Vào mùa hè năm 2003, một chủng tảo được phân lập từ tảo lục phát triển trong bể chứa nước thải của một cơ sở xử lý ở Mexico. Lúc đó nhiệt độ không khí là trên 40oC, nhiệt độ nước 37oC và cường độ nắng trên mặt nước lên tới 2400 μmol.m 2s suốt nhiều giờ trong 4 tháng. Chủng tảo được nhận biết là Chlorella sorokiniana dựa vào toàn bộ trình tự gen 18S rRNA. Chủng này có mật độ tăng cao trong nước thải ở nhiệt độ 4042oC và cường độ ánh sáng 2500 μmol.m 2 s trong 5 giờ thì loại bỏ ammonium trong nước thải tốt hơn ở điều kiện nhiệt độ thấp hơn (28oC) và cường độ ánh sáng ít (60 μmol.m 2s). Khi cố định vi khuẩn Azospirillum brasilense sẽ phát triển tảo, số lượng tăng nhanh hơn và tăng khả năng xử lý ammonium nhiều hơn. Dưới điều kiện ánh sáng mạnh số giờ phơi nhiễm cực cao, số lượng của 4 sắc tố quang tổng hợp màu cố định trong nhiều loại tảo khác nhau. Chủng tảo này có tiềm năng như là chất xử lý nước thải trong điều kiện nhiệt độ và cường độ ánh sáng cực cao.
Trang 1ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TP.HCM
KHOA MÔI TRƯỜNG LỚP: 12CMT
- -
Chlorella sorokinianaUTEX 2805, a heat and
intense, sunlight-tolerant microalga with
potential for removing ammonium from
wastewater
Giáo viên hướng dẫn: Bộ môn Công Nghệ Môi Trường
Nhóm thực hiện: nhóm 2
TP Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2015
Trang 2MỤC LỤC
I GIỚI THIỆU 1
II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3
2.1 Phân lập tảo 3
2.2 Xác định các tảo 3
2.3 Tăng trưởng của tảo dưới nhiệt độ cực cao và sự phơi nắng 4
2.4 Cố định với vi khuẩn A brasilense trong hạt alginate, loại bỏ nitơ, và phân tích sắc tố 6
2.5 Việc thích ứng của tảo với nhiệt độ cao và ánh sáng cực mạnh 7
2.6 Thí nghiệm thực nghiệm 7
2.7 Phân tích thống kê và tính toán tốc độ tăng trưởng và thời gian nhân đôi 8
III KẾT QUẢ 9
3.1 Ưu thế về nhiệt độ và sự tiếp xúc ánh nắng trong bể chứa nước thải 9
3.2 Xác định tảo 11
3.3 Sự phát triển của chủng C sorokiniana ở 40oC trong môi trường nuôi cấy lơ lửng dưới cường độ ánh sáng cao 12
3.4 Sự phát triển của C sorokiniana cố định với A brasilensetrong hạt alginate tăng theo nhiệt độ và cường độ của ánh sáng 12
3.5 Loại bỏ amoni trong nước thải tổng hợp bởi C sorokiniana cố định với A brasilense dưới điều kiện tăng nhiệt độ và cường độ của ánh sáng 12
3.6 Thay đổi sắc tố quang hợp của C sorokiniana cố định với A brasilense theo sự tiếp xúc với nhiệt độ khắc nghiệt và cường độ của ánh sáng 13
IV THẢO U N 13
V KẾT LU N 16
Trang 31
Chlorella sorokiniana UTEX 2805, a heat and intense, sunlight-tolerant microalga
with potential for removing ammonium from wastewater
Tảo Chlorella sorokiniana UTEX 2805 trong môi trường mà nhiệt độ, cường độ ánh
sáng cao có khả năng khử được ammonium trong nước thải
Luz E de-Bashan a,b, Adan Trejo a, Volker A.R Huss c, Juan-Pablo Hernandez a,
Yoav Bashan a,b,*
a
Tập đoàn vi sinh môi trường, Trung tâm Nghiên cứu sinh học Northwestern (CIBNOR), Mar
Bermejo 195, Colonia Palo de Santa Rita, La Paz 23.090, BCS, Mexico
b Khoa Đất, Nước và Khoa học Môi trường, Đại học Arizona, Tucson, Arizona, USA
c
Khoa Sinh học, sinh học phân tử, Đại học Friedrich-Alexander Erlangen-Nürnberg nu (FAU),
Staudt Strasse 5, 91058 Erlangen, Đức
Nhận 02 tháng 04 năm 2007; nhận bản sửa đổi ngày 31 Tháng 8 năm 2007; chấp nhận ngày 9 tháng 9
năm 2007 Bản trực tuyến có ngày 19 Tháng 11 2007
Sơ lƣợc nghiên cứu_abstract.
Vào mùa hè năm 2003, một chủng tảo được phân lập từ tảo lục phát triển trong bể
nhiều giờ trong 4 tháng Chủng tảo được nhận biết là Chlorella sorokiniana dựa vào
toàn bộ trình tự gen 18S rRNA Chủng này có mật độ tăng cao trong nước thải ở nhiệt
lượng tăng nhanh hơn và tăng khả năng xử lý ammonium nhiều hơn Dưới điều kiện ánh sáng mạnh số giờ phơi nhiễm cực cao, số lượng của 4 sắc tố quang tổng hợp màu
cố định trong nhiều loại tảo khác nhau Chủng tảo này có tiềm năng như là chất xử lý nước thải trong điều kiện nhiệt độ và cường độ ánh sáng cực cao
I GIỚI THIỆU
Xử lý nước thải ở các đô thị, cả ở những nơi rất nóng hay lạnh điều cần thiết cho môi trường sống con người Phương pháp xử lý sinh học ở các nơi này phụ thuộc môi trường và điều kiện sẵn có cho vi sinh vật phát triển Các loài tảo được nghiên cứu
Trang 4Oswald, 1988; Talbot et al., 1991; Valderrama et al., 2002), và hiếm khi thấy khảo sát
2005) Điều này đúng với Chlorella sp thích nghi trong nhiệt độ 5-42oC (Kessler, 1985; Maxwell et al., 1994)
Trong số tất cả các loài Chlorella thì Chlorella sorokiniana Shith et Krauss chịu
được nhiệt độ, cường độ ánh sáng cao và được nghiên cứu chính tạo sinh khối và
ứng dụng trong xử lý nước thải ở điều kiện nhiệt và cường độ sáng hợp lý vừa phải
(Mũnoz et al., 2004, 2005; Yoshida et al., 2006) Cố định tảo trong polymer để tận
and de la Nou¨e, 1985; Lau et al., 1997; Tam and Wong, 2000) Trong những năm gần
đây những cải tiến hệ thống kỹ thuật, giúp chlorella sp và tảo thúc đẩy sự tăng trưởng
Gonzalez and Bashan, 2000)
Một số tương tác của tảo với vi khuẩn được ghi lại Pseudomonas diminuta và
Pseudomonas vesicularias là 2 vi khuẩn hiếu khí được phân lập từ nhiều loại tảo trong
phòng thí nghiệm kích thích sự phát triển tảo Scenedesmus bicellularis và chlorella sp
(Mouget et al., 1995) Nghiên cứu có kết quả tích cực từ vi khuẩn biển trên tảo biển
Bishop, 1975) Người ta đã cấy tảo biển Chaetoceros gracilis được sử dụng thức ăn cho giống trai ngọc với MGPB Flavobacterium sp Tốc độ tăng trưởng của khuê tảo
cao hơn đáng kể so với các loài tảo khác (diatom: loài khuê thảo hay còn gọi là tảo
thủy sản với Azospirillum sp và Azotobacteria sp làm tăng thực vật phù du, tăng sản
Ralstonia basilensis suy giảm hàm lượng sodium salicylate và acetonitrile Cố định Chlorella vulgrais với Azospirillum brasilense (được biết thúc đẩy tăng trưởng vi
(Gonzalez and Bashan, 2000),nhưng quy trình cố định tự nhiên xảy ra, sự kết hợp cố
Trang 53
2000) làm giảm lượng tảo (quá trình lão hóa tảo dẫn tới chết) (Lebsky et al., 2001) Nghiên cứu đã cố gắng phân lập và mô tả đặc tính của chủng tảo này thích nghi tốt trong điều kiện môi trường nóng như ở môi trường sa mạc và có tiềm năng như là chất dùng để xử lý được nước thải dưới điều kiện không thuận lợi này Chủng tảo này được cho tiếp xúc dưới điều kiện được điều chỉnh hoàn toàn bằng phản ứng sinh học và điều kiện nhiệt, ánh sáng cao đang có sẵn trong khu vực môi trường đó và có được sự tương tác cần thiết với vi khuẩn MGPB để chủng tảo này phát triển
II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Phân lập tảo
Trong các mẫu thu thập thường xuyên vào tháng 08 năm 2003 từ các cơ sở xử lý nước thải của thành phố La Paz, Baja California Sur, Mexico, xảy ra hiện tượng tảo lục nở hoa trên diện rộng được quan sát ở hồ chứa Trong thời gian lấy mẫu vào giữa
nước được thu thập từ bề mặt của ao và được đưa đến các phòng thí nghiệm Các tảo
sử dụng kỹ thuật tiêu chuẩn vi sinh Các tảo cũng thường xuyên được nuôi và bảo
2.2 Xác định các tảo
Trình tự gen 18S rDNA được xác định như sau: tảo đã được nuôi tại môi trường
C-30 trong 10 ngày, thu được bằng cách ly tâm, rửa sạch hai lần với nước muối, và làm
khô lạnh Một mẫu 0,5g của các tế bào Chlorella khô được ủ trong 30 phút trong 30
mL đệm TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) Sau khi ly tâm, các tế bào được chiết xuất với một số giọt TE đệm và phần cặn được làm khô với nitơ lỏng Việc tách DNA ra và thanh lọc được thực hiện theo phương pháp chuẩn PCR và lớp lót bên trong được liệt kê bởi Huss và cộng sự (1999) Trình tự đã được thực hiện theo chu trình phân tích nguồn gốc với lăng kính ABI 310 (Perkin- Elmer / Cetus, Boston, MA, USA) Trình tự xác định 18S rRNA thủ công phù hợp với một số tài liệu tham khảo để
so sánh và nhận dạng với tảo lục
Trang 62.3 Tăng trưởng của tảo dưới nhiệt độ cực cao và sự phơi nắng
được xây dựng với những điều sau đây (Hình 1) a: 1-1 lên men kín (vi khuẩn Omni,
VIRTIS, NY, USA 400 ml chất lỏng) với kiểm soát thông khí dưới đáy và trộn kết nối với một hệ thống làm mát bên ngoài (Model 1160S, VWR, Niles, IL, USA) tại nhiệt
(Biotronette Mark III, Melrose Park, IL, USA) được bao phủ bởi lá nhôm ở mặt trong
đốt (200 W) và thêm 4 bóng (100 W) gắn trên một cột vào hai bên của bình lên men, hai bên đặt đèn halogen 400W cho nên khoảng cách của các đèn được bố trí sao cho các phản ứng sinh học có thể được thay đổi bởi cường độ ánh sáng khác nhau Các
kế (Model 840.010, Sper Scientific, Scott ) Nhiệt độ trong buồng tăng trưởng và
buồng lên men được kiểm soát bởi hệ thống làm mát và điều hòa không khí Ngoài ra, nhiệt còn rất lớn ở những cường độ ánh sáng cao xung quanh nơi lên men Sự biến đổi
được kiểm soát bởi hệ thống sưởi ấm và làm mát lên men của femeter với sự thay đổi
± 1oC
Trang 75
Trang 8Sơ đồ biểu diễn (A) và hình chụp (B) của buồng môi trường, với các phụ kiện của nó, được sử dụng ở nhiệt độ cao và các thí nghiệm cường độ ánh sáng cao
(a) fementor bao gồm (1) lọ, (2) nhiệt kế, (3) khuấy, (4) sục khí, (5) lò, (6) cổng nhận
để chiết mẫu, (7) làm mát nước đầu vào, (8) làm mát nước đầu ra;
(b) hai đèn halogen (400W) nằm ở phía trước của lọ;
(c) hai cột với bốn đèn sợi đốt (600W mỗi cột) nằm trên cả hai mặt của lọ;
(d) ba quạt(một lớn và hai nhỏ);
(e) nước tuần hoàn làm mát hệ thống; lá nhôm được phủ lên buồng môi trường (Schematic không phải là quy mô.)
2.4 Cố định với vi khuẩn A brasilense trong hạt alginate, loại bỏ nitơ, và
phân tích sắc tố
Cố định tảo với vi khuẩn được thực hiện theo de-Bashan et al (2004) Tóm lại,
tăng trưởng vi khuẩn A brasilense (DSM 1843, Braunschweig, Đức; ở mức 1,3 ± 0,2
định hai vi sinh vật trong hạt như nhau, cấy 1 lớp mỏng, mỗi lớp được lơ lửng trong
10 ml dung dịch nước muối 0,85% và sau đó trộn với nhau trong alginate trước khi các hạt định hình Vì quy trình cố định và phối hợp cố định thường làm giảm số lượng
tế bào Azospirillum trong các hạt, cần thiết ủ qua đêm thứ hai trong chất dinh dưỡng
đã pha loãng Để đếm tế bào, các hạt này được hòa tan bằng cách ngâm hạt trong dung
brasilense, đếm bằng cách cấy chuỗi pha loãng (ở muối 0,85% ) lên đĩa thạch dinh
dưỡng (Sigma) và Chlorella sau đó đếm dưới ánh sáng kính hiển vi với huyết tốc kế
Neubauer
Amoni được đo bằng cách sử dụng các kỹ thuật phân tích nước tiêu chuẩn (APHA, AWWA, WPCF, 1992) sử dụng bộ dụng cụ (Hach, Loveland, CO, USA) và một quang phổ kế (Hach DR / 2000, Loveland, CO, USA) theo nhà sản xuất Sắc tố
(chlorophyll a và b, violaxanthin, và zeaxanthin) được xác định sau khi hòa tan các hạt và giải phóng tế bào C sorokinina, đo bằng HPLC, như được mô tả bởi de-Bashan
et al (2002a) Trong phương pháp này, sắc tố ngay lập tức được chiết bởi HPLC
Trang 97
được phát hiện với những tín hiệu hấp thụ mảng diode ở bước sóng 440 nm Việc xác định được thực hiện bằng cách so sánh thời gian lưu và peak chuẩn thương mại được
http://www.c14.dhi.dk/index.htm) Xác định số lượng trong kết quả sử dụng các yếu
tố phản ứng sắc tố (khu vực đỉnh cao HPLC / khối màu) thu được từ peak thương mại, như mô tả của Mantoura và Repeta (1997) Kết quả được thể hiện như ng sắc tố/tế bào
2.5 Việc thích ứng của tảo với nhiệt độ cao và ánh sáng cực mạnh
Vì tiếp xúc đột ngột với nhiệt độ cao hoặc ánh sáng cường độ cao hoặc cả hai kết
quả là tan vỡ tế bào C sorokiniana (S Fendrich, 2005, luận án Diploma, Đại học Kỹ
thuật, Hamburg- Harburg, Đức), nên cần thiết có thời gian để thích ứng Do có ít kiến thức về nhiệt độ và ánh sáng cần cho chế độ thích nghi của các loài tảo này, theo đó
có ba cơ chế thích ứng, mỗi cơ chế bao gồm năm ngày, đã được thử nghiệm (i) Nhiệt
2.6 Thí nghiệm thực nghiệm
Mỗi thí nghiệm lên men sử dụng 17g hạt aginate trong 400ml nước thải tổng hợp trong năm ngày Việc tiếp xúc với điều kiện khắc nghiệt (ánh sáng, nhiệt độ, hoặc cả
Bởi vì quá trình lên men kín, nên amoniac không thể bốc hơi và thoát Các kỹ thuật
Trang 10khác nhau (hạt mà không có vi sinh vật, một mình nước thải, và tảo và vi khuẩn cố
quan đến tảo và vi khuẩn cố định riêng biệt được trình bày
2.7 Phân tích thống kê và tính toán tốc độ tăng trưởng và thời gian nhân đôi
Mỗi thí nghiệm thực hiện ba lần, mà mỗi lần đều lặp lại quá trình lên men Ba mẫu
20 ml cho mỗi lần phân tích được đưa đi phân tích nước trong khoảng thời gian 24h Các sắc tố được phân tích trong sáu lần Mỗi thí nghiệm, bao gồm việc thích ứng với điều kiện khắc nghiệt, được lặp đi lặp lại hai lần Kết quả được phân tích một chiều của ANOVA cùng với phân tích post-hoc của Tukey và phân tích t-test của sinh viên, tất cả đều ở mức P ≤ 0.05, với Statistica, phần mềm phiên bản 6 (StatSoft, Tulsa, OK,
khi N1 và N0 là những tế bào ở thời điểm 1 (t1) và thời gian 0 (t0) Thời gian hình
tính toán tốc độ tăng trưởng
Trang 119
Biểu đồ Thời gian nuôi cấy 2 Sự tăng trưởng Chlorella sorokiniana UTEX 2805 trong nước thải tổng hợp, cố định riêng hoặc với Azospirillum brasilense Cd trong hạt
A brasilense Cd trong điều kiện tăng trưởng (e, f) Vị trí cho mỗi lần nuôi cấy, trong
mỗi subfigure riêng biệt được ký hiệu bằng chữ viết hoa khác nhau và khác đáng kể trong phân tích t-test của sinh viên tại P ≤ 0.05 Đơn vị đo áp xuất đại diện trong SE là bars Dữ liệu được trình bày đầy đủ chu kì của mỗi 24h
III KẾT QUẢ
3.1 Ưu thế về nhiệt độ và sự tiếp xúc ánh nắng trong bể chứa nước thải
Nhiệt độ và cường độ ánh sáng trong khu vực này đã được đo trong ba năm liên tiếp (2003-2005) từ tháng 6 đến tháng 9 Mặc dù các giá trị thay đổi từ năm này sang
Trang 12năm khác và những ngày này sang ngày khác khi các phép đo được thực hiện, nhưng nhìn chung các đặc điểm tương tự nhau Nhiệt độ vào buổi trưa được đo ( thấp – cao):
(1969–2176), tháng 7 (2048–2137), tháng 8 (2002–2434), tháng 9 (1878–2040) Nhiệt
năm 2005 tại buổi trưa)
Hình 3: Tốc độ tăng trưởng (K) (a, b) của Chlorella sorokiniana UTEX 2805 cố định đơn bào hoặc với Azospirillum brasilense Cd trong hạt alginate và nuôi cấy trong
Trang 1311
3.2 Xác định tảo
Chuổi di truyền 18S rDNA hoàn chỉnh của UTEX 2805 có sẵn trong ngân hàng Gen ( mã số AM423162) Với hai nucleotide trao đổi là nơi đa dạng nhất của gen
( Huss và cộng sự, 1986 ), có có tới 99 % kiểu di truyền tương tự với chủng SAG 211
– 8k (Sammlung Für Algenkulturen ở Gottingen, Đức) của C sorokiniana (X62441) Tương tự với các chủng sorokiniana khác (X73993, X74001, AB080307) dao động từ
99,6% đến 99,9%, tương ứng với bảy, ba, và một nucleotide trao đổi Tương tự với
các chủng khác liên quan mật thiết với loài Chlorella, C vulgaris SAG 211-11b (X13688) và Chlorella lobophora Andreyeva 750-I (X63504), giống tới 99,5% Dựa trên những dữ liệu phân biệt của nó, đó là một đặc điểm quan trọng cho C
sorokiniana (Kessler,1985), UTEX 2805 rõ ràng có thể được gán với C sorokiniana Hình 4: Khả năng loại bỏ amoni của Chlorella sorokiniana UTEX 2805 từ nước thải tổng hợp, cố định đơn bào hoặc với Azospirillum brasilense Cd trong hạt alginate, ở
s-1) Và hai nồng độ
Trang 143.3 Sự phát triển của chủng C sorokiniana ở 40o C trong môi trường nuôi cấy
lơ lửng dưới cường độ ánh sáng cao
Trong hệ thống giá thể lơ lửng, chủng C sorokiniana UTEX 2805 một mình có thể
Fendrich, 2005 luận án Diploma, Technische Universität, Hamburg-Harburg, Đức)
cấp tảo và chúng đã tăng trưởng thành công ở tất cả các cường độ ánh sáng Tại 45 µmol m2s-1, theo tính toán, tỷ lệ tăng trưởng cụ thể là 0,22 (thời gian nhân đôi 3.27
tốc độ tăng trưởng cụ thể tính toán được là 0,06 (thời gian nhân đôi 11,43 ngày) Theo
3.4 Sự phát triển của C sorokiniana cố định với A brasilensetrong hạt
alginate tăng theo nhiệt độ và cường độ của ánh sáng
Dưới ảnh hưởng của nồng độ amoni khác nhau và được tiêm thêm MGPB A
brasilense, nhiệt độ cao (40oC) và cường độ của ánh sáng (2500 µmol m2s-1) so với
C và 60 µmol m2s-1) , cải thiện tăng trưởng
đáng kể tăng trưởng của chủng C sorokiniana (Fig 2) Thúc đẩy tăng trưởng bởi A
brasilense thì thấy C sorokiniana được phát hiện nhiều hơn ở nồng độ amoni clorua
nhiệt độ và ánh sáng giới hạn và dưới điều kiện tăng trưởng chung (Hình 2b và d.) Tỉ
lệ tăng trưởng lớn nhất khi A brasilense đã được đồng cố định với C sorokiniana khi
tiếp xúc với điều kiện nuôi cấy giới hạn (Hình 3b.) dưới điều kiện nồng độ amoni cao Hiệu quả tăng trưởng không được quan sát dưới điều kiện nồng độ amoni thấp
(Hình 3a) Đồng thời, các quần thể của A brasilense giảm ở các mức độ amoni thấp,
nhưng vẫn cao hơn đáng kể trong điều kiện khắc nghiệt (Hình 2e.), trong khi duy trì quần thể tương tự theo nồng độ amoni cao bất kể điều kiện tăng trưởng
3.5 Loại bỏ amoni trong nước thải tổng hợp bởi C sorokiniana cố định với
A brasilense dưới điều kiện tăng nhiệt độ và cường độ của ánh sáng
Ở mức độ amoni ban đầu thấp hơn, trong cùng môi trường chứa C sorokiniana và
A brasilense loại bỏ amoni tốt hơn môi trường chỉ chứa C sorokiniana (Hình 4a và