Sử dụng dấu chuẩn phân tử để phát hiện gen kháng bệnh bạc lá (xanthomonas oryzae pv oryzae) từ hạt của một số giống lúa trồng ở đồng bằng sông cửu long

Các s công trình nào khác... ch ng gen nh vào MAS... Chen và ctv... công vi c ch ng các gen kháng b nh... oryzae Ishiyama syn... phòng tr b nh bác lá... Các dòng gi ng khu n, các dòng g

HÙYNH V N NGHI P

KHÁNG B NH B C LÁ (Xanthomonas oryzae pv oryzae)

HÙYNH V N NGHI P

KHÁNG B NH B C LÁ (Xanthomonas oryzae pv oryzae)

th c hi n các thí nghi m và hoàn thi n lu n án

Tác gi lu n án

Hu nh V n Nghi p

I CAM OAN

phát hi n gen kháng b nh b c lá (Xanthomonas oryzae pv oryzae) t h t c a

t s gi ng lúa tr ng ng b ng sông C u Long” này là c a riêng tôi Các s

công trình nào khác

Tác gi lu n án

Hu nh V n Nghi p

1 Tính c p thi t c a tài ……… 1

2 M c tiêu c a tài ……… 2

3 Ý ngh a khoa h c và th c ti n c a tài ……… 3

4 i t ng nghiên c u ……… 3

5 Ph m vi nghiên c u ……… 3

I CH NG I: C S KHOA H C C A TÀI VÀ T NG QUAN TÀI LI U 4 1.1 C s khoa h c c a tài ……… 4

1.1.1 C s v gen kháng b nh b c lá ……… 4

1.1.2 C s d a trên xây d ng b n gen kháng b nh b c lá …… 6

1.2 Tình hình nghiên c u trong và ngoài n c 9 1.2.1 Gi i thi u chung v b nh b c lá lúa ……… 9

1.2.2 ánh giá ki u hình tính kháng b nh b c lá c a các gi ng lúa 14

1.2.3 ng d ng MAS trong ch n t o gi ng lúa ……… 20

II CH NG II: V T LI U, N I DUNG VÀ PH NG PHÁP NGHIÊN C U 40 2.1 t li u nghiên c u 40 2.1.1 B gi ng lúa chu n kháng nhi m và b gi ng th nghi m … 40

2.1.2 Các nòi vi khu n b c lá Xoo ……… 40

2.1.3 Ph ng ti n và hoá ch t nuôi c y vi khu n ……… 41

2.1.4 Ph ng ti n và hoá ch t ly trích DNA ……… 41

2.1.5 Ph ng ti n và hoá ch t cho n di agarose gel ……… 42

2.1.6 Ph ng ti n và hoá ch t cho PCR ……… 43

2.2 N i dung nghiên c u 45 2.2.1 ánh giá ki u hình các gi ng lúa th nghi m i v i b nh c lá 45 2.2.2 ánh giá ki u gen kháng b nh b c lá lúa c a các gi ng lúa th nghi m 45 2.2.3 T o các qu n th h i giao chuy n gen kháng b nh b c lá …… 45

vi

c lá v i 13 nòi b nh b c lá thu th p t i BSCL trên B

gi ng lúa cao s n ng n ngày

cho các gi ng lúa nghiên c u

Phân nhóm di truy n c a b gi ng lúa chu n nòi b nh b c lá

Vi n lúa Qu c t (IRRI) d a vào tính tr ng chi u dài v t

nh trên 13 nòi vi khu n b c lá thu th p t i BSCL b ng

ph n m m NTSYS pc2.1

57

3.2

ph n ng b nh c a 13 nòi kháng b nh b c lá nòi thu t i

BSCL

60

3.3

Phân nhóm di truy n ki u hình c a b gi ng lúa mùa a

khu n thu th p t i BSCL b ng ph n m m NTSYS pc2.1

62

3.4

12 (Cà Mau) và nòi b nh s 13 (H u Giang) v i 13 nòi b c

lá thu th p t i BSCL

64

3.5

Long lên các gi ng lúa mùa qua ki u hình

67

3.6

khu n gây b nh b c lá có ngu n t IRRI lên các gi ng lúa

mùa qua ki u hình

67

3.8

ph n ng b nh c a 13 nòi kháng b nh b c lá nòi thu t i

BSCL

72

3.9

Phân nhóm di truy n ki u hình c a b gi ng lúa cao s n d a

vào tính tr ng chi u dài v t b nh trên 13 nòi vi khu n thu

th p t i BSCL b ng ph n m m NTSYS pc2.1

73

gel agarose 3 %

gen xa-5

84

3.17 xa-13 trên các gi ng lúa mùan ph m PCR s d ng ánh d u RG 136 liên k t v i gen 87

(minisatellite)

xii

1 Tính c p thi t c a tài:

Châu Á

nhà khoa h c trong các l nh v c khác nhau nh : Di truy n ch n gi ng, công ngh

trên các gi ng Ba Túc Gi ng ôi, Koi Bo Teng; xa-13 trên các gi ng Cà ung, Ba

ph i m t nhi u th i gian, hi u qu ch n l c th p, khó thành công m t s tính

chu n phân t phát hi n gen kháng b nh b c lá (Xanthomonas oryzae pv oryzae) t h t c a m t s gi ng lúa tr ng BSCL” c ngh th c hi n nh m

chính xác h n

2 M c tiêu c a tài:

gi ng

o các dòng lai h i giao mang gen kháng b nh b c lá

- H tr quá trình ch n gi ng lúa kháng b nh b c lá nhanh và chính xác.

ti p theo và trong gi ng d y

4 i t ng nghiên c u:

n, các isolate (ch ng phân l p) vi khu n b c lá và các d u chu n phân t thích h p phát hi n b nh b c lá

5 Ph m vi nghiên c u:

các nòi và isolate vi khu n b c lá thu th p t Vi n nghiên c u lúa Qu c t (IRRI) và

phát hi n gen kháng b nh b c lá c a m t s gi ng lúa th nghi m

BSCL

CH NG I

1.1 C s khoa h c c a tài

1.1.1 C s v gen kháng b nh b c lá:

trang ch (www.gramene.org), qua ó có 13 clone t nh ng nhóm khác nhau, bao

protein NBS (nucleotide-binding site) và LRR (leucine rich repeat) [77]),

Xa-3/Xa-26 s n xu t ra leucine rich repeat và TM (transmembrane region) [69],[75]; xa-5 s n

xu t y u t phiên mã IIA [36], xa-13 ch a bi t protein [21], xa-5 s n xu t protein

TM kinase [67], và Xa-27 ch a bi t protein [32].

ch ng gen nh vào MAS

gen Xa-21 vào gi ng lúa Minghui63 và Shanyou63 [19] Các tính tr ng nông h c

(Xa-4, xa-5, xa-13, và Xa-21) theo nh ng s k t h p khác nhau [35] K t qu các

nh, th hi n tính h u ích c a ph ng pháp ch ng gen nh s tr giúp c a marker

phát tri n c a tính kháng b nh trong ch n gi ng Chen và ctv [20] ã phân tích

các nòi b nh t 792 isolate c a Pyricularia grisea ch y u t i mi n Trung và mi n

dòng NILs, ví d t l r t nh (10% ho c ít h n) c a các isolate có th gây ra ph nng

pháp chuy n gen v n có th có m t vai trò trong vi c s d ng các gen nhân b n Ví

bi u hi n quá m c c a gen Xa-26 v i m t promoter m nh ti p t c t ng

ng tính kháng trong c hai loài indica và japonica, trong khi s bi u hi n c a

Cùng v i s t ng lên c a các clone mang gen kháng s n có, hi n nay nh ng

kháng Ví d , th c hi n clone nhi u gen kháng v i ph kháng khác nhau vào m t

kháng r ng và kháng b n v ng So sánh v i ph ng pháp ch ng a gen s d ng

tính kháng sâu b nh c ng nh tính tr ng khác, cùng v i các gen kháng b nh N u

a kháng

1.1.2 C s d a trên xây d ng b n gen kháng b nh b c lá

Gen Xa-1: Gen Xa-1 th hi n tính kháng chuyên bi t v i nòi 1 (race1 Xoo)

Nh t B n Gen Xa-1 mã hoá chu i ký t 1802 amino acid, bao g m nhi u vùng có

th hi n thành hai mô típ NBS và LRR Vùng giàu leucine c a Xa-1 bao g m sáu

Gen Xa-3: Gen Xa-3 liên k t locus XNpb 181 trên nhi m s c th s 11 v i

kho ng cách di truy n là 5,3 cM

Gen Xa-4: Gen Xa-4 n m nhi m s c th s 11 v i kho ng cách di truy n là

1,7 cM và n m gi a 2 RFLP marker: RZ536 và RG303 Gen Xa-4 là gen tr i.

Gen xa-5: Gen xa-5 nh v trên nhi m s c th s 5 [36] ã xây d ng b n

gen b ng RFLP, trong ó có 3 marker liên k t v i xa-5 là: RG556, RG207 và RZ

390 [77]

Gen Xa-10: Gen Xa-10 nh v trên nhi m s c th s 11 liên k t v i markerRAPD locus 007 2000 v i kho ng cách di truy n 5,3cM

Gen xa-13: Gen xa-13 là gen l n liên k t v i marker RG136 trên nhi m s c

th s 8

Gen Xa-21: Gen Xa-21 c tìm th y trong qu n th lúa hoang Oryza

gen, con lai ch a gen Xa-21 kí hi u là IRBB21 ánh giá ki u hình v i hàng lo t

i locus Xa-21 và phát hi n ra r ng gen Xa-21 là m t thành ph n c a m t h

bào

công vi c ch ng các gen kháng b nh

c lá cây lúa do nhi u nòi vi khu n gây nên, m t gi ng lúa có th ch a m t hay vàigen kháng b nh

Ti p t c phân tích v i b nh b c lá trên 66 gi ng lúa cao s n, bao g m 20

c khác nhau [42] Gen Xa-4 n m trên nhi m s c th s 11 và liên k t ch t v i marker RM 224 và RM 114 Gen xa-5 n m nhi m s c th s 5 và liên k t v i marker RM 13, RM 122, RM164 Gen Xa-21 n m trên nhi m s c th s 11 và liên

u, và c dùng làm khuôn DNA thi t l p các c p primer c bi t Các c p

ó, th c hi n ch ng 2-3 gen th y u (QTL pyramiding), s th hi n c a chúng có

mu n

1.2 Tình hình nghiên c u trong và ngoài n c

1.2.1 Gi i thi u chung v b nh b c lá lúa

1.2.1.1 S phân b b nh b c lá lúa

nh b c lá lúa là m t trong nh ng b nh nguy hi m nh t cho các vùng tr ng

nh ng n m 1960, b nh b c lá ã tr nên ph bi n nh ng vùng tr ng lúa c a Châu

vùng Caribê và Hoa k [48]

Jasmine85 [26]

1.2.1.2 Tri u ch ng b nh b c lá lúa và s gây h i

Có hai tri u ch ng chính gây ra do b nh b c lá là cháy bìa lá và héo cây:

ra trên các v t b nh non Lá già có th tr nên xám do s phát tri n c a n m ho i

sinh Khi b nh n ng các v t b nh s ng n c, tròn, nh c ng có th hình thành trên

tr u Cây b b nh s sinh ra bông ít h t, h t b l ng ho c lép [48]

Tri u ch ng héo cây (Kresek) là s bi u hi n tr m tr ng nh t c a b nh,

t mùa hoàn toàn

t tri u ch ng ph th ba là lá b vàng ho c vàng nh t, lá non nh t c a cây

1.2.1.3 Tác nhân gây b nh b c lá lúa

nh b c lá lúa gây ra b i vi khu n Xanthomonas oryzae pv oryzae (Ishiyama) (syn X campestris pv oryzae (Ishiyama) Dye), vi khu n gram âm, háo

màu vàng tr ng, sau có màu vàng r m, hình tròn, l i và b m t nh n [48]

Philippines Horino và ctv [34] ã báo cáo r ng các nòi vi khu n t Nh t b n vàPhilippines khác nhau hoàn toàn và Mew [47] ã th a nh n có hai d ng sinh h c

1.2.1.4 Các u ki n nh h ng n b nh b c lá lúa

ng nh nhi u lo i b nh cây tr ng khác, b nh b c lá lúa mu n th hi n

môi tr ng thu n l i cho vi khu n phát sinh phát tri n, có ký ch nhi m b nh và

lúa

1.2.1.5 Qu n lý b nh b c lá

nh b c lá có th gây t n th t n ng n v n ng su t, c n ph i phát tri n

các bi n pháp khác nhau nh bi n pháp gi ng kháng, bi n pháp sinh h c và bi npháp hóa h c

Bi n pháp gi ng kháng:

ch ng l i ngu n b nh b c lá, bi n pháp gi ng kháng t ra r t quan tr ng trong vi c

phòng tr b nh bác lá i v i lúa, di truy n tính kháng i v i nhi u ngu n b nh

n gen chính, nó có th là tr i ho c l n S ki m soát b nh b c lá ã thành công

nh ng gen này ã tr nên kém hi u qu do s b c phát các nòi b nh m i

[12], [54] D ng kháng này có l i do nó có th c n tr s phá v tính kháng c a

Nhi u nhà nghiên c u c ng ã xác nh nh ng gi ng lúa bi u hi n tính

này [66] Ch n t o gi ng kháng b nh b c lá b ng các gen kháng n chính th ng

các ti u qu n th ngu n b nh có th phá v tính kháng c a nh ng gen này S thay

i ngu n b nh c ng gây c n tr cho s phát tri n nh ng hóa ch t phòng tr b nh

nh Nh ng nghiên c u g n ây trong các phòng thí nghi m ã xác nh các vi

thí nghi m trong ng nghi m Các vi sinh v t này có th làm h n ch b nh m t cách

ng nh là tác nhân phòng tr sinh h c

Hàng lo t các nghiên c u ánh giá hi u qu phòng tr b nh c a dòng vi

khu n Pseudomonas putida V14i (m t tác nhân phòng tr sinh h c ch ng l i b nh

tr b nh b c lá lúa Nh ng k t qu c a các thí nghi m này cho th y r ng phun cáctác nhân phòng tr sinh h c qua lá có th kh ng ch t i a ch s b nh [37] M i

liên h tr c ti p gi a s s ng sót vi khu n n i sinh Pseudomonas putida trong mô

nh b c lá lúa

Bi n pháp hóa h c

streptomycin s d ng liên t c trong th i gian ng n c khuy n cáo phòng tr

nh này [63] Phun các lo i thu c Bactocide 12WP, Sasa 20WP, Xanthomix 20WP

có hi u qu làm gi m phát tri n b nh [18] Thu c tr vi khu n h u c t ng h p nhnickel dimethyl dithiocarbamate, dithianone, phenazine và phenazine noxide c ng

t cách d dàng và c ch vi khu n nhân nhanh trong cây lúa X lý h t b ng

nh b c lá [45]

khó kh n trong vi c xác l p các tác nhân phòng tr h u hi u, các h th ng d báo

t hi u qu cao

1.2.2 ánh giá ki u hình tính kháng b nh b c lá c a các gi ng lúa

1.2.2.1 Chu n b d ch ch ng vi khu n Xoo [72].

Phân l p vi khu n Xoo t lá nhi m b nh

phân l p vi khu n, môi tr ng Suwa ch a trong a Petri (10-15 ml môi

Ch n ph n v t b nh ang phát tri n trên lá lúa em i c t và kh trùng b

khu n a ra t v t b nh ang phát tri n Dùng que c y l y m t vòng d ch khu n và

Ph c h i vi khu n t môi tr ng t n tr

d ng nh là ngu n d ch ch ng

Chu n b d ch ch ng vi khu n

1.2.2.2 Ph ng pháp ch ng b nh nhân t o [72]

Ph ng pháp phun d ch khu n: Phun d ch khu n n ng 108-109 t

Ph ng pháp châm kim: Ch ng b nh lên cây lúa b ng cách nhúng các u

Ph ng pháp nhúng r : R c a cây m c nhúng vào d ch khu n tr c

1.2.2.2 Xác nh ngu n gen kháng b nh b c lá lúa [72].

Ngoài ng

Trong nh ng n m c a th p niên 1980, IRRI ã thanh l c tính kháng b nh b c

Evaluation and Utilization- GEU) b ng vi c ánh giá b s u t p qu gen a d ng xác nh ngu n gen kháng b nh b c lá Các dòng/gi ng bi u hi n ph n ng kháng

ng m thanh l c b nh b c lá (BB General Screening Nursery –BB GSN)

kh ng nh

trong B ng 1.1

cây trong h p m và ch ng b nh lúc 21 ngày sau khi gieo v i các nòi vi khu n hi n

khu n trên l n l p l i và ch ng các nòi vi khu n hi n có lúc 45-50 ngày sau khigieo ánh giá c p b nh theo thang ánh giá chu n c a IRRI (SES) Các dòng gi ng

khu n, các dòng gi ng bi u hi n kháng ph r ng mang t hai gen kháng tr lên

vi khu n hi n có ánh giá tính kháng theo thang ánh giá chu n c a IRRI (SES)

tính kháng theo thang ánh giá chu n c a IRRI (SES)

gen kháng b nh b c lá Thông qua nghiên c u di truy n và tr c nghi m alen, hi n

nh ng dòng ch ng gen mang t hai gen kháng tr lên hi n ang s n có trong

Á V i s s n có nh ng gen kháng b nh b c lá, vi c xác nh các gen avr trong các

qu n th gây b nh b c lá có th th c hi n các vùng tr ng lúa trên ph m vi toàn th

di truy n phân t c a ngu n b nh

1.2.2.3 Thanh l c các dòng gi ng ch n t o [72].

Các nhà ch n gi ng và các nhà b nh h c cây tr ng ph i h p v i nhau thanh l c các v t li u ch n gi ng Các nhà ch n gi ng th c hi n vi c tr ng và qu n

th c hi n vi c ch ng b nh và ánh giá tính kháng c a các dòng gi ng ch n t o

lá

ch i t i a v i nòi Xoo 1 ho c Xoo 2 ánh giá c p b nh d a theo thang ánh giá

14 ngày sau khi ch ng

kh o nghi m s kh i (observational yield trial - OYT) và trong kh o nghi m h u k

(replicated yield trial - RYT), trong khi ó cây u tiên c a m i hàng c ch ng

nh v i nòi Xoo 1 và/ho c nòi Xoo 2.

ánh giá c p b nh b c lá: Trong nhà l i, ch s b nh c ánh giá d a

ng 1.1: Thang ánh giá b nh b c lá lúa [72]

1.2.3 ng d ng MAS trong ch n t o gi ng lúa

1.2.3.1 Khái ni m v ch n gi ng nh d u chu n phân t

ch n l c ki u hình trong qu n th con lai ang phân ly c a m t t h p lai nào ó

t t ch Marker-assisted selection) là m t ph ng pháp có kh n ng kh c ph c

ánh giá ki u hình trong lai t o gi ng cây tr ng truy n th ng

ng ch n theo ki u gen m t cách tr c ti p ho c gián ti p

tri n) c a cây tr ng

t l i c a m t d u chu n phân t m c tiêu là s l thu c vào kh n ng t o

ra a hình trong chu i trình t nucleotide, t o ra s khác bi t gi a hai alen theo d u

fragment length polymorphism), AFLP (amplified fragment length polymorphism),SSR (simple sequence repeat hay microsatellite), RAPD (random amplifiedpolymorphic DNA), CAPS (cleavable amplified polymorphic sequence), SSCP(single strand conformation polymorphism), SNP (single nucleotide polymorphism)

và k thu t khác [50], [57]

Trong các d u chu n DNA, RFLP (restriction fragment length

5’-3’, v i th t nh t nh trên t ng nhi m s c th RFLP là công c r t quan tr ng

phân t th m dò (có ánh d u b ng phóng x ho c hu nh quang), c th hóa b ng

thu t Southern blot T b n RFLP, ng i ta thi t k nh ng c p m i t ng

trong k thu t PCR K thu t PCR cho phép chúng ta th c hi n nh ng nghiên c u

c áp d ng cho k thu t PCR là RAPD, AFLP, STS, SSR (microsatellite) G n

c quan tâm SNP có tính ch t “diallenic” trong qu n th , và t n su t alen c a nó

nghi m k thu t SNP là nh ng d u chu n có tính n nh r t cao v m t di truy n

Arbitrary primer-PCRSingle strand conformation polymorphismModerately repeated, dispersed, and highly variable DNA(minisatellite)

Single nucleotide polymorphism

trình ch n gi ng tin c y h n trên c s :

• n di truy n bao g m các d u chu n phân t liên k t v i gen ch l c ho cQTL c a tính tr ng có liên quan

c tiêu

cách hi u qu v m t chi phí

i gen m c tiêu

y càng cao, b i vì r t hi m alen c a d u chu n s b tách ra kh i tính tr ng

ó, nó có hai d u chu n a hình, k c n t i QTL m c tiêu; c ng v i m t ho cnhi u d u chu n có trong vùng ch a QTL nh v y

ng

1.2.3.2 M c ích c a ch n gi ng nh d u chu n phân t

i v i nhà ch n gi ng cây tr ng, vi c ng d ng h u hi u nh t c a MAS là

d ng d u chu n phân t DNA nh m 3 m c ích sau [28]:

mong mu n

thành ph n alen c a genome

gen có t n su t cao v bi n thiên ki u hình tính tr ng, s d ch chuy n m t vùng trên

ng d u chu n phân t DNA có th c i ti n áng k hi u qu h i giao, ít nh t trên

li u cho gen (donor) t i m t locus nh v g n gen m c tiêu, có th làm t ng

tái t h p g n gen m c tiêu, do ó, nó có th làm gi m i r t nhi u các nh

ng “linkage drags” (liên k t b t l i)

th y hi u qu c a MAS t l ngh ch v i h s di truy n c a m t tính tr ng m c tiêu

1.2.3.3 Nh ng ph ng pháp c b n v ng d ng MAS trong ch n t o gi ng lúa.

i ích c a vi c ch n gi ng nh d u chu n phân t (MAS).

Ch n gi ng nh d u chu n phân t có th làm gia t ng hi u qu ch n gi ngkhi so sánh v i ch n gi ng d a và ki u hình truy n th ng L i ích c b n c a MASkhi so sánh v i ch n gi ng nh vào ki u hình truy n th ng nh sau [22]:

• Ch n gi ng có th c th c hi n giai n m

i ích có th t o nên hi u qu cao h n ho c phát tri n thành các dòng nhanh

n kém nhi u th i gian b ng các th nghi m d u chu n DNA H n n a, vi c ch n

ng l c ch n các tính tr ng m c tiêu cao h n có th làm cho nh ng tính

c xác nh và ch n l c m t cách d dàng H n n a, nh ng d u chu n c b n

trình lai h i giao nh s d ng d u chu n

m quan tr ng c a vi c l p b n QTL cho MAS

n QTL và tr c khi th c hi n MAS Nh ng b c có th bao g m nh sau[22]:

trong các n n di truy n khác nhau

t ch t ch nh t trong kho ng cách h p t 5-10 cM so v i v trí gen m c tiêu

Chi n l c MAS trong ch n gi ng cây tr ng

i giao nh d u chu n (Marker assisted backcrossing-MAB)

c ki u hình t n nhi u công s c ho c nh ng alen l n m c ch n l c th hai bao

m ch n l c con cháu h i giao v i gen m c tiêu và các d u chu n hai bên gen m c

c con lai tái t h p (recombinant selection) M c th ba c a MAB bao g m vi c

ph c h gen c a b m tái t c B ng h i giao truy n th ng, ph i m t ít nh t 5 – 6

kh ng nh r ng có ít nh t 2 nh ng có th 3 ho c ngay c 4 th h h i giao có th

c ti t ki m nh vào ng d ng d u chu n trong ch n gi ng

Hình 1.1: Ba m c ch n l c trong su t quá trình h i giao nh d u chu n [22]

kháng nòi 2 nhi m nòi 1