THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ VI SINH

NỘI DUNG THỰC HÀNH Bài mở đầu: Các thiết bị phòng thí nghiệm vi sinh và phương pháp khử trùng Bài 2: Khảo sát đặc điểm sinh trưởng của chủng vi sinh vật Bài 3: Hiện tượng lên men của vi

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA HÓA-BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

־־־־־־־־־******־־־־־־־־־־־

BÀI GIẢNG

THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ VI SINH

Người soạn: Ths PHẠM THỊ KIM THẢO

Đà Nẵng, 2016

NỘI DUNG THỰC HÀNH

Bài mở đầu: Các thiết bị phòng thí nghiệm vi sinh và phương pháp khử trùng Bài 2: Khảo sát đặc điểm sinh trưởng của chủng vi sinh vật

Bài 3: Hiện tượng lên men của vi sinh vật

Bài 4: Vi sinh vật phân giải tinh bột và cellulose

Bài 5: Xác định một số chỉ tiêu chất lượng của bia

Bài 6: Bảo quản giống vi sinh vật

Kế hoạch thí nghiệm (4 buổi) YÊU CẦU THÍ NGHIỆM

Sinh viên xem kỹ tất cả các bài thí nghiệm, phần tính toán, cách pha hóa chất cho thí nghiệm

KẾ HOẠCH THÍ NGHIỆM

Buổi 1(Bài 1)

Kiểm tra Chuẩn bị môi trường và bao gói dụng cụ (Bài 1)

Buổi 2 (Bài 2)

Báo cáo kết quả tìm hiểu về chủng VSV được giao Thực hiện thí nghiệm bài 1 và 2

Buổi 3: Bài 3

Báo cáo kết quả làm buổi 2, thực hiện 1 phần bài 4 (chuẩn bị dịch lên men và giống)

Buổi 4:

Đánh giá một số chỉ tiêu của bia thành phẩm

Thực hiên bài 5( bảo quản giống vi sinh vật )

YÊU CẦU CHUNG VÀ QUY TẮC LÀM VIỆC TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT

1 Quy tắc làm việc trong phóng thí nghiệm vi sinh vật

- Phải tôn trọng trật tự ngăn nắp và vệ sinh phòng thí nghiệm

- Mỗi người mỗi nhóm có nơi làm việc riêng, chỉ sử dụng những dụng cự thiết bị dành riêng cho mình Thiếu thì phải hỏi cán bộ hướng dẫn Tuyệt đối không lấy của người khác

- Trong phòng thí nghiệm không được ăn uống hút thuốc, giữ im lặng… luôn mặc áo Blue khi làm việc

- Không được tự điều chỉnh hoặc sử dụng những thiết bị của phòng thí nghiệm khi chưa được hướng dẫn

- Sau khi thí nghiệm xong phải làm vệ sinh, rửa dụng cự thí nghiệm và sắp xếp gọn gàng nơi làm việc

- Trước khi ra khỏi phòng thí nghiệm phải rửa tay bằng xà phòng diệt khuẩn Trường hợp cần thiết phải sát trùng bằng cồn

2 Nguyên tắc làm việc với các giống vi sinh vật

Trong điều kiện phóng thí nghiệm, các vi sinh vật được nuôi cấy trên các môi trường

dinh dưỡng đặc hoặc lỏng đựng trong các ống nghiệm, trong các bình thủy tinh hoặc các đĩa Petri Dụng cụ thủy tinh và môi trường dinh dưỡng đều đã được khử trùng trước khi cấy, phải tiến hành theo những quy tắc nhất định để đảm bảo giữ cho các giống nghiên cứu khỏi bị nhiễm bẩn bởi vi sinh vật ở môi trường xung quanh

Trước khi cấy cần ghi cẩn thận lên ống nghiệm ( hoặc bình thủy tinh hoặc đĩa Petri):

- Tên môi trường

- Tên giống vi sinh vật

- Ngày cấy

Tất cả các thao tác được trực hiện bên cạnh ngọn lửa đèn cồn và tốt hơn hết là thực hiện trong các phòng cấy vô trùng Sau khi cấy, phải đặt ống nghiệm ( hoặc các dụng cụ khác có nuôi cấy vi sinh vật) vào các tủ ổn nhiệt (còn gọi là tủ ấm) Đối với các dụng cụ nuôi cấy vi sinh vật đã dùng xong, cần phải khử trùng bằng nồi áp xuất, rồi mới đem đi rửa Phải đổ lên bề mặt môi trường đặc đã dung xong một lớp dung dịch khử trùng và giữ yên một ngày sau đó mới đổ môi trường đi và cọ rửa sạch sẽ

Tiến hành ghi chép thí nghiệm:

Trong sổ phải ghi chép đầy đủ các điều có liên quan đến việc hoàn thành các thí nghiệm Phải ghi chép cẩn thận, rõ ràng và theo một trật tự nhất định

Ví dụ :1/ Tên thí nghiệm, ngày bắt đầu và ngày kết thúc

2/ Đối tượng nghiên cứu

3/ Những điều kiện tiến hành thí nghiệm

4/ Nguyên tắc cơ bản của phương pháp phân tích đã sử dụng

5/Kết quả nhận được

Các số liệu phai ghi thành từng bảng Nếu cần thiết phải làm đồ thị, biểu đồ, hình

vẽ, ghi chép tất cả các số liệu thực nghiệm và các tính toán vào trong sổ

Bài 1:

MỘT SỐ CÔNG THỨC PHA MÔI TRƯỜNG, THUỐC THỬ, CHỦNG VSV

1.1 Công thức môi trường

Bảng 1 Công thức pha môi trường thông dụng

Thạch thịt pepton

(Vi khuẩn)

Cao thịt: 5g Pepton: 10g NaCl : 5 g Aga: 20g Nước cất: 1000ml, pH = 7-7,2 Hansen

(nấm men)

Saccharose hoặc Maltose: 50g

- Pepton: 10g

- KH2PO4: 3g

- MgSO4: 3 – 5 g

- Agar: 20g, Nước cất: 1000ml môi trường Czapek)

(nấm mốc)

- Saccharose: 30g

- NaNO3: 30g

- K2HPO4: 1g

- MgSO4: 0,5g

- FeSO4: 0,01g

- Agar: 20g

- Nước cất: 1000ml

pH = 6, khử trùng 1atm/30 phút Gauze 1

(Xạ khuẩn)

Tinh bột tan: 20g

- K2HPO4: 0,5g

- MgSO4.7H2O: 0,5g

- KNO3: 1,0g

- NaCl: 0,5g

- FeSO4: 0,01g

- Agar: 20g

- Nước cất: 1000ml

pH = 7,2 – 7,4 khử trùng 0,5 atm/30 phút

- Môi trường PDA để nuôi cấy nấm men và nấm mốc

Bảng 1.2 Thành phần môi trường PDA

Để chuẩn bị chất chiết khoai tây, đun sôi 200g khoai tây xắt lát, không gọt vỏ trong

1 lít nước cất trong 30 phút Lọc qua vải thưa, giữ lại phần lỏng, đó là chất chiết khoai tây Trộn với các thành phần khác rồi đun sôi để hoà tan Hấp tiệt trùng trong 15 phút ở 1210C Cho từng thể tích 20 – 25ml vào các đĩa petri vô khuẩn 15x100mm pH cuối là 5,6±0,2 Không làm tan chảy môi trường nhiều hơn một lần

- Môi trường hoạt hóa tế bào vi khuẩn Gluconacetobacter hansenii

 Môi trường rắn:

- Dịch chiết khoai tây 20%: 100ml - Agar: 20g/l

- Axit axetic: 2m/l - Nước cất bổ sung: 1000ml

Etanol 99.7% và axit axetic bổ sung vào môi trường sau khi đã tiệt trùng và làm nguội

- Môi trường kiểm tra hoạt tính sinh axit axetic của tế bào vi khuẩn

Gluconacetobacter hansenii

- Dịch chiết khoai tây 20%: 100ml - Agar: 20g/l

- Thuốc thử brommocresol: 0.2g/l ( pha trong cồn 200C)

- Nước cất bổ sung: 1000ml

Etanol 99.7% và thuốc thử cho vào môi trường sau khi đã tiệt trùng và

làm nguội 40-450C

- Môi trường thạch - thịt - pepton để phân lập và nuôi vi khuẩn

- Cao thịt : 10g/l - Pepton : 10g/l

- NaCl : 5g/l - Agar : 20g/l

- Nước cất bổ sung : 1000ml

- Môi trường kiểm tra hoạt tính sinh enzyme amylaza (MT5)

- Cao thịt : 10g/l - Pepton : 10g/l

- NaCl : 5g/l - Tinh bột tan : 5g/l

- Agar : 20g/l - Nước cất bổ sung : 1000ml

- Môi trường kiểm tra hoạt tính sinh enzyme cellulaza (MT6)

- Cao thịt : 10g/l - Pepton : 10g/l

- NaCl : 5g/l - CMC : 10g/l

- Agar : 20g/l - Nước cất bổ sung : 1000ml

- Môi trường kiểm tra hoạt tính sinh enzyme proteaza (MT7)

- Cao thịt : 10g/l - Pepton : 10g/l

- NaCl : 5g/l - Gelatin : 10g/l

- Agar : 20g/l - Nước cất bổ sung : 1000ml

1.2 Thuốc thử

+ Đối với amylase và cellulase: sử dụng lugol

Thành phần và cách pha dung dịch Lugol: Hòa tan 2g KI trong 5ml nước cất, thêm 1g I2 vào, sau đó bổ sung nước cất đến đủ 300ml và lắc đều cho tan thành dung dịch thuốc thử Lugol đồng nhất

+ Đối với Protease sử dụng: Amido – Black 1%, hoặc Tricloroacetic acid (sẽ kết tủa các protein chưa bị thủy phân)

Công thức pha thuốc nhuộm Amido – Black 1%: Hòa 1g Amido – Black trong 100ml dung dịch CH3COOH 7%

1.3 Chủng vi sinh vật

1.3.1 Vi khuẩn Bacillus subtilis

1.3.2 Nấm mốc Aspergillus niger

1.3.3 Nấm mục trắng Phanerochaete chrysosporium

1.3.4 Nấm men bia Saccharomyces carlsbergensis

1.3.5 Xạ khuẩn X5

Yêu cầu: Sinh viên tự tìm hiểu đặc điểm của các chủng vi sinh vật nêu trên( đặc điểm sinh trưởng, có khả năng sinh enzym gì, ứng dụng)

BÀI 2

ĐÁNH GIÁ SỰ SINH TRƯỞNG CỦA VI SINH VẬT

Sự tăng trưởng của giống vi sinh vật được biễu diễn bằng sự gia tăng của mật độ tế bào ( số tế bào/ml môi trường, N/ml) hay sự gia tăng sinh khối giống theo thời gian nuôi cấy

 Đánh giá sự sinh trưởng thông qua số tế bào

Đếm vsv trên buồng đếm chuyên dùng:

- Buồng đếm Thoma, Malassez

- Kỹ thuật Breed (đếm vi khuẩn): sử dụng 0.01mL mẫu cố định trên 1cm 2 phiến kính, nhuộm màu vsv rồi đếm

- Đếm khuẩn lạc trên hộp petri

 Đánh giá sự sinh trưởng thông qua lượng sinh khối

- Xác định hàm lượng chất khô bằng phương pháp sấy đến trọng lượng không đổi

- Xác định độ đục của canh trường

 Đánh giá sự sinh trưởng thông qua hàm lượng các chất nội bào

- Phương pháp định lượng ATP

 Đánh giá sự sinh trưởng thông qua hoạt tính sinh khối

- Mức độ sử dụng cơ chất

- Mức độ hình thành sản phẩm

2.1 Xây dựng đường cong tăng trưởng đối với chủng vi khuẩn và nấm men (thời gian thế hệ 2 giờ)

2.1.1 Nguyên tắc

Mật độ tế bào có thể được xác định bằng các phương pháp trực tiếp (sử dụng buồng đếm hồng cầu) gián tiếp bằng phương pháp đếm khuẩn lạc, phương pháp đo mật độ quang OD610

Phương pháp đo OD610 để gián tiếp theo dõi sự gia tăng của mật độ tế bào theo thời gian nuôi cấy, phương pháp này dựa trên sự tương quang tuyến tính giữa OD610 và log

(N/ml)

2.1.2 Tiến hành:

 Xây dựng đường chuẩn tường quan giữa OD610 và mật độ tế bào

+ Huyền phù hóa một ít sinh khối giống (thu từ môi trường rắn như ống thạch nghiên hoặc hộp petri) trong nước cất Thực hiện pha loãng sao cho thu được các huyền phù có giá trị OD610 gần bằng 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 và 0,5

+ Dùng phòng đếm hồng cầu hoặc đếm khuẩn lạc để xác định mật độ tế bào tương ứng với các huyền phù có OD610 khác nhau 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 và 0,5

 Khảo sát sự tăng trưởng của giống theo thời gian

+ Giống vi khuẩn hoặc nấm men đã được phân lập và làm thuần, được hoạt hóa bằng cách cấy một ít sinh khối từ giống thạch nghiên vào ống nghiệm chứa 5 ml môi trường cao thịt pepton hoặc môi trường hansen Lắc ở nhiệt độ thíc hợp 28-35ºC 100-130 vòng/phút trong 1 ngày

+ Chuyển một lượng giống đã hoạt hóa vào ống nghiệm chứa môi trường lỏng sao cho OD610 đạt xấp xỉ 0,05

+ Nuôi cấy lắc ở 28-35ºC Sự tăng trưởng của giống được theo dõi trong 24 h bằng cách thu lấy mẫu sau những khoảng thời gian nuôi nhất định: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24 giờ + Pha loãng mẫu nếu cần thiết sao cho OD610 sau khi pha loãng nằm trong khoảng 0,1-0,5

+ Nhân trị số OD610 đo được với độ pha loãng để suy ra giá trị OD610 của huyền phù

tế bào

Trường hợp không thể theo dõi sự tăng trưởng của giống qua đêm, có thể thực hiện như sau:

+ Cấy giống đã hoạt hóa vào ống nghiệm chứa môi trường lỏng tương tự như trên vào chiều ngày hôm trước Sau 12 giờ hoăc 14 giờ ( sáng hôm sau), bắt đầu thu mẫu để

đo OD610

+ Ống giống đã được hoạt hóa ở trên được bảo quản ở 4ºC để ức chế sự tiếp tục tăng trưởng của giống Ngày hôm sau, thực hiện cấy giống vào một ống nghiệm khác chứa

20 ml môi trường lỏng tương tự như trên

+ Song song với việc theo dõi sự tăng trưởng của giống sau 12 giờ nuôi cấy, tiến hành theo dõi sự tăng trưởng của giống từ 0 – 12 giờ sau nuôi cấy

2.1.3 Tính toán kết quả

2.1.3.1 Tương quan giữa log (N/ml) theo OD610

- Lập bảng kết quả xác định mật độ tế bào của huyền phù có OD610 khác nhau

- Vẽ đường biểu diễn log(N/ml) theo OD610

- Nhận xét khoảng tương quan tuyến tính giữu log(N/ml)và OD610

2.1.3.2 Vẽ đường cong tăng trưởng của giống

- Lập bảng kết quả theo dõi tăng trưởng của giống (dựa theo OD610 và dựa theo log(N/ml) theo thời gian nuôi cấy

- Vẽ đường cong tăng trưởng của giống trong môi trường lỏng khảo sát bằng đồ thị biểu diễn hàm số OD610 hoặc log(N/ml) theo thời gian nuôi cấy

- Xác định các đặc trưng tăng trưởng: Ghi nhận thời gian pha lag, thời gian của pha log, thời gian tế bào tăng gấp đôi (doubling time), mật độ tế bào ở pha ổn định

2.2 Xây dựng đường cong tăng trưởng đối với nấm (thời gian thế hệ 4-12 giờ)

2.2.1 Đánh giá thông qua lượng sinh khối

 Nguyên tắc:

Để khảo sát biến dưỡng ở vi sinh vật, thường phải nuôi cấy chúng trên môi trường lỏng

và thu sinh khối Đối với vi sinh vật đa bào dạng sợi như nấm mốc, xạ khuẩn có thể dùng phương pháp lọc để tách sinh khối ra khỏi dịch nuôi và sấy khô 105ºC cho đến khi trọng lượng không đổi

 Tiến hành:

- Chuẩn bị môi trường PDA lỏng (thay nguồn đường bằng CMC)

- Nuôi cấy nấm:

+ Thay đổi thành phần dinh dưỡng (đường, đạm ) hoặc pH môi trường hoặc thời gian nuôi cấy

+ Chuẩn bị và bình tam giác 250 (môi bình 30ml môi trường PDA lỏng)

+Sau khi khử trùng, nghiên lọ để mặt môi trường nằm ngang Cấy miếng thạch có sợi nấm ở sát mép nước, sau đó để đứng lại từ từ

+ Nuôi cấy tĩnh trong 4 giờ, 12 giờ, 16 giờ, 20 g, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 54 giờ + Sinh khối sợi được vớt ra và đặt lên giấy lọc (được cân để trừ) Sấy ở nhiệt độ 105ºC cho đến khi trọng lượng không đổi

 Tính toán kết quả

Vẽ đường cong tăng trưởng của giống

- Lập bảng kết quả theo dõi tăng trưởng của giống dựa vào sinh khối nấm theo thời gian nuôi cấy

- Vẽ đường cong tăng trưởng của giống trong môi trường lỏng khảo sát bằng đồ thị biểu diễn hàm sinh khối theo thời gian nuôi cấy

- Xác định các đặc trưng tăng trưởng: Ghi nhận thời gian pha lag, thời gian của pha log, thời gian tế bào tăng gấp đôi (doubling time), mật độ tế bào ở pha ổn định

BÀI 3:

VI SINH VẬT PHÂN GIẢI PROTEIN, TINH BỘT VÀ CELLULOSE

Vi sinh vật như vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm sợi có khả năng sinh enzyme ngoại bào nhờ đó chúng có thể thủy giải các cơ chất tự nhiệ như protein, tinh bột, cellulose, hemicellulose để thành những thành phần đơn giản hơn cho quá trình hấp thu và dinh dưỡng của chúng

3.1 Nguyên tắc

Cấy chấm điểm vi sinh vật lên môi trường thạch có chứa cơ chất tương ứng (đối với enzyme cellulose, sử dụng cơ chất Carboxymethyl cellulose (CMC); enzyme amylase,

sử dụng cơ chất tinh bột tan) Sau thời gian nuôi cấy ở điều kiện nhiệt độ thích hợp, khuẩn lạc vi sinh vật hình thành, các enzyme được tổng hợp và tiết ra ngoài môi trường

sẽ thủy phân cơ chất và tạo thành vòng thủy phân xung quanh khuẩn lạc Dựa vào hiệu

số giữa đường kính của vòng thủy phân và đường kính khuẩn lạc, ta đánh giá khả năng sinh tổng hợp enzyme (cellulose, amylase) của loài vi sinh vật quan tâm

- Để quan sát rõ vòng thủy phân, sử dụng thuốc nhuộm protein (Amido – Black) Dựa vào việc có xuất hiện vòng thủy phân ta xác định hoạt tính sinh enzym protease

- Để quan sát rõ vòng thủy phân đối với khả năng thủy phân tinh bột và cellulose sử dụng thuốc thử lugol

Ngoài ra, có thể sử dụng dịch chiết enzyme thô do vi sinh vật tiết ra trong môi trường lỏng, sử dụng phương pháp đục lỗ thạch và xác định hoạt tính của enzyme thông qua hiệu số giữa đường kính của vòng thủy phân và đường kính lỗ thạch

3.4 Thực hành

3.4.1 Chuẩn bị:

- Môi trường:

Chuẩn bị môi trường chọn lọc thích hợp đối với từng chủng vi sinh vật, thay nguồn carbon duy nhất bằng protein (gelatin hoặc cazein), tinh bột, hoặc cellulose

 Nuôi cấy

Tiến hành cấy chấm điểm khuẩn lạc vào các đĩa Petri đã có bổ sung môi trường tương ứng như trên, mỗi đĩa có thể cấy 3 vị trí (tạo thành tam giác đều)

Nuôi đĩa đã cấy ở 300C, qua đêm

3.4.2 Quan sát và ghi nhận kết quả

Để tính toán đường kính thủy phân, ta đổ thuốc thử lên mặt thạch, tráng đều Môi trường có màu xanh đậm (hoặc tím do tinh bột kết hợp với iod), hoặc nâu tím

(cellulose kết hợp với iod) còn vòng thủy phân xung quanh vị trí cấy khuẩn lạc thì không màu

Khi ghi nhận kết quả, cần đo đường kính khuẩn lạc d (mm), và đo đường

kính thủy phân D (mm) Tính hiệu số giữa D-d (mm)

d D