Bài giảng Công nghệ enzime

Cung cấp cho sinh viên một số kiến thức cơ bản về: Phương pháp công nghệ để thu được chế phẩm enzym Phương pháp nghiên cứu về enzym Các ứng dụng của enzym Sự biến tính: Tất cả các yếu tố làm biến tính protein (nhiệt độ cao, axit đặc, kiềm đặc, muối kim loại nặng .v.v.) đều có thể làm biến tính Enzym và làm mất một phần hoặc hoàn toàn hoạt tính xúc tác Cường lực xúc tác: Ở điều kiện thích hợp, Enzym xúc tác tạo ra phản ứng có tốc độ rất nhanh có thể gấp 108 đến 1011 lần phản ứng thiếu xúc tác (một gam pepsin phân giải 5 kg protein trứng trong 2 giờ, 1 gam renin làm đông tụ 72 tấn sữa trong sản xuất phomat . . .)

Công nghệ enzym

Người giảng bài PGS TS Nguyễn Duy Thịnh

ĐT 0913.349.796

Mục đích của môn học

Cung cấp cho sinh viên một số kiến thức cơ bản về:

- Phương pháp công nghệ để thu được chế phẩm enzym

- Phương pháp nghiên cứu về enzym

- Các ứng dụng của enzym

2

Phần mở đầu MỘT SỐ KHÁI NIỆM

Enzym là gì?

Là chất xúc tác sinh học, có nguồn gốc protein

Tính chất của enzym

 Sự biến tính: Tất cả các yếu tố làm biến tính protein (nhiệt độ cao, axit đặc, kiềm đặc, muối kim loại nặng v.v.) đều có thể làm biến tính Enzym và làm mất một phần hoặc hoàn toàn hoạt tính xúc tác

Cường lực xúc tác: Ở điều kiện thích hợp, Enzym xúc tác tạo ra phản ứng có tốc độ rất nhanh có thể gấp 108 đến 1011 lần phản ứng thiếu xúc tác

(một gam pepsin phân giải 5 kg protein trứng trong 2 giờ, 1 gam renin làm đông tụ 72 tấn sữa trong sản xuất phomat )

Tính chất của enzym

chất nhất định theo một kiểu phản ứng nhất định, vì thế không gây ra phản ứng

phụ

Điều kiện phản ứng: phản ứng Enzym xấy ra trong điều kiện thông thường (nhiệt độ thấp – 300C đến 500C, pH trung tính, áp suất thường), nên không cần thiết bị đắt tiền

Tính chất của enzym

Tính độc hại: Tất cả enzym có nguồn gốc tự nhiên không độc

Tính kinh tế: Hầu hết các chế phẩm enzym được sản xuất từ nguồn nguyên liệu dễ kiếm và rẻ tiền

Enzym proteaza động vật thường thu từ các phụ phẩm của lò mổ, còn enzym thực vật thu từ lá, thân, vỏ, nhưa cây của một số loại cây

Hoạt độ enzym

 Hoạt độ enzym: thể hiện tính hoạt động của enzym

hóa một lượng cơ chất nhất định trong một đơn vị thời gian ở điều kiện tiêu chuẩn

Đơn vị hoạt độ enzym

 Đơn vị IU: Là lượng enzym có khả năng chuể hóa 1 micromol cơ chất sau thời gian 1 phút

Hoạt độ enzym

Hoạt độ riêng của một chế phẩm enzim: là số đơn vị hoạt độ enzym trên đơn vị khối lượng protein IU/1 mg protein hoặc kat/1 mg protein

Hoạt độ phân tử (còn goi là hoạt độ riêng phân tử): là số phân tử cơ chất được

chuyển hóa bới một phân tử enzym trong một đơn vị thời gian (phút)

Hoạt độ tâm xúc tác: là số phân tử cơ chất được chuyển hóa bởi một trung tâm hoạt động trong 1 đơn vị thời gian (phút)

Chương 1 Công nghệ thu chế phẩm enzym

1.1 – Nguồn nguyên liệu thu enzym

 Enzym không thể tổng hợp được bằng con đường tổng hợp hóa học

 Enzym được thu nhận từ:

- Nguồn động vật (8%)

- Nguồn thực vật (4%)

- Nguồn vi sinh vật (chr yếu từ nấm mốc và nấm men, 1/3 từ vi khuẩn)

1.1 – Nguồn nguyên liệu thu enzym

1.1.1- Enzym động vật

- Tụy tạng: amilaza, maltaza, lipaza, trypsin, nucleaza, colesterol esteraza,

chymotrypsin, elastaza, carboxyl - peptidaza, pectinaza, v.v

Các enzym này tiết ra ngoài tế bào cùng với dịch tụy

- Dạ dầy: màng nhầy của dạ dầy lợn, chó, gà, thỏ chứa pepsin A, B, C, D Dạ dày lợn con có gastrisin (thủt phân protein)

1.1.1- Enzym động vật

- Tuyến nước bọt: có enzym tiêu hóa như amilaza, maltaza và enzym kalicrein làm tăng sự tiết nước bọt

- Huyết thanh: có một số enzym chỉ thị

 Amylaza tăng khi viêm dạ dầy

 Phosphataza tăng khi bị còi xương, tắc mật

 Transaminaza tăng khi viêm gan, nhồi máu cơ tim

1.1.2 – Enzym thực vật

- Papain trong nhựa đu đủ

- Bromalin trong thân, lá và vỏ quả dứa

- Plazmin, papain, fixin có trong lá, quả, thân các cây họ xung, si, vả

- α và β – amilaza có trong malt đại mchsj và malt thóc

- Ureaza có trong giá đậu tương

- Lipaza có trong mầm hạt thầu dàu

- Polyphenoloxydaza có trong lá chè

1.1.3 – Enzym vi sinh vật

Enzym vi sinh vật thu được từ việc nuôi cấy VSV trong những điều kiện nhất định

VSV phát triển với tốc độ rất lớn nên có thể cho lượng chế phẩm enzym lớn

Enzym VSV có hoạt tính rất mạnh so với enzym động vật và enzym thực vật

Một số enzym động vật

Ngoại bào

Sử dụng trong CN

Một số enzym thực vật

Ngoại bào

Sử dụng trong CN

Một số enzym vi khuẩn

Ngoại bào

Sử dụng trong CN

Gluco isomeraza Bacillus Streptomices Nội Siro fructoza

Một số enzym nấm sợi

Ngoại bào

Sử dụng trong CN

Một số enzym nấm sợi (tiếp theo)

Ngoại bào

Sử dụng trong CN

Một số enzym nấm men

Ngoại bào

Sử dụng trong CN

1.2 - Phương pháp thu chế phẩm enzym vi sinh vật

Quy trình sản xuất chế phẩm enzym vi sinh vật gồm 3 giai đoạn

 Phân lập, tuyển chọn và cải tạo giống VSV

 Nuôi cấy VSV tổng hợp enzym

 Tách và tinh chế enzym

B – Cải tạo giống vi sinh vật

Nguyên tắc: Enzym được tạo thành trong tế bào đều được xác định bởi tính di truyền của tế bào do đó có thể dùng các tác nhân đột biến tác động lên bộ máy di truyền của tế bào để tạo ra các dạng biến chủng có khả năng sinh tổng hợp đặc biệt cao

một loại enzym nào đó như mục đích đã đặt ra

Hai phương pháp gây đột biến

tạo biến chủng

Phương pháp thứ nhất: Đột biến bằng các tác nhân vật lý hoặc hóa học

Các tác nhân vật lý: Chiếu bằng các tia: tia cực tím, tia rơnghen (tia X), tia gama, bắn bằng hạt notron, electron

Các tác nhân hóa học: Các hợp chất chứa ni tơ như nitrozometylguanidin,

metyldicloroetylamin nitrithydroxylamin, etymetylsulfonat

Hai phương pháp gây đột biến

tạo biến chủng

Phương pháp thứ 2: đột biến bằng phương pháp sinh học phân tử

 Phương pháp biến nạp: là sự truyền ADN từ tế bào cho đến tế bào nhận Tế bào

có thể nhận một số doạn ADN nhất định (thường không quá 10 đoạn), không cần

có sự tiếp xúc giữa 2 tế bào mà chỉ tiếp xúc với dịch chiết

Các đoạn ADN được truyền đi trong biến nạp có phân tử lượng khoảng 106 –

107 và phải có cấu trúc xuắn kép

Phương pháp thứ 2: đột biến bằng phương pháp sinh học phân tử

Phương pháp tiếp hợp gel: ADN chỉ được truyền từ tế bào cho đến tế bào nhận bằng

sự tiếp xúc giữa 2 tế bào Các tế bào có khả năng biến nạp thì không có khả năng tiếp hợp gel

Phương pháp tải nạp: ADN được truyền từ tế bào cho đến tế bào nhận nhờ vai trò

trung gian của thực khuẩn thể Trong quá trình tải nạp, các đoạn ADN được chuyển đến tế bào nhận và tiếp hợp với ADN của tế bào nhận làm biến đổi tính chất di

truyền của tế bào

1.2.2 - Các phương pháp nuôi vi sinh vật

Có 2 phương pháp nuôi VSV

 Phương pháp nuôi bề mặt

 Phương pháp nuôi chìm

A - Phương pháp nuôi bề mặt

Còn gọi là phương pháp rắn, phương pháp nổi (solid state fermentation)

Nguyên tắc: Nuôi VSV trên bề măt môi trường dinh dưỡng ở thể rắn đã được làm ẩm

và vô trùng

Môi trường dinh dưỡng: cám gạo, khô cám, cám mỳ, tấm gạo, ngô (chiếm 90 – 95%)

có bổ xung trấu để làm xốp Có thể bổ xung nguồn ni tơ hữu cơ (cao nấm men, cao ngô, dịch chiết nấm men) và ni tơ vô cơ (muối NH3 hoặc NO3)

A - Phương pháp nuôi bề mặt (tiếp theo)

Điều kiện kỹ thuật:

Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp nuôi bề mắt

Ưu điểm:

Cho nồng độ enzim cao

Canh trường sau khi sấy khô bảo quản và vận chuyển dễ dàng

Tránh được nhiễm trùng toàn bộ canh trường

Ít tốn năng lượng

Nhược điểm:

Phương pháp gián đoạn, khó cơ giới và tự động hóa

Cần nhiều diện tích nuôi, năng suất thấp, lao động thủ công

B - Phương pháp nuôi chìm

Còn gọi là phương pháp lỏng, phương pháp bề sâu ( liquit state fermentation)

Nguyên tắc: VSV được nuôi và phát triển trong môi trường dinh dưỡng lỏng, có sục khí liên tục

Môi trường dinh dưỡng: Cần phải có thành phần dinh dưỡng phù hợp với từng loại VSV

Nguồn dinh dưỡng nuôi chìm

Nguồn các bon: các loại đường dễ đồng hóa như gluco, malto, rỉ đường, hoặc tinh bột

đã thủy phân sơ bộ, có thể sử dụng glyxerol, axit béo

Nguồn ni tơ:

ở 2 dạng:

Vô cơ: (NH4)2SO4, NaNO3, NH4NO3

Hữu cơ: nước chiết từ malt, ngô, cao ngô, cao nấm men, pepton, bột cá, khô đậu tương, khô lạc

Nguồn muối khoáng, vitamin: MgSO4, K2HPO4, K2SO4, FeSO4, B1, B8 (biotin)

Điều kiện kỹ thuật nuôi chìm

Pha chế dung dịch dinh dưỡng

Thanh trùng ở nhiệt độ : 118 - 1250C,

Thời gian: 45 - 60 phút

Làm nguội và bổ xung VSV giống

Thời gian nuôi 2 – 4 ngày

Xục khí liên tục để tạo môi trường hiếu khí

Chú ý: chống tạo bọt

Thu nhận chế phẩm enzym

sau khi nuôi chìm

Đặc điểm: Sự tiết các enzym vào môi trường xẩy ra trong suốt quá trình phát triển.Enzym của nấm mốc, xạ khuẩn và vi khuẩn là enzym ngoại bào Khi kết thúc quá trình nuôi, tiến hành lọc để loại bỏ sinh khối, thu dịch men và đem cô đặc tạo ra chế phẩm thô, tinh chế, thu được chế phẩm tinh

Chú ý: có một số enzym nội bào (enzym liên kết với các bào quan bên trong tế bào, cần phá vỡ tế bào để thu enzym

Ưu nhược điểm của phương pháp nuôi chìm

Ưu điểm

Có tính liên tục, tiết kiệm diện tích sản xuất

Dễ cơ giới hóa và tự động hóa, năng suất cao

Sử dụng hợp lý các chất dinh dưỡng

Enzym thu được ít lẫn tạp chất

Là phương pháp hiện đại, được áp dụng ở nhiều nướcNhược điểm

Nồng độ enzym thấp nên phải cô đặc, giá thành cao

Tốn nhiều năng lương để khuấy

Dễ bị nhiễm toàn khối

Kiểm soát bọt Kiểm soát áp suất

Giống Cấp 2

Các thông số kỹ thuật cần theo dõi để hiệu chỉnh

trong quá trình nuôi chìm

Bọt: Khi xục khí bọt xuất hiện, cần sử dụng chất chống sinh bọt

Oxy: Sự cấp oxy là cần thiết nhưng cần phải đúng lúc để tránh tình trạng chính sự

có mặt của oxy làm giảm sự hình thành enzym

Các thông số kỹ thuật cần theo dõi để hiệu chỉnh

trong quá trình nuôi chìm

Các thông số về sinh lý

Áp suất CO2: CO2 có vai trò quan trọng trong các phản ứng carboxyl hóa và có vai

tích cực trong một số quá trình tổng hợp enzym thí dụ tổng hợp amilaza của B

subtilis Vì thế không nên tăng cường sục khí trong giai đoạn này.

tổng hợp enzym Oxy làm tăng sự sinh trưởng E coli nhưng làm giảm sự tổng hợp

enzym penicilinacydaza, còn với A niger, oxy vừa làm tăng sự sinh trưởng vừa là tăng sự bài xuất enzym glucooxydaza

Các thông số kỹ thuật cần theo dõi để hiệu chỉnh

trong quá trình nuôi chìm

Các thông số về sinh lý

Chất cảm ứng và ức chế: Có một số chất có tác dụng cảm ứng hoặc ức chế đối với

sự tổng hợp enzym như cellulo cảm ứng đối với T vinide, còn gluco hoặc axit amin

là những chất ức chế

Chất ảnh hưởng tới khả năng trích ly: Sự dư thừa nucliotit là tăng độ nhớt của dịch bào và làm giảm khả năng chiết xuất enzym nội bào

1.2.3 – Các chế phẩm enzym

Gồm 3 dang: chế phẩm thô và chế phẩm kỹ thuật và chế phẩm tinh khiết

A - Chế phẩm thô:

 Chế phẩm thô từ canh trường lỏng: sau khi lên men (nồng độ chất khô 4-6

gam/lít)), lọc, cô đặc chân không ở t0 = 350C đến 15 – 20 g/l, cô tiếp ở t0 = 450C đến 30 – 50 g/l Bổ xung chất bảo quản (NaCl, glycerol, sorbitol, natri

40-benzoat) Có thể tiếp tục sấy phun dung dịch ở nhiệt độ to=1200C và tc= 400C, thu được chế phẩm thô dạng bột

1.2.3 - Các chế phẩm enzym

A - Chế phẩm thô:

Chế phẩm thô từ canh trường bề mặt:

Sau khi lên men, chế phẩm thu được ở dạng rắn, đem sấy khô ở nhiệt độ 400C đến độ

ẩm 12%, thu được chế phẩm men thô ở dạng bột khô

Chế phẩm men thô dùng trong sản xuất khi chế phẩm này không làm ảnh hưởng tới mùi, vị, mầu sức của sản phẩm

1.2.3 - Các chế phẩm enzym (tiếp theo)

B – Chế phẩm kỹ thuật

là chế phẩm đã được tinh chế sơ bộ, trong đó một số protein và enzym tạp đã bị tách

ra Trong Chế phẩm kỹ thuật thường có một vài enzym chủ yếu

Chế phẩm kỹ thuật thường được dùng trong sản xuất thực phẩm

C – Chế phẩm enzym tinh khiết

Là chế phẩm đã được loại bỏ hoàn toàn protein và enzym tạp, chỉ còn lại 1 enzym mong muốn

Chế phẩm enzym tinh khiết dùng trong y học, nghiên cứu khoa học và trong phân tích

1.2.4 – Sự khu trú của enzym

Enzym trong tế bào thường khu trú ở 3 dạng

Enzym ngoại bào: enzym được tổng hợp bên trong tế bào và sau đó được tiết ra môi trường bên ngoài

Enzym nội bào: enzym được tổng hợp bên trong tế bào nhưng liên kết với các chất

và bị nhốt ở bên trong tế bào

Enzym periplasmic: Enzim nằm ở xoang ngoài giữa màng sing chất vf dưới màng tế bào

1.2.5 – Sự trích ly enzym từ tế bào

Sự trích ly enzym chỉ áp dụng cho enzym nội bào và enzym piriplasmic

Cơ sở chung để trích ly enzym từ tế bào

 Để trích ly enzym từ tế bào, trước hết cần phá vỡ cáu trúc tế bào (màng tế bào

và các cấu trúc bên trong) bằng các phương pháp vật lý và hóa học thích hợp để giải phóng enzym

 Tùy theo cấu trúc của tế bào, người ta có thể sử dụng các phương pháp có mức năng lượng khác nhau để phá vỡ tế bào

1.2.6 – Các yếu tố ảnh hưởng đến enzym trong qúa trình phá vỡ tế bào

1- Nhiệt: dùng phương pháp cơ học sẽ sinh nhiệt Cần làm lạnh để giảm nhiệt độ tránh biến tính enzym

2- Lực cơ học: Lực cắt sẽ phá hủy enzym, đặc biệt khi có mặt kim loại nặng hoặc có bề mặt phân chia với không khí

3- pH: các dung dịch đệm, các cơ chất hoặc tương tự như cơ chất, các polyol vai trò

ổn định enzym

4- Hóa chất: enzim có thể bị biến tính khi có mặt một số chất như chất tẩy rửa, dung môi, các poliphenol,

1.2.6 – Các yếu tố ảnh hưởng đến enzym trong qúa trình phá vỡ tế

bào (tiếp theo)

5- Tác nhân oxy hóa: Các tạc nhân có tính chống oxy hóa như axit ascorbic,

mercaptoetanol, ditiotreitol, có lợi cho việc sinh khối và sự tổng hợp enzym

5- Sự sinh bọt: Các bề mặt phân cách giữa pha lỏng và pha khí trong bọt có thể có thể phá hủy hình thể của snzym

6- Kim loại nặng: kim loại nặng từ thiết bị có ảnh hưởng xấu tới hoạt tính của enzym

 Sóng siêu âm có thể làm biến đổi một phần cấu trúc của enzym

A – Phương pháp cơ học (tiếp theo)

Dùng máy đồng hóa cao áp: thường sử dụng máy Manton-Gaulin APV, dùng một

bơm đẩy với áp suất cực lớn (150MPa = 10.000 KG/inch vuông), với tốc độ 10.000 lít/h đi qua 1 van rất hẹp, các tế bào bị bị nén lại, khi qua van, áp suất giảm đi rất nhanh nên và bị phá vỡ Tuy nhiên phương pháp này chỉ có tác dụng tốt đối với các đơn bào việc phá vỡ tế bào dạng sợi không có hiệu quả

Đối với các enzym nội bào chỉ cần qua máy đồng hóa một lần nhưng các enzym liên kết phải qua nhiều lần

A – Phương pháp cơ học (tiếp theo)

Dùng máy nghiền có chứa hạt nhỏ (thủy tinh hoặc thép):

Huyền phù tế bào được trộn với các hạt và cho vào máy lắc Tế bào bị phá vỡ do

va chạm mạnh với các hạt (đường kính thừ 0,25 đến 1 mm) Hiệu suất giải phòng enzym phụ thuộc vào tốc độ lắc, đường kính của thiết bị và kích thước của các hạt

Tế bào càng lớn dễ bị phá vỡ hơn tế bào có kích thước nhỏ

Khi nghiền, nhiệt độ của khối dịch tăng lên, cần phải làm lạnh

A – Phương pháp cơ học (tiếp theo)

Dùng phương pháp lạnh đông

Huyền phù tế bào được làm lạnh đến nhiệt độ - 200C rồi nén dưới áp suất cao (khoảng 10.000KG/1 inch vuông) qua các lỗ hẹp (máy Hughe) Tế bào bị phá vỡ do bị thay đổi pha và thay đổi thể tích, đồng thời bị lực cắt của các tinh thể đá Máy này chỉ làm việc gián đoạn với năng suất thấp

B – Phương pháp không dùng cơ học

- Dùng sốc thẩm thấu: dùng cách tạo ra áp suất thẩm thấu bằng nồng độ đường

sacaro 20% ở nhiệt độ 40C, giải phóng được một số hợp phần của tế bào nhưng chỉ áp dụng cho việc tách enzym từ vi khuẩn gram âm để tách enzym thủy phân có trong xoang periplasmic

- Dùng cách xử lý kiềm: Xử lý tế bào bằng kiềm (pH 11,5 – 12,5) thủy phân màng tế bào giải phóng enzym

B – Phương pháp không dùng cơ học

- Dùng chất tẩy rửa : chất tẩy rửa (triton x-100, hoặc dùng kết hợp với guanidin-HCl)

dùng để trích ly các enzym liên kết màng rất có hiệu quả

- Dung giải bằng enzym Dùng lysozym thủy phân liên kết β-(1-4)- glucosid của các peptidoglucan có tác dụng phá hủy vỏ tế bào, giải phóng ra enzym Phương pháp có giá thành cao nên chỉ dùng ở quy mô nhỏ

1.2.8 - Phân đoạn và tinh chế enzym

Các phương pháp tinh chế enzym

Ba phương pháp

 Phương pháp kết tủa

 Phương pháp sắc ký

 Phương pháp phân tchá lỏng – lỏng

- Kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính

Nguyên tắc: độ hòa tan của một protein tăng cùng với lực ion của môi trường, nhưng khi lực ion vượt ngưỡng nào đó thì độ hòa tan giảm làm protein kết tủa Các muối thường dùng: (NH4)2SO4, Na2SO4 Phần enzym thu được cần phải loại bỏ muối bằng thẩm tích hoặc lọc gel