Tìm hiểu về HPLC và ứng dụng

Sắc ký là kỹ thuật tách các cấu tử ra khỏi hỗn hợp dựa trên ái lực khác nhau của mỗi cấu tử đối pha tĩnh và pha động. Một pha nằm cố định tại một chỗ, gọi là pha tĩnh, Pha di chuyển theo một hướng xác định gọi là pha động, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau. HPLC ( High performance liquid chromatography): Là phương pháp tách trong đó pha động là một chất lỏng, còn pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn được phân chia dưới dạng tiểu phân. Quá trình SKL dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay loại trừ theo kích cỡ. Sắc ký lỏng hiệu năng cao là kĩ thuật tách, nhận biết, định lượng từng thành phần trong hỗn hợp. Ưu điểm của HPLC: Thể tích tiêm lượng mẫu nhỏ Pha tĩnh gồm các hạt nhỏ kích cỡ từ (35µm) Mẫu và chất lỏng đi qua cột thông qua áp lực được cung cấp bởi một máy bơm.

TÌM HIỂU VỀ HPLC

VÀ ỨNG DỤNG

1.1 KHÁI NIỆM CƠ BẢN

- Sắc ký là kỹ thuật tách các cấu tử ra khỏi hỗn hợp dựa trên ái lực khác nhau của mỗi cấu tử

đối pha tĩnh và pha động Một pha nằm cố định tại một chỗ, gọi là pha tĩnh, Pha di chuyển theo một hướng xác định gọi là pha động, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau

to t’

r2

t’ r1

tr1

tr2

To : Thời gian lưu chết t’r1 : Thời gian lưu thực chất A t’r2 : Thời gian lưu thực chất B

1.2 CÁC ĐẠI LƯỢNG ĐẶC TRƯNG

1.2.1 THỜI GIAN LƯU

T R1 : Thời gian lưu chất A

T R2 : Thời gian lưu chất B

Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ khi bơm mẫu vào cột cho đến khi chất đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại

1.2 Hệ số phân bố K (tỉ số phân bố khối lượng )

Hệ số phân bố của một chất cho biết khả năng phân bố của chất đó trong hai pha cộng với sức chứa cột tức là tỷ số giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động ở trong thời điểm cân bằng

Nếu K nhỏ thì tR cũng nhỏ và sự tách kém Nếu K lớn thì

Peak bị doãng

Trong thực tế K’ từ 1- 8 là tối ưu

Độ chọn lọc cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc ký ,khi 02 chất A ,B có K’A

va K’B khác nhau thì mới có khả năng tách, mức độ tách biểu thị ở độ chọn lọc

α = K’ B / K’ A Với điều kiện K’B > K’A

với  càng khác 1 thì khả năng tách càng rõ ràng

α : phụ thuộc vào pha tĩnh, pha động và bản chất của chất tan

1.3 Độ chọn lọc α

Đại lượng đặc trưng cho hệ thống tách là số đĩa lý thuyết N Đĩa lý thuyết được định nghĩa là miền mà cân bằng động của nồng độ cấu

tử trong pha tĩnh và pha động được thiết lập.

Chiều cao của một đĩa lý thuyết

H= L/N

L: chiều dài cột

N: số đĩa lý thuyết

1.4 Số đĩa lý thuyết N

Số đĩa lý thuyết và bề dày đĩa phụ thuộc vào nhiều yếu tố như:

- đường kính của hạt pha tĩnh, hình dạng và kiểu hạt

- Điều kiện chế tạo, độ xốp, kích thước lỗ xốp của hạt pha tĩnh

- Bản chất, cấu trúc phân tử của chất tan

- Loại, tốc độ và thành phần của pha động trong quá trình sắc ký

- Độ nhớt, pH của pha động….

1.4 Số đĩa lý thuyết N

Hệ số không đối xứng T cho biết mức độ không đối xứng của Peak trên sắc ký đồ thu được T được tính bằng tỷ số độ rộng của 02 nửa Peak tại điểm 1/10 chiều cao Peak :

Peak dạng đối xứng hình Gauss trên thực tế khó đạt được vì vậy phải quan tâm đến hệ số không đối xứng T,

 Khi T < 2.5 thì phép định lượng được chấp nhận

 Khi T > 2.5 thì điểm cuối của Peak rất khó xác định .

b a

T = a/b

1.2.4 Hệ số không đối xứng T (Tailing factor)

1.3 Hệ số phân giải giữa 2 peak

Độ phân giải là đại lượng biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau trên một điều kiện sắc ký đã cho

Trong thực tế nếu các Peak cân đối ( Gass) thì độ phân giải tối thiểu để

02 Peak tách là R =1.0 Trong phép định lượng R=1,5 là phù hợp

Độ phân giải phụ thuộc vào hệ số chọn lọc α, số đĩa lý thuyết N, và hệ

số lưu k:

2 2

, 0

1 2

2 1

t

t W

1.3 Hệ số phân giải giữa 2 peak

1.4 Reduced Parameters ( Các tham số)

 Chiều cao đĩa lý thuyết

H h

.





m o

p c

m

p

D t

d

L D

.

.

2

2 2

c

o p c

p

L

t d

p u

1.4 Đường cong Van Deemter

2.Tìm hiểu về HPLC

20 What is HPLC ?

HPLC ( High performance liquid chromatography): Là phương

pháp tách trong đó pha động là một chất lỏng, còn pha tĩnh- chứa trong cột là một chất rắn được phân chia dưới dạng tiểu phân Quá trình SKL dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay loại trừ theo kích cỡ Sắc ký lỏng hiệu năng cao là kĩ thuật tách, nhận biết, định lượng từng thành phần trong hỗn hợp

Ưu điểm của HPLC:

- Thể tích tiêm lượng mẫu nhỏ

- Pha tĩnh gồm các hạt nhỏ kích cỡ từ (3-5µm)

- Mẫu và chất lỏng đi qua cột thông qua áp lực được cung cấp bởi một máy bơm.

1.16 Hệ thống HPLC

22

Bình chứa

dung môi điều khiển áp Hệ thống Bộ phận tiêm mẫu Cột Detector

37

Yêu cầu

1.Bơm Các loại bơm

Bơm pittong Bơm màng

39

Nguyên tắc hoạt động của bơm

 Gồm 2 van một chiều:

Gồm 2 van:

- Một van một chiều vào, chỉ cho phép dung môi vào đầu bơm.

- Một van một chiều ra chỉ cho phép dung môi ra khỏi bơm

2 Bộ phận tiêm mẫu (injection)

 Dùng để nạp mẫu vào hệ thống

 Gồm có van 6 chiều:

 Nạp mẫu qua vòng lấy mẫu (sampling loops)

 Có thể tiêm lượng mẫu từ 5 l đến 500 l

 Sai số của lượng mẫu nạp dưới 1%

 Ở vị trí load, thể tích mẫu

cần thiết sẽ giữ trong loop,

phần dư sẽ thải ra ngoài.

 Khi chuyển về vị trí inject, mẫu từ loop sẽ được bơm vào hệ thống cột tách.

 Cột bảo vệ (Guard Column)

Được lắp đặt trước cột phân tách để kéo dài tuổi thọ của cột Thành phần = thành phần của cột phân tách nhưng cỡ hạt lớn hơn để giảm tổn thất áp suất

3.1 Pha tĩnh (SP)

 Pha tĩnh (stationary phase): là những hợp chất hữu cơ được gắn trên chất mang rắn silica or

silanol, là chất nhồi cột để làm nhiệm vụ tách sắc ký một hỗn hợp chất phân tích

- Là những chất rắn xốp và kích thước hạt nhỏ, đường kính từ 5-7 µm, diện tích bề mặt riêng từ

100-250 m 2 /g

45

SiO2

 Gốc R là C8 octyl), C12

(n-octyl) hoặc C18 (n-octyldecyl).

 Pha động là H2O + dung môi

hòa tan (acetonitrile, methanol,

ethanol, isopropanol).

 Các cấu tử phân cực sẽ bị rửa ra

nhanh nhất, tăng độ phân cực của

pha động sẽ làm tăng thời gian

chạy mẫu

Pha tĩnh-Pha đảo

(Stationary Phases for Reversed-Phase LC)

Pha tĩnh bình thường của LC

(Stationary Phases for Normal LC)

 Pha động tương đối không phân cực: Hexane, Isopropyl eter, toluene…

 Các cấu tử không phân cực sẽ bị rửa ra nhanh nhất, tăng độ phân cực của pha động sẽ giảm thời gian chạy mẫu

48

1 Phải trơ và bền với các điều kiện sắc ký

2 Pha tĩnh có khả năng chọn lọc trong những điều kiện

sắc ký nhất định

3 Tính chất bề mặt phải ổn định, đặc trưng về độ xốp không bị thay đổi hay biến dạng trong QTSK

Cân bằng động học của sự tách xảy ra nhanh, thuận nghịch

và lặp lại

Yêu cầu đối với pha tĩnh

3.2 Pha động (MP)

 Pha động (mobil phase): là hệ dung môi dùng để rửa giải các chất

phân tích ra khỏi cột để thực hiện quá trình sắc ký

 Pha động trong HPLC có thể là đơn dung môi MeOH, Acetonitrile, THF, nước… or hỗn hợp 2 or nhiều dung môi, và cũng có thể là dung môi nước có chứa đệm, ion, chất tạo phức

7 Phù hợp với kinh tế

6 Phù hợp với loại detector

5 Nhanh đạt được trạng thái cân bằng

4 Độ tinh khiết

3 Bền, không bị phân hủy

2 Hòa tan được mẫu

1 Trơ với pha tĩnh

Tính chất một số loại dung môi sử dụng trong HPLC

4 CÁC LOẠI DETECTOR TRONG SẮC KÝ LỎNG

k: hằng số thực nghiệm của detector

Tín hiệu A có thể là độ hấp thu quang, cường độ phát xạ, độ dẫn điện, nhiệt, hiệu điện thế, chiết suất

_

_

4.2 Nguyên lý hoạt động chung

Trong sắc ký lỏng người ta thường dùng các quang phổ kế đo quang có độ

nhạy cao, nhờ đó có thể nhận dạng các hợp chất đến nồng độ cực nhỏ 10 -10

M trong miền ánh sáng tử ngoại nhìn thấy (miền quang phổ 190 – 800nm)

Để dò tìm các chất không màu (không có hiệu ứng phổ hấp thụ) người ta

thường dùng các máy đo chiết suất vi sai Khi phân tích các chất có khả

năng oxy hóa – khử người ta dùng các bộ dò tìm điện hóa (đo điện thế, cực

phổ) Người ta cũng dùng các bộ dò tìm huỳnh quang, đo độ dẫn điện.

4 CÁC LOẠI DETECTOR TRONG SẮC KÝ LỎNG

4 CÁC LOẠI DETECTOR TRONG SẮC KÝ LỎNG

Không bị tác động bởi những thay đổi của các điều kiện Thể tích chết Thể tích chết thấp thấp

Không dễ bị phá hủy

Không dễ bị phá hủy

Rẻ tiền, đáng tin cậy và dễ

sử dụng

Rẻ tiền, đáng tin cậy và dễ

sử dụng

4 CÁC LOẠI DETECTOR TRONG SẮC KÝ LỎNG

nm Detector này kém linh hoạt

trong sử dụng nhưng rẻ tiền

Detector đo ở bước sóng cố định

4 CÁC LOẠI DETECTOR TRONG SẮC KÝ LỎNG

4.3.2 Detector hấp thụ UV-Vis

 Detector đo ở bước sóng thay đổi:

Có thể đo ở bất kỳ bước sóng nào trong

vùng UV-Vis, cho phép lựa chọn bước

sóng có đáp ứng tối ưu của detector đối

với chât phân tích

Gồm hệ thống tạo bước sóng đơn

sắc cùng thiết bị đơn sắc hóa được kết

nối với ống nhân quang Detector đo ở bước sóng thay đổi

4 CÁC LOẠI DETECTOR TRONG SẮC KÝ LỎNG

thu, bước sóng và thời gian.

Sơ đồ Detector mảng diod

4.3.2 Detector huỳnh quang

 Đại lượng đo: độ phát xạ huỳnh quang của chất tại λEm nhất định khi được kích thích bằng λEx nhất định

Ihq(λ) =.I0.Ci

- Detector huỳnh quang gồm 2 hệ quang Một hệ cung cấp chùm sáng tia kích thích,

một hệ quang thu nhận chùm tia phát xạ huỳnh quang của chất phân tích đặt vuông góc với chùm tia kích thích

4 CÁC LOẠI DETECTOR TRONG SẮC KÝ LỎNG

4.3.2 Detector huỳnh quang

Company Logo

Hệ dùng kính lọc

Detector HQ của Agilent

Hệ có bộ phân giải phổ cách tử

4 CÁC LOẠI DETECTOR TRONG SẮC KÝ LỎNG

4.3.2 Detector huỳnh quang

 Ưu điểm:

• Chọn lọc hơn và nhạy hơn (có thể đến 1000 lần) so với detector hấp phụ

UV-Vis

• Nó đáp ứng với các chất huỳnh quang như: hợp chất thơm đa vòng, dẫn xuất

quinolin, steroid và alcaloid

• Có thể dùng thuốc thử tạo huỳnh quang để làm dẫn chất hóa (trước cột hoặc

sau cột) của chất phân tích

• Được sử dụng trong phân tích vết trong kiểm soát môi trường, giám định

pháp y,…

4 CÁC LOẠI DETECTOR TRONG SẮC KÝ LỎNG

Company Logo

1.17 GIỚI HẠN CỦA DETECTOR

63 Giới hạn phát hiện cho biết lượng tối thiểu của cấu tử có thể được thấy một cách đáng

tin cậy trên sắc ký đồ Về mặt thực nghiệm giới hạn dò tìm của một chất là lượng chất

đó cho một pic gấp vài lần nhiễu của nền (thường 3 lần)

1.17 Giới hạn của detector

64

LOC: Limit Of Detection

1.18 Độ nhiễu

65

1.19 ĐỘ KHÔNG ĐẢM BẢO ĐƯỢC BIỂU DIỄN BẰNG SƠ ĐỒ ISHIKAWA DIAGRAM

- Độ không đảm bảo: (ĐKĐB) là độ lệch chuẩn or độ rộng của khoảng tin cậy.

- ĐKĐB: được ước lượng từ việc đánh giá ảnh hưởng của các nguồn KĐB xác định

trong kết quả phân tích, kết quả được xđ từ các thủ tục kiểm soát chất lượng, kq so sánh liên phòng, kết quả của chương trình thử nghiệm đánh giá năng lực phân tích

8 Các biến đổi ngẫu nhiên

7 kết hợp không chính xác giữa pp đo với tính toán

6 Các giá trị tham chiếu

5 KĐB của cân, thiết bị

4 Điều kiện môi trường

3 Ảnh hưởng của nhiễu nến, nhiếu mẫu

2 Quy trình lấy mẫu

1 Định nghĩa không đầy đủ về đại lượng đo

Nguồn sinh ra ĐKĐB

1.19 ĐỘ KHÔNG ĐẢM BẢO ĐƯỢC BIỂU DIỄN BẰNG SƠ ĐỒ ISHIKAWA DIAGRAM

Tính toán độ không đảm bảo được đơn

giản bằng 2 quy tắc sau:

1.19 ĐỘ KHÔNG ĐẢM BẢO ĐƯỢC BIỂU DIỄN BẰNG SƠ ĐỒ ISHIKAWA DIAGRAM

69

PHẦN II: KHÓ KHĂN VÀ NGUỒN GỐC PHÁT SINH LỖI

71

2.1 SỰ PHỐI TRỘN CỦA PHA ĐỘNG

73

2.1 SỰ PHỐI TRỘN CỦA PHA ĐỘNG

75

2.1 SỰ PHỐI TRỘN CỦA PHA ĐỘNG

2.2 PH của pha động

• Thông thường khuyến cáo kiểm tra PH của pha động, bất cứ khi nào có sự tách của các hợp chất ion or quá trình ion hóa xảy ra Việc thay thế nước tinh khiết bằng hệ đệm để đạt được điều kiện ổn định, bền vững như phần 1.14 thì PH phân tách phải thấp hơn pKS của hợp chất liên quan

2.2 PH của pha động

 nortriptyline: pka10.76.

 Amitriptyline : pka =9,24

2.2 PH của pha động

2.3.Thêm một số tác nhân vào đệm

Đối với việc chuẩn bị dung môi cho pha động thì không chỉ có PH mà còn một số thành phần khác được thêm vào như: muối trung tính, thuốc thử ion, or dung môi hữu cơ Giai đoạn nào thì nên điều chỉnh PH, Và nó ảnh hưởng đến khả tách

không??????

2.3.Thêm một số tác nhân vào đệm

82 Đối với việc chuẩn bị dung môi cho pha động thì không chỉ có PH mà còn một số

thành phần khác được thêm vào như: muối trung tính, thuốc thử ion, or dung môi hữu

cơ

Sample: 0.5 mL solution with α-chymotrypsinogen, cytochrome C and lysozyme

Column: 10 mm × 10 cm

Pha tĩnh: Mono S HR, 10 µm (strong cation exchanger)

Pha động: 20 mM trisodium citrate pH 4.9 với gradient 0- 0.5M NaCl / 50:50/40 min, tốc độ dòng : 4 mL min−1

Detector: UV 280 nm

2.4 Ảnh hưởng của acid và nồng độ acid trong pha động

PH ổn định thu được bằng dung dịch đệm (acid or bazo và muối tương ứng) với khả năng đủ lớn tuy nhiên, trong quá trình tách cũng có thể được thực hiện với việc thêm vào acid or bazo Những trường hợp như vậy thì việc chuẩn bị pha động là đơn giản tuy nhiên phương pháp này không đảm bảo ổn định của PH

Không chỉ có nồng độ acid ảnh hưởng đến quá trình tách mà nó còn phụ thuộc vào bản chất acid

Điều kiện sắc ký

Pha tĩnh: HALO fused core C18, 2.7 µm (reversed phase C18)

Pha động: A: water với 0.05, 0.1 or 0.2 % các loại acid khác nhau