi phân tửDNA được đặt dưới một điện trường xác định,những phân tử DNA tích điện âm này sẽ dichuyển về phía cực dương của điện trường,trong trường hợp điện di agarose chúng sẽ dichuyển qua gel agarose được đặt trong dung
dịch đệm điện di Các phân tử càng nhỏ có khả
năng di chuyển càng nhanh trong gel agarose về phía cực dương so với các phân tử DNAlớn hơn Nguyên tác này cho phép kỹ thuật điện di phân tách các đoạn DNA có kíchthước khác nhau
Sản phẩm PCR được trộn với dung dịch đặt mẫu (loading gel) vào chuyển vào các
giếng trên gel agarose để thực hiện phân tách dưới tác động của điện trường Gel agarose
có chứa sẵn Ethidium bromide vì thế khi DNA di chuyển trong gel agarose sẽ tạo liên
kết với Ethidium bromide
Dung dịch đặt mẫu (loading gel) chứa chất có tỷ trọng nặng (như đường sucrose hoặc
glycerol) để lôi cuốn DNA xuống đáy giếng trên bản gel agarose và ngăn cản không choDNA khuếch tán vào dung dịch đệm điện di Ngoài ra, trong dung dich đặt mẫu còn chứachất chỉ thị tích điện âm Chất chỉ thị di chuyển cùng với DNA giúp cho dễ dàng ướclượng sự di chuyển của DNA trong bản gel Chất chỉ thị thường dùng là Xylene cyanol
và Bromophenol blue, chúng di chuyển cùng với những phân tử DNA có chiều dài tươngứng lần lượt là 5000 bp and 300 bp
Đệm diện di: Đệm điện di giúp ổn định các điều kiện môi trường cho phép quá trình di
chuyển của DNA được ổn định trong suốt quá trình điện di Có một vài loại đệm điện dithường dùng trong phân tích điện di agarose: Tris acetate EDTA (TAE),
Tris/Borate/EDTA (TBE) Khả năng đệm của dung dịch đệm TAE thấp hơn so với TBE.Tuy nhiên, TAE lại cho phép phân tách tốt đối với những đoạn DNA lớn hơn Điều nàyđồng nghĩa với việc phải dùng điện thế thấp hơn và mất thời gian điện di nhiều hơn
Kết thúc quá trình điện di bản gel sẽ được đặt dưới tác động của tia UV, các đoạn DNAsản phẩm PCR sau khi phân tách theo kích thước sẽ được hiển thị dưới dạng băng vạchmàu vàng sáng tại những vị trí khác nhau tương ứng với kích thước chiều dài của chúng
Trang 8Ethidium bromide có sẵn trong bản gel sẽ chèn vào giữa các bazơ nitơ của phân tử DNAdẫn đến chúng bám vào phần trung tâm của phân tử DNA Sự phát sáng là do phức hợpDNA-Ethidiun bromide phát ra khi chịu tác động của tia UV.
Ghi chú:
1 Khu thao tác tách chiết vật liệu di truyền, khu pha chế hoá chất và khu điện di sảnphẩm PCR phải tách biệt, tránh trường hợp DNA từ khu tách chiết và khu điện di ngoạinhiễm vào trong hoá chất trước khi đem phản ứng
2 Tủ thao tác gắn đèn cực tím dùng cho pha chế hoá chất cho phản ứng PCR
3 Gel agarose chạy điện di phải được chuẩn bị trong một tủ hút khí độc
Trang 9CHƯƠNG 2: THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT
3 Máy cách thủy (water bath) hay block nhiệt khô (dry heat block)
4 Máy trộn mẫu (Vortex)
5 Micropipette các loại: 0,5 - 10 l; 10 -100 l; 40 -200 l; 200 -1000 l; đầu tipmicropipette các loại: 0,5-10l, 20l, 200l, 1000l
6 Eppendorf các loại: 0,2ml; 0,5 ml và 1,5 ml (chuyên dùng cho PCR) ; Giá ốngnghiệm cho Eppendorf
7 Giá ống nghiệm cho loại tube PCR 0,2ml và 0,5ml
8 Hộp đựng nước đá
9 Dụng cụ bào đá bằng tay
10 Bình đựng cồn
11 Hộp đựng giấy thấm lau tay
12 Các bộ kéo, panh vô trùng
13 Hộp nhựa có nắp đựng vật liệu dơ
14 Box vô trùng
15 Máy cất nước 2 lần
16 Tủ sấy dụng cụ (hot box oven)
17 Vật liệu khác: Các lọ sạch để đựng mẫu, cồn 95% để cố định và bảo quản mẫu,găng tay, giấy lau, bút lông dầu, kim tiêm vô trùng
2 Khuếch đại nucleic acid
Máy luân nhiệt (thermocycler)
Bộ giữ điện UBS: loại online, công suất 2000 w
4 Bếp điện hoặc lò vi ba dùng để đun agarose
5 Cân kỹ thuật độ chính xác 0,1gr hay 0,01gr
6 Ống đong 100ml và 500ml hay 1000ml
7 Chai thủy tinh chịu nhiệt có nắp, dung tích 250ml để đun Agarose
8 Tủ đổ gel (có hệ thống hút hơi Ethidium bromide)
9 Hộp nhựa có nắp đậy chứa rác thải
10 Vật liệu khác: Găng tay, giấy lau tay, Giấy paraffin, Hộp đầu tip 10 -200l
Trang 10II Hoá chất tách chiết acid nucleic
1 Hoá chất tách chiết thô DNA
Dung dịch 0,5 N NaOH: Cân 1 g NaOH cho vào ống định mức (ống falcon) 50ml thêm
nước cất 2 lần vô trùng cho tới mức 50 ml của ống Ta có được dung dịch 0,5N NaOH
Dung dịch 0,25% SDS: Cân 0,125 g SDS cho vào ống falcon 50 ml thêm nước cất 2 lần
vô trùng cho tới mức 50 ml Ta có được dung dịch 0,25 % (W/V) SDS
Dung dịch NaOH 0,25% - SDS 0,125%:
5ml NaOH 0,5N 5ml SDS 0,25%
H2O đủ 100ml Bảo quản lạnh 4oC
2 Hoá chất tinh sạch DNA
TE ( Tris-EDTA): pha100 ml (1 ml 1M Tris, 0.2ml 0.5M EDTA và cho nước đủ 100
ml) hấp khử trùng 121oC trong 15 phút (autoclave) sau đó bảo quản ở 40C
Dung dịch 0.5M EDTA (Ethylene Diamine TetraAcetic ): cân 18,61 g trong 70ml nước
cất Sau đó cho 15-20 hạt NaOH để chuẩn cho pH = 8 sau đó thêm nước cất đủ 100 ml
và đem đi hấp autoclave Bảo quản ở 40C
Phenol pH 8: Cân khoảng 100 g phenol tinh thể, để tan ở 680C Thêm vào một thể tích
100 ml dung dịch Tris HCl 0,5M (pH = 8) Khuấy từ trong 15 phút , để yên dung dịchcho đến khi thấy hai pha rõ rệt, hút bỏ pha bên trên Tiếp tục cho thêm một thể tích TrisHCL 0,1M (pH = 8) Lặp lại thao tác như trên cho đến khi đo được dung dịch phenol pH
= 8
Phenol pH 4: Cân khoảng 100 g phenoltinh thể, để tan ở 680C Thêm vào một thể tích
100 ml nước cất hai lần hấp khử trùng Khuấy từ trong 15 phút, để yên dung dịch cho đếnkhi thấy hai pha rõ rệt, hút bỏ pha bên trên Tiếp tục cho thêm một thể tích nước cất nhưtrên Lặp lại thao tác như trên cho đến khi đo được dung dịch phenol pH = 4
Phenol pH 8 : Chloroform : Isomyl alcolhol (25:24:1): Pha 100 ml dung dịch tách chiết
bằng cách dùng đầu tip tinh sạch hút 2ml Isoamyl alcolhol vào 50ml phenol pH = 8, lắctrộn đều; sau đó thêm 48ml dung dịch cholroform vào trộn đều
Sodium Acetate 3M (pH: 5.2): Cân 40,8g NaOAc*3H2O, hòa tan trong 80 ml H2O Sau
đó chuẩn pH 5.2 với acid acetic Thêm nước cho đủ 100 ml
Cồn 70%: Đong 70 ml cồn tuyệt đối cho vào 30 ml H2O cất vô trùng Ta được 100 mlcồn 70%
Cồn tuyệt đối (100%)
H 2 O – DEPC : Hút 1ml DEPC (diethylpyrocarbonate) cho vào 1lít nước cất loại Ion Ủ
qua đêm và đem hấp vô trùng
Dung dịch TN (20 mM Tris–HCl, 0.4 M NaCl, pH 7.4)
3 Hoá chất tách chiết RNA (Trizol)
Trang 114 Phân tích sản phẩm PCR trên gel agarose
TBE 10X (Tris-Boric acid-EDTA)
108g Tris base
55g Boric acid
9,8 g EDTA
- Hòa tan 108g Tris và 55g Bocic acid trong khoảng 600ml H2O
- Thêm 9,8 g EDTA và chỉnh pH: 8, thêm thể tích H2O cho đủ 1 lít
Bảo quản ở nhiệt độ phòng (280C)
Dung dịch nạp mẫu (loading gel) Bromophenol 6X:
Bromophenol blue 0,25% (w/v)
Glycerol 40% (v/v)
Agarose tinh cho sinh học phân tử
Ethidium bromide stock 10mg/ml
Trang 12CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP
I CHUẨN BỊ MẪU
Mẫu tôm có thể được sử dụng trực tiếp (gọi là mẫu tươi) hoặc được bảo quản trong dungdịch cồn 950 Trong trường hợp mẫu được bảo quản trong cồn thì phải thay mới dungdịch cồn sau một tuần bảo quản đầu tiên để mẫu được bảo quản được lâu hơn Nhữngmẫu được bảo quản trong cồn cần được loại cồn trước khi sử dụng Có thể dùng giấythấm để loại cồn khỏi mẫu trước khi tinh sạch vật liệu di truyền Mẫu tươi sử dụng chophân tích PCR là tốt nhất
1 Mẫu DNA virus: MBV, WSSV, HPV
Mẫu tôm giống (PL): lấy khoảng 50-70 con
Mẫu tôm nuôi: lấy một phần nhỏ mang của 10 -15 con (tổng lượng mẫu không qúa 1gram)
Tôm bố mẹ: lấy mẫu cuốn mắt, chân bò, hoặc chân bơi hoặc một phần mang
Mẫu giáp xác hoang dã: lấy một phần mang các loại động vật này (tổng lượng mẫu khôngqúa 500 microgram)
2 Mẫu RNA virus: TSV, YHV
Mẫu tôm giống: lấy khoảng 30-50 PL
Mẫu tôm nuôi: lấy một phần nhỏ mang của 10-15 con (tổng lượng mẫu không qúa 200microgram)
Tôm bố mẹ: lấy mẫu cuốn mắt, chân bò, hoặc chân bơi hoặc một phần mang
Mẫu giáp xác hoang dã: lấy một phần mang các loại động vật này (tổng lượng mẫu khôngqúa 200 microgram)
II QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH VẬT LIỆU DI TRUYỀN
1 Tách chiết thô DNA
Nguyên tắc: Phương pháp dựa trên nguyên tắc phối hợp cơ học (nghiền), hóa học(NaOH-SDS) và sốc nhiệt để tách chiết DNA virus ra dịch chiết
1 Mẫu tôm được nghiền kỹ trong eppendorf với 600-800ml dịch tách chiết DNA (NaOH0.25N, SDS 0,125%)
2 Đem biến tính bằng cách đun sôi cách thuỷ 5-10 phút và làm lạnh nhanh ở điều kiệnlạnh (nhúng vào nước đá) Mẫu được sốc nhiệt nhằm phá vở màng tế bào và phá huỷhoạt tính sinh học của một số chất có trong dịch chiết gây ảnh hưởng đến phản ứngPCR)
3 Tiếp theo dịch nghiền được ly tâm 5 phút ở tốc độ 13.000 vòng/phút
4 Sau ly tâm, thu dịch nổi bên trên; dịch chiết này được đem phân tích PCR ngay hoặcbảo quản ở –200C để phân tích sau
Trang 132 Tách chiết tinh DNA bằng phenol-chloroform
Nguyên tắc: Dung dịch Phenol : Chloroform : Isoamyl Alcohol(PCI) (25:24:1) sẽ làmbiến tính và tủa các protein, chúng sẽ bị tập trung trong lớp phân cách giữa phase lỏng vàphase PCI sau khi ly tâm DNA trong phase lỏng sẽ bị kết tủa bởi ethanol ở nồng độ muốicao
1 Trong eppendorf, cho vào 400l dịch chiết thô DNA bệnh phẩm (xem phương pháp1), thêm 400l PCI
2 Vortex mạnh trong 10 giây
3 Ly tâm 13,000RPM trong 2 phút
4 Hút chuyển khoảng 350l phần phase lỏng ở trên chứa DNA vào một tube ly tâmnhỏ mới (lặp lại bước này một lần nữa nếu ở phần tiếp xúc giữa hai phase vẫn còntủa trắng, và lần 2 này thì hút khoảng 300l phần phase lỏng ở trên chứa DNA vàomột tube Eppendorf nhỏ mới)
5 Thêm 35l hay 30l (1/10 thể tích, tuỳ thuộc vào thể tích pha lỏng lấy được ở bướctrên là 350l hay 300l) Sodium acetate 3M, pH 5.2 vào dung dịch DNA để làmcho DNA dễ bị tủa khi cho Ethanol vào
6 Trộn bằng vortex nhẹ hay bằng cách búng ngón tay nhẹ vào tube nhiều lần Thêm1ml (2,5V) ethanol 100% đã để lạnh trong đá rồi vortex Giữ tube trong trong kem
đá khô trong hơn 5 phút, hay giữ trong tủ - 70C trong 15 phút, hay trong tủ lạnhngăn -20C trong 30 phút
7 Ly tâm 13.000 rpm trong 5 phút
8 Dùng miropipette hút bỏ phần nước nổi bằng cách vừa hút cạn dần vừa cho đầu tipvào dọc thành ống đối diện với chỗ đóng cặn lóng DNA Rửa cặn lóng DNA với1ml Ethanol 70%, không vortex mà chỉ úp ngửa vài lần
9 Ly tâm 13.000 rpm trong 5 phút, hút bỏ Ethanol, và làm khô cặn lóng bằng cách đuncách thủy hay đun trong block nhiệt khô ở nhiệt độ 50-560 C cho đến khi khô hoàntoàn (không còn thấy các giọt nước đọng trên thành ống)
10.Hoà tan cặn lóng DNA trong 50 - 100l đệm TE
3 Tinh sạch RNA tổng số bằng Trizol
Nguyên tắc: Phương pháp này dùng Guanidine Thiocyanate và Amoniumthiocyanate,phối hợp với phenol acid và các chất tẩy khác để làm chất gây biến tính các protein, nhờ
đó tách chiết được RNA toàn phần ra khỏi DNA và protein RNA tách chiết được sẽ dễdàng bị kết tủa bởi isopropanol và ethanol
Nghiền 150 - 200 mg mô tôm trong 300 µl Ly tâm 12000 vòng/ phút trong 10 phút Hút
150 µl dung dịch nổi cho vào eppendorf 1,5 ml
1 Thêm 1ml dung dịch Trizol
2 Ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút
Trang 149 Ủ ở nhiệt độ phòng ít nhất 10 phút (qua đêm ở -200C hay để ở -700C trong 1 giờ)
10 Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút Loại bỏ dịch nổi
11 Hoàn tan cặn lóng RNA bằng 1ml Ethanol 70%
12 Vortex, ly tâm 7500 vòng/phút trong 5 phút Loại bỏ dịch nổi
13.Làm khô cặn RNA ở 550C bằng cách đun cách thuỷ hay block nhiệt
14.Hòa cặn RNA trong 50-100 µl H2O-DEPC Bảo quản ở -200C
III QUI TRÌNH PCR CHẨN ĐOÁN VIRUS GÂY BỆNH TRÊN TÔM
1 Qui trình chẩn đoán virus WSSV (Kiapathomchai, 2001).
Nguyên tắc: Sử dụng 4 mồi: một mồi xuôi (F), ba mồi ngược (R1, R2, R3) Để khuếch
đại ba trình tự khác nhau của một đoạn gene của WSSV Trong ba chu kì nhiệt khácnhau Đối với cặp mồi F, R1 khuếch đại đoạn gene có kích thước 1100bp Với cặp mồi F,R2 khuếch đại đoạn gene bên trong của cặp mồi F, R1 kích thước sản phẩm khuếch đại
là 526 bp Với cặp mồi F, R3 khuếch đại đoạn gene bên trong của sản phẩm của hai cặpmồi trên và có kích thước sau khi khuếch đại là 250 bp Giới hạn của qui trình phát hiệnDNA virus trong mẫu ở mức fetogram (10-7g) Ngoài ra, qui trình còn có thể đánh giámức độ nhiễm của virus trên tôm
21 l nước cất hai lần vô trùng,
Hút 1,5 - 2 l dịch chiết DNA từ mẫu phân tích
b Thực hiện phản ứng
Thực hiện phản ứng trên máy luân nhiệt theo các chu kỳ sau:
Giai đoạn 1 (1 chu kỳ): 930C trong 5 phút
Trang 15Giai đoạn 2 (5 chu kỳ): 930C trong 20 giây
40C trong vô cùng
Xác định sản phẩm: Sử dụng 10l sản phẩm khuếch đại điện di trên gel agrose 1,5%
thời gian 30-40 phút và ở 100V
Kết quả điện di:
2 Qui trình PCR chẩn đoán YHV
A Qui trình chẩn đoán YHV (Wongteerasupaya và cộng sự, 1997)
Nguyên tắc: Cặp mồi 10 F, 114 R được thiết kế để khuếch đại đoạn gene của YHV có
1 2 M 3 4 5 6 7 8