Công nghệ chất thơm: Nguồn tinh dầu

3.1 Thực vật chứa tinh dầu: 3 3.2 Sự biến đổi của các hợp chất hóa học thực vật. 7 3.2.2.2 Họ Cúc (Compositae) 12 3.3: Xác định nguồn nguyên liệu 16 3.4. Kỹ thuật di truyền và protein 17 3.5. Tài nguyên tinh dầu: Thu nhận từ cây dại hoặc từ cây trồng. 19 3.5.1. Sự thu nhận hoang dã và phát triển bền vững 23 3.5.2. Thuần hóa và hệ thống hóa canh tác 24 3.5.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sản xuất và chất lượng của cây trồng chứa tinh dầu 26 3.5.3.1. Biến thể di truyền và giống cây trồng 26 3.5.3.1.1. Lựa chọn bằng cách khai thác những biến đổi tự nhiên 26 3.5.3.1.2. Sinh sản với thay đổi đa dạng mở rộng (kết hợp sinh sản) 27 3.5.3.1.3. Chăn nuôi với nhân tạo được tạo ra mới thay đổi đa dạng 30 3.5.3.2 Kế hoạch nhân giống cây chứa tinh dầu và các quyền sở hữu trí tuệ: 30 3.5.3.2.1 Bảo vệ giống cây trồng 31 3.5.3.2.2 Bằng sáng chế về bảo hộ giống cây trồng: 31 3.5.3.3 Sự biến đổi thành phần tinh dầu của cây phụ thuộc vào từng giai đoạn phát triển 31 3.5.3.4 Những ảnh hưởng của môi trường 36 3.5.3.5 Các biện pháp canh tác và thu hoạch tránh ô nhiễm 37 3.6 Tiêu chuẩn quốc tế về thu nhận và trồng cây hoang dại: 38 3.6.1 GA(C)P: Hướng dẫn thực hành nông nghiệp tốt các cây dược liệu và cây hương liệu: 38 3.6.2 ISSCMAP: Tiêu chuẩn quốc tế về thu thập bền vững cây dược liệu và hương liệu và tiêu chuẩn FairWild: 39 Tinh dầu là hỗn hợp phức tạp của nhiều hợp chất hữu cơ dễ bay hơi được sản xuất bởi các cơ thể sống và được tách ra bằng các phương pháp vật lý (ép và chưng cất) cơ thể thực vật nguyên vẹn hoặc chỉ một bộ phận của nó đây được xem như một nguồn gốc của phân loại. Những hợp chất quan trọng chủ yếu được dẫn xuất từ 3 con đường sinh tổng hợp.Con đường mevalonate dẫn tới sesquiterpene, con đường methylerithrytol dẫn tới mono và diterpene và con đường acid shikimic dẫn tới phenylpropenes. Do đó các đơn chất tinh dầu có số lượng hầu như không thể đếm được và thành phần của nó thì biến đổi khác thường. Nhiều hợp chất bay hơi có chức năng sinh thái học đa dạng. Chúng có thể hoạt động như những chất vận chuyển nội tại, như những chất bảo vệ chống lại sâu bệnh, những hợp chất bay hơi trực tiếp này không chỉ là thiên địch đối với sâu bệnh mà còn thu hút côn trùng thụ phấn cho cây chủ nữa. Tất cả thực vật phần lớn có khả năng sản xuất ra các hợp chất dễ bay hơi, khá thường xuyên, tuy nhiên chỉ ở dạng vết. “Thực vật tinh dầu là những thực vật đặc biệt cung cấp tinh dầu cho lợi ích thương mại. Hai trường hợp chính để thực vật có thể được gọi với cái tên như vậy là: Hỗn hợp độc đáo của các hợp chất dễ bay hơi như hương thơm của: hoa hồng, hoa nhài hoặc hoa huệ. Những bông hoa này sản sinh trực tiếp các hợp chất dễ bay hơi bởi những lớp biểu bì ở cánh hoa. Do đó hiệu suất thu hồi rất thấp ngay cả đối với những loài hoa vốn có mùi hương mạnh và bên cạnh kỹ thuật chưng cất đặc biệt, ví dụ như, phương pháp tách hương liệu của hoa phải được áp dụng để thu hồi những hợp chất dễ bay hơi. Các hợp chất dễ bay hơi được tiết và dự trữ trong các cấu trúc tổ chức đặc biệt. Điều này dẫn đ

M C L C Ụ Ụ

3.1 Thực vật chứa tinh dầu:

Tinh dầu là hỗn hợp phức tạp của nhiều hợp chất hữu cơ dễ bay hơi được sản xuất bởi các

cơ thể sống và được tách ra bằng các phương pháp vật lý (ép và chưng cất) cơ thể thực vật nguyên vẹn hoặc chỉ một bộ phận của nó đây được xem như một nguồn gốc của phân loại Những hợp chất quan trọng chủ yếu được dẫn xuất từ 3 con đường sinh tổng

hợp.Con đường mevalonate dẫn tới sesquiterpene, con đường methyl-erithrytol dẫn tới mono và diterpene và con đường acid shikimic dẫn tới phenylpropenes Do đó các đơn chất tinh dầu có số lượng hầu như không thể đếm được và thành phần của nó thì biến đổikhác thường Nhiều hợp chất bay hơi có chức năng sinh thái học đa dạng Chúng có thể hoạt động như những chất vận chuyển nội tại, như những chất bảo vệ chống lại sâu bệnh, những hợp chất bay hơi trực tiếp này không chỉ là thiên địch đối với sâu bệnh mà còn thu hút côn trùng thụ phấn cho cây chủ nữa

Tất cả thực vật phần lớn có khả năng sản xuất ra các hợp chất dễ bay hơi, khá thường xuyên, tuy nhiên chỉ ở dạng vết “Thực vật tinh dầu là những thực vật đặc biệt cung cấp tinh dầu cho lợi ích thương mại Hai trường hợp chính để thực vật có thể được gọi với cáitên như vậy là:

- Hỗn hợp độc đáo của các hợp chất dễ bay hơi như hương thơm của: hoa hồng, hoanhài hoặc hoa huệ Những bông hoa này sản sinh trực tiếp các hợp chất dễ bay hơi bởi những lớp biểu bì ở cánh hoa Do đó hiệu suất thu hồi rất thấp ngay cả đối với những loài hoa vốn có mùi hương mạnh và bên cạnh kỹ thuật chưng cất đặc biệt,

ví dụ như, phương pháp tách hương liệu của hoa phải được áp dụng để thu hồi những hợp chất dễ bay hơi

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Hà Nội 10/2016

- Các hợp chất dễ bay hơi được tiết và dự trữ trong các cấu trúc tổ chức đặc biệt Điều này dẫn đến tinh dầu có nồng độ cao hơn Như vậy các cấu trúc dự trữ tinh dầu có thể là những dị bào kích thích bài tiết (tế bào tiết) Các khoang/ống dẫn hoặc các long tuyến.

Tế bào tiết là những tế bào đặc biệt sản xuất ra tinh dầu với số lượng lớn và bao gồm cả dầu bên trong của tế bào như dị bào chứa tinh dầu trong rễ của cỏ hương bài xuất hiện trong phạm vi từ lớp ngoài đến kết thúc của lớp vỏ trong.Tương tự cấu trúc chứa tinh dầunày cũng được tìm thấy ở nhiều loài hoa, ví dụ như : hoa hồng, viola (bao gồm cả cây hoabướm và cây hoa tím), họ cây hoa nhài

Khoang tiết và ống tiết:

a. Ống tiết:

Ống tiết ở thân lốt cắt ngang

Ở lát cắt ngang, số tế bào tiết thay đổi tùy loài: 3, 4 ở cà rốt, rất nhiều tế bào tiết và xoangống tiết rất to như ở xoài.

Vị trí ống tiết trong thân thay đổi tùy loài, nhưng vị trí này nhất định và đặc sắc trongcùng một loài Ví dụ: ống tiết trong nhu mô vỏ (họ Quế, Cúc, Xoài), trong libe (carốt),trong gỗ (làm cho gỗ có mùi thơm như ở họ Tùng bách), trong nhu mô tủy (họ Cà na …)

b. Túi tiết:

Khi cắt ngang, túi tiết có cơ cấu giống như ốn tiết nhưng đó là những bị ngắnkhông dài như ốn tiết Túi tiết thường gặp ở họ Cam chanh (Rutaceae), họ Mận(Myrtaceae), họ Xoài (Anacardiaceae)…

Cách thành lập ống tiết và túi tiết: túi tiết và ống tiết thường liên quan với nhau;nhiều loài có ống tiết ở thân và có túi tiết ở lá như họ Cam chanh (Rutaceae), hay

ở trái (họ Xoài Anacardiaceae) … Có 3 cách thành lập ống tiết và túi tiết:

- Bằng ly bào: xoang ống tiết do các tế bào xa nhau mà ra, gặp ở họ Dầu(Dipterocarpaceae), họ Mận (Myrtaceae) …

- Bằng tiêu bào: xoang ống tiết có được là do tế bào của vùng đó tan đi

- Bằng ly tiêu bào: xoang ống tiết vừa do tế bào nới ra vừa do tế bào nơi đó tan đi,gặp ở họ Cam quít (Rutaceae) …

Lông tiết có thể được chia làm 2 loại chính: lông hình khiên và lông hình đầu

Các lông tuyến hình khiên gồm 1 tế bào biểu bì cơ bản, một tế bào cuống và một đầu tiếtvới 4-16 tế bào, là nơi mà dự trữ những sản phẩm được tiết ra Lông hình đầu chỉ có 1-4

tế bào tiết chỉ có một khoảng nhỏ dưới biểu bì Cấu trúc này điển hình ở họ bạc hà cũngnhư trong họ mỏ hạc.

Sinh tổng hợp monoterpene ở các loài khác nhau của họ bạc hà,ví dụ như cây xô thơm vàbạc hà bị giới hạn bời thời kỳ phát triển của lá cây Sự tổng hợp monoterpene đạt cực đạikhi lá đạt 15 ngày tuổi, tỷ lệ này rất thấp nếu lá non hơn 12 ngày tuổi và già hơn 20 ngàytuổi, lượng monoterpene đã tăng lên một cách nhanh chóng tới ngày thứ 2, khi đó lá đãrụng, và giữ ổn định phần còn lại của lá sống

Thành phần tinh dầu thường biến đổi giữa các bộ phận khác nhau của cây Tính đa hìnhcủa các chất hóa học thực vật được thấy ở các cơ quan khác nhau của thực vật đó TrongOriganum vulgare tính đa hình có thể được phát hiện ở mức thấp hơn nhiều, ấy là tuyếndầu khác nhau ở lá Hình thức đa dạng này giường như không thường xuyên xảy ra, sựkhác biệt trong thành phần ở các tuyến dầu thường liên quan nhiều đến dộ tuổi của nó Tính đa hình này cũng có thể được tìm thấy một cách khá thường xuyên khi so sánh cácthành phần tinh dầu của các thực vật của một loài riêng biệt dựa trên nền tảng di truyềnthực vật

Sự khác nhau trong hỗn hợp thành phần của hai tinh dầu đôi khi gây khó khăn cho việcphân định hoặc sự khác biệt cũng có thể nảy sinh do kết quả của sự phản ứng lại với cácđiều kiện của môi trường, chẳng hạn như vị trí sinh trường khác nhau Tuy nhiên vẫnnhiều hình thái đa hình chưa được khám phá ra hoặc chưa được mô tả, chỉ gần đây thựcvật tinh dầu mới được sử dụng rộng rãi như cây xô thơm

3.2 Sự biến đổi của các hợp chất hóa học thực vật.

3.2.1 Phân loại hóa học:

Khả năng tích tụ tinh dầu không hện diện ở khắp nơi trong thực vật nhưng lại phân tánkhắp giới thực vật, tuy nhiên trong nhiều trường hợp rất thường xuyên hoặc là đặc điểmtiêu biểu cho các họ thực vật.Từ sự phân loại và quan điểm các hệ thống, không sảnphẩm tinh dầu nào là đặc trưng riêng biệt cả bởi lẽ đây là nhóm các hợp chất khá hỗn tạp,nhưng hoặc là sản phẩm tiết thuộc cơ quan tiết (lông, tuyến dầu,các đường ống phân giảihoặc các ống sản sinh ra tinh dầu) hoặc nhóm các chất sinh tổng hợp cụ thể, ví dụ nhưmono- hoặc sesquiterpene, phenylpropene …Có nhiều hơn một chất được dẫn ra từ conđường sinh tổng hợp này, cụ thể hơn nó được dùng cho sư phân loại: monoterpene là đặcthù cho giống bạc hà nhưng tinh dầu bạc hà lại đặc trưng cho bạc hà nam và bạc hà cay.Sesquiterpene được tìm thấy trong họ dương kì thảo nhưng chỉ có Achillearoseo-alba vàAchillea collina là có thể sản xuất ra được matricine (C17H22O5) là tiền chất củachamazulene (C14H16) mặt khác eugenol phenylpropenoid phổ biến trong họ đinh hươngcũng có thể được tìm thấy với một số lượng lớn ở các loài khác nhau Ví dụ như cây quế(họ nguyệt quê), cây húng quế (họ bạc hà) Các nguồn cho anethol được biết là hạt hồi

có khi cũng là hợp chất chính trong tinh dầu của giếng nếp (thuộc họ gừng) nguyệt quế(họ nguyệt quế) tiêu Nhật (Zanthoxylum piperitum, họ cam chanh còn được gọi là họ cửu

lý hương) và một số thực vật thuộc họ bạc hà ví dụ như cây xô thơm (S.oficinalis, Salviafruticosa, Salvia lavandulifolia) cây hương thảo và cây bạc hà Cách phân loại hóa họcliên quan đến những đường hướng chung hoặc riêng, dấu hiệu điển hình, và hoặc nhữnghợp chất chính hoặc là rất đặc biệt ngay cả là những chất thứ yếu hsy chỉ dạng vết

Các họ thực vật mà bao gồm những loài cho sản lượng lớn quan trọng nhất về mặtphương diện kinh tế không bị giới hạn trong một nhóm phân loại nào, mà phân bố ở tất

cả các lớp thực vật hạt trần, ví dụ như, họ hoàng đàn (gỗ và lá cây tuyết tùng, tinh dầucây bách xù) họ thông (dầu thông và dầu linh sam) Cũng như cây hạt kín trong phân lớpthực vật 2 lá mầm, họ hoa hồng, thực vật một lá mầm Họ quan trọng nhất thuộc thực vật

2 lá mầm là họ hoa tán (dầu cây ngải đắng và cây ngải dâm) họ mỏ hạc (dầu chi mỏ hạc)

họ hồi (dầu hồi), họ bạc hà (tinh dầu bạc hà, tinh dầu cây hoắc hương, oải hương,oregano) và nhiều tinh dầu thảo mộc khác, họ nguyệt quế (màng tang, long não, quế, tinhdầu cây de vàng )họ nhục đậu khấu, họ đào kim nương (tinh dầu mía, đinh hương, hạttiêu giamaica) họ oliu (dầu hoa nhài) họ hoa hồng (tinh dầu hoa hồng) họ đàn hương (tinhdâu đàn hương) Ở cây một lá mầm, về cơ bản giới hạn ở họ xương bồ (tinh dầu thạchxương bồ), họ hòa thảo (tinh dầu vetive, tinh dầu cỏ thơm) họ gừng (tinh dầu gừng vàtinh dầu bạch đậu khấu) Ngoài sự phân loại nhóm chất hóa học thực vật điển hình ra thì

cơ bản còn dựa vào kiểu di truyền điển hình, trạng thái phát triển của thực vật cũng nhưảnh hưởng bởi các tác nhân của môi trường và bộ phận của thực vật Xem xét tất cả cácảnh hưởng đến sự trình bày phân loại phải bao gồm cả nguyên liệu so sánh, sinh trưởng,giống cây dưới hoàn cảnh có thể so sánh được

3.2.2 Sự biến đổi giữa và trong các loài khác nhau

3.2.2.1 Họ bạc hà và họ cỏ roi ngựa

Có lẽ chi lớn nhất của họ bạc hà là chi xô thơm bao gồm khoảng 900 loài phân bố mộtcách rộng rãi ở vùng ôn đới, cận nhiệt đới và nhiệt đới Cây xô thơm có xuất xứ từ vùngĐịa trung Hải và sau nay phân bố rộng khắp trên thế giới Hầu hết 400 loài được sửudụng truyền thống ở dạng thuốc, thảo dược hoặc dung cho trang trí Nhiều úng dụng dựatrên các hợp chất không biến đổi, ví dụ như diterpene và polyphenolic acid Về mặt tinhdầu, có một số lượng lớn cuat mono- và sesquiterpene đươch tìm thấy trong chi nàynhưng trái ngược với loài húng quế và loài tía tô (cũng thuộc họ bạc hà), là không cóphenylpropene

Để hiểu biết sự khác biệt đặc thù của các loài trong chi này ta sẽ đối chiếu giữa loài xô đỏĐịa Trung Hải S.officinalis và loài bản địa ở Nam châu Phi S.stephylla Trong nhóm S.officinalis thường thấy α- và β-thujones, 1,8-cineole,camphor, và đôi khi trong một sốtrường hợp là linalool, β-pinene, limonene, hoặc cis-sabinyl acetate là những chất phổbiến, trong khi ở S.stephylla hợp chất thường thấy là sesquiterpene, ví dụ nhưcaryophyllene hoặc α -Bisabolol, lại là những hợp chất chính

Dựa trên các nghiên cứu phân loại của Salvia spp (Hedge, 1992; Skoula et al, 2000; Reales et al,2004) và một cuộc khảo sát gần đây liên quan đến các chất hóa học thực vật của S stenophylla và các đồng minh của nó (Viljoenet al., 2006), Hình 3.1 cho thấy kiểu hóa học hiện đã được xác định trong những đơn vị phân loại Bức ảnh trong công bố này đang so sánh các dữ liệu sự khác nhau, tuy nhiên không giải thích rõ ràng sáu nguồn gôc loài S officinalis trong hình 3.2.Điều này có thể do kiểu hóa học trong một quần thể , sự biến đổi giữa các thực vật duy nhất, thời gian thu nhận mẫu, và kích thước mẫu Điềunày cho thấy một cách đối chiếu bởi một quần thể S officinalis nơi các cá thể đa dạng về α- thujones, từ 9% đến 72%, β-thujones, từ 2% đến 24%; 1,8-cineone, từ 4% đến 18% Mà còn tất cả các hợp chất khác của tinh dầu đã cho thấy sự biến đổi giữa các loài.

Một ví dụ thú vị hơn về sự đa dạng của loài oregano, được tính toán là loài có giá trị thươngmại nhất trên khắp thế giới Với hơn 60 loài thực vật đã được gọi dưới tên chung này các hương thơm tương đồng đặc trưng được mô tả bởi những hợp chất cymyl ví dụ như, carvacrol và thymol Với một vài ngoài lệ thì phần lớn oregano thuộc về họ bạc hà

và họ cỏ roi ngựa với chi chính Origanum và Lippia (Bảng 3.1) Trong năm 1989, gần như tất cả đươc ước tính 15.000 tấn / năm oregano khô có nguồn gốc từ sự thu nhận

So với cây xô thơm, các Origanum chi là nhỏ hơn nhiều và bao gồm 43 loài và 18

lai theo các cation classifi thực tế (Skoula và Harborne, 2002) với phân bố chính

khu vực Địa Trung Hải Một số phân loài của O vulgare chỉ cũng được tìm thấy ở vùng

ôn đới và vùng khô cằn của Âu Á đến Trung Quốc Tuy nhiên, các chi được đặc trưng bởimột hình thái lớn và đa dạng các hợp chất hóa học (Kokkini, 1996; Baser, 2002; Skoula

và Harborne, 2002) Sự xuất hiện của một vài kiểu hóa học đã được báo cáo, ví dụ, cho mục đích thương mại được sử dụng loài Origanum, từ Thổ Nhĩ Kỳ (Baser, 2002) Trong onites O., hai hợp chất được mô tả bao gồm carvacrol và linalool Ngoài ra, một "kiểu hỗn hợp " với pha trộn cả hai loại cơ bản cũng có thể xảy ra

Trong một cuộc điều tra toàn diện của quần thể hoang dã của L graveolens thu thập từ các vùng đồi núi của Guatemala, ba kiểu hợp chất tinh dầu khác nhau có thể được xác định, loại thymol,loại carvacrol, và một loại khác thường (Fischer et al., 1996) Trong loại thymol, số lượng lên đến 85% thymol trong tinh dầu có thể đạt được và chỉ có dấu vết của carvacrol Loại khác thường đã được xác định với nhiều thành phần rất phổ biến

mà không có hợp chất vượt quá 10% của dầu, và cũng đã phát hện ra phenylpropenes, ví

dụ, eugenol và methyl eugenol Trong bảng 3.2, so sánh các số liệu gần đây được đưa ra bao gồm Lippia alba thường được gọi là "Oregano" hoặc "oregano del Monte" mặc dù carvacrol và thymol vắng mặt từ tinh dầu loài này Tại Guatemala, hai kiểu hóa học khác nhau đã được tìm thấy trong L alba: một loại myrcenone và một loại citral (Fischer et al.,2004) Bên cạnh đó, một kiểu hóa học linalool, một carvone, một long não-1,8-cineole,

và một limonene-piperitone đã được mô tả (Dellacassa et al, 1990; Pino et al.,

1997;Frighetto et al., 1998; Senatore và Rigano, 2001).Đa dạng hóa học là mối quan tâm đặc biệt nếu ở cấp trên chi hoặc cấp loài cả tecpen cũng như phenylpropenes có thể đượctìm thấy trong tinh dầu Hầu hết Lamiaceae ưu tiên tích lũy mono-(Và sesqui-) tecpen trong các loại dầu dễ bay hơi của chúng nhưng một số chi sản xuất dầu cũng giàu

phenylpropenes,trong số này có Ocimum sp và tía tô sp.Các chi Ocimum bao gồm hơn

60 loài, trong đó hương nhu trắng và O basilicum có giá trị kinh tế cao Nghiên cứu sinh học di truyền trên sự kế thừa của các thành phần dầu Ocimum làbáo cáo của Khosla et al.(1989) và một chủng gratissimum O tên "Clocimum" có chứa 65% của eugenol trong dầu của nó được mô tả bởi Bradu et al (1989) Một số kiểu khác nhau của húng quế (O basilicum) đã được xác định và phân loại (Vernin, 1984; Marotti et al, 1996) chứa lên đến 80% linalool, lên đến 21,5% 1,8-cineole, 0,3-33,0% eugenol, và cũng có các chất độchại có lẽ là hợp chất methyl chavicol (ESTRAGOLE) và methyl eugenol ở nồng độ gần 50% (Elementi et al, 2006 Macchia et al., 2006) Perialla frutescens có thể được xếp vào nhiều kiểu hóa học cũng theo chính thành phần monoterpene perillaldehyde,

elsholtziaketone, hoặc perillaketones, mặt khác kiểu phenylpropanoid có chứa myristicin,

dillapiole, hoặc elemicin (Koezuka et al., 1986) Một trình bày toàn diện trên kiểu hình hóa học và sản lượng của các hợp chất được đề cập đã được đưa ra bởi tác giả này trong Hay và Waterman (1993) Trong hai ví dụ cuối cùng không chỉ là tính cảm quan mà còn

là độc tính của các hợp chất tinh dầu được quyết định cho sự sử dụng thương mại của đa dạng sinh học các loài tương ứng

Mặc dù họ tía tô đóng một vai trò nổi bật liên quan đến đa hình hóa học các loại tinh dầu, nhưng cũng có trong tinh dầu cuat nhiều họ thực vật khác và có một chất hóa học thểhiện tính đa dạng đã được miêu tả

3.2.2.2 Họ Cúc (Compositae)

Chỉ có một số giới hạn các chi của họ Cúc được gọi là thực vật tinh dầu, trong đó có Tagetes, Achillea, và Matricaria Các chi Tagetes gồm thực 55 loài, tất cảhọ đặc hữu của châu Mỹ với trung tâm đa dạng sinh học giữa 30 ° bắcvà 30 ° vĩ độ phía nam Một trong những loài chủ yếu được sử dụng bởi người bản xứ là T.lucida, được phân bố rộng khắp cao nguyên Mexico và Trung Mỹ

Trái ngược với hầu như tất cả các loài Tagetes khác đặc trưng bởi sự số lượng của

tagetones, loài này có chứa phenylpropenes và tecpen Một nghiên cứu chi tiết về về tính

đa dạng của nó ở Guatemala dẫn đến ác định một số kiểu sinh thái và hóa học (Bảng 3.3):anethol, methyl chavicol (estragol), methyl eugenol, và loại sesquiterpene sản xuất số lượng cao hơn nerolidol (Bicchi et al, 1997; Goehler, 2006) Sự phân bố của ba loại phenylpropenes chính trong sáu quần thể được minh họa trong hình 3.3

So với các nguyên liệu thực vật điều tra bởi Ciccio (2004) và Marotti et al (2004) có chứa các loại dầu với 90-95% estragol, chỉ thu nhận được từ chất mầm nguyên sinh có nguồn gốc Guatemaltekan (Goehler, 2006) cho phép lựa chọn các cá thể với anethol cao nhưng có số lượng thấp đến rất thấp estragol hoặc methyleugenol hay với số lượng nerolidol lớn, như đã đề cập ở trên.Các chi Achillea được phân phối rộng rãi trên Bắc báncầu, bao gồm khoảng 120 loài, trong đó Achillea millefolium tổng hợp (cỏ thi) đại diện cho một đa bội phức tạp của cây lâu năm allogamous (Saukel và Langer, 1992; Vetter và Franz, 1996) sự khác nhau đơn vị phân loại của phân loại gần đây (loài nhỏ và phân loài)

là hì nh thái và hóa học đến một mức độ nhất định riêng biệt và chỉ có các loài lưỡng bội Achillea asplenifolia và A.roseo-alba là A collina tứ bội và Achillea ceretanica được đặc trưng

bởi proazulens, ví dụ, achillicin, trong khi các loài khác, đặc biệt là lục bội và bát bội chứa eudesmanolides, longipinenes, germacranolides, hoặc peroxit guajanolid, (Bảng 3.4) Các biến thể trong một loài số lượng proazulene dao động từ vết lên đến 80%.

Tần suất phân bố của các cá thể proazulene giữa hai quần thể được hiển thị trong hình 3.4.thí nghiệm qua dẫn đến proazulene là một tính trạng lặn của thể lưỡng bội, tứ bội của Achillea sp (Vetter et al., 1997) tương tự như hoa cúc (Franz, 1993a, b)

Hình 3.6 cho thấy số lượng đối chiếu Bisabolol của hai quần thể hoa cúc tùy thuộc vào sốlượng cá thể thực vật dùng để lấy mẫu Tại một số lượng nhỏ, giá trị trung bình dao động mạnh và chỉ sau khi ít nhất 15-20 cá thể trong phạm vi của sự biến đổi trở nên chấp nhậnđược Khá khác nhau xuất hiện tình hình tại sự khác biệt về chất lượng, đó là, "một trong hai-hay-biến" bên trong quần hoặc đơn vị phân loại, ví dụ,carvacrol / thymol, α- / β-Thujone / 1,8-cineole / long não, hoặc monoterpene / phenylpropenes Bất kỳ mẫu ngẫu nhiên có thể cung cấp thông tin không đặc hiệu chỉ trên cá thể hóa học chủ yếu của quần thể tương ứng được cung cấp rằng mẫu là đại diện

Điều này phụ thuộc vào số lượng các kiểu hình hóa học được kế thừa của chúng, và tần

số phân bố trong quần thể, và nói chung không kém hơn 50 cá thể là cần thiết cho mục đích đó, vì nó có thể được bắt nguồn từ sự so sánh của kiểu hóa học trong một quần thể Thymus vulgaris (Hình 3.7) Tổng quát sự biến động cao của các thành phần trong tinh dầu có thể được giải thích bởi thực tế là khá nhiều sản phẩm khác nhau có thể được tạo rabởi chỉ những thay đổi nhỏ trong chuỗi tổng hợp Mặt khác, sự tổng hợp khác nhau khác nhau cũng có thể sản xuất các chất tương tự ở loài họ hàng xa Nguồn gốc khác nhau củacác chất đó có thể được xác định bằng cách, ví dụ, 12C: tỷ lệ 13C (Mosandl,1993) "Do

đó, phân tích định lượng đơn giản của các thành phần tinh dầu không nhất thiết phải là thích hợp cho việc ước tính gần gen thậm chí trong đơn vị phân loại liên quan chặt chẽ

"(Bazina et al., 2002)

Như được minh họa bởi các đoạn trước, một trong những điểm quan trọng của việc sửdụng thực vật như là nguồn tinh dầu là tính không đồng nhất của nó Do đó điều kiện tiênquyết để một thành phần có thể sản xuất được thì nguyên liệu ban đầu phải được xác định

là một thực vật và có đặc điểm rõ ràng Trước tiên cách tiếp cận này xác định cách phânloại cổ điển nguyên liệu thực vật dựa vào đặc trưng hình thái lớn hay nhỏ của thực vật

Sự xác định theo phân tích hợp chất hóa học thực vật góp phần nhận biết loài và quyếtđịnh chất lượng tinh dầu Cách tiếp cận này hiện nay được bổ sung bằng cách xác địnhdựa trên DNA

DNA là một chuỗi polime dài các nucleotide, các đơn vị xây dựng Một trong bốn bazonito là một phần của mỗi nucleotide và trình tự của các bazo trên sợi polymer là đặc trưngcho mỗi cá thể sống Tuy nhiên ở một số vùng của DNA được duy trì ở cấp loài và cấp họ

và có thể được sử dụng trong nghiên cứu mối quan hệ về phân loại Nghiên cứu đinh loạibằng cách trình tự ngắn chuẩn được các nhà khoa học trên thế giới áp dụng và thực hiệntrong những năm gần đây Với kỹ thuật giải trình tự mới này cho phép phân tích nhanh vànhận diện Mã vạch DNA của động vật đã trở thành một nhiệm vụ cấp bách Với mã vạchthực vật thì dù sao vẵn còn ít qaun trọng và đòi hỏi kỹ thuật cao

Bên cạnh phương pháp tiếp cận trình tự thông tin cơ bản, phương pháp tiểu vệ tinh đa vịtrí DNA [RAPD, khuếch đại độ dài đoạn đa hình (AFLP)] đang được thực hiện để giảiquyết sự phân loại phức tạp và có thể trở thành một mã vạch cho việc xác định các quầnthể và giống cây trồng Hơn nữa phương pháp này có thể gắn đặc trưng cụ thể cho mộtthực vật khi mà bộ gen của nó chưa được biết tới Cách tiếp cận này được gọi là chỉ thịphân tử bởi chúng đánh dấu sự xuất hiện của một đặc điểm cụ thể như một kiểu hóa họchoặc màu sắc của hoa Vùng gen này được hình dung như một gagarose gel không phải làmột gen đặc biệt chịu trách nhiệm về đặc điểm nhưng nằm trên hệ gen, trong vùng lâncận của gen này và do đó biểu thị tính trạng và vắng mặt khi tính trạng biến mất Một ví

dụ cho phản ứng chuỗi trùng hợp là PCR nhanh và rẻ tiền – Hệ thống đã được phát triểnbởi Brugbury etal(2005) để phân biệt gạo thơm và không thơm Nếu chỉ thị phát triển chokiểu hóa học của thực vật tinh dầu, nhận diện loài bởi DNA và xác định kiểu hóa học chỉtrong một bước

Phương pháp sinh học phân tử ngày nay thường được sử dụng để xác định trong thức ăngia súc và thực phẩm Đặc biệt là các cuộc thảo luận truy xuất nguồn gốc của sinh vậtbiến đỏi gen (GMO) trong suốt chuỗi cung ứng “từ cơ thể sống đến siêu thị” đã đẩy mạnhnghiên cứu trong lĩnh vực này Một lợi thế của phương phấp sinh học phân tử là khả năng

sử dụng được trong một số loại nguyên liệu được chế biến như dầu béo hoặc thậm chítrong trích ly dung môi Sự hiện diện của một số lượng nhỏ DNA trong một loại tinh dầukhông thể loại trừ hết được dẫu cho chưng cất như kỹ thuật tách yêu cầu không tồn tại sự

có mặt của DNA Tuy nhiên thực vật nhỏ hoặc đoạn DNA có thể được chiết lọc qua hoặctinh dầu có thể tiếp xúc với nguyên liệu thực vật sau khi chưng cất

3.4 Kỹ thuật di truyền và protein

Kỹ thuật gen được định nghĩa là các thao tác trực tiếp các kỹ thuật phòng thí nghiệm,không nên nhầm lẫn với các thao tác gián tiếp của các gen truyền thống (thực vật) trongnuôi trồng Biến đổi gen hoặc sinh vật biến đổi gen (GMOs) là sinh vật (vi khuẩn, thựcvật,…) đã được thiết kế với một hoặc nhiều gen di truyền (hoặc là từ cùng một loại hoặc

là từ các loài khác nhau), sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại Đây là những sinhvật có những đặc tính được cải thiện ở thực vật, ví dụ có sức đề kháng hoặc chống chịuđược với các tác nhân sinh học hoặc vô sinh như côn trùng, bệnh tật, hạn hán, nhiễm mặn

và nhiệt độ Một mục tiêu quan trọng trong việc cải thiện điều kiện sản xuất nông nghiệp

là tạo điều kiện kiểm soát cỏ dại bằng cây chuyển kháng thuốc diệt cỏ như glufosinate.Cây bạc hà đã được chuyển thành công với việc giới thiệu các gen bar, mã hóaacetyltransferase phosphinothricin, một loại enzyme bất hoạt glufosinate-amoni hoặcmuối amoni của glufosinate, phosphinothricin làm cho cây không nhạy cảm với hoạt tínhthuốc diệt cỏ Roundup ( Roundup ready bạc hà) (Li et al., 2001)

Bước đầu tiên trong kỹ thuật di truyền là sự phát triển và tối ưu chuyển đổi (sự chuyểngen) giao thức cho loài mục tiêu Giao thức tối ưu hóa như vậy tồn tại trong thực vật chứa

tinh dầu như lavandin (Lavandula x intermedia; Dronne et al., 1999), cành hoa oải hương

( Lavandula latifolia, Nebauer et al., 2000) và bạc hà (Menths x piperita; Diemer et al.,1998; Niu et al., 2000)

Nguồn: Wildung, M.R and R.B Croteau, 2005 Transgenic Res., 14: 365-372

Dxr= deoxyxylulose phosphate reductoisomerase; 1-3-h = limonene-3-hydroxylase; mfs

(MEP) đường nhỏ đầu tiên đến đường tiền thân của monoterpenes, từ Arabidopsisthaliana đã được giới thiệu và dẫn đến sự gia tăng các tinh dầu của lá lên 360% và tinhdầu hoa lên đến 74% (Munoz-Bertomeu et al., 2006).

Trong bạc hà, nhiều bước khác nhau để thay đổi sản lượng và thành phần tinh dầu đãđược có mục tiêu (xét bởi Wildung và Croteau 2005; bảng 3.6) Các biểu hiện quá mứccủa DRX, bước thứ hai trong MEP-pathway, tăng sản lượng tinh dầu khoảng 40% thửnghiệm dưới thực nghiệm trên cánh đồng (Mahmoud và Croteau, 2001) Các biểu hiệnquá mức của geranyl diphosphate synthase (GPPS) dẫn đến sự gia tăng tương tự của tinhdầu Methofuran- một hợp chất không mong muốn được điều chỉnh xuống nhờ phươngpháp antisense (một phương pháp để gây ảnh hưởng hoặc ngăn chặn các hoạt động gen

cụ thể) Biểu hiện của menthofuran antisene RNA là chịu trách nhiệm cho chất lượng dầuđược cải thiện bằng cách giảm cả menthofuran và pulegone trong một bước chuyển đổi(Mahmoud và Croteau, 2003) Khả năng sản xuất tinh dầu bạc hà với một thành phần mới

đã được chứng minh bởi Mahmoud et al 2004 bằng việc kiểm soát limonene qua việc ứcchế limonene-3-hydroxylase, các enzyme chịu trách nhiệm chuyển đổi (-)-limonene tới(-)-trans-isopiperitenol trên đường tới menthol

Kỹ thuật protein là việc áp dụng các phương pháp khoa học (toán học và các phươngpháp phòng thí nghiệm) để phát triển các protein hữu ích và có giá trị Có hai chiến lượcchung của kỹ thuật protein là đột biến ngẫu nhiên và kỹ thuật hợp lý.Trong thiết kế hợp

lý, kiến thức chi tiết về cấu trúc và chức năng của protein là cần thiết để thực hiện nhữngthay đổi mong muốn bởi địa điểm- hướng đi biến đổi- nguồn gốc, một kỹ thuật đã pháttriển rất tốt Ví dụ ấn tượng của một thiết kế hợp lý monoterpene synthase đã được đưa ra

bởi Kampranis et al 2007 đã chuyển đổi một 1,8-cineole syn-thase từ S fruticosa từ một

synthase thành sản phẩm sabinene, tiền thân của α- và β-thujone với một lượng tối thiểucủa thay thế Họ đã đi được một bước xa hơn và điều khiển monoterpene synthase thànhmột sesquiterpene bằng cách thay thế một axit amin mở động vị trí hoạt động đủ để chứatiền chất lớn hơn của sesquiterpene, farnesyl pyrophosphate (EPP)

3.5 Tài nguyên tinh dầu: Thu nhận từ cây dại hoặc từ cây trồng.

Nguyên liệu thô để sản xuất tinh dầu có nguồn gốc từ cây hoang dã hoặc từ cây trồng

Bảng 3.7: Thực vật quan trọng có chứa tinh dầu- tên chung, tên khoa học, họ, bộ phận được sử dụng, nguông gốc nguyên liệu thô và sản lượng thương mại của tinh dầu.