Ứng dụng kỹ thuật real tiem pcr xác định đột biến gen itga2 và itga3 liên quan đến chứng ưa huyết khối di truyền ở phụ nữ có tiền sử sẩy thai thai chết lưu

Ket qua Real-time PCR cua bệnh nhân HK08 với kiêu gcn dồng hợp từ bính thưởng cũa gen ITGA2...35 ỦNG DỤNG KỸ THUẬT REAL TIME PRC XÁC ĐỊNH ĐỘT BIÊN GEN ITGA2 NẰITGB3 LIÊN QUAN ĐẾN CHÚ NG

Lời đầu liên, tòi xin bây to lòng bict cm sâu sấc nhất vã lời cám cm chânthành lới PíĩS.TS Nguyen Thị Trang, giang viên cao cấp Bộ món Y Sinh học -

Di truyền, trưởng Đại học Y Hà Nội là người htrớng dần khoa học cho tòi Cỏ làngười đà định hướng diu dất tỏi từ nhùng bước đi đầu tién trẽn con dườngnghiên cữu khoa học Nhờ cò sự hướng dần tận tinh, những kiến thức quý báu

và sự động viên, quan tâm cua cô đà giúp tỏi hoãn tlìảnh khóa luận tốt nghiệpnáy

Tôi xin chân thảnh cam cm thầy cỏ anh chị nội tnì anh chị kỳ thuật viêntrong Bộ ntôn Y sinh học - Di truyền, trưởng Dili học Y Hà Nội dã chi dạy giúp

dờ tỏi rầt nhiều trong then gian học tập và nghiên cửu tại Bộ môn

Tói xin trân trợng cam em Ban giám hiệu Phòng Dão tạo Dại học Thưviện trưởng Đại hợc Y Hâ Nội đã tạo diêu kiện thuận lọi cho tôi hoãn thảnh khóaluận này

Lời cuối cùng, tôi xin gứi lời biết ưn đến bố mẹ gia đính, bạn bè vi dàluôn là chỏ dựa tinh thần vừng chắc, khích lệ ung hộ tỏi trong quá trình học tập

và thực hiện khóa luận

Hà Nội ngày 09 tháng 05 nám 2021

Giáp Ánh Tuyết

Tỏi lã Giáp Ánh Tuyết, sinh viên tô s lớp Y6B chuyên ngành Bác sỳ đa khoa, xin cam đoan:

1 Khóa luận tốt nghiệp này hoàn toàn do tôi thực hiện dưới sự hướng dần cứa PGS.TS Nguyễn Thị Trang

2 Các số liệu và kết quá trong khóa luận là trung thực, khách quan vá chưa lừng công bố trước đây

3 Nghiên cửu nãy không trùng lập vói bất cử nghiên cửu nào khác đà được cõng bồ tại Việt Nam

Hả Nội ngày 09 tháng 05 năm 2021

Giáp Ánh Tuyết

FIGO The International Federation of

Gynecology and Obstetrics

Hiệp hội Sân phụ khoa thê giới

ACOG The American College of

Obstetricians and

Gynecologists

Hiệp hội San phụ khoa Hoa Kỳ

thai

TORC

gonadotropin

morphologically selected sperm

injection

thái vào bào tương noãn

TÀI LIỆU THAM KHÁO

PHỤ LỤC

Hĩnh 22 Kiêu gen dồng help tứ bi'nh thường với gen ITGA2 vã ITGB3 31

Hình 23 Kiêu gen dị hựptư dột biến với gen ĨTGA2 \'ảỉTGB3 31 Hình 2.4 Kicu gcn đồng hợp tư dột biến gen ITGA2 và ITGB3 32

Hình 3.1 Kết quá Real-time PCR cưa bệnh nhãn HK46 với kiêu gen dị hợp

tứ dột biến cua gen ITGB3 34

Hĩnh 32 Ket qua Real-time PCR cua bệnh nhân HK08 với kiêu gcn dồng

hợp từ bính thưởng cũa gen ITGA2 35

ỦNG DỤNG KỸ THUẬT REAL TIME PRC XÁC ĐỊNH ĐỘT

BIÊN GEN ITGA2 NẰITGB3 LIÊN QUAN ĐẾN CHÚ NG ƯA

HUY ÉT KHÓI DI TRUYỀN Ó PHỤ NŨ CÓ TIỀN sử SÂY

THAI THAI CHÉT Lưu

từ cung - rau thai Hai gen ITGA 2 và TTGB3 mà hóa các protein hỉnh thành nên

trung gian kết dinh tiêu cầu Do đó đột biến hai gen này có thê liên quan đếnchứng tăng dóng Nghiên cứu mô ta cắt ngang này sư dụng kỹ thuật Real-time

PCR nhằm xác định ty lệ đột biến haĩ gen ĨTGA2 vã ITGB3 ở dối tượng cỏ tiền

sư sây thai, thai chết lưu Nhóm phụ nữ tham gia nghiên cứu cùa chúng tòi cõtuổi trung binh lã 31.99 ± 6.02 Kct qua tim được, tý lệ alcn đột biến (T) cùa gen

JTGA2 là 22.0% (CT 34.0%, TT 5.0%) gen ĨTGB3 cỏ tỳ lệ alcn dột biến (C) là

tiến hảnỉỉ các nghiên cứu cỏ nhóm chứng trãi một cừ mầu lớn hơn vã phân tíchthêm về tương tác giữa các đột biển gen lèn tinh trạng này.

Từ khóa: IT GA 2 JTGB3 sây thai, thai chết lưu chứng ưa huyết khối di

truyền

REAL TIME PCR TECHNOLOGY IN WOMEN WITH

MISCARRIAGES OR STILLBIRTHS

Abstract

Miscarriage and stillbirth are serious pregnancy complications for women.Many etiologies have been found However, up to about 50% of cases lias nothad clear causes Front a hypothesis about thrombi disrupting utero-placentalcirculation recently, researchers are concentrating on genes related to inherited

thrombophilia ITGA2 and ITGB3 encode proteins which form adhesion

molecules promoting platelet aggregation Hence, different polymorphisms ofthese genes can associate with thrombophilia This descriptive cross-sectional

study applied Real-time PCR technology to determine rates of ỈTGA2 C807T and

ITGBỈ Leu33Pro polymorphisms in women with miscarriages and stillbirths.

Women in our study had average age of 31,99 = 6.02 The percentage of allele T

of gene ĨĨGA2 was 22,0% (CT 34.0%, TT 5.0%) while the proportion of allele c

of gene ỈTGBỈ is 1.5% (TC 3.0% cc 0.0%) Through this study, we cannot

conclude any relationship between these two polymorphisms and miscarriagesand stillbirths Thus, there is a need to conduct controlled studies, on a largersample size, and further analysis of the interaction between different genepolymorphisms on these obstetric complications

Key- words: JTGA2 ITGB3, miscarriage, stillbirth,

inherited thrombophilia

ĐẬT VẨN ĐÈ

sẩy thai và thai chết lưu là hai biền cồ san khoa thường gập ánh hương kmtới sức khoe thê chầt và tinh thần cua người phụ nử Theo Hiệp hội San phụ khoathế giởi (FIGO), tý lộ sẩy thai chiếm khoang 12-15% nhùng trưởng hợp đà nhậnbiểt dược minh cõ thai [1] Trong khi dó theo nghiên cúu khác, con sổ ước tính

dộng xấu lèn sửc khóc người mẹ và gia dính, dặc biệt là ánh hường VC tàm lý.

trạng thãi lo king, và khoáng 10-15% bị trầm cám [1]

Nhiều yếu tố đà được xác định là nguyên nhàn hoặc yếu tố nguy cơ dần đếnsây thai, thai chết kru vi dụ như: bẩt thưởng nhiêm sấc thê bất thường về giãiphẫu tứ cung, chấn thương, các rối loạn mien dịch và chuyên hóa nhiêm trùng Tuy nhiên, vẫn còn khoáng 50% trường hợp chưa xác định được nguyên nhãn[4] Đẻ cỏ the tim hiểu rò hơn về cãc cơ chể dần đến mầt thai, ngày nay cảc nhàkhoa học dà ứng dụng sự phảt triên cua sinh học phản tư vào việc nghiên cữu sựbiêu hiện (dột biến hoặc tính da hínlì) cua càc gen liên quan dến sấy thai, thaichết lưu Trong dó các gcn liên quan đen tinh trạng tâng đông máu dần đen hinhthành cãc cục mâu đông lãm gián đoạn tuần hoãn tư cung - thai rất dtrợc quantảm nghiên cửu [5] Nếu tím dược mối liên quan giừa tinh ưạng mất thai vá cácgen nãy thi có thê dự đoán được nguy cơ mắt thai cua người phụ nử vả từ dó cócác biện pháp dự phòng hiệu qua Trẽn thề giới, nhiêu nghiên cứu về dột biềntính da hỉnh cúa các gen liên quan den cơ chế tâng đông máu đã chi ra mối quan

hệ giữa những gen này vã biền cổ sấy thai, thai chết lưu ví dụ như cãc đột biến

gen MTHFR, FVL PAI-L Những thư nghiệm làm sàng cũng dà dược tiền hành

nhầm dành giá hiệu quá cua việc đùng thuòc chông đông cho nhửng san phụmang dột biển gcn tàng đông máu có tiền sư say thai, thai chềt lưu liên tiếp [5].[6], Ở Việt Nam nghiên cứu về các gcn liên quan đền dông máu ở phụ nừ có tiềnsir sẩy thai, thai chết lưu còn rẩt ít .Một vài nghiên cứu đà kháo sát đánh giã tỷ

lộ đột biến cua các gcn như MTHFR FVL F2 hay PAI-J Tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào đánh giá dột biến hai gen ĨTGA2 và ITGB3 lã hai gen mà hóa

cãc protein CÓ vai trò trung gian kct dinh tiêu cầu, ớ bệnh nhản có tiền sư sây

time PCR xác định dột biến gen ITGA2 và ITGB3 liên quan dén chứng tra huyết khỏỉ di truyền à phụ nữ có tiền sừsạy thai, thai chết /rrn” với hai mục tiêu sau:

7 Dành giá chất lượng tách chiết DNA từ mẫu máu bưng bộ kit DNA

-Express (Lytech - Nga IVD).

2 Mỏ ta dột biền gen ITGA2 vã ITGB3 liên quan dền chửng

ưa huyềĩ khối dì truyền ớ phụ nữ cỏ tiền sứ sầy thai, thai diết lưu.

Chircmg 1 TÓNG QUAN

1.1 Đại cương về sấy thai, thai chct liru

l.ỉ.ỉ Dinh nghía

Sầy that theo Tồ chức Y tế the giói (WHO, 2009) là hiện tượng kết thúc thai kỳmột cách tự nhiên trước khi thai dược 20 tuần tuổi thai (hoặc 18 tuần sau khi thự tinh),trong trường hợp không xác định dược tuổi thai, thi xét trọng lượng phôi/thai dưới400g [7] Đôi vói các nước khác nhau thỉ định nghía này có thê khác nhau ờ mốc tuổithai và cân nặng phòi/thai tùy thuộc vào sự phát then cùa hồi sức và chăm sóc sơ sinh,

ớ Việt Nam sầy thai được định nghía là hiện tượng kết thúc thai nghén trước klũ thai

cõ thê sống dược, cụ thê là thai bị lỗng xuất ra khôi buồng tư cung Irước 22 tuần hoặccàn nặng cùa thai dưới 500g [8]

Thai chết lưu lã hiện tượng tliai chết trước khi bị trục xuất ra khôi tử cung từ tuần thử

20 trớ di WHO 2009 [7], Định nghía này của WHO rầt khác so với Việt Nam Theo

Bộ Y tế Việt Nam thai chết lưu là tất ca các trường hợp thai bị chết mà còn lưu Lạitrong tư cung trên 48 giờ [8]

1.12 Tĩnh hình dịch tễ sẩy thai, thai chết lưu

Trên thế giới, theo FIGO, tỳ lệ sây thai ờ những trường hợp đà xác định là cỏ thaikhá cao, từ 12-15% [1] Theo Hiệp hội Sán phụ khoa Hoa Kỳ (ACOG) đây lã nguyênnhân mất tliai phổ biến nhất Con sổ ước tinh ty lệ sấy thai thực có the lẽn tới 26%.Trong dỏ 80% trường hợp sảy thai xay ra trong 3 tháng dầu Qua 12 tuần, nguy cơ sâythai giam rỏ rệt [2] Cùng theo FIGO (2015), ước tinh một ngày trên thế giới có khoang

7200 ca thai Chet lưu Ty lộ Tỉiai chết lưu nâm 2000 là 24.7 trên 1000 ca sinh, đà giamxuống 18,4 năm 2015 Ty lệ thai chềt lưu cỏ sự khác biệt lim giữa các nước, dạt rấtthấp ờ một số nước châu Ảu và còn cao ờ các nước châu Phi nơi mà chàm sóc tnrớcsinh vả sửc khóe phụ nử còn kém phát triển Tuy nhiên một dắu hiệu khả quan lã tý lệ

tliai chết lưu nói chung dang có những tín hiệu giam khá tích cực [3].

Tui Việt Nam, hiện nay chưa có con số chính thức thống kê tý lệ sậy thai, tuynhiên theo một sò tài liệu, ty lệ này trong khoang 15-20% [9] Đôi vối thai chết lưu tỹ

lệ nãy ờ nước ta chiếm khoang 10'1000 ca de sống Nhõm phụ nữ ở tuổi 20-30 cỏ tỷ lệ

có thai chết lưu cao nhất (chiếm 59.9% sổ trường hợp thai chết lưu), tiếp dó là nhómchưa sinh lần não (chiếm 39.7%) [10]

sây thai vả thai chết lưu dược xem là một chần thương dối với người phụ nữ.Không những anh hương xấu tới sức khoe mà nó còn tác dộng sâu sắc tới tâm lý tinhcảm cùa người phụ nừ và gia đình Theo FIGO, sau khi mất thai 30-50% người phụ nừ

sè trái qua lo lẳng, vả 10-15% bị tram cam Anh hường nãy cỏ the kéo dài nhiều tháng

Và thậm chi ờ những lần mang thai sau nhừng người phụ nừ này cỏ the sê trài quanhiều lo lắng và đau buồn lum nhùng người phụ nừ khác Sức khóe tinli thần cũa bà mẹ

có anh hường tói hạnh phúc tức thi vả lâu dải Một sức khoe tinh thần kẽm sè hạn chềngười phụ nữ tham gia vào các hoạt dộng kinh tẻ và xà hội dồng thời cùng làm giamkhã năng tự chàm sóc và châm sóc tre em [1 ]

Không nhùng vậy, nghiên cửu còn chi ra sây thai lã một yểu tố sày thai lần tiếp theo lã 20% sau 1 lần sẩy thai 28% sau 2 lầnliên tiếp, và 43% sau 3 lần liên tiếp [2] Qua dây có the thấy, sấy tíiai thai chết lưu là một trong cãc bệnh san khoa nừ

1.13 Nguyên nhãn.yếu tổ nguy cơ, và điều trị

Có nhiều nhóm nguyên nhân dà dược xác định gáy ra sây thai thai chết lưu Và hàng

loạt các yếu tố dược chi ra lả yểu tố nguy cơ cua hai biến cổ này.Cảc nguyên nhân thường gập gày ra sẩy thai thai chết lưu là bất thường nhiễm sắc thê bất thường giai phẫu đường sinh dục mẹ, bất thường về nội tiết, miền dịch,

các bệnh lý nhiễm trùng, Tuy nhicn vần còn khoang 50°/o cãc trường họp không

Cận lãm sàngkhông cần thiết

Bẩt thường

giải phầu

Siêu âm hai chicu/ba chiều và siêu âm bơm nước buồng tử cung hoặc kết hựp nội soi ô bụng và nội soi buồng

tứ cung

MRI

chửc phôi thai (PƠC)

Nhi cm sắc thê đổ cúa bố mẹ

Chứng ưa

huyết khối

Mắc phai: hội chúngkhàng phospholipid

(APS)

Anti-b2 glycoprotein

Chứng ưa huyết khui bẩm sinh

thâp (Lvsycao (Hvsychlamydia Sinh thiết nội mạc

tứ cung vã nuôi cấy

toxoplasma, các tác nhãn khác, rubella,

cytomegalovirus,herpes simplex

nhàn

HLA

Tc bão diệt tự nhiên

(chi dung cho nghiên cữu)

kháng the kháng tuyền giáp nếu TSH bầt thường)

Prolactin

DNA cua tinhtrùng

Như vậy, các nguyên nhân dã tim thấy cua tinh ưạng sây thai thai chết lưu có the lã bắt thường cơ quan sinh dục người mẹ

di truyền, xẽt nghiệm huyết thanh phô biền hiện nay

Báng 1.2 TÓIÌ1 tắt diều trị với một số nguyên nhân mất thai (4]

Xem xét phầu thuật u

xơ dưới niêm mạc

Vách ngán tư cungPolyp nội mạc tư cungDinh buồng tứ cung

Các bầt thường ống sinh dục khác

Di truyền Chân đoán di truyền

trước klũ cấy phôi (trong trưởng hợp dà biết bố mọ cõ bất thường nhiễm sắc the)

Sàng lọc di truyền trước cay phôi

Chửng ưa

huyết khối

Hội chứng kháng phospholipid (APS):

aspirin và heparin không phân đoạn

Asprin

bằng chửng làm sàng cua nhíềm trùng

Kháng si nil

dự phỏng

Thuốc gây miền dịch thụ động (I\TG)Truyền tế bào

lynipho phù hợp

Truyền nhừ tương lipid

đường, suy giàp và cưởng giáp

Suy giáp cận lãm sàngProgesteron

Androgensp-hCGLH

bào tương cua noãn (PICSI)

Tiêm tinh trũng cõ chọn lọc hĩnh thãi vào bào tương noãn

(IMSI)AntioxidantsMôi

trưởng/ỉối

sống

Dừng hút thuốc, sứ dụng ma túy

Duy tri BMI ờ giã trị bỉnh thường

Chúm sóc chuyên biệt

vã cã nhãn hóa tại các phông khâm chuyên khoa

Hạn chc dung caffeine

Trong các nguyên nhân trài, một sổ cỏ thê điều trị can thiệp ngay cho thai phụ đế

cõ thê duy tri một thai kỳ khóe mạnh, vi dụ như các bệnh lỷ nhiễm trùng, nội tiết, hộichứng kháng phospholipid Đối với các nguyên nhân khác, cần được chân đoán, canthiệp sãr§ lọc trước khi mang thai lẩn sau Tuy nhiên, còn tồn tại một sỗ nguyên nhânhiện nay vẫn chưa có phương pháp điều tri hiệu quá

Như vậy có thê thấy có rat nhiều nhóm nguyên nhân da dạng dần den tinh trạngsấy thai, thãi chết lưu Đo dó trên lâm sàng, khi tiếp cận một trưởng hợp sây thai, thaichết lim cần cỏ nhùng bước đánh giá dầy du nhăm tránh bo sót nguyên nhãn

Sơ dồ 1.1 Tiếp cận các truừng họp mất thai 2 lẩn [4]

Ngoải các nguyên nhàn trẽn, khoang 50% các trường hợp sây thai, thai chết lưuvẫn chưa xác định dưực nguyên nhân rỗ ràng Nhiều gia thuyết đưực đặt ra trong đó

giai thuyết về tinh trạng tảng đỏng máu dẫn đen hình thánh huyết khối lãm gián đoạntuần hoãn sir cung thai được rẩt nhiều nhã khoa học quan tám Từ giá thuyết này cácnghiên cửu trên the giới và tại Việt Nam dã tập trung vào các gen liên quan đến quátrình đông máu [5] [ó] [ 12], [13].

1.2 Chứng ưa huyết khối di truyền (Inherited thrombophilia)

1.2.1 Đại cương về chứng ưa huyết khổi dỉ truyền

Chứng ưa huyết khối dược dặc trưng bởi xu hướng hình thành các cục máu đôngtrên lâm sàng hoặc nhùng bầt thường mức độ phân tứ trong quả trinh cầm màu dẫn đenkhuynh hướng cõ các huyết khối gây tắc mạch [14] Huyết khối cỏ thè hĩnh thành ờ cánhh mạch và dộng mạch gây ra triệu chứng tấc nghèn tại chồ hay tại nơi chúng dichuyên den và tác Lại ví dụ như nào phôi Chửng ưa huyết khói có thê gập ờ mọi liratuỏi ở ca nam và nử tuy nhiên có xu hướng biểu hiện tại phụ nữ hem do tính trạng tảngđông máu khi matg thai hoặc sir dụng cãc thuốc tránh thai

Chững ưa huyết khối có hai loại là mắc phai vã di truyền Chứng ưa huyết khốimắc phái thưởng gặp nong Hội chúng khàng phospholipid (Antiphospholipid syndrome

• APS) dặc trung bơi sự hĩnh thảnh huyết khối và sự hiện điện cua chầt chống đônglupus và kháng thề gần phospholipid APS có tiêu chuân dê chân doân và liệu pháp canthiệp mang lại hiệu qua Trong klìi dờ chứng ưa huyết khốỉ dỉ truyền bao gồm mộtnhỏm nhùng bất thường VC you tố tiền dòng máu, yếu tố dông mâu dẫn tới táng nguy

cơ thuyên tấc tinh mạch, do các đột biến gcn/đa bính gcn gây ra

Mối lièn quan giữa chứng ưa huyết khối di truyền và tình trạng mất thai dặc biệt là các trường họp mất thai tái diễn:

MỘI thai kỳ thảnh còng phụ thuộc vảo sự phát triển cùa tuần hoàn rau thaibỉnh thường và đẩy du sự bất thường cua các mạch mâu rau thai có thè đản đến một

sổ bệnh lý thai kỳ báo gầm sấy thai, thai chậm phát triển trong tư cung, thai chếtlưu hay rau bong non vã tiền sân giật

Nhiều nghiên cứu đã chi ra là cỏ mối liên quan giữa đột biến/da hỉnh cãc genliên quan đến huyết khối với sấy Iliai thai chết lưu Trong khi dò một sổ nghiêncữu khác lại không ung hộ mối quan hệ này Tuy nhiên bâng chững cãc nghiên cửu

nãy đưa ra côn chưa đủ mạnh.

Trong nghiên cứu cua Mert Ulas Barut vả cộng sự năm 2018 tại Thố Nhf Kỳ

2660 bệnh nhãn cõ tiền sir sầy thai trước tuần thứ 20 ít nhất 2 lần đà dược lầy máu

ngoại vi và xét nghiệm tim các dột biến gen yếu tồ V Leiden (H1299R) prothrombin G20210A MTHFR com MTHFR A1298C PAI-1 4G/5G và PA1-]

4G/4G Vã kết quá cho thấy sự khãc biệt có ý nghía thống kẽ (p<0.01) trong mỗiquan hộ giừa mất thai tải diễn vã các da hình gcn liên quan den bệnh huyết khối như

yếu tổ dị hợp tư V Leiden H1299R dị hựp tư prothrombin G20210A PAI-Ỉ 4G/5G

và P.4J-J 4G/4G [6] Nghiên cứu cua Benjamin Brenner tại Isarcl nám 1999 đà so

sánh giữa nhóm 110 san phụ có cãc bệnh lý thai kỳ là tiền san giật, thai chậm pháttriền trong tư cung, rau bong non hoặc thai chết lưu vói nhóm 110 sản phụ cỏ thai

kỳ bỉnh thường Số liệu cho thấy một trong ba đột biến huyết khối phố biến lã.ycM

tố VLeiden, yểu tồ lĩ G20210A hoặc MTHFR C677T được tim thầy ờ 52% nhóm có

bệnh lỷ và dù 17% ở nhóm binh thường [15]

Trong khi đó các nghiên cứu khác ví dụ như một nghiên cửu ở Argcntinia nảm

2017 lại chi ra không có sự khác biệt não trong sự phàn bố cùa cãc biến thê ditruyền giữa nhỏm mắt thai tái diễn và nhôm dối chứng [16] [17]

Nhin chung kct qua cua các nghiên cứu trước đây cho thấy răng, dà có nhùngbảng chúng giá trị về mồi quan hộ giửa dột biến các gen huyết khối vói tinh Usingsấy thai, thai chct lưu Tuy nhiên, chứng ưa huyết khối di truyền anh hương bời dabiến di truyền Do dó de có the kháng định mối liên quan này và xem xét nhữngcan thiệp y khoa dối với nhỏm bệnh nhãn cố chứng ưa huyết khối di truyền, vẫn cần

có thêm những nghiên cứu chuyên sàu toàn diện hơn nữa

1.22 Một sổ gen liên quan đến chứng ưa huyết khối dỉ truyền

Băng 1.3 Một số gen liên quan đến chứng ưa huyết khối di truyền [5],

(12], [13], [15], (18], (19]

Protein Gen Đột bỉền/da

cơ hình thành cục máu dôngtrong tính mạch, yếu tố nguy cơhuyết khối

tàng nguy cơ huyết khối5.10-Methylene-

tổ xni dẩn den lãng nguy cơ hinil thành cục máu đông

Chát ức chc hoạt hóa

plasminogen-1 (PAI-1)

Serpinei 4G/5G Tâng hoạt dộng => yếu tổ nguy

cơ huyềt khối tinh mạch và cácbiển chứng thai kỳ

=> tăng nguy cơ hình thànhhuyết khói

(Phe224Phe)

Lã protein hình thành nên trunggian kết dinh tiêu cầu chưa rõ

anh hường cua dột biến lèn quátrinh đông máu

(Leu33Pro)5-

1.23 Vai trò cùa hai đột biến gen ITGA2 C807T và ITGB3 Leu33Pro

Gen 1TGA2 năm ưên cánh dài nhiêm sắc thế sổ 5 (5q 11.2) mà hóa tiếu

đơn vị alpha 2 một thụ thê kết dinh xuyên màng (intergrin) cùa tiêu cầu vớicollagens và các protein liên quan

Chr 5

i 5 ịrịịị JjH £

Hình 1.1 V| tri cúa gen IT GA 2 trèn NST số 5 [20]

Mờ ta dột biển gen ITGA2- C807T

Protein đirọc mà hỏa lả integrin subunit alpha 2 ket hợp với tiêu đơn vị beta 1 tụo thành trung gian cho sự kết

ngoại bão (intcrgrin a2pi) [20] Đột biến ITGA2 CS07T dần

vã tảng tý lộ kết dinh tiêu cầu Nhiều nhà nghiên cửu dà chi ra mối liên quan giữa sự hiện diện cua alen T trong thiếu mâu cục bộ và huyết khối tấc mạch, dộc biệt lã ớ tuồi trê [21 ]

e»rr»c »■<.«««

(4WK

Hinh 1.2 Mò tá hoạt động cùa các thụ the kết dính (intersrin)

Gen ITGB3 nẳm ưén cánh dãi nhỉềm sấc thê 17 (17q21.32) mã hóa tiêu

đơn vị beta 3 là một protein bề mật te bão kct hựp với cãc tiêu đơn vị alpha tạothành cảc thụ thè kết dinh allbfB và «V03 trãi bề mặt tiêu cẩu Các thụ the này cỏvai trò quan ưọng trong kết tập tiếu cầu [22]

Hình 1.3 Vị trí cùa gen ITGB3 trẽn NST 17 [22]

MÒ tã đột biến gen ĨTGB3' Leu33Pro T196C T1565C »5918.

Đột biến ỈTGB3 Lcu33Pro làm thay đói cấu trúc cãc thụ thê kết dinh giữa

các tiếu cấu

Extracollular domain Heavy Chao

Light chain Membrane

Cytoplasmic domainHinh 1.4 Cấu trúc thụ the kết dính trên bể mặt tiều cầu ullb(ỉ3 [23]

Trong khi thụ thê «201 có vai trò kết dinh tiêu cầu vảo thành mạch bịthương thí các thụ thê ưllbịB và UV03 đóng vai trò chinh ưong kết tập các tiềucằu lại Như vậy khi hai gen này bi đột biểiL sè làm thay đôi các tliụ thè kết dinhgiừa cảc tế bào tiểu cầu và giừa tiêu cẩu với các cấu trúc ngoại bão Điều này cóthề dần tới hiện tượng tâng dông

Đà có nhùng nghiên cửu VC tác động cua gen ỈTGA2 và ỈTGB3 lẻn cãc

biến cố khác như nhồi máu cơ tim nhồi máu phôi nào Các nghiên cứu VC mồiquan hệ gi ùa hai gen nãy với cảc biến cố san khoa hiện tại đang cô những kếtluận khác nhau, thực hiện trẽn cừ mẫu còn nho nên chưa dưa ra được kểt luận ròràng [21] [24]

Do dó cần thiết dê cỏ những nghiên cứu sâu hơn về hai gen này vả vai tròcua chúng trong mối quan hệ da biến cua các gen với chứng ưa huyết khối ditruyền

13 Một sổ phương pháp xác định đột biến gen /rơ.42 và ITGB3

allb-subunit pS-subunit

13.1 Kỷ thuật giãi trình tựgen

Giai trinh tự gen lả kỹ thuật dùng đê xác dịnh trùiỉi tự nucleotide cua một gencụthẽ

Cỏ một số phương pháp giai trinh tự gcn nhưng hiện nay phô biến làphương pháp giải trinh tự gen theo nguyên lý Sanger và phương pháp giai trình

tự gen thế hộ mới

Phương pháp giai trinh tự theo nguyên ỉý Sanger

Phương pháp giãi trinh tự theo nguyên lý Sanger dược pliat minh bơiFrederick Sanger (1977) và ngày nay dược ảp dụng bời hầu hết cảc thiểt bi vá kỳthuật giãi trinh tự DNA tién tiền

Phương pháp này còn cớ tên là phương pháp dideoxy (chain termination)

do có nguyên lý lả sử dụng dideoxynucleotide triphosphates (ddNTPs) lãm chấtchấm dirt kéo dài chuồi DNA (chain terminators) Trong quá trinh tòng hợpDNA, enzyme DNA polymerase xúc tãc gản các nucleotide vào mạch dơn DNAdang tông hợp ờ vị tri 3’ cỏ chứa nhỏm -OH tự do khi gặp nucleotide không cónhóm 3’-OH tlũ phan ímg tông hợp bi dừng lại Trong phương pháp nãy, khi mộtddNTP đưực gần vảo mạch đơn DNA dang tông hợp thay ù một nucleotide thôngthường (deoxynucleotide triphosphate dNTP) <Ịuá trình tông họp mạch dơn

tiếp theo cua enzyme DNA polymerase Tử đó sẽ tạo ra các đoụn polynucleotide

cỏ chiều dãi khác nhau Đe xác định trinh tự nucleotide, người ta diện di kết quathu được trẽn gel polyacrylaniid Các đoạn polynucleotide cỏ kích thước khácnhau sè di chuyên với tốc độ khác nhau trài ban gel Lúc náy thực hiện phan ứnghiện hình phỏng xạ cỏ thè quan sát dược các doạn mạch đơn DNA bang cãc vạchtrài ban gel Tông hợp ket qua sè thu dược trình tự sắp xếp cãc nucleotide cuađoạn gen Kỳ thuật này xãc định trực tiếp trinh tự các nucleotide, sè xác địnhdược tất ca các bất thưởngda hình gen có độ chính xác cao và được coi là

tiêu chuấn vàig trong xác định biển đồi gen Tuy nhiên giai trinh tự mất nhiều thời gian, giá thành cao.

The difference between the stopnuclcotidc ddNTP and a normal nucleotidedNTP

Hình 1.5 Sự khác nhau giữa cấu trúc cua ddNTP và dNTP Phương pháp

giãi trình tự gen thể hệ mới (NGS - Next Generation Sequencing)

Khác phục cảc hạn chế cua phương pháp Sanger, giai rrnứi lượng cao cho phép phàn tích song song nhiều trình tự DNA Nguyên lý hoạt động cơ ban vần tương tự như phương pháp Sanger song kỹ thuột này cho phép giãi trinh tự vin một lượng lởn các đoạn DNA khác nhau tại cũng một thời diem, từ dó tiết kiệm thời gian và cho lượng dừ liệu đầu

ra vô cùng l ón so với phương pháp Sanger Mặc dù giá

phương pháp Sanger nhưng nôi chung, giá thành cua giãi trinh tự gen vàn côn khả cao mặt khác cần trang thiết bị đắt tiền Do dó khó áp dụng tại nhiều cơ sơ, dặc biệt là các cơ sơ tuyến dưới trang thiết bị côn hạn chế

13.2 Kỷ thuật PCR cổ điển (classical PCR)

Polymerase Chain Reaction (PCR) là một kỹ thuật sinh hục phân tư dùng

de tồng hợp DNA trong ống nghiệm, chuỗi DNA được khuếch đại theo cắp lũythừa bằng cách sir dụng enzyme Taq DNA polymerase trong một phản ứng phụthuộc vảo nhiệt độ Phương pháp này dược Kary Mullis để xuất ra vào nãm1985

Nguyên lý cua PCR dựa trẽn sự thay dôi nhiệt độ cua phan ứng chu kỳnhiệt nông lạnh, được chia lãm ba giai đoạn:

- Giai đoạn biến tính (90°C - 95°C): chuỗi DNA sợi kẽp dược chuyến thànhsợi đơn dưới tãc dụng cua nhiệt độ cao do cãc liên ket hydro giừa hai sọiDNA bi phá vờ

- Giai đoạn u (55°c - 65°C): lúc này nhiệt độ dược hạ xuống DNA dược ũvói mối liên kết Các đoạn mồi sè tạo ra những vị trí dê khỡi dầu quá trinhtống hợp

cua đoạn mối dê bắt dầu tông họp DNA bằng cách gẩn thèm cảcnucleotide vảo sợi DNA dang tòng hợp

Các bước này dtrợc lụp lại khoang 25-40 lần trong dó mỗi lần DNA dirợcnhân dôi lên

Các kỳ thuật liên quan tới PCR và có ứng dụng nhiêu trong phát hiện cácdột biến gen bao gồm: kỹ thuật PCR cố điển, kỹ thuật RFLP - PCR kỳ thuậtARMS PCR kỳ thuật real-time PCR

PCR cồ điển là kỳ thuật mà sau khi khuếch đại DNA cần thực hiện thêmcác bước dê phân tich san phàm khuếch dại xem cỏ sản phẩm mong muốn haykhông Thòng thường, san phan khuếch đại sè dược diện di trên gel agarose,hoặc dùng các đoạn dò dặc hiộu (trài màng, trên giếng hoặc phiến nhựa ) dê xác

định đoạn DNA cần tim.

Đây là phương pháp dễ thực hiện, chi phí thấp, tuy nhiên mat nhicu thờigian, độ đặc hiệu không cao vả sử dụng một so hóa chất độc hại để nhuộm bangel

133 Kỹ thuật RFLP - PCR

RFLP-PCR (Restriction fragment length polymorphisms PCR) lã kỹ thuậtPCR sư dụng tinh đặc hiệu cua enzym cắt giới hạn đối với vị trí nhận biềt cuachùng trên đoạn DNA đè nghiên cứu tính da hình chiều dài cua các đoạn DNA.Sau khi tiến hãnh PCR vói mồi dặc hiệu cho đa hình cằn tim mầu được ú vóỉenzyme giới hạn thích hợp ờ dung dịch đệm thích hop với pH nhiệt độ hợp lý sètụo ra nhùng phân đoạn DNA với kích thước khác nhau Sán phẩm sau đỏ dượcđiện di Dựa trên sự khác nhau cúa các bàng DNA sau điện di sê phát hiện được

da hình

Kỳ thuật nãy tuy kinh tế hon giài trinh tự gcn nhưng lại không xác địnhđược toàn bộ các biến dôi gcn Các bước thực hiện còn phức tạp tốn thin gian.13.4 Kỳ thuật ARMS - PCR

ARMS - PCR (Amplification-refractory mutation system PCR) là kỳ thuậtdược sư dụng đè phát hiện bất kỳ đột biến nào lien quan đền những thay dôi bazơđơn le hoặc sự mất đoạn nhó

Nguyên lý cua kỳ thuật nãy lã sư dụng các đoạn moi đặc hiệu, do đó nó chi chophép phan ững khuếch dại xay ra khi đoạn DNA chửa alcn đích cần tim Sauphan ứng ARMS, sự hiện diện cỏ hoặc không cua sán phàm PCR giúp xãc định

cỏ hoặc không có alcn đích cần tim trong mẫu ban đầu Phan ứng dùng các mồiđậc hiệu cỏ trinh tự đầu 3' bó sung vời alen dột biến vá một mòi chung ngượcchiều với vói mồi đặc hiệu alen Kct qua PCR dược diện di và phân tích kết qua

cô thề ưa lời có alen dột biền cần tim hay không, nếu có thi kiêu gen là dồng hợp

hay dị họp Khắng đinh không cỏ alcn dột biến với ki cu gcn bính (hưởng cùngđược thê hiện bảng hình ảnh hiền thị ưẽn máy chụp gel nhở Sừ dụng cả mỗi alcn(hường Việc sư dụng ca chứng dương (gcn cỏ alen dột biến đã biết trước) haychứng âm (gen không mang alcn đột biến) giúp cho việc kiêm chứng chất lượngcua cặp mối dặc hiệu dược chính xác lum.

Kỷ thuật này đặc biệt hữu dụng trong việc phát hiện một đột biến cụ thètrẽn gen không cần thiết phái giải trinh tự tất cá câc nucleotide trên đoạn genmầu mả chi cằn phát hiện cõ chứa đột biến nào dô hay không thông qua việc xácđịnh kích thước cua san phàm PCR thu dược Do dó tiết kiệm được nhiều thòigian vã kinh phí hơn thực hiện đơn gian vã thuận tiện hơn

13.5 Kỳ thuật Real-time PCR

Kỳ thuật Real-time PCR dược sứ dụng vần với mục đích là khuếch đại phàn

tư DNA, tuy nhiên khác vói kỹ thuật PCR thông thưởng, kết qua cùa nó dượcphân tích và do lường, hiển thị ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt cua phan ứng, do dó

kỳ thuật này có tên là Real-time hay còn được gọi là PCR định lượng(Quantitative PCR) Trong kỹ thuật PCR thông thưởng, chi sau khi phán ứngkhuếch dại kết thúc, san phàm cua PCR mới dược xác định bằng diện di trài gelagarose Kỳ thuật Real-time PCR vần sư dụng Taq polymerase, mồi dNTPs kếthợp chu trinh nhiệt tối ưu đê khuếch dại DNA

Có hai phương pháp phô biến de xác định san phẩm ttong kỳ thuật time PCR đó lả:

Real Sứ dụng các dye phát huỳnh quang không dìic hiệu gẳn vảobất kỳ đoạn DNA mạch đôi nào đó

- Sư dụng các đâu dò DMA dặc hicu có chứa các đoạn oligonucleotide đàđược đảnh dầu với chất phát huỳnh quang, từ đó cho phép phát hiện chikhi có sự lai giừa dầu dò với một trình tự bố sung với nó

Real-time PCR được thực hiên trong một mây gia nhiệt có kha nàng chiếu sáng mỏi một mẫu với một chũm ánh sáng có chiều dãi bước sóng nhất dinh và

xác định dược ảnh sảng huỳnh quang phát ra từ các phân tứ huỳnh quang bỊ kíchhoạt Khi DNA dích cỏ du sò lượng nhãn ban sè làm cho õng phan ứng pháthuỳnh quang nhận được nguồn sáng kích thích, ngược lại sè không thê phát dượchuỳnh quang nếu không cỏ sán phàm khuếch đạỉ trong ống Như vậy nểu nongmẫu ban dầu số lượng DNA đích nhiều thi sè cần ít chu ký nhiệt hon dê tạo dược

số lượng ban sao du phát tin hiệu huỳnh quang máy ghi nhận dược, trường hụpmầu ban dầu có ít DNA dích thỉ sẽ cần nhiều chu kỳ nhiệt hơn Trong trường hợpmầu ban đầu không có DNA đích, máy sè không phát hiện được tin hiệu huỳnhquang

Có the tinh toán số bản sao cùa DNA đích ban dầu dựa vào đường biếudiễn chuãn (dược tạo nên bời các mảu chuẩn dà biết trước nồng độ), xác dịnhmối quan hộ giừa chu kỳ ngưởng với số lượng ban sao DNA đích có trong ốngphàn ứng Khi cường độ tin hiệu huỳnh quang cua mẫu vượt qua đường tin hiệuhuỳnh quang ncn (base line) cua phan ứng mầu thi dược xem là dương tinh vàngười ta lấy thời diêm vượt qua đó (biêu hiện qua giã ưị chu ki ngưởng- Ct-Cycle threshold) dê so sánh với 1 dường cong chuẩn (stADNard curve) dã biết

de suy ra nồng dụ trinh lự DNA đích trong thư nghiệm ban đầu Dường congchuẩn cỏ chứa sân phẩm đích đà biết ưước nồng độ

ligarc II Ktaacw ộế I M R ■af'LtKat’OM I»nr lUuc w» pl «»<*•« curtc of a ptMrtnc uRipk Rod acwanxc

Hinh 1.6 Biêu đồ một đường bicu (liễn khuếch đạí ghi nhận cường dộ

huynh quang khỉ nhận dược ánh sáng kích thích ớ mỗi chu kỳ nhiệt

Hiện nay kỳ thuật Real-time PCR đang nôi bật với các ưu diem là tiết kiệmthời gian và công sức, cho phép định lượng sổ ban sao ban đầu chi phi tháp, phũ hợp sư dụng trong phát hiện các đa hình gcn dà được xác định

Iliộn nay lại Bộ môn Y sinh học - Di truyền Trường Dụi học Y Hả Nội xét nghiệm xác định các dột biến gen liên

quan đến huyết khổi bao gồm ca hai gen ỈTGA2 vã ITGB3

dược thực hiện bằng kỹ thuật Real-time PCR

Chircmg 2 ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứt

Dối tượng nghiên cửu là các phụ nữ có lien sir say thai, thai chét lưu đenkhám, tư vấn và làm xét nghiệm tại Bộ môn Y sinh hục - Di truyền Trường Đạihọc Y Hà Nội từ 11/2019 đen 11/2020

Đỗi lượng thoa màn đổng thòi cãc tiêu chuẩn sau:

- Cõ tiền sư sẩy thai, thai chết lưu lừ một lần trớ lên

- Các lằn có thai là thai tự nhiên hoặc bang các phương pháp hở trợ sinh sàn

- Đồng ý xct nghiệm tím đột bicn ITGA2 C807T vàITGB3 Leu33Pro.

- Đồng ý tham gia nghiên cửu

2.12 Tĩèu chuẩn loại trừ

Thóa màn một trong các liêu chí:

- Tien sư có thai bị tống xuầt ra khói buồng tư cung sau 22 tuần hoặc trọnglượng thai lớn hơn 500gram

- Tien sư thai ngoài tứ cung, thai trứng

- Tien sư đính chi thai nghén lự nguyện hoặc do dị tật có chỉ định cua bãcsỳ.

- Các trường hợp dã xác định dược nguyên nhân sấy thai, thai chết limthuộc các nhóm nguyên nhản khác

- Không đổng ý tham gia nghiên cửu

Nghicn cứu dược tiền hành tại phỏng Di truyền phân tứ Bộ môn Y sinh học

- Di truyền, Trường Đại Học Y Hà Nội trong thời gian từ tháng 11/2019 đentháng 5/2021

thoa màn tiêu chuân lựa chọn dồi tượng nghiên cứu

* Dụng cụ: Ong Eppendorf 1.5 ml micropipet cãc loại (0,5-10pl 20- 100

ui 200-1000 pl) các loại dầu còn phù hợp với micropipette

* Trang thỉết bị

- Thiết bị dũng trong tách DNA: Máy vortex, máy ly tâm máy u nhiệt độESCO máy do OD Nanodrop 2000.

Thiết bị dùng trong Real-time PCR: Mây CFX 96-BioRad

(1) Thu thập thông tin đối tượng tham gia nghiên cứu

(2) Lấy vả xử lý mầu bệnh phâm

(3) Tách DNA từ mảu nghiên cứu bàng bộ kit DNA • Express (Lytech • Nga IVD)

(4) Do nồng độ vã kiểm tra độ tinh sạch bang máy quang phó kế Nanodrop 2000

(5) Tiến hành xác định đột biến gen ỈTGA2 C807T và ỈTGB3 Leu33Pro bằng