VI SINH môi TRƯỜNG báo cáo nhóm 6

---NHÓM 6---Dương Công Thàng Nguyễn Trung Bảo B VI SINH MÔI TRƯỜNG PHÂN BIỆT VÀ GIẢI THÍCH CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH & ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT TRONG MỘT MẪU MÔI TRƯỜNG.

-NHÓM

6 -Dương Công Thàng

Nguyễn Trung Bảo

B

VI SINH MÔI TRƯỜNG PHÂN BIỆT VÀ GIẢI THÍCH CÁC PHƯƠNG PHÁP

PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH & ĐỊNH LƯỢNG

VI SINH VẬT TRONG MỘT MẪU MÔI TRƯỜNG

CHỦ ĐỀ:

Phân biệt và giải thích các phương pháp Phân tích ĐỊNH TÍNH và ĐỊNH LƯỢNG vi sinh vật

trong một mẫu môi trường (đất, nước)

A/ Phương pháp phân tích ĐỊNH TÍNH vi sinh vật

B/ Phương pháp phân tích ĐỊNH LƯỢNG vi sinh vật

1- Phương pháp đếm trực tiếp

Là phương pháp định lượng dựa trên sự quan sát và đếm trực tiếp số lượng tế bào vi sinh vật bằng kính hiển vi và buồng đếm

Đối tượng: mật độ vsv đơn bào có kích thước lớn như nấm men, men, tảo… có thể được xác định trực tiếp bằng buồng đếm trên kính hiển vi

- Ưu điểm: cho phép xác định nhanh chóng số lượng vi sinh vật có trong mẫu

- Nhược điểm:

 Không phân biệt được tế bào sống và chết trong mẫu

 Không phân biệt được các tế bào vi sinh vật và vật thể

 Hạn chế đối với huyền phù có mật độ thấp do lượng dung dịch đem đếm nhỏ

 Độ chính xác không cao, dễ nhầm lẫn

 Không thích hợp mẫu có mật độ vi sinh thấp

Để hạn chế nhược điểm của phương pháp đếm trực tiếp, có 3 phương pháp đếm trực tiếp:

 Đếm trực tiếp bằng kính hiển vi hùynh quang

 Đếm trực tiếp bằng buồng đếm breed

 Đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu

Cách tiến hành:

2- Phương pháp đếm khuẩn lạc

Khác với phương pháp đếm trực tiếp, phương pháp đếm khuẩn lạc cho phép xác định số lượng tế bào vi sinh vật còn sống hiện diện trong mẫu Tế bào sống là

tế bào có khả năng phân chia tạo thành khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc Do vậy phương pháp này có tên gọi là phương pháp đếm khuẩn lạc

Mặc dù có một số nhược điểm nhưng phương pháp đếm khuẩn lạc vẫn là phương pháp tốt nhất để xác định mật độ tế bào sống

- Ưu điểm: là độ nhạy cao, cho phép định lượng vi sinh vật ở mật độ thấp trong mẫu phương pháp này được sử dụng rộng rãi trong kiểm nghiệm vi sinh vật trong nước.có thể định lượng các vi sinh vật kích thước nhỏ, di động

- Nhược điềm:

+ Mật độ tế bào quá lớn làm các khuẩn lạc chồng chéo lên nhau hoặc tạo thành màng sinh khối

+ Số lượng khuẩn lạc trên một đĩa quá nhỏ sẻ không có giá trị thống kê

+ Nhiều tế bào chưa kịp hình thành khuẩn lạc nếu thời gian ủ không đủ dài + Phương pháp đếm khuẩn lạc dể cho sai số lớn nên cần thực hiện lặp lại trên ít nhất 2 đĩa

3- Phương pháp đếm khuẩn lạc trên màng lọc

Phương pháp này thường được dùng để định lượng vi sinh vật chỉ thị trong mẫu nước khi tiến hành các thí nghiệm môi trường nơi có mật độ vi sinh vật tương đối thấp phương pháp này gồm bước lọc để tập trung vi sinh vật trong mẫu nước trên màng lọc và xác định số tế bào vi sinh vật dựa vào số khoảng lạc đếm được sau khi đặt màng lọc lên trên môi trường thạch có thành phần dinh dưỡng thích hợp cho loại vi sinh vật cần kiểm Dựa trên khối lượng màu nước ban đầu và quy ước là mỗi khuẩn lạc được hình thành từ tế bào vi sinh vật, người ta quy ra số lượng vi sinh vật có trong một đơn vị thể tích nước

Như vậy phương pháp này là sự kết hợp của các phương pháp lọc vô trùng và phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa petri Màng lọc có kích thước lỗ là 0,45pm hoặc 0,2 pm được chế tạo từ các nguyên liệu là sợi thủy tinh siêu mánh, sợi polypropylene, thường được cung cấp trong trạng thái vô trung

Ngoài màng lọc bình thường hiện nay người ta còn sử dụng màng lọc lưới kị nước trên đó có in các ô vuông bằng vật liệu kỵ nước các vạch chia ô bằng vật liệu này ngăn cán sự mọc lan của các khuẩn lạc khác với trường hợp màng lọc bình thường , từ số các ô vuông có khoảng lạc mọc, mật độ vi sinh vật trong mẫu nước

được tính và tình bày dưới dạng số có xác suất lớn nhất(mpn) của lượng vi sinh vật

có trong một đơn vị thể tích mẫu theo công thức :mpn = n.ln(n/n-x)

- Ưu điểm: xác định được mật độ vsv cụ thể trong một thể tích mẫu lớn: 10ml; 100ml;…

- Nhược điểm: không thích hợp cho việc phân tích các mẫu thực phẩm rắn

4- Phương pháp đo độ đục

Ngoài các phương pháp nêu trên, mật độ vi sinh vật c.ó thể đươc xác định một cách gián tiếp thông qua đo độ đục khi một pha lỏng có chứa nhiều phần tử không tan thì sẻ hình thành một hệ huyền phù và có độ đục bởi các phần tử hiện diện trong môi trường lỏng cản ánh sáng, làm phân tán chùm ánh sáng tới Tế bào vi sinh vật là một thực thể nên khi hiện diện trong môi trường củng làm môi trường trở nên đục Độ đục của huyền phù tỷ lệ với mật độ tế bào Trong một giới hạn nhất định của độ đục và mật độ tế bào, có thế xác lập được quan hệ tỷ lệ tuyến tính giữa mật độ tế bào và độ đục Do vậy có thể định lượng mật độ tế bào một các gián tiếp thông qua đo độ đục bằng máy so màu ở các bước sóng từ 550-610nm Trong trường hợp này, trước tiên cần phải thiết lập được đường quan hệ tuyến tính giữa độ đục và mật độ tế bào bằng cách sử dụng một số huyền phù tế bào có độ đục xác định và mật độ tế bào của mỗi huyền phù được xác định bằng một phương pháp trực tiếp khác, ví dụ như phương pháp đếm khuẩn lạc, phương pháp đếm trực tiếp…

Phương pháp định mật độ tế bào theo độ đục có thể được dùng để so sánh mức độ tàng trướng của hai hay nhiều chung vi sinh vật môi trường lỏng Trong trường hợp không cần biết giá trị tuyệt đối của mật độ tế bào thì không cần phải xây dựng đường tương quan tuyến tính giữa độ đục và mật độ

- Ưu điểm: Phương pháp này cho kết quả nhanh thường được ứng dụng trong theo dõi hoặc nghiên cứu đặc trung tăng trưởng của các chủng vi sinh vật trong phòng thí nghiệm hoặc trong sản xuất

- Nhược điểm: không thích hợp cho ứng dụng trong kiểm nghiệm vi sinh vật

5- Phương pháp MBN

Phương pháp dựa trên nguyên tắc xác suất thống kê sự phân bố vsv trong các độ pha loãng khác nhau của mẫu Hay có thể nói là phương pháp đánh giá số lượng

vi sinh vật có xác xuất lớn nhất hiện diện trên một đơn vị thể tích Phương pháp này có thể dùng để định lượng mọi nhóm vi sinh vật có thể được nuôi cấy trong môi trường lỏng chọn lọc và cho kết quả biểu kiến thích hợp

Là phương pháp định lượng dựa trên kết quả định tính của một loạt thí nghiệm được lặp lại ở một số độ pha loãng khác nhau (thông thường mỗi độ pha loãng được nuổi cấy lập lại nhiều lần (3-10 lần)) Số lượng ống nghiệm được lặp lại càng nhiều lần thì độ chính xác càng cao

Quy trình thực hiện phương pháp này như sau:

+ Cho vào các ống nghiệm có chứa các môi trường thích hợp cho sự tăng trưởng của đối tượng vi sinh vật cần định lượng một thể tích xác định dung dịch mẫu ở nhiều nồng độ pha loãng liên tiếp

+ Ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp

+ Dựa vào kết quả biểu kiến chứng minh sự tăng trưởng của vi sinh vật cần kiểm định trong từng ống nghiệm (ghi nhận số lượng số lượng ở từng độ pha loãng)

+ Sử dụng số liệu dựa vào bảng Mac Crady, suy ra mật độ vi sinh vật được trình bày dưới dạng số MPN/100ml hay số MPN/1g mẫu

Bảng Mac Crady (hình ảnh)

Các độ pha loãng dk chọn lựa sao cho trong các lần lặp lại có một số lần dương tính và có một số lần âm tính

Số lần dương tính được ghi nhận và so sánh với bảng thống kê -> giá trị ước đoán số lượng vsv trong mẫu

- Ưu điểm : cho phép định lượng được mật độ vi sinh vật thấp trong thể tích mẫu lớn

Link bổ sung nội dung: https://www.slideshare.net/kimqui91/173083723-baigiangltphantichvisinhdhcd