chuong 3 ky thuat len men

Một số lưu ý trong quá trình chuẩn bị giống- Môi trường có thể không cần thiết phải tối ưu trong giai đoạn sản xuất , nhưng không nên khác quá xa giá trị tối ưu thi sẽ làm kéo dài phas

Phần 1

VSV ỨNG DỤNG TRONG CÁC QUÁ TRÌNH LÊN MEN TẠO CÁC SẢN PHẨM THỰC

PHẨM VÀ CÁC CHẤT PHỤ GIA

Chuong 1: Các kỷ thuật căn banû trong lên men.

Chương 2: Ứng dụng VSV trong sản xuất sinh khối- protein đơn bào.

Chương 3: Ứng dụng VSV trong sản xuất các chất phụ gia (A glutamic,

nucleotide,dextan,a.acetic,a citric….)

Chương 4: Ứng dụng VSV trong chế biến các thực phẩm len men truyền thông

Chương 1

Các kỷ thuật căn bản trong qui trình lên

men của VSV

I Giống VSV trong CNLM

1.1 Tiêu chuẩn chọn giống.

1.2 Nguồn gốc giống 1.3 Biện pháp bảo quản giống 1.4 Các kỷ thuật nâng cao năng suất giống

II Nguyên liệu lên men

III Các phương pháp khử trùng.

III Kỷ thuật lên men

4.1 Thiết bị lên men ( fermentor).

4.2 Phuơng pháp lên men

- Lên men từng mẽ ( batch culture).

- Lên men liên tục (Constinuous culture)

- Lên men có bổ sung chất dinh dưỡng (Fed-batch culture).

- Lên men bề mặt.

IV Các phương pháp thu hoạch sản phẩm.

V Một số vấn đề cần lưu ý

SƠ ĐỒ QUI TRÌNH LÊN MEN

Chế tạo môi trường dinh dưỡng

Khử trùng môi

Nguyên liệu (C, N, P, K) dầu phá bọt, muối

Các giai đoạn giữ giống - nhân giống, sản xuất thử nghiêm

và sản xuất công nghiệp

Giống vi sinh vật

- Sinh sản nhanh,phase tiềm phục ngắn.

- Sử dụng được nguyên liệu là phụ phẩm hay

phế phẩm

- Có thể phát triển trong thể tích môi trường

lớn (tỷ lệ giống thường khoảng 3-10%).

- Có hình thái phù hợp để tiện thu hoạch

sinh khối ( kích thước lớn , dạng sợi dễ thu hoạch bằng cách lắng hay vớt , lọc….).

- Chủng phải thuân khiết ,không bị nhiễm

phage

1.Tiêu chuẩn của giống

2 Một số lưu ý trong quá trình chuẩn bị giống

- Môi trường có thể không cần thiết phải tối ưu trong

giai đoạn sản xuất , nhưng không nên khác quá xa giá

trị tối ưu thi sẽ làm kéo dài phase tiềm phục.

- Số lượng các bước nhân giống ( 2-3 trong bình tam giác

hay 1-3 trong fermentor) càng cao thì nguy cơ tạp

nhiễm , nguy cơ thoái hoá giống càng cao

- Số lượng bào tử của nấm sợi có thể ảnh hưỡng hình

thái, và năng suất tạo sản phẩm :

* Số lượng bào tử thấp- pellet: phù hợp đối với sự tạo

thành acid citric của nấm Aspergillus niger.

* Số lượng bào tử cao- Khuẩn ty: phù hợp cho sản xuất

kháng sinh pénicillin của nấm Pénicillium chrysogenum

DỰA VÀO ĐƯỜNG CONG SINH TRƯỞNG CHỌN LƯA CHỦNG VSV

CHO SẢN XUẤT

1 Phân lập từ tự nhiên :

Nguyên tắc cơ bản :”Ở đâu tồn tại cơ chất nào thì ở đó sẽ tập trung nhiều VSV có nhu cầu sinh lý phù hợp với cơ chất đó ù” EX:

*Chọn chủng VSV có các loại enzim amilase (trên cơ chất giàu tinh bột), pectinase (trên cơ chất tự

nhiên giàu pectin), cellulase (trên cơ chất tự nhiên nhiều chất xơ)…

*Chọn chủng VSV làm chế phẩm thuốc trừ sâu bệnh thì phân lập VSV trên các cơ thể côn

trùng bị dịch bệnh do vi khuẩn , nấm sợi , virus.

*Chọn chủng có khả năng tổng hợp kháng sinh thì phân lập trong đất, môi trường sống có

nhiều chủng loại VSV do đó mà VSV muốn tồn

tại thường phải có khả năng cạnh tranh đối

kháng cao.

* Chọn chủng VSV lên men lactic thì phân lập trên

cơ chất giàu dinh dưỡng, giàu vitamin: trong đường tiêu hoá người và động vật, trên sữa chua, rau quả muối chua theo phương pháp truyền thống

3 Phân lập giống

Giống phân lập trong tự nhiên thường có năng suất STH không cao, do VSV hoang dại

luôn có khả năng tự điều hoà TĐC Vì vậy muốn nâng cao năng suất phải sử dụng kỷ thuật gây đột biến hay tạo những chủng tái tổ hợp gen thông qua công nghệ lấp ghép gen.

CÁC GIAI ĐỌAN PHÂN LẬP- NHÂN GIỐNG VSV

 Shake flasks

 Stirred tank Batch culture

4 Trung Tâm Bảo Quản giống VSV

Sau đây là một số trung tâm giữ giống

trên thế giới như:

• ABBOTT : Abbott Laboratories, North

Chicago,III.60064, USA.

• ATCC : America Type Culture Collector, 12301,

Parklaw Drive Rockvill Md20852,

USA.

• HIR : Food ad Fermentation Divisio, Hokkatdo

Profectural Idustrial Research Institute

Sapporo, Japan.

• FERM : Fermentatio Research Institute, Agency

of Industrial Science and Technology, Ministry

of Idustrial Trade and Industry, Chiba Japan

Các phương pháp bảo quản

giống

Mục đích việc bảo quản giống :

-ổn định các tính chất của dòng thuần

- tránh tạp nhiễm -Tránh bị thoái hoá giống làm giãm năng suất

desiccation on soil, sand, silica gel,

paper strips, gelatin discs

low costs, not labour- intensive

frozen in glycerol between -50oC and -80oC

high cost of freezer, not intensive

labour-liquid nitrogen high capital costs, potential failure

to refill liquid nitrogen, hazardous

freeze-drying

(lyophilization)

not good for non-sporing fungi, high capital costs, labour- intensive, no further attention on storage, good for long term

storage

sub-culture mainly for bacteria, inexpensive,

labour-intensive, risk for contamination and loss in viability

under paraffin on agar short storage for fungi

1.3 Phương pháp bảo quản giống VSV:

Giống VSV rất dể bị thoái hoá, nên cần bảo quản đúng kỹ thuật.

1.Giữ giống trên môi trường thạch nghiên.

2.Giữ giống dưới lớp dầu khoáng.

3.Giữ giống trong cát, đất, hay ngũ cốc.

4.Giữ giống trên silicagen, gelatin

5.Giữ giống trên giấy lọc : Giấy lọc cắt

thành từng miếng nhỏ 1-3 cm, cho vào ống nghiệm thanh trùng 1210C/1h, cho vào tủ

sấy 1000C/3h SV nuôi cho có bào tử 3-5

ngày, dùng pipette vô trùng cho vào mỗi miếng giấy lọc 1 giọt vi khuẩn, đậy nút

bông và cho vào tủ ấm để tiếp 2-3 ngày cho đến khi giấy hoàn toàn khô, phủ

paraffin đặc đun chảy lên nút bông, để tủ lạnh hoặc phòng mát, thời gian bảo quản nhiều năm.

6.Giữ giống bằng phương pháp lạnh sâu (dùng khí Nitơ lỏng hay cấp đông trong ngăn đá tủ lạnh ) :

Giống được giữ trong điều kiện lạnh sâu (-15 0 đến -70 0 C) Để bảo vệ VSV không bị chết ở nhiệt đô thấp ( lạnh sâu do các tinh thể đá gây ra) người ta trộn VSV vào một trong các chất bảo vệ sau:

• + Glycerin 15%.

• + Huyết thanh ngựa (loại không cho chất bảo quản).

• + Dung dịch saccarose 10% + gelatin 1% PH= 6,8 - 7.

• + Dung dịch Glucose hoặc Lactose 10%.

Sau khi đã trộn với chất bảo vệ, ta cho vào các ống nghiệm, đậy nút và cho lạnh từ từ, khi độ lạnh đạt -20 đến -25 0 C thì phải giữ tốc độ làm lạnh 1-2 0 C/ phút.

Thời gian cấy truyền :

• + Giữ ở -15 đến -20 0 C thì 6 tháng cấy truyền và làm lại một lần.

• + Giữ ở -30 0 C thì 9 tháng cấy truyền và làm lại một

lần.

• + Giữ ở -40 0 C thì 1 năm cấy truyền và làm lại một lần.

• + Giữ ở -50 đến -60 0 C thì 3 năm cấy truyền và làm lại một lần.

• +Giữ ở -70 0 C thì 10 năm cấy truyền và làm lại một lần.

7.Giữ giống bằng phương pháp đông khô :

( lyophilization)

• Đông khô là phương pháp làm thăng hoa nước có

trong môi trường nhũ hóa VSV ở điều kiện áp suất thấp

• Cách thực hiện : VSV sau khi thu hoạch từ các ống canh

khuẩn bằng cách ly tâm, sau đó được trộn với 1 trong những chất bảo vệ như :

- Glutamat 3%

-Lactose 1,2%+ pepton 1,2%.

- Saccarose 8%+sữa 5%+gelatin 1,5%.

Hạ nhiệt độ xuống -60 0 C đến -70 0 C, để đóng băng.Sau đó tăng nhiệt độ lên 0 0 C, trong phòng chân không

với áp suất 1.10 -4 mmHg Hiện tượng thăng hoa sẽ xảy

ra , nước trong tế bào VSV và môi trường sẽ chuyển từ trạng thái rắn sang trạng thái hơi Đó là đông khô Đây là kỷ thuật tối ưu, giống trong các ampul thủy

tinh được hàn chân không có thể bảo quản nhiệt độ 4- 6 0 C hay nhiệt độ phòng trong thời gian hàng chục

năm với tỷ lệ sống cao và ít bị biến đổi về di

truyền, ít chiếm diện tích bảo quản

Công việc chủ yếu của phòng kỷ

thuật của xí nghiệp lên men :

*Kiểm tra độ thuần khiết của giống

*Kiểm tra khả năng hồi biến của giống

(Giống đột biến thường có khả.

năng hồi biến ).

*Hoạt hoá giống sau thời gian sử dụng hay

bảo quản.Thường dùng các môi trường giàu các chất kích thích sinh trưỡng như: dịch chiết nấm men, nuớc chiết cà chua, hổn hợp

vitamin

* Có biện pháp bảo quản giống thích hợp.

• Nguồn carbon : Rĩ đường (mật mía hay

mật củ cải đường không kết tinh được trong quá trình sản xuất đường), Malt

trích ly, tinh bột, detrin, dịch kiềm sulphit, cellulose, dầu thực vật (dầu đậu nành, dầu dừa, dầu phọng, dầu hạt bông),

metanol và các carbuhydro dầu hỏa…

• Nguồn nitơ hữu cơ : sử dụng cao ngô,

dịch chiết nấm men, pepton

• Nguồn Nitơ vô cơ: urea, Sulphatamon

(NH4)2SO4, Diamino Phosphat (NH4)2HPO4

• Nguồn khoáng vô cơ : bảo đảm các

yếu tố khoáng và các nguyên tố vi

lượng :, H3PO4, KH2PO4, KH2HPO4, KCL, H2SO4, CaCO3, MgSO4, FeSO4, MnSO4, ZnSO4.

II Nguyên liệu dùng trong công

nghệ lên men

Dầu phá bọt

• Trong khi lên men các chủng VSV hiếu khí

cần phải thổi khí và khuấy liên tục nên

môi trường có nhiều bọt Khối bọt hình

thành càng nhiều có thể trào ra ngoài nồi lên men qua khe hở các chi tiết gây tạp

nhiễm.

• Có nhiều biện pháp chống tạo bọt : Dùng

những chất có hoạt tính bề mặt :dầu thực vật (dầu lạc, dầu ngô, dầu đậu tương,

dầu hướng dương , dầu bông )mỡ cá voi,

và một số chất phá bọt

III Các phương pháp khử trùng

1.Loại vi khuẩn bằng cách lọc.

2 Khử trùng bằng nhiệt cao: Autoclave

3 Khử trùng bằng bức xạ: tia UV, tia X 4.Khử trùng bằng hố chất: SO 2 , Ozon 5.Tạo mơi trường nuơi cấy chọn lọc

 Sterile methods for

stirred tank reactors

Kỷ thuật khử trùng:

• Khử trùng từng mẻ (Sterilisation batch).

• Khử trùng liên tục (Sterilisation continuos).

Lọc môi trường: hệ thống siêu lọc Lọc không khí: bằng bông thuỷ tinh

Sterilisation are applied

- to ensure that the process is carried out only with the desired

organism, to avoid loss in productivity and competition for the substrates

- to avoid environmental contamination

- to prevent deterioration of the final product, e.g., beta-lactam

antibiotics contaminated by beta-lactamase-producing bacteria

- to prevent contamination of the final product, e.g., pharmaceutical products by pyrogene compounds, blood products by HIV virus Sterilisation by

- removing organisms (filtration)

■ Từng mẽ: dùng autoclave với hơi

nước trực tiếp ( nồi khử trùng

nhỏ)hay hơi nước gián tiếp (nồi

khử trùng có thể tích lớn)

■ Tốn thời gian dài để tăng nhiệt lên

1210C và hạ nhiệt

■ Khử trùng liên tục

- Nhiệt độ tăng rất nhanh đến 140 0 C

- Giữ ổn định nhiệt độ vài phút

- Làm lạnh nhanh ( sốc nhiệt)

Khử trùng

x Có thể được tính toán nều biết trước các thông số sau:

- Tổng số lượng không khí được cung cấp,Ex:10 m 3 /min trong 100 hr.

- Vận tốc luồng khí qua lọc ,Ex: 0.15 m/sec.

- Số lượng VSV ô nhiễm trong 1 m 3 khí Ex : 200 microorg./ m 3

- Chất lượng khử trùng cần đạt : Ex::1 tb./ 1000 m 3

 filtration

Khử trùng không khí bằng cách lọc

Hệ thống vi lọc

VI Phương pháp lên men

Khái niệm về lên men

chìm và lên men bề

mặt:

• Lên men chìm : lên men

trong các fermentor với

môi trường nuôi cấy

lỏng, VSV chìm trong

môi trường nuôi cấy (

lên men công nghiệp)

• Lên men bề mặt : lên

men trên các khay với

môi trường nuôi cấy

lỏng hay môi trường

có cơ chất rắn, hay

xốp VSV phát triển

trên bề mặt cơ chất

( Lên men cổ điển –

thủ công )

Điều kiện lên men

• Lên men hiếu khí : thông khí bằng hệ thống

trục khuấy có sụt khí (sản xuất sinh khối tế bào)

• Lên men kị khí (sản xuất rượu, bia)

Kỷ thuật lên men chìm: có 3 cách

• Lên men từng mẽ ( batch fermentor)

• Lên men từng mẽ có bổ sung chất dinh

dưỡng (feed batch fermentor)

• Lên men liên tục (Continuous fermentor)

• Batch culture (Lên men từng mẽ):

Sau chu kỳ 2-4 ngày lên men trong thiết bị, thu hoạch toàn bộ dịch nuôi cấy, làm vệ sinh, khử trùng thiết bị, tiến hành mẽ nuôi cấy mới.

Phương pháp không đòi hỏi kỷ thuật cao nhưng năng suất không cao do bị gián đọan sản xuất Phải luôn theo dỏi đường cong sinh trưởng để thu hoạch sản phẩm đúng thời điểm, nếu

không chất lượng sản phẩm không ổn định

Hiệu suất Y =

Lượng tế bào sinh ra Lượng cơ chất sử dụng

Thiết bị lên men (Fermentor)

Batch culture

 Shake flasks

 Stirred tank

Máy lắc

ICI’s 1500 m 3 fermenter under installation

 Bubble columns & Airlift reactors Bubble columns &

■ Batch culture

• Feed batch culture (lên men cĩ bổ sung

cơ chất từng giai đọan)

Một số cơ chất dinh dưỡng nếu cho vào mơi trường nuơi cấy ở mức dư thừa cĩ

thể ảnh hưỡng khơng tốt đến VSV , vì

vậy người cho chỉ cho vào mơi trường

lúc đầu ở một nồng độ giới hạn Trong quá trình lên men người ta sẽ bổ sung

cơ chất giới hạn trên vào mơi trường để bảo đãm thành phần dinh dưỡng tối ưu trong quá trình lên men từng mẻ.

EX: trong sản xuất sinh khối nấm men nếu cho vào mơi trường nồng độ đường cao( saccarose hay glucose) sẽ ức chế quá trình sinh sản của nấm men, thay

vào đĩ là quá trình lên men rượu ethylic

vì vậy phải bổ sung theo từng giai đoạn lên men

Fed batch culture

Những ưu điểm của Feed Bacht fermentor

-Sử dụng cơ chất dinh dưỡng ở nồng độ cao có thể ức chế sinh trưởng của VSV ( ethanol, mathanol, acid

acetic, hợp chất bay hơi.

-Làm tăng năng suất của sinh khối ,năng suất có thể

tăng gắp 10 lần so với phương pháp batch culture)

- Đối với những sản phẩm thứ cấp mà năng suất không

có liên quan đến tốc độ sinh trưởng của VSV (được

tạo ra khi sự sinh trưởng VSV vào giai đọan cân

bằng) Sự cung cấp hạn chê chất dinh dưỡng giúp cho

sự kiểm soát sự gia tăng sinh khối trong giai đoạn

đầu , nhờ thế khi vào giai đọan cân bằng sản phẫm thứ cấp sẽ được tổng hợp nhiều hơn

- Tránh hiện tượng ức chế ủa sản phẩm dị hoá

- Làm giãm độ nhớt của môi trường

- Tránh bị tạp nhiễm , đột biến , biến dị (thường gặp

trong nuôi cấy liên tục)

• Hệ thống nuôi cấy liên tục (Continuous culture)

– Môi trường dinh dưỡng liên tục được bổ sung vào và đồng thời dịch lên men được lấy ra một lượng tương ứng Do đó VSV luôn trong điều kiện sinh trưởng lý tưởng

v Vận tốc pha loãng D=

Vận tốc dòng vào

Vận tốc dòng ra

f =

– Trong nuôi cấy liên tục dòng môi trường vào có tốc độ bằng

tốc độ thu sản phẩm Phương pháp này có lợi vì nếu sản phẩm cuối chưa đáp ứng yêu cầu , có thể khắc phục :

1.Điều chỉnh tốc độ môi trường vào và ra

châm lại, để thời gian lưu của dịch dinh

dưỡng và tế bào VSV trong thiết bị lâu hơn.

2 Hoàn lưu dịch lên men vào môi trường để tái lên men , làm các thành phần của môi trường có thể tham gia triệt để quá trình

trao đổi chất ản phẩm tạo ra sẽ nhiều hơn

3 Thiết bịlên men liên tục nhiều bình nối

tiếp nhau sẽ cho sản phẩm cuối cùng có

năng suất cao nhất.

■Continuous culture

Có 3 loại hệ thống nuôi cấy liên tục :

1 Hệ thống hở gồm một bình lên men có dòng môi

trường vào và dòng môi truờng ra.

2 Hệ thống có hồi lưu: phần lấy ra được bơm hồi lưu

trở lại bình lên men.

3 Hệ thống liên tục nhiều bình lên men liên hoàn.

Thu hoạch sản phẩm

Kết thúc quá trình lên men là tìm cách tách tế bào VSV ra khỏi pha lỏng của môi trường lên men :

Sản phẩm cuối là sinh khối tế bào:

• Nếu là các VSV có cấu tạo hệ sợinhư nấm sợi, tảo

đa bào thu hoạch bằng phương pháp lọt hay với.

• Nếu là VSV đơn bào , kích thước tê bào nhỏ như nấm

men , vi khuẩn thường dùng phương pháp ly tâm

Sản phẩm cuối là sản phẩm trao đổi chất sơ cấp, thứ cấp của tế bào

• Nếu sản phẩm là chất bên trong tế bào như enzim

nội bào phải thu hoạch tế bào, làm ly giảõi tế bào, sau đó mới chiết tách chất nội bào.

• Nếu sản phẩm là những chất được VSV tiết ra môi

trường ngoài thì phải tiến hành chiết tách bằng

những cách như: kết tủa, sắc ký hấp phụ, điện di……