Quy trình sản xuất enzyme naringinase

Kết quả thí nghiệm cho thấy, nấm mốc Aspergillus oryzae có khả năng sinh trưởng và phát triển trên môi trường PDA có bổ sung thêm cơ chất naringin nên có thể dự đoán được nấm mốc Aspergi

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

BỘ MÔN DUWDCNSH TRONG CNTP

BÁO CÁO TÌM HIỂU QUY TRÌNH SẢN XUẤT

ENZYME NARINGINASE

GVHD: Nguyễn Thị Thu SangLớp: Chiều Thứ 5_tiết 11-12 Nhóm: 27

trong quả họ citrus (Nguồn: Kefford (1959); Marwaha and others (1994)) Việc làm mất

đi vị đắng do những hợp chất này gây ra là một vấn đề nan giải

Tp Hồ Chí Minh, 5//2015

Các công trình nghiên cứu được tìm ra và áp dụng để làm giảm vị đắng trong nước

bưởi như: công nghệ lọc chất đắng, các công nghệ như hút bám (Nguồn: Grif-fith, (1969), Johnson và Chandler, (1988)), phương pháp hóa học (Nguồn: Kimball, (1987); Pritchet, (1957)), điều trị bằng styrene divinyl benzen polystyrene (DVB) nhựa (Nguồn: Kimball, (1991); Puri, (1984)), và β-cyclodextrin (Nguồn: Shaw và Wilson, (1983); Wagner et al, (1988)) Tuy nhiên, những công nghệ trên không được hiệu quả vì còn

nhiều hạn chế Với sự tiến bộ của Công nghệ sinh học, việc sử dụng enzyme naringinase

(Nguồn: Habelt và Pittner, (1983); Ting, (1958)) để thủy phân naringin trong nước bưởi

làm giảm vị đắng của nước bưởi một cách hiệu quả

Do vậy việc sử dụng enzyme naringinase như một chất phụ gia thực phẩm để làm giảmhoặc loại bỏ chất đắng, tạo vị hài hòa cho sản phẩm nước ép từ các loại quả có múi làđiều hêt sức quan trọng

Naringinase là một enzyme được sử dụng trong sản xuất thương mại nước trái cây có múinhư: cam, bưởi, tắc… và rau quả khác Những hợp chất đắng được tìm thấy trong tất cả

các bộ phận của quả bưởi như neohesperidin, limonin và naringin (Nguồn: Kefford, (1959); Marwaha and others (1994)) Naringin là thành phần chính trong bưởi và nó là

chất đắng nhất Ngưỡng vị của nó trong nước là khoảng 20 ppm, nhưng mức độ 1,5 ppm

có thể được phát hiện Naringin có nhiều trong trái cây chưa trưởng thành nhưng nồng độ

của nó giảm khi quả chín (Nguồn: Yusof et al, (1990)) Enzyme này thủy phân các hợp

chất naringin, hợp chất có vị đắng trong nước bưởi Enzyme này chứa cả

α-L-rhamnosidase (EC 3.2.1.40) và β-D - glucosidase (EC 3.2.1.21) Naringin có thể được thủy phân bởi α-L-rhamnosidase tạo ra rhamnose và prunin (4,5,7-trihydroxyflavonone-

7-glucopy - ranoside), cũng có thể thu được prunin bởi β-D-glucosidase (Nguồn: Park and Chang, (1979)) Lực đắng của dịch quả ép sau khi đã xử lý bằng enzyme giảm đi rất

nhiều do tính đắng của prunin nhỏ hơn naringin khoảng 1/3 Nhờ vậy mà nước bưởi mang lại vị hài hòa hơn, tăng giá trị cảm quan của sản phẩm

1.2 Nguồn Thu Nhận

Trong lịch sử, naringinase đã được phân lập từ nguồn thực vật như: hạt cần tây (Nguồn: Hall, (1938)) và lá bưởi (Nguồn: Hall, (1938), Thomas và cộng sự., (1958); Ting, (1958)) Tuy nhiên, chỉ có các quy trình dựa trên vi sinh tạo ra naringinases là khả thi, và

loài nấm mốc Aspergillus Niger được ứng dụng rộng rãi Naringinase là một trong sản

phẩm chính yếu của nấm loài Aspergillus và Penicillium (Nguồn: Ono et al, (1978)).

Naringin α-L-rhamnosidase Prunin + Rhamnose jjkRtRhanrarhamnose

Prunin β-D-glucosidase Naringenin + Glucose

1.3 Hoạt động chuyển hóa của naringinase

Naringinase là một enzyme gồm sự kết hợp của hai thành phần là rhamnosidase (EC 3.2.1.40) và β-D-glucosidase (EC 3.2.1.21) Naringinase phân cắtnaringin thành naringenin qua hai công đoạn sau:

α-L-Hình 2.6 Sơ đồ thủy phân naringin thành prunin, rhamnose, naringenin và glucose bởi naringinase gồm hai enzyme là α-L-rhamnosidase và β-D-glucosidase

Bước thủy phân đầu tiên là quan trọng hơn vì nó làm giảm đáng kể vị đắng củanước bưởi Prunin cơ bản là ít đắng hơn naringin (Ashok Pandey, (2004) Naringenin là

một thành phần không đắng trong nước bưởi (Nguồn: Munshi et al, (1996)).

1.4 Đặc Tính

Enzyme naringinase bị ức chế cạnh tranh bởi rượu và glucose, nồng độ ion không ảnhhưởng đến hoạt động của enzyme Nồng độ cồn 12 % (v/v) làm giảm 20 % hoạt tính củaenzyme này Hoạt tính thủy phân của naringinase giảm 15 % khi có sự hiện diện của 21

% (w/v) glucose Tuy nhiên, tốc độ thủy phân của enzyme này không bị ảnh hưởng khi có

SO2 ở nồng độ 50 ppm (Gallego và ctv, 2001)

Theo Thomas và cộng sự (1958) việc làm giảm chất đắng đã thành công khi chuyểnnaringin thành rhamnose và pruning, những chất này tương đối không đắng và quá trìnhthủy phân tạo naringenin là không cần thiết.Nghiên cứu của Ladaniya (2008) còn chothấy các yếu tố nhiệt độ, pH, nồng độ enzyme và thời gian thuỷ phân cũng có ảnh hưởngđến hiệu quả thủy phân naringin Khả năng thủy phân của naringinase tăng khi tăng nhiệt

độ Tuy nhiên, mối quan hệ này không tuyến tính Ở nồng độ enzyme thấp, khả năng thủyphân tỷ lệ với thời gian thuỷ phân Tuy nhiên, ở nồng độ enzyme cao hơn thì khả năngthủy phân ít phụ thuộc vào thời gian

Theo Walson (2001), nhiệt độ tốt nhất cho quá trình thủy phân là 600C, enzyme hoạt độngtối đa ở pH 4, nhưng hoạt động của enzyme không có sự khác biệt ở pH 3,5 đến 4,5 Kếtquả nghiên cứu của Ting cho thấy, nồng độ enzyme thấp thì hiệu quả thủy phân tỷ lệthuận với thời gian, trong khi nồng độ enzyme cao hơn thì tỷ lệ thủy phân giảm theo thờigian phản ứng Nguyên nhân có thể là do sự có mặt của những enzyme khác và nhữngchất ức chế như glucose và ảnh hưởng của sản phẩm cuối

Ngoài ra, áp suất cũng có tác động đến hoạt tính thủy phân naringin của enzymenaringinase Vấn đề này được Helder và ctv nghiên cứu vào năm 2006 Kết quả cho thấy,

ở cùng một nhiệt độ (303 K), hoạt động của enzyme cao hơn ở áp suất 160 MPa (Vmax =2,7 mM/phút) so với áp suất khí quyển (Vmax = 0,06 mM/phút)

Hình 2.7 pH và nhiệt độ tối ưu cho mức độ hoạt động của enzyme Naringinase

2.2.1 Phân Lập Chủng Nấm Mốc

Với mục tiêu nghiên cứu vi sinh vật thuộc giống Aspergillus có khả năng sinh tổng

hợp enzyme naringinase, nên đã dùng chất cảm ứng với thành phần g/l gồm: NaNO3 2.0,KH2PO4 1.0, KCl 0.5, MgSO4.7H2O 0.5, FeCl3 0.1,naringin chiết từ vỏ lụa (mg%)98.26, peptone 5.0 lên vỏ bưởi (ở vườn chỉ trồng duy nhất bưởi năm roi) Nấm mốc thuthập được nuôi cấy trên môi trường PDA Sau đó quan sát khuẩn lạc phát triển trên môi

trường nuôi cấy, tách ròng loài nấm mốc nghi ngờ là Aspergillus bằng phương pháp cấy

chuyền liên tục Cuối cùng, thực hiện tiêu bản nấm mốc quan sát dưới kính hiển vi

Sau quá trình tiến hành thí nghiệm quan sát thấy trên vỏ bưởi xuất hiện một số loàinấm mốc (được phân biệt chủ yếu dựa trên màu sắc và chỉ xác định được ở mức độ loài)như sau:

Sau quá trình phân lập và định danh bằng phương pháp dùng kính hiển vi quan sát

đã xác định được ba loài Aspergillus sau:

- Aspergillus niger.

- Aspergillus flavus.

- Aspergillus oryzae.

Kết quả của quá trình thí nghiệm thu thập và phân lập các giống nấm mốc

Aspergillus cho 5 ống nghiệm Aspergillus niger (VL01), 2 ống nghiệng Aspergillus flavus (VL02), 3 ống nghiệm Aspergillus oryzae (VL03).

 Nấm mốc Aspergillus niger

Sau khi tiến hành thực hiện tiêu bản nấm mốc và quan sát dưới kính hiển vi, ta có

những kết quả sau về nấm mốc Aspergillus niger: Đại thể: Khuẩn lạc có đường kính 4,5 –

5,8 cm trên thạch PDA sau 5 ngày, màu đen hoặc nâu đen lấm tấm như bã cafe

- Sắc tố ra môi trường: không.

Vi thể:

- Bông hình cầu có màu đen Bọng hình cầu Thể bình 1 hoặc 2 tầng, ở đa số loài thể bình

2 tầng Vách cuống conidia trơn Hạt đính hình cầu đến gần cầu, có gai rõ

- Dạng khuẩn lạc: Dạng bột rời lấm tấm, tâm khuẩn lạc lồi, rìa là lớp tơ trắng

- Giọt tiết: không

- Màu sắc:

Mặt phải: khuẩn lạc có màu đen như than

Mặt trái: không màu

Sau thời gian phân lập nhận thấy nấm mốc Aspergillus niger có thể thích nghi và

phát triển tốt trên môi trường PDA có chất cảm ứng naringin từ vỏ lụa bưởi Điều đó cho

thấy Aspergillus niger có khả năng sinh tổng hợp enzyme Naringinase

 Nấm mốc Aspergillus oryzae

Đại thể:

- Khuẩn lạc có đường kính 5-6 cm, màu vàng lục

- Sắc tố ra môi trường: không

Vi thể:

- Dạng khuẩn lạc: Dạng bột rời lấm tấm, khuẩn lạc tâm lồi, rìa thấp dần, ngoài là lớp tơ trắng

- Giọt tiết: không

- Màu sắc:

Mặt phải: khuẩn lạc ban đầu có màu vàng lục sau chuyển sang màu lục

Mặt trái: không màu

Kết quả thí nghiệm cho thấy, nấm mốc Aspergillus oryzae có khả năng sinh trưởng

và phát triển trên môi trường PDA có bổ sung thêm cơ chất naringin nên có thể dự đoán

được nấm mốc Aspergillus oryzae có khả năng sinh tổng hợp enzyme Naringinase.

 Nấm mốc Aspergillus flavus

Đại thể:

- Khuẩn lạc có đường kính 5-5,5 cm, màu xanh lục

- Sắc tố ra môi trường: không

Vi thể:

- Dạng khuẩn lạc: dạng bột rời

- Giọt tiết: có giọt tiết màu trắng đục hoặc màu đen

- Màu sắc:

Mặt phải: Ban đầu khuẩn lạc có màu vàng sau chuyển sang màu xanh lục

Mặt trái: Không màu

Qua thí nghiệm ta thấy Aspergillus flavus thích nghi được với môi trường PDA có bổ sung thêm cơ chất naringin, điều đó cho ta thấy Aspergillus flavus có khả năng sinh tổng

hợp enzyme naringnase

Như vậy: Chất cảm ứng naringin chiết từ vỏ lụa bưởi được bổ sung vào thành

phần của chất bẫy đã giúp loại trừ được một số nấm mốc Aspergillus không hoặc ít có

khả năng sinh tổng hợp naringinase Đồng thời, cơ chất naringin cũng được bổ sung vàothành phần nuôi cấy chuyền nấm mốc PDA, nhằm chứng minh những nấm mốc

Aspergillus thích nghi và phát triển tốt trên môi trường sẽ có khả năng sinh tổng hợp

enzyme naringinase

Thí nghiệm trên đã phân lập, tuyển chọn được ba giống: Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus flavus Bên cạnh đó, ta thấy nấm mốc Aspergillus niger phát triển tốt và mạnh hơn so với Aspergillus oryzae, Aspergillus flavus trên môi trường nuôi cấy Điều đó cho thấy, Aspergillus niger có thể sẽ sinh tổng hợp naringinase nhiều

nhất

2.2.2 Môi Trường Nuôi Cấy Ezyme

Quá trình tạo enzyme naringinase của nấm mốc Aspergillus phụ thuộc vào nhiều

yếu tố, mỗi yếu tố có những ảnh hưởng riêng đối với lượng cũng như hoạt tính của

enzyme tạo thành Các yếu tố gồm: thời gian nuôi cấy, thành phần môi trường, pH, nhiệt

độ nuôi cấy,… Hoạt tính xúc tác của enzyme naringinase cũng chịu ảnh hưởng của nồng

độ cơ chất mà nó phản ứng

Thí nghiệm được tiến hành bằng cách nuôi cấy nấm mốc Aspergillus trên các môi

trường có thành phần khác nhau, thu nhận môi trường sau nuôi cấy ở những khoảng thời gian khác nhau và đo hoạt tính enzyme naringinase thu được

B1 thành phần g/l gồm: NaNO3 2.0, KH2PO4 1.0, KCl 0.5, MgSO4.7H2O 0.5, FeCl3

0.1, naringin chiết từ vỏ lụa (mg%) 98.26, peptone 5.0, glucose 0.0

B2 thành phần g/l gồm: NaNO3 2.0, KH2PO4 1.0, KCl 0.5, MgSO4.7H2O 0.5, FeCl3

0.1, naringin chiết từ vỏ lụa (mg%) 73.69, peptone 5.0, glucose 2.5

B3 thành phần g/l gồm: NaNO3 2.0, KH2PO4 1.0, KCl 0.5, MgSO4.7H2O 0.5, FeCl3

0.1, naringin chiết từ vỏ lụa (mg%) 49.13, peptone 5.0, glucose 5.0

B4 thành phần g/l gồm: NaNO3 2.0, KH2PO4 1.0, KCl 0.5, MgSO4.7H2O 0.5, FeCl3

0.1, naringin chiết từ vỏ lụa (mg%) 24.57, peptone 5.0, glucose 7.5

B5 thành phần g/l gồm: NaNO3 2.0, KH2PO4 1.0, KCl 0.5, MgSO4.7H2O 0.5, FeCl3

0.1, naringin chiết từ vỏ lụa (mg%) 0.0, peptone 5.0, glucose 10.0

 Kết quả thí nghiệm như sau:

Đối với Aspergillus niger:

Sau khi tiến hành thí nghiệm ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi và thời gian

nuôi cấy đến hoạt tính của naringinase do nấm mốc Aspergillus niger ở ống nghiệm

VL01 sinh tổng hợp được thể hiện ở bảng 5 Trong thí nghiệm lượng naringin ban đầu là 100mg% Cho thấy năm kiểu môi trường B1, B2, B3, B4, B5, trong đó ba môi trường B2,B3, B4 thu được enzyme có hoạt tính trung bình khác biệt có ý nghĩa trong thống kê ở mức ý nghĩa 5% Còn kiểu môi trường B1, B5 thì enzyme thu được không có sự khác biệt

ý nghĩa trong thống kê ở mức ý nghĩa 5% Trên môi trường B3 hoạt tính enzyme thu được là cao nhất Bên cạnh đó, ta thấy trên môi trường nuôi cấy B1, B2, B3, B4, B5 hoạt tính tăng dần khi thời gian nuôi cấy từ ngày nuôi thứ hai đến ngày thứ ba và sau đó giảm dần đến khi nuôi đến sáu ngày Hoạt tính trung bình thu được ở ngày ba là cao nhất (1.87 UI) Như vậy, ngày ba là thời điểm nấm mốc sinh tổng hợp enzyme có hoạt tính mạnh nhất trên môi trường nuôi cấy B3 Hoạt tính enzyme naringinase thu được cao nhất ở môitrường B3 với thời gian nuôi cấy ba ngày (1.87 UI) Trong đó, môi trường B2 nuôi cấy ở

ba ngày có hoạt tính thấp nhất (0.77 UI) Như vậy, trong năm kiểu môi trường khảo sát thì môi trường B3 là môi trường nấm mốc phát triển và sinh tổng hợp enzyme có hoạt tính mạnh nhất

Đối với nấm mốc Aspergillus flavus:

Kết quả thí nghiệm ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi và thời gian nuôi

cấy đến hoạt tính của naringinase do nấm mốc Aspergillus flavus ở ống nghiệm VL03

sinh tổng hợp được thể hiện ở bảng 6 và Ở bảng 6 cho thấy năm kiểu môi trường B1, B2, B3, B4, B5, trong đó môi trường B1, B5, B3, B4 thu được enzyme có hoạt tính trung bình khác biệt có ý nghĩa trong thống kê ở mức ý nghĩa 5% Còn kiểu môi trường B4 thì enzyme thu được không có sự khác biệt ý nghĩa trong thống kê ở mức ý nghĩa 5% Trên môi trường B3 hoạt tính enzyme thu được là cao nhất Bên cạnh đó, nếu quan sát ở hình

19 trên môi trường nuôi cấy B1, B2, B3, B4, B5 hoạt tính tăng dần khi thời gian nuôi cấy

từ ngày nuôi thứ hai đến ngày thứ ba và sau đó giảm dần đến khi nuôi đến sáu ngày Hoạttính trung bình thu được ở ngày ba là cao nhất (1.44 UI) Như vậy, ngày ba là thời điểm nấm mốc sinh tổng hợp enzyme có hoạt tính mạnh nhất trên môi trường nuôi cấy B3 Hoạt tính enzyme naringinase thu được cao nhất ở môi trường B3 với thời gian nuôi cấy

ba ngày (1.44 UI) Trong đó, môi trường B5 nuôi cấy ở ba ngày có hoạt tính thấp nhất

(0.55 UI), khác với Aspergillus niger hoạt tính enzyme thấp nhất ở môi trường B2 Như

vậy, trong năm kiểu môi trường khảo sát thì môi trường B3 là môi trường nấm mốc phát triển và sinh tổng hợp enzyme có hoạt tính mạnh nhất

Đối với nấm mốc Aspergillus oryzae:

Kết quả thí nghiệm ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi và thời gian nuôi

cấy đến hoạt tính của naringinase do nấm mốc Aspergillus oryzae ở ống nghiệm VL02

sinh tổng hợp được thể hiện ở bảng 7 và Ở bảng 7 cho thấy năm kiểu môi trường B1, B2,

B3, B4, B5, thu được enzyme có hoạt tính trung bình khác biệt có ý nghĩa trong thống kê

ở mức ý nghĩa 5% Trên môi trường B3 hoạt tính enzyme thu được là cao nhất Bên cạnh

đó, nếu quan sát ở hình 20 trên môi trường nuôi cấy B1, B2, B3, B4, B5 hoạt tính tăng dần khi thời gian nuôi cấy từ ngày nuôi thứ hai đến ngày thứ ba và sau đó giảm dần đến khi nuôi đến năm ngày Hoạt tính trung bình thu được ở ngày ba là cao nhất (1.68 UI) Như vậy, ngày ba là thời điểm nấm mốc sinh tổng hợp enzyme có hoạt tính mạnh nhất trên môi trường nuôi cấy B3

Hoạt tính enzyme naringinase thu được do nấm mốc Aspergillus oryzae sinh tổng

hợp cao nhất ở môi trường B3 với thời gian nuôi cấy ba ngày (1.68 UI) Trong đó, môi

trường B1 nuôi cấy ở ba ngày có hoạt tính thấp nhất (0.79 UI), khác với Aspergillus niger (môi trường B2), Aspergillus flavus (môi trường B1) Như vậy, trong năm kiểu môi

trường khảo sát thì môi trường B3 là môi trường nấm mốc phát triển và sinh tổng hợp enzyme có hoạt tính mạnh nhất

Qua kết quả thí nghiệm trên ta thấy Aspergillus niger có khả năng sinh tổng hợp enzyme naringinase hoạt tính cao hơn Aspergillus oryzae, Aspergillus flavus Và môi

trường B3 và thời gian nuôi ba ngày là điều kiện tốt để naringinase được sinh tổng hợp cóhoạt tính cao nhất