Ứng dụng kỹ thuật lai điểm để phát hiện methyl hóa gen RASSF1A, GSTP1 ở bệnh nhân ung thư vú và ung thư tuyến tiền liệt

Tiếp nối các nghiên cứu phân tích sự methyl hóa các gen ức chế khối u cũng như kết hợp kỹ thuật MSP và kỹ thuật lai điểm để phát hiện methyl hóa DNA của Phòng Thí nghiệm Sinh Y, chúng tô

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−

Đoàn Thị Hồng Vân

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT LAI ĐIỂM ĐỂ PHÁT HIỆN METHYL HÓA

GEN RASSF1A, GSTP1 Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ VÚ VÀ UNG THƯ

TUYẾN TIỀN LIỆT

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội-2017

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−

Đoàn Thị Hồng Vân

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT LAI ĐIỂM ĐỂ PHÁT HIỆN METHYL HÓA

GEN RASSF1A, GSTP1 Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ VÚ VÀ UNG THƯ

TUYẾN TIỀN LIỆT

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS Võ Thị Thương Lan

Hà Nội-2017

LỜI CẢM ƠN

Trong những năm tháng theo học và làm việc tại Phòng Thí nghiệm Sinh Y, tôi

có cơ hội học hỏi kiến thức mới, có điều kiện thực hành cũng như tiếp xúc với tác phong khoa học nề nếp Tôi được thử sức mình với những khó khăn, thử thách của

thực nghiệm mang lại Vì thế, lời cảm ơn đầu tiên, tôi xin được gửi tới PGS TS Võ Thị Thương Lan – người đã bên cạnh tôi suốt những năm tháng đó Cô là người

hướng dẫn đặc biệt, tâm huyết và vô cùng kiên nhẫn sửa đổi khuyết điểm của tôi

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS Tạ Bích Thuận Mặc dù, cô không

hướng dẫn trực tiếp nhưng những lời động viên của cô làm cho tôi suy nghĩ tích cực

hơn trong lúc gặp trắc trở Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới ThS Phạm Anh Thùy Dương và NCS Ngô Thị Hà – hai người chị luôn chia sẻ kinh nghiệm và lắng nghe

những khúc mắc của tôi Tôi gửi lòng yêu mến của mình tới các bạn đồng khóa cùng toàn thể sinh viên và học viên cao học trong Phòng Thí nghiệm Sinh Y

Để có được kết quả trong luận văn này, tôi xin cảm ơn Khoa Giải phẫu, Bệnh viện K, các thầy cô Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội đã tạo điều kiện giúp đỡ trong quá trình học tập và thực hành

Tôi gửi lòng biết ơn cũng như lời cảm ơn này tới các thành viên trong gia đình

đã ủng hộ mọi quyết định của tôi

Hà Nội, ngày 27 tháng 7 năm 2017

Học viên cao học

Đoàn Thị Hồng Vân

MỤC LỤC

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 METHYLHÓADNAVÀUNGTHƯ 2

1.1.1 Methyl hóa DNA 2

1.1.2 Methyl hóa DNA và ung thư 5

1.1.3 Methyl hóa gen GSTP1 7

1.1.4 Methyl hóa gen RASSF1A 8

1.2 MỘTSỐKỸTHUẬTPHÂNTÍCHSỰMETHYLHÓADNA 10

1.2.1 Các kỹ thuật phân tích phổ biến 10

1.2.2 Kỹ thuật khuếch đại đặc hiệu methyl MSP (Methylation-Specific PCR) 12

1.3 KỸTHUẬTLAIĐIỂM 15

1.3.1 Nguyên tắc chung kỹ thuật lai axit nucleic 15

1.3.2 Phương pháp đánh dấu đầu dò 17

CHƯƠNG 2 – NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 26

2.1 CÁCBƯỚCTIẾNHÀNHTHÍNGHIỆM 26

2.2 NGUYÊNLIỆU,HÓACHẤTVÀTHIẾTBỊ 26

2.2.1 Nguyên liệu 26

2.2.2 Hóa chất 27

2.2.3 Thiết bị 30

2.3 PHƯƠNGPHÁP 30

2.3.1 Tách chiết DNA từ mẫu bệnh phẩm ung thư vú 30

2.3.2 Xử lý DNA với sodium bisulfite 30

2.3.3 Phương pháp PCR 30

2.3.4 Tinh sạch sản phẩm PCR 34

2.3.5 Tách plasmid 35

2.3.6 Phương pháp xác định nồng độ DNA bằng quang phổ hấp thụ 35

2.3.7 Điện di 35

2.3.8 Phương pháp lai điểm 35

2.3.9 Phương pháp phân tích thống kê sinh học 36

CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38

3.1 ĐIỀUKIỆNLAIĐIỂMTỐIƯUCỦAĐẦUDÒG200VÀR200PHÂNBIỆT TRÌNHTỰBỊMETHYLHÓAVÀTRÌNHTỰKHÔNGBỊMETHYLHÓA 38

3.1.1 Kết quả tinh sạch các trình tự nucleotide bị methyl hóa và trình tự nucleotide không bị methyl hóa 38

3.1.2 Kết quả tổng hợp đầu dò 39

3.1.3 Điều kiện lai điểm phân biệt trình tự GSTP1 bị methyl hóa (MeG) và trình tự GSTP1 không bị methyl hóa (UnG) với đầu dò G200 40

3.1.4 Điều kiện lai điểm phân biệt trình tự RASSF1A bị methyl hóa (MeR) và trình tự RASSF1A không bị methyl hóa (UnR) với đầu dò R200 42

3.2 PHÂNTÍCHSỰMETHYLHÓAPROMOTERGEN GSTP1 VÀ RASSF1A BẰNGKỸTHUẬTMSP 47

3.2.1 Tách chiết DNA 47

3.2.2 Xử lý DNA với sodium bisulfite 49

3.2.3 Xác định sự methyl hóa promoter của hai gen GSTP1 và RASSF1A trên các mẫu bệnh phẩm 50

3.2.4 Mối liên hệ giữa sự methyl hóa và các thông số sinh học 55

3.2.5 Kết quả lai điểm trên một số sản phẩm MSP từ mẫu bệnh phẩm 57

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO 60

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Các plasmid sử dụng cho kỹ thuật lai điểm 27 Bảng 2.2 Thành phần các dung dịch dùng trong quá trình lai điểm 28 Bảng 2.3 Trình tự mồi sử dụng cho nghiên cứu và kích thước sản phẩm PCR tương

ứng 29

Bảng 2.4 Thành phần và điều kiện phản ứng MSP với cặp mồi khuếch đại trình tự

GSTP1 bị methyl hóa 31

Bảng 2.5 Thành phần và điều kiện phản ứng MSP với cặp mồi khuếch đại trình tự

GSTP1 không bị methyl hóa 32

Bảng 2.6 Thành phần và điều kiện phản ứng MSP với cặp mồi khuếch đại trình tự

RASSF1A bị methyl hóa 33

Bảng 2.7 Thành phần và điều kiện phản ứng MSP với cặp mồi khuếch đại trình tự

RASSF1A không bị methyl hóa 33

Bảng 2.8 Thành phần và điều kiện phản ứng PCR tổng hợp đầu dò có và không có

biotin 34

Bảng 3.1 Điều kiện lai điểm phân biệt sản phẩm tinh sạch mang trình tự GSTP1 bị

methyl hóa (MeG) và trình tự GSTP1 không bị methyl hóa (UnG) sử dụng

đầu dò G200 40

Bảng 3.2 Điều kiện lai điểm phân biệt sản phẩm tinh sạch mang trình tự RASSF1A bị

methyl hóa (MeR) và trình tự RASSF1A không bị methyl hóa (UnR) sử dụng

đầu dò R200 45

Bảng 3.3 Nồng độ và độ sạch của một số mẫu DNA tách chiết từ mẫu mô 48 Bảng 3.4 Nồng độ và độ sạch của một số mẫu DNA sau xử lý với sodium bisulfite 49

Bảng 3.5 Tỷ lệ methyl hóa hai gen GSTP1 và RASSF1A trong ung thƣ vú 55 Bảng 3.6 Mối liên hệ giữa sự methyl hóa promoter hai gen GSTP1 và RASSF1A với

các thông số sinh học của bệnh nhân ung thƣ vú 56

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Sự methyl hóa DNA trong genome động vật có vú 4

Hình 1.2 Cấu trúc gen GSTP1, mRNA, protein và các yếu tố điều hòa phiên mã 7

Hình 1.3 Cấu trúc gen RASSF1A 9

Hình 1.4 Phương pháp biến đổi DNA nhờ sodium bisulfite 12

Hình 1.5 Các cặp mồi của kỹ thuật MSP 13

Hình 1.6 Kỹ thuật MethyLight 14

Hình 1.7 Phương pháp đánh dấu thông qua phản ứng tổng hợp DNA in vitro 18

Hình 1.8 Hệ thống đánh dấu gián tiếp 20

Hình 1.9 Mức độ tương đồng giữa trinh tự bị methyl hóa và trình tự không bị methyl hóa với đầu dò đặc hiệu 23

Hình 3.1 (A) Kết quả tách plasmid mang các trình tự bị methyl hóa và không bị methyl hóa (B) Kết quả điện di 4 ng tinh sạch sản phẩm PCR các trình tự nucleotide GSTP1 và RASSF1A bị methyl hóa (MeG, MeR) và trình tự nucleotide không bị methyl hóa (UnR, UnG) 39

Hình 3.2 Kết quả tổng hợp đầu dò G200, R200 có và không có biotin 39

Hình 3.3 Kết quả lai điểm với đầu dò G200 tại các nồng độ muối SSC khác nhau 41

Hình 3.4 Kết quả lai điểm với đầu dò R200 trên các sản phẩm tinh sạch mang trình tự RASSF1A bị methyl hóa (MeR) và trình tự RASSF1A không bị methyl hóa (UnR) 43

Hình 3.5 Kết quả lai điểm với đầu dò R200 tại nhiệt độ 400C, 450C và 490C trong dung dịch đệm lai có bổ sung 50% formamide 45

Hình 3.6 Kết quả lai điểm và điện di của sản phẩm PCR tinh sạch mang trình tự bị

methyl hóa (MeG, MeR) và trình tự không bị methyl hóa (UnG, UnR) 46

Hình 3.7 Kết quả điện di minh họa một số DNA tách chiết từ 49 cặp mẫu bệnh phẩm

mô ung thƣ vú-VU và mô liền kề-VL (A) và từ 10 mẫu đúc mô ung thƣ tuyến tiền liệt T1-T10 (B) 47

Hình 3.8 Kết quả điện di sản phẩm MSP phát hiện sự methyl hóa promoter GSTP1 sử

dụng các mẫu bệnh phẩm ung thƣ tuyến tiền liệt (T1-T10) 51

Hình 3.9 Kết quả điện di minh họa sản phẩm MSP phát hiện sự methyl hóa promoter

gen GSTP1 sử dụng các mẫu bệnh phẩm ung thƣ vú 52

Hình 3.10 Kết quả điện di minh họa sản phẩm MSP phát hiện sự methyl hóa promoter

RASSF1A sử dụng các mẫu bệnh phẩm ung thƣ vú 54

Hình 3.11 Kết quả lai điểm trên một số sản phẩm MSP từ mẫu bệnh phẩm ung thƣ vú

(A) và ung thƣ tuyến tiền liệt (B) 57

KÝ HIỆU VÀ CHỮ CÁI VIẾT TẮT

ATP Adenine triphosphate

dUTP Deoxyuridine triphosphate

ELISA Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay

GSTs Glutathione S-transferases

GSTP1 Glutathione S-transferases Pi 1

HER-2 Human Epidermal growth factor Receptor 2

ICR Imprinting Control Region

PCR Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp)

PR Progesterone Receptor

PSA Prostate specific antigen (kháng nguyên đặc hiệu tuyến tiền liệt)

RASSF1A Ras association domain family 1A

SDS Sodium Dodecyl Sulfate

SNP Single Nucleotide Polymorphism (đa hình đơn nucleotide)

SSC Saline Sodium Citrate

Các kỹ thuật phân tích methyl hóa DNA ngày càng phát triển và hoàn thiện không chỉ để đáp ứng độ nhạy và độ đặc hiệu cao mà còn có khả năng ứng dụng thực tiễn Hiện nay, kỹ thuật khuếch đại đặc hiệu methyl MSP (Methylation-Specific PCR) được sử dụng phổ biến trong nhiều phòng thí nghiệm, bởi có độ nhạy cao và không yêu cầu thiết bị đặc biệt Mặc dù vậy, nhược điểm của MSP là không định lượng, có hiện tượng dương tính giả và cần thời gian chuẩn bị gel để phân tích kết quả Do vậy, nhiều nghiên cứu đã cải tiến kỹ thuật MSP cũng như kết hợp với các kỹ thuật khác nhằm mục đích tăng độ nhạy, độ đặc hiệu, khả năng ứng dụng trong thực tế và giảm chi phí Tiếp nối các nghiên cứu phân tích sự methyl hóa các gen ức chế khối u cũng như kết hợp kỹ thuật MSP và kỹ thuật lai điểm để phát hiện methyl hóa DNA của Phòng Thí nghiệm

Sinh Y, chúng tôi thực hiện đề tài: “Ứng dụng kỹ thuật lai điểm để phát hiện methyl

hóa gen RASSF1A, GSTP1 ở bệnh nhân ung thư vú và ung thư tuyến tiền liệt”

Chương 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 METHYL HÓA DNA VÀ UNG THƯ

1.1.1 Methyl hóa DNA

Di truyền ngoại gen là những thay đổi sự biểu hiện hoặc kiểu hình có khả năng

di truyền qua các thế hệ nhưng không do biến đổi về trình tự DNA [44] Methyl hóa DNA là một trong những cơ chế chính của di truyền ngoại gen liên quan trực tiếp tới

sự biến đổi hóa học DNA Đây là hiện tượng thêm một gốc methyl (-CH3) vào vị trí carbon số 5 của cytosine thành dạng 5-methylcytosine [44] Hiện tượng này xảy ra ở prokaryote và eukaryote [24] Ở vi khuẩn, methyl hóa DNA phân biệt DNA genome vi khuẩn với DNA của thực khuẩn thể, nhờ đó DNA của thực khuẩn thể bị cắt bởi các enzyme vật chủ Đối với thực vật, sự methyl hóa xảy ra ở các cấu trúc CG, CHG và CHH (trong đó H có thể là A, C hoặc T) Nhưng ở động vật có vú, sự methyl hóa xảy

ra ở cytosine trong dinucleotide CpG [24]

Ở động vật có vú, sự methyl hóa DNA được xúc tác bởi họ enzyme DNA methyltransferases (DNMTs) chuyển một gốc methyl từ S-adenyl methionine (SAM) vào carbon số 5 của gốc cytosine thành dạng 5-methylcytosine [24, 44] DNMT3A và DNMT3B có thể thiết lập sự methyl mới trên sợi DNA không được biến đổi Mặt khác, chức năng DNMT1 trong quá trình tái bản DNA để sao chép sự methyl hóa của sợi DNA bố mẹ tới sợi mới Cả ba enzyme này đều liên quan tới quá trình phát triển của phôi nhưng giảm biểu hiện vào cuối giai đoạn biệt hóa [44]

Sự methyl hóa DNA có liên quan và đóng vai trò quan trọng trong bất hoạt nhiễm sắc thể X, in dấu gen, ổn định hệ gen và điều hòa biểu hiện gen [12, 61]:

Bất hoạt nhiễm sắc thể X: Ở giới tính cái của động vật có vú (kiểu gen XX),

một trong hai nhiễm sắc thể X bị bất hoạt để bù lại sự mất cân bằng các gen liên kết với nhiễm sắc thể X so với giới tính đực (kiểu gen XY) Quá trình này xảy ra trong giai

đoạn phát triển phôi sớm [12] Sự bất hoạt xảy ra ngẫu nhiên với một trong hai nhiễm sắc thể và được duy trì trên cùng nhiễm sắc thể đó trong quá trình nguyên phân của tế bào cho tới khi phát triển thành mô trưởng thành Cơ chế duy trì nhiễm sắc thể X bị bất hoạt là sự methyl hóa quá mức đảo CpG vùng promoter các gen phân bố dọc theo chiều dài của nhiễm sắc thể X bị bất hoạt (Hình 1.1D) [12] Sự methyl hóa DNA trong trường hợp này xảy ra khá muộn [61] Quá trình bất hoạt được khởi đầu bởi sự hoạt

hóa các RNA không mang mã hoạt động kiểu cis (cis-acting noncoding RNA), từ đó

làm kích hoạt sự thay thế các nhân tố phiên mã, thay đổi nhiễm sắc thể và sau cùng, các CpG bị methyl hóa tại đảo CpG vùng promoter [43] Sự methyl hóa DNA rất cần thiết cho việc duy trì ổn định trạng thái không phiên mã của các gen nằm trên nhiễm sắc thể X bị bất hoạt [12]

In dấu gen: Ở động vật có vú, hệ gen có nguồn gốc từ bố và từ mẹ có chức

năng không cân bằng nhau nhưng đều cần cho sự phát triển bình thường Tính trạng của gen được biểu hiện phụ thuộc vào nguồn gốc di truyền từ bố hay mẹ Những gen được in dấu thường định vị theo cụm và các allen được đánh dấu khác nhau nhờ sự methyl hóa DNA, acetyl hóa/khử acetyl hóa histone, methyl hóa histone và thường liên quan tới các sợi antisene RNA [61] Các gen trong cụm thường chịu kiểm soát của vùng điều khiển in dấu ICR (Imprinting Control Region) (Hình 1.1E) Phôi sau khi thụ tinh, methyl hóa ICR ở dòng tế bào mầm không chịu sự tái lập chương trình của genome nhưng trong quá trình phát triển của tế bào mầm, sự methyl hóa ICR bị xóa và được thiết lập lại ICR hoạt động khi không bị methyl hóa và không hoạt động khi bị methyl hóa Ở trạng thái hoạt động, ICR sẽ điều khiển các gen bị in dấu biểu hiện [48]

Ổn định hệ gen: Methyl hóa DNA đóng vai trò ổn định hệ gen bằng cách bất

hoạt phiên mã các trình tự DNA lặp lại và các transposon nội sinh [61] Hoạt động phiên mã ở các vùng này bị ức chế bởi sự methyl hóa quá mức Nếu các transposon không bị ức chế bởi sự methyl hóa thì có thể làm đồng hoạt hóa các gen xung quanh hoặc phiên mã các yếu tố có khả năng di chuyển (Hình 1.1B) Nếu vùng lặp lại ở gần

tâm động đƣợc hoạt hóa phiên mã thì gây ra sắp xếp lại các vùng lân cận tâm động, có khả năng là nguyên nhân dẫn đến các nhiễm sắc thể không xếp hàng trong nguyên phân (Hình 1.1C) [43]

Hình 1.1 Sự methyl hóa DNA trong genome động vật có vú [43] (A) Phân loại promoter của

gen dựa trên mật độ CpG bị methyl hóa (B) Các transposon bị ức chế bởi sự methyl hóa DNA (C) Sự methyl hóa DNA ức chế phiên mã của các trình tự lặp lại vùng tâm động (D) Sự methyl hóa DNA duy trì bất hoạt gen trên một nhiễm sắc thể X (E) In dấu gen điều khiển biểu hiện gen đặc hiệu allen Sự methyl hóa DNA tại vùng điều khiển in dấu điều hòa các protein bám hoặc biểu hiện của các RNA không mang mã hoạt động kiểu cis

Điều hòa biểu hiện gen: Phân bố CpG đƣợc coi là vùng quan trọng cho sự điều

hòa của di truyền ngoại gen tới biểu hiện gen [41] CpG phân bố không ngẫu nhiên trong genome mà tập trung thành vùng đƣợc gọi là đảo CpG [11] Đảo CpG chiếm 1-2% genome, dài 200 bp đến vài kb, thành phần G và C ít nhất chiếm 50% với tỉ lệ quan sát/mong đợi >0,6 [11, 41] Các nghiên cứu hiện tại bổ sung thêm vào xung quanh đảo CpG các vùng CpG lân cận Mặc dù các vùng này có mật độ CpG thấp hơn nhƣng lại

có chức năng quan trọng đối với điều hòa biểu hiện gen Ví dụ, trong quá trình biệt hóa

tế bào, sự methyl hóa vùng CpG cách đảo CpG 2 kb diễn ra mạnh hơn sự methyl hóa tại đảo CpG, chứng tỏ vai trò chính của vùng lân cận này đối với hướng biệt hóa của tế bào [14] Đảo CpG thường gần với vùng promoter và/hoặc exon của gen [11] Mật độ CpG vùng promoter xác định sự methyl hóa sẽ ảnh hưởng tới biểu hiện gen (Hình 1.1A) Theo nghiên cứu của Lister và cs (2009), vùng promoter giàu CpG (High-density CpG Promoter, HCP) không bị methyl hóa ở tất cả các mô ngay cả khi sự phiên

mã của gen liên quan bị bất hoạt Vùng promoter mật độ CpG thấp (Low-density CpG Promoter, LCP) hầu như bị methyl hóa không kể tới sự hoạt hóa hay ức chế của gen Ngược lại, sự methyl hóa ở vùng promoter có mật độ CpG trung bình (Intermediate-density CpG Promoter, ICP) có liên quan tới sự bất hoạt gen [40] Bất hoạt phiên mã bởi sự methyl hóa DNA chưa được hiểu biết đầy đủ mặc dù đã có nhiều cơ chế được đưa ra Cơ chế thứ nhất, sự methyl hóa tại trình tự DNA điều hòa đặc hiệu và việc thêm nhóm methyl vào DNA có thể ngăn cản các protein điều hòa bám vào trình tự này [12]

Vì thế, sự methyl hóa DNA theo cơ chế này sẽ trực tiếp ngăn cản các gen hoạt động Một cơ chế khác điều hòa gián tiếp thông qua protein bám DNA Những protein này có vùng bám DNA bị methyl hóa nên có thể nhận biết và bám vào một hoặc nhiều CpG bị methyl hóa Sau đó, chúng tương tác hoặc tham gia vào phức bất hoạt quá trình phiên

mã như phức tái cấu trúc nhiễm sắc thể và/hoặc các enzyme biến đổi histone [12] 1.1.2 Methyl hóa DNA và ung thư

Methyl hóa DNA có nhiều ưu điểm để trở thành chỉ thị sinh học trong ung thư

và ứng dụng trong lâm sàng Thứ nhất, các chỉ thị methyl hóa DNA đặc hiệu cho các tế bào khối u và xảy ra với phần trăm cao hơn so với biến đổi di truyền [30] Thứ hai, DNA là phân tử hóa học ổn định, vì thế, có thể khuếch đại và phát hiện dễ dàng Thứ

ba, các khối u có nhiều vùng bị methyl hóa bất thường, một trong số đó đặc hiệu cho từng loại khối u trong khi một số khác có mặt ở hầu hết các loại khối u [30] Do đó, methyl hóa bất thường DNA có thể được tìm thấy trong các tế bào biểu mô có vẻ bình

thường [30] Ưu điểm này của dấu chuẩn methyl hóa DNA đã đáp ứng yêu cầu phát hiện sớm và sàng lọc quần thể người có nguy cơ mắc ung thư

Methyl hóa DNA bất thường được quan sát ở ung thư tự phát và ung thư do di truyền [41] Có hai hiện tượng thay đổi sự methyl hóa DNA thường xảy ra trong tế bào ung thư so với tế bào bình thường đã được nghiên cứu:

Trong tế bào bình thường, vùng dị nhiễm sắc bị methyl hóa cao Các vùng trình tự lặp lại như LINE, SINE, IAP và Alu bị bất hoạt, nhờ đó đảm bảo genome được toàn vẹn và ổn định Tuy nhiên, trong nhiều loại khối u, cơ chế này bị gián đoạn và xảy ra hiện tượng mất đi sự methyl hóa ở các vùng mà bình thường bị methyl hóa Đây được gọi là sự methyl hóa dưới mức Hiện tượng này tạo cơ hội cho sự tái tổ hợp không mong muốn trong nguyên phân Các yếu tố gen nhảy được tái hoạt hóa và tích hợp vào

vị trí bất kì trong hệ gen dẫn tới hình thành đột biến và sự bất ổn hệ gen Điều này có liên quan tới sự phát triển khối u và các giai đoạn của bệnh [36] Ví dụ, mất sự methyl

hóa DNA của Sat2 (juxtacentromeric satellite 2) và Satα (centromeric satellite) trong

ung thư vú có liên hệ với sự phát triển sớm của khối u trong khi ở ung thư buồng trứng thì chúng góp phần vào sự tiến triển của khối u và được đề nghị trở thành chỉ thị cho tiên lượng sớm [36]

Ngược lại với hiện tượng trên, ở các tế bào ung thư, các gen chịu sự bất hoạt do sự methyl hóa quá mức đảo CpG mà trong tế bào bình thường chúng không bị methyl hóa [36] Các gen liên quan tới chu trình tế bào, sửa chữa DNA, kháng thuốc và khử độc, biệt hóa, tự chết theo chu trình, tăng sinh mạch, di căn và xâm nhập đều bị bất hoạt bởi methyl hóa quá mức [11] Nghiên cứu của Drexlex và cs (1998), hai gen liên quan tới

chu trình tế bào là p16 INK4a và p15 INK4a chịu sự methyl hóa quá mức ở nhiều loại ung

thư Nhiều gen sửa chữa DNA cũng bị methyl hóa trong các khối u như MGMT, MLH1 Điển hình, sự methyl hóa gen BRCA1, gen liên quan tới sửa chữa đứt gãy sợi

đôi DNA, được nghiên cứu nhiều ở ung thư vú và ung thư buồng trứng [36]

Dấu chuẩn methyl hóa DNA được tiến hành phân tích thuận tiện và có thể sử dụng kết hợp với các phương pháp chẩn đoán khác Methyl hóa DNA không chỉ có thể ứng dụng trong chẩn đoán mà còn là công cụ hỗ trợ xác định và phân loại khối u, có khả năng dự đoán đáp ứng điều trị và cải thiện tiên lượng bệnh [13]

1.1.3 Methyl hóa gen GSTP1

Glutathione S-transferases (GSTs) bao gồm các enzyme có nhiều chức năng Các enzyme này có vai trò giải độc cho tế bào, bảo vệ các đại phân tử khỏi các chất oxi hóa [27] GST Pi 1 (GSTP1) là một trong ba lớp phổ biến của GSTs [45]

Gen GSTP1 nằm trên vùng 11q13, dài 2.8 kb và bao gồm 7 exon Khung đọc

mở bắt đầu tại vị trí 3’ của exon đầu tiên và dài 630 bp, mã cho protein gồm 290 axit amin với khối lượng phân tử khoảng 23224 Da (Hình 1.2) [45] Vùng mã hóa bị điều khiển bởi đảo CpG thuộc vùng promoter nằm ở phía trước vị trí khởi đầu phiên mã Cả khu vực này bị phân cách bởi trình tự dài lặp lại ATAAA Trình tự lặp lại ATAAA hoạt động gần như là một nhân tố để phân chia các trạng thái khác nhau của di truyền ngoại gen [53] Ngoài ra, nhiều nhân tố phiên mã khác như SP1 (Stimulator protein 1), AP1 (Activator protein 1), yếu tố nhân tăng cường hoạt hóa tế bào B (NF-ĸB) và

GATA1 cũng đóng vai trò quan trọng trong điều hòa biểu hiện GSTP1 (Hình 1.2) [53]

Hình 1.2 Cấu trúc gen GSTP1, mRNA, protein và các yếu tố điều hòa phiên mã [45, 53]

Protein GSTP1 liên quan tới điều hòa chết theo chương trình của tế bào GSTP1 tương tác với tín hiệu gây chết c-Jun NH2-terminal kinase (JNK1) hoặc thụ thể liên quan với nhân tố hoại tử khối u (TRAF2) GSTP1 có chức năng chuyển hóa và giải độc

nên gen GSTP1 biểu hiện ở hầu hết các tế bào, đặc biệt các tế bào tiếp xúc với môi

trường bên ngoài như tế bào của hệ thống tiết niệu, tiêu hóa, hô hấp [53] Mức độ biểu

hiện GSTP1 tăng chứng tỏ hoạt động giải độc tăng cường để đáp ứng với các chất oxi

hóa Thực nghiệm cho thấy, chuột không biểu hiện protein GSTP1 sẽ nhạy cảm với các độc tố môi trường, thúc đẩy hình thành đột biến và phát triển ung thư [53] Sự methyl

hóa quá mức vùng promoter dẫn tới bất hoạt biểu hiện gen GSTP1 được nghiên cứu

như một chỉ thị tiềm năng cho chẩn đoán ung thư tuyến tiền liệt [53] Ngoài tuyến tiền liệt, protein GSTP1 biểu hiện ở nhiều mô trong đó có mô vú [45] Do đó, sự methyl

hóa bất thường vùng promoter GSTP1 cũng được phát hiện ở các bệnh nhân ung thư vú [53] Hiện nay, nhiều nghiên cứu đã chứng minh sự methyl hóa bất thường GSTP1 là

một sự kiện xảy ra sớm trong quá trình phát sinh ung thư vú [37], có thể trở thành chỉ thị sinh học cho sàng lọc sớm và nguy cơ mắc ung thư vú [18, 37]

1.1.4 Methyl hóa gen RASSF1A

Gen RASSF1 nằm trên vùng 3p21.3, có kích thước xấp xỉ 11 kb, bao gồm 8

exon [15] Sự cắt nối luân phiên cùng với việc phiên mã từ 2 promoter khác nhau tạo

thành 8 đồng phân khác nhau RASSF1A-RASSF1H trong đó RASSF1A và RASSF1C là hai dạng phổ biến [3] Gen RASSF1 có 2 vùng promoter tương ứng với 2 đảo CpG khác nhau Đảo CpG nhỏ có kích thước 737 bp chứa 85 CpG và là promoter của RASSF1A, RASSF1D, RASSF1E, RASSF1F và RASSF1G Đảo CpG lớn hơn có kích thước 1365

bp chứa 139 CpG và là promoter của RASSF1B và RASSF1C [3] RASSF1A bao gồm

các exon 1, 2, 3, 4, 5, 6 mã hóa cho chuỗi polypeptide gồm 340 axit amin có khối lượng phân tử 39 kDa (Hình 1.3) [3, 15]

Hình 1.3 Cấu trúc gen RASSF1A α, β, γ: các exon C1: vùng bảo thủ 1 (vùng bám của

diacylglycerol) ATM: trình tự xảy ra sự phosphoryl hóa đồng bộ của ATM-kinase RA domain: vùng tương tác của Ras [15]

Protein RASSF1A tham gia điều hòa nhiều quá trình sinh học của tế bào Protein RASSF1A có vai trò trong việc tổng hợp thoi vô sắc và thúc đẩy sự ổn định của chúng [15] Bên cạnh đó, RASSF1A có thể gây kìm hãm chu kì tế bào bằng cách tác động đến protein RB (Restinoblastoma protein) RASSF1A ức chế quá trình tích lũy cyclin D1 điều khiển sự phosphoryl hóa Rb và kiểm soát chết theo chương trình của tế bào từ pha G1 [15] Nhờ vậy, RASSF1A có thể ức chế chu trình tế bào ở điểm chuyển đổi G1/S Do đó, RASSF1A biểu hiện quá mức sẽ thúc đẩy quá trình chết theo chương trình, pha nghỉ chu trình tế bào và giảm tình trạng khối u ở các dòng tế bào ung thư [15] Ngược lại, thực nghiệm chứng minh rằng nếu protein RASSF1A giảm thì làm chu trình tế bào mất kiểm soát, tăng sự bất ổn hệ gen, kháng lại nhân tố cảm ứng quá trình

tự chết TNFα và K-Ras [15] Sự methyl hóa quá mức promoter RASSF1A có mối liên

hệ với việc giảm biểu hiện của protein RASSF1A Hiện tượng này được quan sát ở

nhiều loại ung thư phổ biến Tỷ lệ methyl hóa quá mức vùng promoter RASSF1A xảy

ra từ 99% ở các khối u cho tới 0% ở các mô bình thường ở xung quanh [23] Tỷ lệ cao nhất được báo cáo là 88%, 95% và 99% lần lượt ở ung thư phổi, ung thư vú và ung thư tuyến tiền liệt [15]

1.2 MỘT SỐ KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SỰ METHYL HÓA DNA

1.2.1 Các kỹ thuật phân tích phổ biến

Các kỹ thuật phân tích methyl hóa DNA có thể được phân chia theo số lượng và phân bố vị trí CpG thành các nhóm chính sau [41]:

Các kỹ thuật thuộc nhóm đánh giá toàn bộ số lượng C bị methyl hóa (Global

5mC quantification approaches) Ban đầu, số lượng C bị methyl hóa được đánh giá

dựa trên kỹ thuật sắc kí lỏng hiệu năng cao và kết hợp với khả năng phóng xạ của gốc methyl Sau đó, hướng tiếp cận này được cải tiến thành hóa mô miễn dịch sử dụng kháng thể của C bị methyl hóa, phân tích ELISA (methDNA-ELISA) Hướng tiếp cận này cho phép đánh giá toàn bộ những thay đổi chính về mức độ methyl hóa nhưng không cung cấp được thông tin vị trí bị methyl hóa [55] và không phân tích được sự methyl hóa DNA đặc hiệu vùng [41]

Các kỹ thuật thuộc nhóm đánh giá sự methyl hóa DNA của toàn bộ genome

(Genome-wide DNA methylation approaches) có thể sử dụng hoặc không sử dụng

microarray Kỹ thuật quét hệ gen vùng giới hạn (restriction landmark genome scanning, RLGS) không cần microarray Kỹ thuật quét vùng hệ gen xác định các gen bị methyl hóa đặc hiệu mô trong tế bào bình thường và các gen bị methyl hóa bất thường trong tế bào ung thư [55] Các kỹ thuật dựa trên microarray sử dụng kháng thể nhận biết C bị methyl hóa hoặc sử dụng protein bám trình tự bị methyl hóa; hoặc kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới [41, 55]

Các kỹ thuật thuộc nhóm đánh giá sự methyl hóa DNA đặc hiệu từng vùng

(Locus-specific DNA methylation approaches) sẽ xác định tình trạng methyl hóa

DNA từng vùng được chọn Vùng gen được chọn có số vị trí CpG biến đổi Các kỹ thuật thuộc nhóm này có chi phí tương đối thấp, đặc biệt hiệu quả khi vùng đích phân tích chứa các chỉ thị sinh học có giá trị Hướng tiếp cận này dựa trên phương pháp biến

đổi DNA nhờ sodium bisulfite hoặc phương pháp sử dụng các enzyme giới hạn nhạy cảm nhóm methyl (Methylation-sensitive restriction enzymes, MSREs)

Phương pháp sử dụng enzyme giới hạn nhạy cảm nhóm methyl dựa trên cơ sở nhận biết và cắt trình tự tại CpG không bị methyl hóa [41] Phương pháp sử dụng enzyme này có thể kết hợp cùng PCR để làm giàu đoạn trình tự bị methyl hóa hoặc không bị methyl hóa Phương pháp này tương đối đơn giản và yêu cầu ít lượng DNA Tuy nhiên, chỉ các CpG trong vị trí enzyme được phân tích và nếu cắt không hoàn toàn

có thể dẫn tới kết quả dương tính giả [55]

Phần lớn phân tích methyl hóa DNA được phát triển dựa trên phương pháp biến đổi DNA nhờ sodium bisulfite [55] Sodium bisulfite được sử dụng để chuyển gốc C không bị methyl hóa thành U, trong khi C bị methyl hóa được giữ nguyên Phản ứng này xảy ra trong điều kiện pH thấp và nhiệt độ cao với DNA ở dạng sợi đơn và không thể xảy ra khi DNA ở dạng sợi đôi [9, 34] Quá trình biến đổi nhờ sodium bisulfite gồm 3 bước cơ bản: phản ứng sodium bisulfite với liên kết đôi ở carbon số 5 và 6 của cytosine thành dẫn xuất cytosine sulphonate (bước 1); thủy phân loại gốc amine tạo thành uracil sulphonate (bước 2); loại bỏ gốc sulphonate bằng xử lý kiềm tạo thành gốc uracil (bước 3) (Hình 1.4A) [9] Khi xử lý DNA với sodium bisulfite trong điều kiện thích hợp, tỷ lệ biến đổi C không bị methyl hóa thành U mong đợi khoảng 99% [45] Tuy nhiên, một số vùng nhỏ DNA nhiều bản copy có tỷ lệ C không bị methyl hóa được biến đổi thấp [34] Tỷ lệ biến đổi này cũng phụ thuộc vào chất lượng DNA [34] DNA lẫn protein có tỷ lệ biến đổi bởi sodium bisulfite thấp hơn DNA sạch Protein lẫn trong mẫu sẽ làm cho quá trình xử lý với sodium bisulfite xảy ra không hoàn toàn Các vị trí không được biến đổi sẽ xuất hiện một cách ngẫu nhiên trên từng vùng hoặc từng vị trí đơn lẻ [63]

Hình 1.4 Phương pháp biến đổi DNA nhờ sodium bisulfite (A) Quá trình biến đổi DNA nhờ

sodium bisulfite Bước 1: sự sulphonate hóa Bước 2: sự thủy phân loại gốc amine Bước 3:

loại gốc sulphonate (B) Kết quả PCR với khuôn là DNA đã xử lý sodium bisulfite [66]

Việc biến đổi DNA nhờ sodium bisulfite chuyển gốc C không bị methyl hóa thành U nhưng gốc C bị methyl hóa được giữ nguyên, do đó tạo các sợi không bổ sung [9] Điều này cho phép phân biệt được DNA bị methyl hóa và không bị methyl hóa thông qua phản ứng PCR [55] Trong phản ứng PCR, uracil được khuếch đại như thymine và các C bị methyl hóa vẫn khuếch đại như cytosine (Hình 1.4B) [9]

1.2.2 Kỹ thuật khuếch đại đặc hiệu methyl MSP (Methylation-Specific PCR)

Kỹ thuật MSP được Herman và cs mô tả năm 1996, cho tới nay, nó trở thành một trong những kỹ thuật phổ biến Kỹ thuật phân tích này được phát triển dựa trên phương pháp biến đổi DNA nhờ sodium bisulfite [28] Mồi MSP được thiết kế để khuếch đại DNA bị methyl hóa Sự đặc hiệu này được quyết định bởi nhiều vị trí CpG trong trình tự mồi, thường ở gần hoặc tại vị trí đầu 3’ Trong điều kiện của phản ứng PCR, chỉ có sự khuếch đại DNA bị methyl hóa xảy ra Kỹ thuật MSP thường thiết kế

thêm cặp mồi thứ 2 để khuếch đại DNA không bị methyl hóa, vì thế khẳng định được

sự có mặt của khuôn đã được xử lý với sodium bisulfite (Hình 1.5) [34, 35] Cặp mồi đặc hiệu thiết kế cho DNA bị methyl hóa và cặp mồi đặc hiệu thiết kế cho DNA không

bị methyl hóa nên có cùng vị trí CpG trong trình tự [5] Cả hai bộ mồi này thường có giá trị Tm tương tự nhau, sai khác không quá 50C (Hình 1.5) Kích thước sản phẩm MSP được khuếch đại không quá 500 bp vì sự thoái hóa DNA xảy ra sau quá trình xử

lý với sodium bisulfite [5] Kỹ thuật điện di được sử dụng để phát hiện sản phẩm MSP,

so sánh độ sáng của băng điện di cho phép đánh giá tương đối mức độ methyl hóa [34]

Hình 1.5 Các cặp mồi của kỹ thuật MSP [35]

Kỹ thuật MSP rất nhạy để sàng lọc các gen bị methyl hóa với khả năng phát hiện 1 allen bị methyl hóa trong 1000 allen không bị methyl hóa [28] Kỹ thuật này áp dụng được trên các mẫu DNA bị giới hạn về số lượng và chất lượng ví dụ như DNA từ mẫu đúc [28, 55] Ngoài ra, kỹ thuật MSP không yêu cầu thiết bị đặc biệt, dễ sử dụng,

có thể áp dụng ở bất kỳ phòng thí nghiệm nào và được dùng rộng rãi cho việc phân tích

sự methyl hóa DNA tại nhiều vùng đặc hiệu [34] Hiện nay, một số hãng cung cấp các dung dịch cho phản ứng MSP như EpiTect MSP kit (Qiagen), CpG® Wizard BRCA1 Methylation (Millipore)…

Nhược điểm của kỹ thuật MSP là có thể cho kết quả dương tính giả đặc biệt khi

số chu kì PCR lớn Nguyên nhân có thể là do hiện tượng mồi bắt cặp sai và xử lý sodium bisulfite không hoàn toàn [34] Hiện tượng mồi bắt cặp sai có thể được ngăn chặn bằng cách giới hạn số chu kì và/hoặc sử dụng nhiệt độ gắn mồi cao Vì trong trình

tự mồi MSP có chứa nhiều CpG nên nếu quá trình xử lý sodium bisulfite xảy ra không hoàn toàn thì các phân tử DNA thu được có thể giống các trình tự bị methyl hóa Mặc

dù mồi MSP chứa nhiều CpG trong trình tự mồi sẽ làm cho mồi có tính đặc hiệu cao với khuôn bị methyl hóa nhưng chính nó cũng tạo thuận lợi cho sự khuếch đại các trình

tự bị biến đổi không hoàn toàn trong khuôn DNA bị xử lý [34] Bên cạnh đó, MSP không phải là kỹ thuật định lượng [55] Nhiều cải biến MSP sử dụng real-time PCR để phát hiện các gen bị methyl hóa và định lượng được phát triển như MethyLight (Hình 1.6), MSP định lượng dựa trên SYBR Green… [13, 55]

Hình 1.6 Kỹ thuật MethyLight Kỹ thuật này thiết kế probe gồm một đầu gắn với phân tử

fluorophore và một đầu gắn với phân tử quencher, có khả năng lai với trình tự đích nằm giữa hai mồi MSP Nếu mồi MSP bắt cặp được với trình tự đích, hoạt tính exonuclease của DNA polymerase sẽ phân cắt probe Sau khi cắt, fluorophore được giải phóng khỏi quencher và ánh sáng phát ra tạo tín hiệu huỳnh quang Ánh sáng phát ra tỷ lệ với số lượng đoạn được khuếch đại trong ống [34]

1.3 KỸ THUẬT LAI ĐIỂM

1.3.1 Nguyên tắc chung kỹ thuật lai axit nucleic

Lai axit nucleic bao gồm hỗn hợp sợi đơn từ hai nguồn khác nhau: phân tử đầu

dò (DNA tách dòng hoặc oligonucleotide) và phân tử đích Nếu ban đầu, hai phân tử này ở dạng sợi đôi thì chúng phải được tách thành sợi đơn dưới tác dụng của các yếu tố gây biến tính như kiềm, ure hoặc nhiệt độ cao Khi đó, các liên kết hydro giữa hai mạch đơn bị bẻ gãy nhưng không ảnh hưởng tới các liên kết phosphodieste Nếu các tác nhân biến tính bị loại bỏ và duy trì điều kiện môi trường thích hợp, hai sợi đơn trình

tự base tương đồng có thể liên kết tạo cặp trở lại (hồi tính DNA) Trong trường hợp hai mạch đơn có nguồn gốc khác nhau và có trình tự tương đồng, chúng bắt cặp tạo nên phân tử lai Hiện tượng tái bắt cặp như trên được gọi là quá trình lai phân tử [58]

Kỹ thuật lai được sử dụng nhiều nhất là các kỹ thuật lai pha rắn Thông thường, pha rắn là màng nitrocellulose hoặc màng nylon [59] Quá trình lai pha rắn sử dụng màng có thể chia thành 3 giai đoạn chính [4]:

Giai đoạn đầu tiên: DNA đích cố định trên màng nitrocellulose hoặc màng nylon được ủ tiền lai với dung dịch có chứa hóa chất khóa các vị trí của phân tử DNA không đặc hiệu bám trên bề mặt, nhờ đó giảm tín hiệu nền Hóa chất khóa màng có thể là dung dịch Denhardt hoặc DNA của tinh trùng cá hồi đã biến tính [4]

Giai đoạn thứ hai: dung dịch tiền lai được thay thế bởi dung dịch lai có chứa đầu

dò được đánh dấu, ủ trong điều kiện thích hợp cho phép đầu dò bám vào trình tự đích Trong suốt quá trình lai, đầu dò không chỉ lai với trình tự đích bổ sung 100% với nó

mà còn bám vào các trình tự tương đồng [4] Thông số được quan tâm trong một phản ứng lai là nhiệt độ nóng chảy Tm Tm là nhiệt độ mà tại đó 50% phân tử DNA tồn tại ở dạng sợi đơn, cho phép đánh giá sự ổn định sợi đôi axit nucleic

Chuỗi axit nucleic càng dài, thành phần GC trong chuỗi càng cao thì đầu dò sẽ

có số lượng liên kết hidro càng lớn và Tm càng cao [58] Đầu dò sử dụng cho các kỹ

thuật lai pha rắn sử dụng màng thường ngắn hơn 500 bp, thành phần GC nằm trong khoảng 40%-60% để hạn chế các yếu tố ảnh hưởng trên [4, 16, 17] Trong môi trường hóa học của phản ứng lai, các cation hóa trị một (ví dụ như Na+) sẽ làm ổn định cấu trúc sợi đôi trong khi phân tử phân cực như formamide và urea là các hóa chất gây biến tính DNA [58]

Giai đoạn cuối cùng: Màng được rửa với một loạt các dung dịch để chỉ giữ lại cấu trúc phân tử lai có mức độ tương đồng cao nhất [4] Phản ứng rửa được tiến hành để loại bỏ các đầu dò không lai với phân tử đích và phá vỡ các cấu trúc lai có nhiều vị trí bắt cặp sai Không giống với phản ứng lai, phản ứng rửa phụ thuộc vào mức độ ổn định của cấu trúc lai Cấu trúc lai đầu dò-phân tử đích ổn định nhất khi có sự kết cặp bổ sunghoàn toàn Các dung dịch rửa có thể tiến hành ở điều kiện khắt khe để phá vỡ sợi đôi có sự tương đồng thấp Điều kiện cho kỹ thuật lai liên quan tới nhiệt độ và nồng độ muối trong dung dịch Điều kiện chỉ cho phép giữ lại cấu trúc lai bắt cặp hoàn hảo được gọi là điều kiện khắt khe Điều kiện cho phép cấu trúc lai có nhiều vị trí không bắt cặp được gọi là điều kiện ít khắt khe Như vậy, nồng độ muối thấp và nhiệt độ cao

là điều kiện khắt khe, ngược lại, nồng độ muối cao và nhiệt độ thấp là điều kiện ít khắt khe [59]

Một số kỹ thuật lai trên pha rắn có nhiều ứng dụng như kỹ thuật lai Southern blot, Northern blot, lai điểm dot blot Kỹ thuật lai Southern blot phân biệt một đoạn DNA cụ thể có mặt trong hỗn hợp DNA Trong kỹ thuật này, trình tự DNA đích bị cắt bởi một hay nhiều enzyme giới hạn tạo thành các đoạn được phân tách trên gel agarose nhờ điện di Sau đó, các đoạn DNA được biến tính trong dung dịch kiềm để thành sợi đơn rồi chuyển lên màng nitrocellulose hoặc màng nylon để lai [58] Kỹ thuật Northern blot là một cải biến của Southern blot trong đó phân tử axit nucleic đích là RNA thay

vì DNA RNA hoặc DNAc đã được nhân dòng có thể sử dụng làm đầu dò trong lai Northern blot [58] Dựa trên nguyên tắc lai axit nucleic, kỹ thuật lai điểm dot blot được

Kafatos và cs mô tả năm 1979 nhằm phát hiện phân tử đích quan tâm Thao tác thực hiện kỹ thuật này đơn giản Khác với Southern blot, DNA đích trong kỹ thuật lai điểm dot blot không cần phải cắt với enzyme giới hạn và phân tách trên gel trước khi chuyển lên màng lai DNA đích đã biến tính được chấm lên màng nitrocellulose hoặc màng nylon và để khô Sau đó, tiến hành cố định DNA trên màng bằng cách chiếu tia UV trong vài phút hoặc ủ 800C trong 30 phút [4] DNA cố định trên màng sẽ được tiếp xúc với dung dịch chứa đầu dò đánh dấu Sau khoảng thời gian đủ để hình thành cấu trúc lai đầu dò-phân tử đích, dung dịch chứa đầu dò được loại bỏ Màng được rửa để loại đầu dò còn sót, để khô và thu tín hiệu lai điểm [4]

1.3.2 Phương pháp đánh dấu đầu dò

Đầu dò có thể được sản xuất số lượng lớn bằng cách nhân dòng trong tế bào vật chủ gọi là đầu dò nhân dòng hoặc có thể được tổng hợp hóa học Các phương pháp đánh dấu đầu dò bao gồm đánh dấu DNA sợi đơn, DNA sợi kép và RNA sợi đơn Trong quá trình đánh dấu, các nucleotide đã gắn với các chất đánh dấu như biotin, digoxigenin hay fluorescence được sử dụng thay thế hoặc kết hợp với các nucleotide bình thường khác Có hai phương pháp đánh dấu đầu dò DNA [58]

Đánh dấu ở đầu tận cùng: Phương pháp này có thể sử dụng enzyme polynucleotide kinase để thêm một nhóm đã được đánh dấu vào một hoặc một vài nucleotide tận cùng Chất đánh dấu thường ở dạng 32P tại vị trí γ-phosphate của ATP và hoạt tính của polynucleotide kinase sẽ thực hiện phản ứng chuyển nhóm phosphate sang đầu 5’ của các phân tử axit nucleic Phương pháp này có thể sử dụng để đánh dấu oligonucleotide dạng sợi đơn và phân tử DNA dạng sợi đôi

Đánh dấu thông qua phản ứng tổng hợp DNA in vitro thường được thực hiện theo một trong ba phương pháp (Hình 1.7):

Phương pháp đánh dấu bằng mồi ngẫu nhiên: Đầu dò được biến tính nhiệt để làm

khuôn cho DNA polymerase sử dụng dNTP đánh dấu và các mồi là các oligonucleotide (thường là hexa hoặc octanucleotide)

Phương pháp dịch chuyển điểm đứt: DNase I sẽ cắt phân tử DNA ở nhiều vị trí

tạo những điểm đứt phân bố một cách ngẫu nhiên trên hai mạch Từ những điểm đứt này, DNA polymerase I sẽ sử dụng dNTPs đánh dấu để sửa chữa Kết quả cuối cùng DNA được đánh dấu trên khắp chiều dài phân tử

Phương pháp đánh dấu nhờ PCR có hai cách thực hiện: (1) bổ sung một loại

nucleotide đánh dấu trong quá trình tổng hợp đầu dò; (2) sử dụng mồi có gắn nhóm đánh dấu ở đầu 5' Cách thứ nhất cho tín hiệu tốt hơn vì chất đánh dấu có mặt dọc theo đầu dò Phương pháp đánh dấu PCR có lợi thế đặc biệt so với các phương pháp khác Đầu dò được tạo ra một cách nhanh chóng với kích thước nằm trong phạm vi rộng; có thể thiết kế đầu dò từ bất cứ vùng gen nào quan tâm; chỉ cần lượng nhỏ khuôn DNA cho phản ứng tổng hợp Phương pháp này có thể áp dụng cho cả đầu dò sợi đơn (sử dụng một mồi) và sợi kép (sử dụng một cặp mồi)

Hình 1.7 Phương pháp đánh dấu thông qua phản ứng tổng hợp DNA in vitro [16, 17]

Chất đánh dấu đầu dò có thể dùng chất đánh dấu phóng xạ sử dụng các đồng vị phóng xạ (32P, 33P, 35S, 3H, 14C, 125I) Hiện nay chúng ít được sử dụng bởi một số hạn chế

như chu kỳ bán rã ngắn (chu kỳ bán rã của 32P là 14,3 ngày) do đó phải lặp lại bước đánh dấu đầu dò khi tiến hành thí nghiệm lai trong thời gian dài; nguy hiểm cho người

sử dụng; yêu cầu nghiêm ngặt cho phòng thí nghiệm và cá nhân sử dụng cũng như việc

xử lý chất thải Chất đánh dấu không phóng xạ hiện nay được dùng chủ yếu do có độ

an toàn, độ bền cao, đánh dấu tốt, có thể phát hiện tại chỗ và phát hiện nhanh chóng Chất đánh dấu không phóng xạ có hai loại [58]:

Hệ thống đánh dấu trực tiếp: chất đánh dấu được phát hiện trực tiếp Phổ biến nhất

là các enzyme như alkaline phosphatase hay horseradish perosidase, các chất huỳnh quang như fluorescence hay rhodamin

Hệ thống đánh dấu gián tiếp: chất đánh dấu đầu dò (gọi là nhóm báo cáo) không được phát hiện trực tiếp mà phải thông qua liên kết với một nhóm phát tín hiệu (gọi là nhóm chỉ thị) Nhóm chỉ thị có ái lực liên kết cao với nhóm báo cáo (nhờ phần ái lực)

Sự phát hiện axit nucleic trong hệ thống gián tiếp bao gồm ba phản ứng: (i) đầu dò đã được đánh dấu (mang nhóm báo cáo) lai với phân tử đích; (ii) nhóm báo cáo gắn vào đầu

dò liên kết với nhóm chỉ thị; (iii) nhóm chỉ thị phát tín hiệu (nhờ liên kết với nhóm báo cáo) (Hình 1.8)

Hình 1.8 Hệ thống đánh dấu gián tiếp [58]

Phổ biến nhất trong hệ thống này là hệ thống biotin (vitamin H) Trong đó, biotin đóng vai trò là nhóm báo cáo liên kết với nhóm chỉ thị streptavidin alkaline phosphatase (phần ái lực là streptavidin-một protein có nguồn gốc từ vi khuẩn

Streptomyces avidinii) Tương tác giữa biotin và streptavidin là tương tác sinh học không cộng hóa trị mạnh nhất được biết đến trong tự nhiên (hằng số phân ly K d=10-15) Đầu dò gắn biotin có thể được chuẩn bị dễ dàng với nucleotide đánh dấu biotin như biotin-11-dUTP hoặc biotin-16-dUTP

1.3.3 Một số ứng dụng của kỹ thuật lai điểm

Trong phân tích axit nucleic, ứng dụng phổ biến của lai điểm là phân biệt sự sai khác 1 nucleotide giữa các allen nhờ đầu dò đặc hiệu [58] Đầu dò được thiết kế trong vùng có vị trí nucleotide biến đổi và đặc hiệu với phân tử đích [58] Đối với nghiên cứu xác định và nhân giống cây trồng, lai điểm là một trong những kỹ thuật phù hợp với phân tích các đa hình đơn nucleotide (Single Nucleotide Polymorphism, SNP) [56]

Shirasawa và cs (2006) sử dụng các đầu dò đặc hiệu để tiến hành lai điểm kiểm tra 100 gen trên các cây lúa có SNP [57] Kiểu gen của 43 cây lúa được nhận biết và phân biệt với nhau dựa vào sự khác biệt ở 8 vị trí SNP Kết quả của nghiên cứu cho thấy những

ưu thế của lai điểm: tính chính xác cao, đơn giản và hiệu quả khi phân tích SNP trên số lượng mẫu lớn [57]

Sự kết hợp giữa kỹ thuật MSP và kỹ thuật lai đã được nhiều nghiên cứu sử dụng nhằm phân tích sự methyl hóa DNA [10, 21] Trong nghiên cứu của Raad và cs (2001), nhóm tác giả đánh dấu sản phẩm MSP với fluorescence tại đầu 3’ và lai với một loạt đầu dò Mười hai đầu dò được thiết kế để khảo sát tình trạng methyl hóa 15 vị

trí CpG trong exon đầu tiên của gen ERα và chia thành các cặp Mỗi cặp đầu dò có khả

năng phân biệt allen bị methyl hóa và allen không bị methyl hóa tại 2 đến 4 vị trí CpG của trình tự đích Nhờ đó, nhóm tác giả tạo ra một bản đồ bao gồm các vị trí CpG bị methyl hóa trong dòng tế bào ung thư vú, mẫu ung thư vú và mẫu mô bình thường [21] Nhóm tác giả Pearlly và cs (2003) cũng áp dụng phương pháp thiết kế đầu dò

trên để tiến hành khảo sát tình trạng methyl hóa đảo CpG gen RASSF1A Từ các dữ liệu

thu được, nghiên cứu chỉ ra sự phân bố vị trí CpG bị methyl hóa xảy ra từ exon đầu tiên tới vùng promoter trong mẫu ung thư vú Tuy nhiên, trong các mô vú bình thường, các vị trí methyl hóa này chỉ quan sát được ở exon đầu tiên và không quan sát được ở vùng promoter [47] Trong khi đó, Cle´ment và Benhattar (2005) sử dụng các đầu dò đánh dấu digoxigenin bổ sung với trình tự DNA được khuếch đại nhờ cặp mồi không

có CpG của phản ứng PCR Mỗi đầu dò sẽ xác định trình tự DNA bị methyl hóa hoặc không bị methyl hóa Để xây dựng đối chứng cho thí nghiệm lai điểm, hai tác giả đã trộn khuôn DNA bị methyl hóa và không bị methyl hóa theo tỷ lệ (0%, 20%, 50%, 100%), tiến hành xử lý bisulfite rồi khuếch đại bằng PCR Sản phẩm của phản ứng PCR được sử dụng cho kỹ thuật lai điểm với hai loại đầu dò Cường độ tín hiệu của các chấm trên trở thành đối chứng để định lượng tỷ lệ bị methyl hóa cho các mẫu phân tích khi lai với hai loại đầu dò Áp dụng đối chứng này, hai tác giả định lượng tỷ lệ methyl

hóa trên 3 gen hTERT, APC, và p16 đối với 2 mẫu mô bình thường và 10 mẫu ung thư

thực quản [10]

Dựa trên phương pháp sử dụng đầu dò đánh dấu trong nghiên cứu của Cle´ment

và Benhattar (2005), Phòng Thí nghiệm Sinh Y đã kết hợp kỹ thuật MSP và kỹ thuật lai điểm dot blot nhằm phân tích sự methyl hóa DNA Phòng Thí nghiệm Sinh Y đã thiết kế hai plasmid pMeG200 và pMeR200 lần lượt mang trình tự đầu dò (G200 và

R200) đặc hiệu với trình tự GSTP1 và RASSF1A bị methyl hóa sử dụng cho kỹ thuật lai

điểm Trình tự hai đầu dò này nằm trong vùng giàu CpG, giữa hai mồi MSP khuếch đại trình tự bị methyl hóa Nhờ đó, đầu dò chỉ phát hiện trình tự bị methyl hóa và không cho tín hiệu với các sản phẩm phụ khác (sản phẩm không đặc hiệu hoặc dimer) Do trình tự bị methyl hóa và trình tự không bị methyl hóa có sự tương đồng với nhau, sai khác nhau ở 5-6 vị trí CpG nên chúng tôi cần phải xác định điều kiện lai điểm để đầu

dò chỉ lai với trình tự bị methyl hóa (Hình 1.9) Nghiên cứu trước mới dừng lại ở kết quả tối ưu được điều kiện lai điểm của đầu dò G200 cho phép phát hiện đặc hiệu trình

tự GSTP1 bị methyl hóa, phân biệt với trình tự GSTP1 không bị methyl hóa có sử dụng

formamide trong dung dịch đệm lai.Trong nghiên cứu hiện tại, chúng tôi sẽ tối ưu điều kiện lai điểm của đầu dò G200 không sử dụng formamide và tiếp tục hoàn thiện điều kiện lai điểm cho đầu dò R200

Hình 1.9 Mức độ tương đồng giữa trinh tự bị methyl hóa và trình tự không bị methyl hóa với

đầu dò đặc hiệu (A) Mức độ tương đồng trình tự GSTP1 bị methyl hóa (MeG) và trình tự

GSTP1 không bị methyl hóa (UnG) với đầu dò G200 Vùng màu xám: 6 vị trí nucleotide khác

nhau giữa MeG và UnG (B) Mức độ tương đồng trình tự RASSF1A bị methyl hóa (MeR) và trình tự RASSF1A không bị methyl hóa (UnR) với đầu dò R200 Vùng màu xám: 5 vị trí

nucleotide khác nhau giữa MeR và UnR

Như đã trình bày, sự methyl hóa GSTP1 và RASSF1A đều có thể quan sát được

ở ung thư tuyến tiền liệt và ung thư vú Cụ thể, methyl hóa GSTP1 có mối liên hệ với

các giai đoạn khác nhau của ung thư tuyến tiền liệt, có thể phân biệt ung thư tuyến tiền

liệt với các bệnh liên quan tới tuyến tiền liệt Sự methyl hóa GSTP1 được xác định

thông qua các dịch cơ thể (huyết thanh, huyết tương, nước tiểu) và có độ đặc hiệu cao

hơn so với xét nghiệm PSA trong huyết thanh [64] Trong khi đó, RASSF1A có mối

liên hệ với các đặc điểm xâm nhập của khối u nên các khối u xảy ra sự methyl hóa

RASSF1A có mối tương quan với độ Gleason và PSA [23] Đối với ung thư vú, các nghiên cứu những năm 1990 cho thấy, đảo CpG của promoter GSTP1 không bị methyl

hóa ở mô vú bình thường nhưng bị methyl hóa quá mức ở các mô ung thư vú đồng thời

có mối liên hệ với mức giảm biểu hiện của protein GSTP1 [45] Sự methyl hóa quá

mức promoter của RASSF1A là một sự kiện xảy ra sớm trong quá trình phát triển ung thư vú, được duy trì ổn định ở tất cả các giai đoạn trong quá trình tiến triển ung thư vú [20] Hơn nữa, methyl hóa RASSF1A xuất hiện có mối tương quan với tiên lượng xấu

và có thể trở thành một chỉ thị sinh học có giá trị cho ung thư vú [20] Do đó, sự methyl

hóa của hai gen này được chúng tôi lựa chọn để nghiên cứu trong luận văn

Các nghiên cứu không chỉ sử dụng mẫu mô ung thư mà còn lựa chọn các mẫu đối chứng để phân tích sự methyl hóa Nghiên cứu của Phuong và cs (2015) sử dụng

20 mẫu mô vú bình thường phân tích cùng 95 mẫu mô của bệnh nhân ung thư vú người Việt Nam [49] Hoque và cs (2006) sử dụng mẫu đối chứng là 76 mẫu máu [29] Theo Massie và cs (2017), mẫu đối chứng phù hợp nhất để phân tích sự methyl hóa đặc hiệu khối u là mẫu mô bình thường nằm cùng cơ quan với khối u Ở nhiều loại ung thư, sự thay đổi methyl hóa có thể quan sát được ở mô liền kề Vì thế, mô liền kề sẽ là một lựa chọn thích hợp để so sánh những biến đổi di truyền ngoại gen với mô ung thư [42] Cho và cs (2010) đã phân tích sự methyl hóa các gen trên cặp mẫu mô ung thư và mô liền kề từ 40 bệnh nhân ung thư vú [8] Trong luận văn này, ngoài việc phân tích sự

methyl hóa promoter GSTP1 trên 10 mẫu mô đúc ung thư tuyến tiền liệt, chúng tôi

cũng phân tích sự methyl hóa promoter GSTP1 và RASSF1A trên 49 cặp mẫu mô ung

thư và mô liền kề từ bệnh nhân ung thư vú bằng kỹ thuật MSP Từ đó, chúng tôi khảo sát được tình trạng methyl hóa của hai gen trên hai loại mẫu này

Từ kết quả MSP thu được, chúng tôi sẽ phát hiện một số sản phẩm MSP dương

tính với cặp mồi đặc hiệu khuếch đại trình tự GSTP1 bị methyl hóa bằng lai điểm, sử

dụng điều kiện tối ưu của đầu dò G200 Vì vậy, luận văn “Ứng dụng kỹ thuật lai

điểm để phát hiện methyl hóa gen RASSF1A, GSTP1 ở bệnh nhân ung thư vú và

ung thư tuyến tiền liệt” được thực hiện với các mục tiêu bao gồm: (1) Tối ưu điều

kiện lai điểm của đầu dò G200 và R200; (2) Khảo sát tình trạng methyl hóa promoter

GSTP1 và RASSF1A trên 49 cặp mẫu mô ung thư vú và mẫu mô liền kề; tình trạng methyl hóa promoter GSTP1 trên 10 mẫu đúc ung thư tuyến tiền liệt bằng kỹ thuật

MSP; (3) Phát hiện một số sản phẩm MSP từ mẫu bệnh phẩm dương tính với cặp mồi

đặc hiệu khuếch đại trình tự GSTP1 bị methyl hóa nhờ kỹ thuật lai điểm

Chương 2 – NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM

Các bước tiến hành thí nghiệm gồm có:

 Bước 1: Tối ưu hóa điều kiện lai điểm của các đầu dò G200 và R200 để phát hiện trình tự bị methyl hóa, phân biệt với trình tự không bị methyl hóa

 Bước 2: Tách chiết DNA từ mẫu bệnh phẩm ung thư vú, ung thư tuyến tiền liệt

và xử lý DNA với sodium bisulfite

 Bước 3: Tiến hành phản ứng MSP với cặp mồi đặc hiệu khuếch đại trình tự bị

methyl hóa và cặp mồi đặc hiệu khuếch đại trình tự không bị methyl hóa cho hai

gen GSTP1 và RASSF1A sử dụng các mẫu DNA đã được xử lý sodium bisulfite

 Bước 4: Áp dụng điều kiện lai điểm trên mẫu bệnh phẩm sử dụng đầu dò G200

2.2 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ

2.2.1 Nguyên liệu

Các cặp mẫu mô tươi (mẫu mô ung thư vú và mẫu mô liền kề) từ 49 bệnh nhân ung thư vú; mẫu mô đúc từ 10 bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệt được cung cấp bởi Khoa Giải phẫu, Bệnh viện K từ tháng 2 năm 2012 đến tháng 12 năm 2013 Các mẫu

mô liền kề được lấy cách khối u ung thư vú khoảng 3-5 cm Mẫu bệnh phẩm được tách chiết DNA sau đó tiến hành xử lý với sodium bisulfite DNA sau xử lý được dùng làm khuôn cho kỹ thuật MSP với cặp mồi đặc hiệu trình tự bị methyl hóa và trình tự không

bị methyl hóa

Dòng vi khuẩn E coli JM109 (Promega) mang các plasmid tái tổ hợp sử dụng

cho kỹ thuật lai điểm được trình bày cụ thể trong Bảng 2.1 Các dòng vi khuẩn này được cung cấp bởi Phòng Thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội

Bảng 2.1 Các plasmid sử dụng cho kỹ thuật lai điểm

thước 155 bp

Dùng làm khuôn cho phản ứng PCR nhằm tinh sạch sản phẩm mang trình tự gen bị methyl hóa và không bị methyl hóa

ứng PCR tổng hợp đầu dò có

và không có biotin

trình tự RASSF1A bị methyl hóa

2.2.2 Hóa chất

 dNTPs (Promega)

 MgCl2 (Promega)

 Đệm Taq polymerase 10x (chứa 15 mM MgCl2) (Sigma-Aldrich)

 JumpStart Taq DNA polymerase 2,5 u/µl (Sigma-Aldrich)

 Đệm DreamTaq polymerase 10x (20 mM MgCl2) (Fermentas)

 DreamTaq DNA polymerase 5 u/µl (Fermentas)

 Kit tách chiết: Wizard®SV Genomic DNA Purification System (Promega, A2360) và QIAamp® FFPE tissue (Qiagen, 56404)

 Kit xử lý bisulfite: MethylEdge™ Bisulfite Conversion System (Promega, N1301) và EpiTect® Bisulfite (Qiagen, 59104)

 Kit tinh sạch sản phẩm PCR: High pure PCR production purification (Roche)

 Kit tách plasmid: High pure isolation plasmid (Roche)

 Biotin-11-dUTP 1 mM (Fermentas)

 Streptavidin Alkaline Phosphatase (Promega)

 Cơ chất cho phản ứng tạo màu: Western Blue Stabilized Substrate for Alkaline Phosphatase (Promega)

 Màng nylon tích điện dương (Nylon membrane, positively charged-Roche)

 Tween 20 100% (Sigma-Aldrich)

 Các dung dịch dùng cho quá trình lai điểm được trình bày trong Bảng 2.2

 Các hóa chất thông dụng khác đều đạt độ tinh khiết dùng trong nghiên cứu sinh học phân tử

Bảng 2.2 Thành phần các dung dịch dùng trong quá trình lai điểm

Bovine serum albumin 0,02%

 Các cặp mồi

Cặp mồi M13 F/M13 R thiết kế dựa vào trình tự có trong vector pTZ57R/T (được gọi là cặp mồi của vector) Plasmid pMeG200 và pMeR200 được sử dụng làm khuôn trong phản ứng PCR với cặp mồi của vector sẽ tạo các đầu dò G200 và R200 lần lượt có kích thước 200 bp và 212 bp Để thực hiện kỹ thuật MSP, phản ứng sử dụng các cặp mồi đặc hiệu cho trình tự bị methyl hóa và cặp mồi đặc hiệu cho trình tự không

bị methyl hóa đã được tối ưu trong nghiên cứu trước đó [62] Các cặp mồi được cung cấp bởi hãng IDT Trình tự các mồi sử dụng và kích thước sản phẩm PCR tương ứng được trình bày trong Bảng 2.3