thí nghiệm công nghệ protein enzyme papain

báo cáo kết quả thí nghiệm protein enzyme , đối tượng enzyme thực vật từ đu đủ : papain các mục tiêu cần khảo sát : hoạt tính , hàm lượng protein sau mỗi giai đoạn tinh sạch , quá trình lọc gel , quá trình điện di

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TP HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Mục lục

CHƯƠNG 4 BIỆN LUẬN KẾT QUẢ

BẢNG KÊ KHAI HÓA CHẤTCysteine 300 ml ( nghiền ) 300 ml (pH 5,7)

Xét trên 100 ml dung dịch đệm cho mỗi nấc pH từ 5  8 thì tổng

Na 2 HPO 4 0.2M 518,4 ml ( khảo sát pH ) + 93,6 ml ( ks nhiệt)

Acid citric 0.1M 181,6 ml ( khảo sát pH ) + 6,4 ml ( ks nhiệt )

15x2 ml = 30 ml ( 1 cặp ống thử ko , thử thật) Thực tế chỉ cần

Na 2 HPO 4 0.2M 518,4 x 0.3= 155.52 ml ( ks pH ) + 93,6 x 0.3 = 28.08 ml ( ks nhiệt)

=183.6 ml  dự trù 200 ml

Acid citric 0.1M 181,6 x 0.3 = 54.48 ml ( khảo sát pH ) + 6,4 x 0.3 = 1.92 ml ( ks nhiệt )

= 56.4 ml  dự trù 80 ml

BẢNG KÊ KHAI DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM

YẾU TỐ KHẢO SÁT

Hoạt tính papain sau mỗi giai đoạn tinh chế ( chủ yếu )

Hoạt tính papain theo thời gian ( không cần thiết – vì mụcđích tiết kiệm có thể bỏ qua)

Hoạt tính papain theo pH

Hoạt tính papain theo nhiệt độ

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN

QUÁ TRÌNH CHUẨN BỊ

Quả: lấy ở những quả đang còn xanh, vỏ quả mịn, có trọng lượng từ 0.3-1 kg là tốt nhất Quảnon quá cho ít nhựa, quả quá già hoặc quả to vừa cho nhựa ít, vừa không sánh sệt, hoạt tínhenzyme không cao Quả có vỏ sần sùi, chia thùy cũng cho ít nhựa Để thu enzyme có hoạt tínhcao nhất, nên lấy nhựa ở quả đang độ 10 tuần tuổi

Thời gian lấy nhựa: sáng sớm, kết thúc vào giữa buổi sáng (giai đoạn có độ ẩm không khí cao).Khi độ ẩm không khí thấp, dòng nhựa chảy chậm và đặc rất khó thu nhận Mùa khô: nhựa ít,đặc, nồng độ protein cao

Mùa mưa: nhựa nhiều, loãng, nồng độ protein thấp

Tiến hành Nhựa đu đủ lấy ở quả xanh còn ở trên cây Dùng dao inox có đầu nhọn rạch vàiđường dọc theo quả ở chỗ đường kính quả to nhất, các lát khía cách nhau 3-5cm (không rạchsâu quá 2cm, nếu không dịch nước và tinh bột từ quả sẽ trộn lẫn vào nhựa và làm giảm chấtlượng nhựa thu được)

Hứng lấy nhựa chảy ra bằng lọ thủy tinh màu miệng rộng trong 4 – 6 phút, sau khi lấy nhựaxong đậy nắp kín và bảo quản lạnh, giữ trong tối nhằm tránh không cho nhựa tiếp xúc lâu vớikhông khí và để bảo đảm hoạt tính của papain có trong nhựa

Khi lấy nhựa cần lau sạch trái nhằm tránh không cho chất bẩn hoặc côn trùng lẫn vào Khôngnên trộn nhựa khô với nhựa tươi vì nó làm giảm chất lượng nhựa

Quả có thể được rút nhựa trong suốt khoảng thời gian từ 4 – 7 ngày Lần đầu tiên có thể chỉ cầnmột rạch là đủ, ở những lần thu nhựa sau, rạch 2 – 3 đường giữa những đường rạch trước đó.Khi tiến hành các thao tác với nhựa tươi, tránh không cho nhựa tiếp xúc vào da vì dễ gây bỏng.Đồng thời cũng không nên để nhựa tiếp xúc với các dụng cụ làm từ kim loại nặng như sắt, đồng,

…để tránh làm biến màu và giảm hoạt tính enzyme Lọ, dao, muỗng,… phải được làm bằngnhựa hoặc thép không rỉ Nhựa tươi không bền vì thế nên đông khô chân không ngay sau khithu nhận, nhựa đông khô được bảo quản trong tủ lạnh để tiến hành các nghiên cứu

QUY TRÌNH TINH SẠCH

Trộn 180g nhựa đu đủ khô với 100g celite và 150g cát sạch, nghiền kỹ trong cối ở nhiệt độ phòng với 200-300ml dung dịch cysteine 0.04M (hòa tan 6.3g cysteine hydrochloride trong 1000ml dung dịch NaOH 0.054M, kiềm được sử dụng để đưa pH dịch chiết tới 5.7) Khi dịch

nhựa tạo thành thể huyền phù, gạn bỏ lớp nổi ở trên Quá trình nghiền và trích được lặp lại với

300ml dung dịch cysteine Sau đó rửa cối với dung dịch cysteine để điều chỉnh thể tích lên 1000ml Dịch huyền phù sau cùng được lọc lạnh (có thể hút nhẹ) trên giấy lọc Whatman số 1.

Thời gian lọc phụ thuộc vào nhựa khô được sử dụng và quá trình này có thể rất chậm Nước lọc

có màu trắng sữa hoặc vàng xanh, pH gần 5.7 Các bước còn lại của quá trình tinh sạch enzymeđược tiến hành trong điều kiện lạnh

LOẠI BỎ CÁC CHẤT KHÔNG TAN Ở pH = 9

Dịch chiết thu được ở trên được điều chỉnh lên pH 9 bằng cách thêm từ từ và khuấy đều một lượng khoảng 110ml dung dịch NaOH 1M Tủa xám tạo thành có thể được loại ra bằng lọc hoặc

ly tâm ở 4000rpm trong 30 phút Dịch trích ở giai đoạn này phải trong do các tủa gây biến tính

protein đã được loại bỏ

QUÁ TRÌNH PHÂN ĐOẠN BẰNG AMONIUM SULFATE

Cho amonium sulfate vào dịch enzyme đến 40% độ bão hòa, sau 1-2 giờ, ly tâm ở 4000rpm Thunhận tủa, bỏ dịch lỏng hoặc có thể giữ lại để lấy chymopapain Tủa được rửa một lần với 400-500ml dung dịch amonium sulfate 40% độ bão hòa

QUÁ TRÌNH PHÂN ĐOẠN BẰNG NACl

Hòa tan tủa trong 600ml dung dịch cysteine 0.02M (pH 7-7.5), tủa papain tạo thành khi thêm

từ từ 60g NaCl rắn Sau một giờ, ly tâm ở 4000rpm trong 40 phút để thu tủa, bỏ dịch lỏng

QUÁ TRÌNH KẾT TINH

Tủa được tạo thành dịch huyền phù với 400ml dung dịch cysteine 0.002M ở pH 6.5 và điều kiện nhiệt độ phòng pH của dung dịch huyền phù được điều chỉnh lại đến 6.5 sau khi cho protein vào Giữ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút để tinh thể tạo thành, sau đó duy trì ở 4oC qua đêm, sau đó ly tâm lạnh ở 4000rpm trong 1 giờ để thu nhận tinh thể

QUÁ TRÌNH TÁI KẾT TINH

Hòa tan tinh thể thu được ở giai đoạn kết tinh trong nước cất (tạo dung dịch có nồng độprotein khoảng 1%) ở nhiệt độ phòng Sau đó cho vào từ từ (đồng thời khuấy đều) dung dịchNaCl bão hòa (10ml/300ml dung dịch protein) Khi 75% thể tích dung dịch NaCl đã cho vào,

papain bắt đầu kết tinh ở nhiệt độ phòng Dịch huyền phù được giữ ở 4oC qua đêm, sau đó ly

tâm thu tủa Hoạt độ riêng của enzyme có thể tăng nhẹ nếu tiến hành tái kết tinh thêm một lầnnữa như trên

ĐÔNG KHÔ CHÂN KHÔNG

Tủa protein thu được đem đông khô chân không để loại bỏ nước Protein sau khi đông khôchân không được bảo quản trong tủ lạnh để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo Qui trình thunhận papain tinh khiết có thể được tóm tắt lại theo sơ đồ

Phân đoạn pH = 5,7

180 g nhựa đu đủ khô

Nghiền với 100 g celite và 150 g cát sạch

Phân đoạn tái kết tinh

Dung dịch NaCl bão hòa

DDịch chiết 2

CHƯƠNG 2 : PHƯƠNG PHÁP

2.1 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH PAPAIN BẰNG PP ANSON CẢI TIẾN

quy trình thí nghiệm đối với mỗi phân đoạn là như nhau và theo bảng sau

Để yên 30 phút, lọc lấy dịch trong

o Lấy 2 ống nghiệm mới khác, cho vào ống thứ nhất 5ml dịch lọc của ống thử thật

và cho vào ống thứ hai 5ml dịch lọc cùa ống thử không Làm tương tự cho 5 cặpống nghiệm còn lại

o Tiếp tục thêm vào 12 ống mỗi ống 10ml NaOH 0,5N và 3ml thuốc thử Folin, lắcmạnh,

o sau 10 phút đo OD ở bước sóng 660nm

o Tính ΔOD = ODOD = ODTT – ODTK, sau đó dựa vào đồ thị chuẩn suy ra được số µM Tyrosin

 phương trình đường chuẩn y = ax + b ( cô cho ), với y là OD , x là lượng tyrosine , có

OD sẽ suy ra lượng tyrosine

V : tổng thể tích hỗn hợp trong ống thử thật hoặc ống thử không (ml)

v : thể tích dịch lọc đem phân tích (ml)

t : thời gian thủy phân (phút)

m : khối lượng mẫu enzyme đem đi xác định hoạt tính (g)

L: độpha loãng mẫu enzyme

µM Tyrosin: lượng µMTyrosin trong v (ml) suy ra từ đường chuẩn

Đồ thị đường chuẩn ANSON

2.2 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PROTEIN BIURET:

Thuốc thử Biuret: 1.5 g cupric sulfate pentahydrate (CuSO4.,5 H2O) và 6.0 g sodium potassium

tartrate tetrahydrate (NaKC4H4O6 4 H2O)

Hòa tan trong 500 ml nước cất

so với lượng mẫu Sự phân tách dựa trên sự khác nhau về kích thước phân tử, thường khó đạt được sản phẩm tinh khiết hoàn toàn Vì lý do này, sắc ký lọc gel thường được sử dụng với những kỹ thuật khác nhau nhờ sắc ký trao đổi ion hay sắc ký hấp phụ

Chuẩn bị gel gom

Lắc nhẹ cho tan

Các bước tiến hành sau khi đã điện di

- Lấy gel ra khỏi tấm kính

- Ngâm gel trên đĩa petri có chứa thuốc nhuộm, lay nhẹ cho thuốc thấm

- Chuyển gel sang dung dịch rửa màu, thay dung dịch rửa mới cho tới khi gel trong suốt, lúc này

sẽ xuất hiện các vạch xanh lơ trên gel, chụp ảnh để lấy kết quả

d) kết luận

dựa vào thang mẫu đã biết để xác định từng loại protein trong hỗn hợp protein

CHƯƠNG 3 : THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

xay

3.2 KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM

Pt đường chuẩn Anson y= 1,954x

Pt đường chuẩn Biuret y= 0,0582x – 0,00007

Ngày thí nghiệm 18/3/15

Nguyên liệu đu đủ gần chín

Dịch ban đầu sau khi xay và lọc

Sau khi chỉnh pH = 9 ly tâm dịch thu được 87 ml

Và lấy 25 g amoni sulfate bỏ vào nhưng ko có tủa

Hoạt tính H =

0,02098.16.1

0,003324 20.1,01.5  UI/ml

Hàm lượng protein h = 3,9003 mg/ml

Hoạt tính riêng pH 9

0,000852233,9003

H

Thí nghiệm ngày 19/3/15

400 g đu đủ khác loại làm tiếp

Lấy 39 g muối amoni kết tủa protein, đem ly tâm 5000 rpm 15 phút ,

Kết quả sau khi hòa tan tủa dạng paste dính trên falcon ( sau ly tâm) với đệm pH tối ưu

H

Kết quả lọc gel

ngày thí nghiệm T4/01/04/15

Tiến hành thu tủa từ nguồn đu đủ khác

Không đo hoạt tính , nhiệm vụ cao cả là thu cho được tủa , tại vì tủa trước đó lỡ đem xácđịnh hoạt tính hết rồi

Cuối cùng cũng có tủa mặc dù rất ít

Hòa tan tủa với 1ml đệm pH = 7,6

20  dịch tủa hòa tan với đệm + 10 l  dung dịch xử lý mẫu l

Chạy điện di , phần dịch enzyme với đệm còn lại đi lọc gel thủ công

Kết quả OD Biuret của lọc gel

Xác định hoạt tính Anson tại peak cao – peak 2ODtt = 0,321

ODtk = 0,254 => OD = 0,067

H=

0, 03429.16.1

0,00543720.1,009.5  ; UI/ml

Xác định hoạt tính Anson tại peak lùn - peak 1ODtt = 0,353

ODtk = 0,324 => OD = 0,029

H=

0,01484.16.1

0,00235320.1,009.5 

; UI/ml

CHƯƠNG 4 : BIỆN LUẬN KẾT QUẢ

4.1 Biện luận kết quả hoạt tính

Hoạt tính riêng tương quá nhỏ xấp xỉ bằng 0 , ở giai đoạn pH 9 thì hoạt tính riêng enzyme cao nhất trong cả 3 giai đoạn- điều này không đúng so với lý thuyết bởi vì càng tinh sạch thì ta thu được enzyme càng tinh khiết do vậy hoạt tính riêng phải càng cao

Có nhiều nguyên nhân dẫn đến tình trạng này :

1 sau bước tủa với pH 9 là bước tủa với muối amoni , có khả năng do để lâu nên enzyme mất hoạt tính dần, hoặc lượng muối không đủ để tủa hết toàn bộ enzyme trong dịch , đây là nguyên nhân chính yếu giải thích vì sao ở phân đoạn tủa muối HTR lại giảm

2 do nguyên liệu ban đầu tiến hành thực nghiệm là nguyên trái đu đủ , cho nên lượng tạp chất rất lớn , và ảnh hưởng rất nhiều đến hoạt tính enzyme , mặt khác lượng enzyme trong khối nguyên liệu đó cũng chỉ có mặt 1 lượng rất nhỏ , cho nên hoạt tính riêng ở 3 giai đoạn đều rất nhỏ tương đương = 0

4.2 Biện luận kết quả điện di

Kết quả chạy điện di không có vạch nào

Điều này chứng tỏ enzyme không có mặt trong quá trình thu nhận , hoặc quá trình điện

bị sai sót

4.3 Biện luận kết quả lọc gel

enzyme vào cột nên không tính peak này – ở 3 ống đầu chỉ toàn nước cất

peak cao (2)

không chứa 1 loại protein duy nhất mà thực tế có nhiều loại

 ở peak số 2 hoạt tính theo pp Anson cao hơn nên chọn peak 2 là khoảngquan tâm của ta , ở đó sẽ có nhiều protein - enzyme hơn

xuất hiện thêm nhiều peak nữa nếu ta tiến hành lọc gel tiếp và xác suấtcao là enzyme sẽ nằm ở khu vực những peak này

tài liệu tham khảo

1.Nguyễn Đức Lượng cb , Công nghệ enzyme , NXB ĐH QG TP HCM 2012