Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quy trình sản xuất enzyme penicilin g acylase cố định

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỞNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TRẦN NGỌC THỦY THƯƠNG KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG TRONG QUY TRÌNH SẢN XUẤT ENZYME PENICILLIN G ACYLASE CỐ ĐỊNH CHUYÊ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỞNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

TRẦN NGỌC THỦY THƯƠNG

KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG TRONG QUY TRÌNH SẢN XUẤT ENZYME PENICILLIN G ACYLASE CỐ ĐỊNH

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MÃ SỐ: 60 42 80

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, 03/2011

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỞNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

TRẦN NGỌC THỦY THƯƠNG

KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG TRONG QUY TRÌNH SẢN XUẤT ENZYME PENICILLIN G ACYLASE CỐ ĐỊNH

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MÃ SỐ: 60 42 80

LUẬN VĂN THẠC SĨ

GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN: PGS TS NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG

TP HỒ CHÍ MINH, 03/2011

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH

Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Đức Lượng

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHIÃ VIỆT NAM KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc - -oOo -

Tp HCM, ngày 04 tháng 03 năm 2011

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ và tên học viên: TRẦN NGỌC THỦY THƯƠNG Phái: Nữ

Ngày tháng năm sinh: 21 – 04 – 1982 Nơi sinh: Bình Thuận

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

MSHV: 09310584

1- TÊN ĐỀ TÀI: Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng trong quy trình sản xuất enzyme penicillin G acylase cố định

2- NHIỆM VỤ LUẬN VĂN:

- Khảo sát quy trình lên men Alcaligenes faecalis.

- Khảo sát quy trình thu nhận enzyme nội bào penicillin G acylase.

- Khảo sát quy trình cố định enzyme trên chất mang

- Khảo sát hoạt tính enzyme cố định và khả năng tái sử dụng

3- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 07 – 2010

4- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 12 – 2010

5- HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS.TS NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG

Nội dung và đề cương Luận văn thạc sĩ đã được Hội Đồng Chuyên Ngành thông qua

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN KHOA QL CHUYÊN NGÀNH

(Họ tên và chữ ký) QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH (Họ tên và chữ ký)

(Họ tên và chữ ký)

ii

TÓM TẮT LUẬN VĂN

- Đề tài luận văn: “Khảo sát một số yếu tố trong quy trình sản xuất enzyme

penicillin G acylase cố định ”

- Học viên thực hiện: Trần Ngọc Thủy Thương

- Cán bộ hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Đức Lượng

- Thời gian thực hiện: Từ tháng 7/2010 đến tháng 12/2010

Nội dung đề tài:

- Khảo sát quy trình lên men Alcaligenes faecalis.

- Khảo sát quy trình thu nhận enzyme nội bào penicillin G acylase.

- Khảo sát quy trình cố định enzyme trên chất mang

- Khảo sát hoạt tính enzyme cố định và khả năng tái sử dụng

Kết quả đề tài:

Enzyme Penicillin G Acylase là enzyme nội bào được tạo ra từ chủng Alcaligenes faecalis, khi tham gia vào phản ứng thủy phân Penicillin G tạo ra sản phẩm 6-aminopenicillic acid (6-APA), sản phẩm này được dùng để tạo ra hợp chất kháng sinh Ampicillin và Amoxyllin Đối với chủng Alcaligenes faecalis, với điều kiện nuôi cấy khi thể tích 400 ml, 140 rpm ở nhiệt độ thường, sau thời gian 100 giờ thu nhận sinh khối tế bào Sau đó, tiến hành phá vỡ tế bào bằng sóng siêu âm trong điều kiện thể tích mẫu phá

vỡ tế bào là 100 ml, thời gian phá vỡ 20 phút, nhiệt độ 5oC, thời gian làm việc của chế độ xung là 10 s mở: 1s tắt và biên độ sóng là 30% Sau khi phá vỡ tế bào, tiến hành tủa phân đoạn bằng muối trung tính Ammonium Sulfate với mức độ tủa phân đoạn là 0 – 30% cho hàm lượng tổng protein là 1 610.685 mg, tổng đơn vị hoạt độ là 2 333.300 IU Khi cố định enzyme Penicillin G Acylase trên chitosan có sự hoạt hóa bởi glutaraldehyde 5% thì hiệu suất cố định 82% Enzyme cố định này có khả năng tái sử dụng ít nhất 6 lần Với kết quả trên cho thấy, việc sử dụng enzyme penicillin G acylase cố định đem lại hiệu quả trong sản xuất 6-APA về mặt công nghệ lẫn kinh tế

MỤC LỤC

Lời cảm ơn i

Tóm tắt luận văn ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii

DANH MỤC CÁC BẢNG viii

DANH MỤC CÁC HÌNH ix

PHẦN MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 ĐẶC ĐIỂM CHỦNG ALCALIGENES FAECALIS 4

1.2 ĐẶC ĐIỂM ENZYME PENICILLIN G ACYLASE TỪ ALCALIGENES FAECALIS 5

1.3 KỸ THUẬT THU NHẬN ENZYME TỪ VI SINH VẬT 7

1.3.1 Nguyên lý sinh tổng hợp enzyme từ vi sinh vật 7

1.3.2 Nguyên lý trao đổi chất của vi sinh vật trong sinh tổng hợp enzyme 7

1.3.3 Nguyên lý điều khiển quá trình kỹ thuật sản xuất enzyme từ vi sinh vật 8

1.3.4 Một số kỹ thuật chung trong nuôi cấy vi sinh vật thu nhận enzyme 8

1.3.4.1 Kỹ thuật tạo giống vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme năng suất cao 8

1.3.4.2 Lựa chọn phương pháp nuôi cấy 9

iii

1.3.4.3 Thiết kế thiết bị nuôi cấy 9

1.3.4.4 Kỹ thuật lên men 10

1.3.4.5 Tách, tinh chế thu nhận enzyme 10

1.4 KỸ THUẬT CỐ ĐỊNH ENZYME 10

1.4.1 Định nghĩa enzyme cố định 10

1.4.2 Ý nghĩa của enzyme cố định 11

1.4.3 Kỹ thuật cố định enzyme 11

1.4.3.1 Yêu cầu của một chất mang lý tưởng 11

1.4.3.2 Hoạt hóa chất mang 11

1.4.3.3 Phương pháp cố định enzyme được sử dụng 12

1.4.3.4 Ứng dụng của enzyme cố định 12

1.5 ĐẶC ĐIỂM CHẤT MANG GLUTARALDEHYDE – CHITOSAN 12

1.5.1 Chitosan 13

1.5.2 Glutaraldehyde – chitosan 14

1.5.3 Glutaraldehyde – chitosan – enzyme 15

1.6 CÁC NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT CỐ ĐỊNH ENZYME PENICILLIN G ACYLASE TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 16

1.6.1 Nghiên cứu trong nước 16

1.6.2 Nghiên cứu ngoài nước 16

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 VI SINH VẬT 19

2.2 THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT 19

2.3 ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN LUẬN VĂN 19

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.4.1 Khảo sát đặc điểm giống 20

2.4.2 Phương pháp lên men 22

2.4.3 Phương pháp tách chiết enzyme 24

iv

2.4.4 Phương pháp định lượng protein tổng

bằng phương pháp Bradford 25 2.4.5 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme penicillin G acylase 26

2.4.5.1 Phương pháp định lượng phenylacetic acid bằng NaOH

0.1M 27 2.4.5.2 Phương pháp định tính 6-aminopenicillic acid (6-APA)

bằng p-Dimethylamino Benzaldehyde (pDAB) 28

2.4.6 Phương pháp tinh sạch enzyme bằng phương pháp tủa phân đoạn

sử dụng muối ammonium sulfate 29 2.4.7 Phương pháp cố định enzyme trên hạt Chitosan 31 2.4.8 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme cố định và hiệu suất cố định 32 2.4.9 Phương pháp xác định khả năng tái sử dụng enzyme cố định 33

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 34 3.1 KHẢO SÁT SỰ SINH TRƯỞNG CHỦNG VI KHUẨN

ALCALIGENES FAECALIS 35

3.1.1 Các điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng trên sự sinh trưởng vi khuẩn 36 3.1.1.1 Nhiệt độ 37 3.1.1.2 Chế độ lắc 37

3.1.2 Quá trình sinh trưởng và phát triển của chủng A faecalis 38

3.2 XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN TƯƠNG QUAN GIỮA OD VÀ

HÀM LƯỢNG ALBUMIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP BRADFORD 39 3.3 KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH PHÁ VỠ TẾ BÀO ALCALIGENES

FAECALIS 40

3.4 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ENZYME 42

3.4.1 Khảo sát hàm lượng cơ chất Penicillin G Potassium ảnh hưởng lên hoạt tính enzyme 42

v

vi

3.4.2 Khảo sát thời gian phản ứng thủy phân 44

3.5 KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH TỦA PHÂN ĐOẠN BẰNG MUỐI AMMONIUM SULFATE 45

3.5.1 Khảo sát hàm lượng protein thu được phần lắng sau ly tâm 45

3.5.2 Khảo sát hàm lượng protein thu được theo phương pháp Bradford 47

3.5.3 Khảo sát hoạt tính enzyme ở các mức tủa khác nhau 47

3.6 CỐ ĐỊNH ENZYME 49

3.6.1 Khảo sát hàm lượng chitosan tạo hạt và hoạt hóa bởi glutaraldehyde 49

3.6.2 Khảo sát hiệu suất cố định enzyme 50

3.7 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TÁI SỬ DỤNG 51

3.8 KHẢO SÁT PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH ENZYME BẰNG PHƯƠNG PHÁP SO MÀU 53

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 57

PHỤ LỤC 60

vii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

A faecalis Alcaligenes faecalis

A faecalis PGA Penicillin G Acylase từ Alcaligenes faecalis

pDAB Para-dimethylaminobenzadehyde

w/v Khối lượng/thể tích

viii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Bố trí thí nghiệm khảo sát các chế độ của hệ thống thiết bị 25

Bảng 2.2: Bố trí thí nghiệm trong tủa phân đoạn bằng muồi ammonium sulfate 30

Bảng 3.1: Tương quan giữa thời gian và OD660 ở các điều kiện lên men 36

Bảng 3.2: Hiệu suất phá vỡ tế bào bằng sóng siêu âm 40

Bảng 3.3: Số liệu hàm lượng PAA tạo ra theo hàm lượng cơ chất 43

Bảng 3.4: Hàm lượng tủa thu được và tỷ lệ % lượng tủa trong mẫu 46

Bảng 3.5: Hàm lượng protein thu được ở các mức tủa phân đoạn 47

Bảng 3.6: Số liệu xác định hoạt tính enzyme PGA 48

Bảng 3.7: So sánh đặc tính các hạt gel tương ứng với thể tích acetic acid 49

Bảng 3.8: Hiệu suất cố định tế bào 51

Bảng 3.9: Số liệu khả năng tái sử dung của enzyme cố định trên Glutaraldehyde – chitosan 52

ix

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Hình thái Alcaligenes faecalis 4

Hình 1.2: Khuẩn lạc trên môi trường thạch 4

Hình 1.3: Cấu trúc không gian Penicillin G Acylase 5

Hình 1.4: Cơ chế xúc tác của enzyme trong mô hình không gian 6

Hình 1.5: Cơ chế xúc tác của enzyme 6

Hình 1.6 : Công thức cấu tạo hóa học của chitosan 13

Hình 1.7 : Mô hình liên kết giữa chitosan và glutaraldehyde 14

Hinh 1.8: Mô hình liên kết chitosan – glutaraldehyde và enzyme 15

Hình 2.1: Quy trình nghiên cứu sản xuất enzyme cố định 20

Hình 2.2: Quy trình tách chiết và tinh sạch enzyme 24

Hình 2.3: Phương trình phản ứng hóa học thủy phân 26

Hình 2.4: Phản ứng hóa học giữa pDAB với hợp chất amide 28

Hình 2.5: Sơ đồ quy trình cố định enzyme 31

Hình 3.1: Đồ thị tương quan giữa các thí nghiệm lên men 36

Hình 3.2: Đường cong sinh trưởng chủng Alcaligenes faecalis 38

Hình 3.3: Tương qua giữa nồng độ Albumin và OD595 39

Hình 3.4: Tương quan giữa hàm lượng cơ chất và sản phẩm tạo ra 43

Hình 3.5: Hàm lượng sản phẩm được tạo ra theo thời gian thủy phân PGK của enzyme 44

Hình 3.6: Đồ thị tỷ lệ hàm lượng protein tủa bão hòa theo các mức độ

(NH4)2SO4 46

x Hình 3 7: Khả năng thủy phân của enzyme tái sử dụng 52 Hình 3 8: Màu của hợp chất Shiff’s Base 53

PHẦN MỞ ĐẦU

ĐẶT VẤN ĐỀ

Enzyme Penicillin G Acylase được ứng dụng trong công nghệ sản xuất các hợp chất kháng sinh như amoxycillin và ampicillin bằng cách thủy phân penicillin G tạo ra hợp chất 6-aminopenicillin acid (6-APA) 6-APA được tách ra và tinh chế bằng sắc

ký trao đổi ion, sấy phun sương hoặc kết tủa ở điểm đẳng điện (pH 4.3) Hợp chất 6-APA không có hoạt tính kháng sinh đối với tụ cầu và cũng bị penincillinase phá hủy (do enzyme acylase thể hiện đồng thời cả hai hoạt tính synthetase và hydrolase, tùy theo điều kiện phản ứng)

6-APA cũng được sản xuất theo phương pháp hóa học có hiệu suất chuyển hóa cao (90 – 95%) và tốc độ phản ứng nhanh Tuy nhiên, lại tiêu hao năng lượng và dung môi có nguy cơ gây ô nhiễm môi trường, điều kiện phản ứng rất khó và kiểm soát chặc chẽ

Penicillin G bị thủy phân rất chậm (thấp hơn khoảng 100 lần so với các loại Penicillin V, K và F) Penicillinamidase nội bào hoạt động mạnh ở pH 7.3 – 8.5, còn enzyme ngoại bào hoạt động mạnh ở pH 9.0 Enzyme cố định có ưu điểm được

sử dụng lại nhiều lần và dịch Penicillin G chưa bị deacetyl hóa có thể sử dụng lại Trong nước, Thủ tướng Chính phủ đã phê duyệt quy hoạch phát triển ngành công nghiệp hóa dược đến năm 2015, tầm nhìn đến năm 2025: Giai đoạn từ năm 2016 đến năm 2025, sử dụng sản phẩm của Nhà máy sản xuất penicillin G để sản xuất các nguyên liệu trung gian 6-APA, 7-ADCA từ trong nước cung cấp cho các nhà máy sản xuất kháng sinh đã xây dựng trong giai đoạn trước đó [26]

Danh mục các dự án sản xuất hóa dược dự kiến đầu tư giai đoạn 2016 – 2025 (Quyết định số 81/2009/QĐ-TTg ngày 21 tháng 5 năm 2009 của Thủ tướng Chính phủ): Nhà máy sản xuất kháng sinh (giai đoạn II): sản xuất penicillin G, công suất

1

2

1.000 (tấn/năm), vốn đầu tư 80 (triệu USD), địa điểm tại Miền Bắc, thời điểm đầu

tư từ năm 2016 đến năm 2020 [23]

Tình hình nhập khẩu trong nước: nguyên liệu dược phẩm nhập khẩu trong tuần cuối tháng 5/2009, đối với Benzyl Penicillin Sodium Sterile đã nhập 210 kg, từ Trung Quốc Theo ông Nguyễn Đức Sơn, Tổng giám đốc Tổng công ty Dược Việt Nam cho biết trong năm qua giá của nhiều mặt hàng thuốc, đặc biệt là thuốc kháng sinh tăng cao, Penicillin tăng 50% [34]

Đồng thời, phương pháp enzyme cố định để sản xuất 6-APA cho hiệu suất tương đối cao (90 – 95%)

Chính vì vậy, chế phẩm ezyme penicillin G acylase cần được xem xét đến để có thể thực hiện trên quy mô công nghiệp Nhằm giải quyết vấn đề này, tôi tiến hành thực

hiện đề tài “Khảo sát một số yếu tố trong quy trình sản xuất enzyme penicillin

G acylase cố định”

MỤC TIÊU

Khảo sát tổng quát quy sản xuất enzyme Penicillin G Acylase và cố định trên chất mang chitosan tạo tiền đề cho việc ứng dụng vào sản xuất tiền chất tạo kháng sinh

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

• Khảo sát quy trình lên men Alcaligenes faecalis thu sinh khối

• Khảo sát quy trình thu nhận enzyme nội bào penicillin G acylase

• Khảo sát quy trình cố định enzyme trên chất mang

• Khảo sát hoạt tính enzyme được cố định và khả năng tái sử dụng

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

3

1.1 ĐẶC ĐIỂM CHỦNG ALCALIGENES FAECALIS [10, 24]

Khóa phân loại

Đặc điểm hình thái: Alcaligenes

faecalis là nhóm Gram âm (-), hình que, di động

Hình 1.1: Hình thái Alcaligenes faecalis

Đặc điểm khuẩn lạc: Nhỏ, lồi,

không sắc tố, bóng, không gây thay

đổi màu đỏ của máu trong môi

trường Blood Agar Nhiệt độ sinh

trưởng và phát triển trong điều kiện ở

30 – 37oC và hiếu khí bắt buộc

Đặc điểm sinh hóa: có enzyme

oxidase và catalase Tuy nhiên, đối

với chủng vi khuẩn không chuyển

hóa được các loại đường, nó chỉ sử

dụng cacbon trong các acid amin Tốc

độ tăng trưởng của A faecalis tối ưu

ở 37°C A faecalis được tìm thấy

trong đất, nước và môi trường xung quanh con người A faecalis thường được ứng

dụng nhiều trong tạo các acid amin không thay thế

Hình 1.2: Khuẩn lạc trên môi trường thạch

4

1.2 ĐẶC ĐIỂM ENZYME PENICILLIN G ACYLASE TỪ ALCALIGENES FAECALIS [31]

Tên gọi khác: penicillin acylase; benzylpenicillin acylase; novozym 217; semacylase; α-acylamino-β-lactam acylhydrolase; ampicillin acylase; penicillin amidohydrolase

Mã số phân loại: E.C 3.5.1.11

Mã số trên cơ sở dữ liệu ở website http:///www.ebi.ac.uk là 3K3W

Vị trí tạo enzyme: Khoảng giữa 2 lớp màng tế bào

Cấu trúc bậc không gian của Penicilin G Acylase:

Cấu trúc: Hướng thẳng Hướng trái Hướng dưới

Hình 1.3: Cấu trúc không gian Penicillin G Acylase

Tâm xúc tác: Gồm 3 amino acid tham gia: serβ1, Asnβ241 và Alaβ69

Hoạt tính enzyme không bị ảnh hưởng khi ủ ở nhiệt độ 50oC trong 20 phút Enzyme

Penicillin G Acylase của chủng Alcaligenes faecalis thể hiện sự bền nhiệt do có cầu

nối disulfide của cystein vị trí 492 và 525 của của tiểu đơn vị β Khối lượng phân tử tiểu đơn vị α là 23.9 kDa và của tiểu đơn vị β là 62.7 kDa

Cơ chế thủy phân của enzyme penicillin G acylase

Phản ứng hóa học: penicillin + H2O = carboxylate + 6-aminopenicillanate

5

Hình 1.5: Cơ chế xúc tác của enzyme Hình 1.4: Cơ chế xúc tác của enzyme trong mô hình không gian

6

Theo hình 1.6 và 1.7, cơ chế xúc tác của enzyme penicillin acylase trong thủy phân

cơ chất penicillin G potassium có sự tham gia của 3 amino acid ở serβ1, Asnβ241

và Alaβ69 Liên kết amide bị phá vỡ, sản phẩm đầu tiên được tạo ra là hợp chất APA và giải phóng ra khỏi enzym Sau đó, phần còn lại có vòng benzyl, sự liên kết giữa cacbonyl với phân tử nước tạo ra sản phẩm PAA

6-1.3 KỸ THUẬT THUẬT THU NHẬN ENZYME TỪ VI SINH VẬT [3] 1.3.1 Nguyên lý sinh tổng hợp enzyme từ vi sinh vật

Mỗi một enzyme được tổng hợp sự điều khiển bởi một gen Mỗi enzyme lại tham gia một phản ứng sinh học và cuối cùng tạo ra sản phẩm

Sinh tổng hợp enzyme ở vi sinh vật còn bị điều khiển bởi chất cảm ứng

1.3.2 Nguyên lý trao đổi chất của vi sinh vật trong sinh tổng hợp enzyme

Quá trình trao đổi chất ở vi sinh vật với môi trường bên ngoài theo hai quá trình: quá trình đồng hóa và quá trình dị hóa Quá trình đồng hóa chỉ xảy ra bên trong tế bào Quá trình dị hóa xảy ra cả bên trong và bên ngoài tế bào

Để thực hiện hai quá trình này, vi sinh vật phải tổng hợp ra các enzyme tương ứng Các enzyme đồng hóa được tổng hợp trong tế bào và thực hiện các hoạt động đồng hóa bên xảy ra trong tế bào Các enzyme dị hóa được tổng hợp trong tế bào có thể thực hiện cả các hoạt động dị hóa trong tế bào (enzyme nội bào) và các hoạt động dị hóa ngoài tế bào (enzyme ngoại bào)

7

1.3.3 Nguyên lý điều khiển quá trình kỹ thuật sản xuất enzyme từ vi sinh vật

Sơ đồ nguyên lý điều khiển quá trình kỹ thuật sản xuất enzyme được tóm tắt như sau:

1.3.4 Một số kỹ thuật chung trong nuôi cấy vi sinh vật thu nhận enzyme

Quy trình chung trong nuôi cấy vi sinh vật thu nhận enzyme:

• Kỹ thuật tạo giống

• Lựa chọn phương pháp nuôi cấy

• Thiết kế thiết bị nuôi cấy

• Kỹ thuật lên men

• Tách, tinh chế thu nhận enzyme

1.3.4.1 Kỹ thuật tạo giống vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme năng suất cao

o Phân lập giống: giống có thể được phân lập từ các nguồn từ tự nhiên, từ trong sản xuất, từ trong mẫu giống đã bị hư

8

o Nâng cao chất lượng giống: có hai kỹ thuật: huấn luyện thích nghi và thay đổi bộ máy di truyền

o Bảo quản giống: theo phương pháp cấy chuyền, bảo quản lạnh, bảo quản trong đất cát, bảo quản trong hạt ngủ cốc, bảo quản trong lớp dầu khoáng, bảo quản theo phương pháp đông khô, làm lạnh đông

1.3.4.2 Lựa chọn phương pháp nuôi cấy

Đến nay, có hai phương pháp nuôi cấy vi sinh vật thu nhận enzyme: phương pháp nuôi cấy bề mặt và phương pháp nuôi cấy chìm

o Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp tạo môi trường cho vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường Nguyên liệu nuôi cấy có thể ở dạng lỏng hoặc đặc (bán rắn)

o Phương pháp nuôi cấy chìm, vi sinh vật phát triển hẳn trong lòng môi trường nên nguyên liệu nuôi cấy thường ở dạng lỏng

1.3.4.3 Thiết kế thiết bị nuôi cấy

Đối với phương pháp nuôi cấy bề mặt, thiết bị thường được thiết kế theo các dạng sau:

o Thiết bị khay: Các khay được xếp theo tầng, bên dưới có các lỗ lưu thông khí

o Thiết bị hộp: Hộp có các lỗ xung quanh Các hộp được xếp đứng có khoảng cách

o Thiết bị thùng quay: Thùng quay có hệ thống thổi khí liên tục

Đối với phương pháp nuôi cấy chìm, hệ thống nuôi cấy gồm các thiết bị cơ bản sau:

hệ thống điều khiển cánh khuấy, hệ thống cung cấp khí oxy, hệ thống điều chỉnh pH

và hệ thống điều chỉnh nồng độ các chất dinh dưỡng

9

1.3.4.4 Kỹ thuật lên men

Trong quá trình nuôi cấy, đối với phương pháp nuôi cấy chìm có thể sử dụng phương pháp nuôi cấy theo chu kỳ hoặc nuôi cấy liên tục

1.3.4.5 Tách, tinh chế thu nhận enzyme

Kết thúc quá trình nuôi cấy, tiến hành tách enzyme ra khỏi tế bào và các thành phần khác Một số phương pháp cơ bản thường sử dụng để thu nhận enzyme là phá vỡ tế bào, chiết tách enzyme, cô đặc, tinh sạch enzyme…

o Phương pháp phá vỡ tế bào:

ƒ Phương pháp cơ học: phương pháp áp suất cao, phương pháp nghiền, và phương pháp siêu âm

ƒ Các phương pháp khác: phương pháp sấy, phương pháp phân giải

o Phương pháp chiết tách enzyme

ƒ Phương pháp ly tâm: là quá trình tách vật chất rắn ra khỏi dung dịch

ƒ Phương pháp lọc: là phương pháp tách thành phần rắn ra khỏi dung dịch khi đi qua vật liệu lọc

ƒ Phương pháp cô đặc: sử dụng phương pháp nhiệt, phương pháp kết tủa và phương phá siêu lọc

ƒ Phương pháp tinh sạch enzyme: sử dụng hương pháp kết tinh, phương pháp điện di và phương pháp sắc ký

1.4.2 Ý nghĩa của enzyme cố định

Một lượng enzyme có thể sử dụng lặp đi lặp lại nhiều lần trong một thời gian dài Enzyme không lẫn vào trong sản phẩm, do đó tránh được ảnh hưởng không tốt đến lượng sản phẩm

Dùng enzyme cố định có thể dừng nhanh chóng phản ứng khi cần thiết bằng cách tách nó ra khỏi cơ chất

1.4.3.2 Hoạt hóa chất mang

Nhằm năng cao hiệu suất cố định enzyme trên chất mang, người ta tiến hành hoạt hóa chất mang

Một số phương pháp hoạt hóa chất mang thường được ứng dụng

• Hoạt hóa chất mang bằng cyanogen halogenur

• Hoạt hóa chất mang bằng ethyl chloroformate

11

• Hoạt hóa chất mang bằng phương pháp azide

• Hoạt hóa chất mang bằng glutaraldehyde

• Hoạt hóa chất mang bằng phản ứng diazo

• Hoạt hóa chất mang bằng carbodiimide

• Hoạt hóa chất mang bằng 3-aminopropytriethoxysilane

1.4.3.3 Phương pháp cố định enzyme được sử dụng

• Phương pháp nhốt enzyme: bao gồm nhốt enzyme trong gel và nhốt enzyme trong hệ sợi

• Phương pháp tạo enzyme với chất mang Enzyme được gắn vào chất mang theo các cơ chế: hấp phụ, tạo liên kết ion, liên kết với kim loại, liên kết đồng hóa trị

1.4.3.4 Ứng dụng của enzyme cố định

Enzyme cố định được ứng dụng trong một số lĩnh vực sau:

• Ứng dụng enzyme cố định trong quy trình công nghiệp

• Ứng dụng enzyme cố định trong quy trình y học: chủng đoán và điều trị bệnh

• Ứng dụng enzyme cố định trong phân tích: sử dụng trong các thiết bị cảm biến sinh học để phân tích chất

1.5 ĐẶC ĐIỂM CHẤT MANG GLUTARALDEHYDE - CHITOSAN

1.5.1 Chitosan [11]

Chitin có trong vỏ các loài giáp xác, màng tế bào nấm thuộc họ Zygemycetes, có

trong sinh khối nấm mốc và một vào loại tảo Khi chế biến những loại hải sản giáp xác, lượng chất thải chứa chitin chiếm 50% khối lượng Deacetyl hóa nhóm –NH2của chitin thành nhóm –COCH3 ở vị trí C(2) Như vậy, cấu tạo của chitosan có D-glucosamine (deacetyl) liên kết với N-acetyl-D-glucosamine (acetyl) nhờ liên kết β-

12

(1,4) -glycoside Và còn được gọi là poly β-(1,4)-glucosamine, poly amino -2-deoxy-D-glucose

β-(1,4)-2-Công thức cấu tạo hóa học:

Một số tính chất của chitosan

Hình 1.6 : Công thức cấu tạo hóa học của chitosan

• Tính chất vật lý: dạng rắn, không mùi, độ nóng chảy 309 – 311oC

• Trong cấu trúc hóa học: gồm nhóm amino và hydroxyl

• Tính tan: không tan trong ethanol 95%, tan rất ít trong nước, tan được trong dung dịch acid loãng

• Có khả năng tạo màng hay tạo dung dịch keo trong trong acid loãng

Ứng dụng chitosan trong công nghệ sinh học: cố định enzyme, tinh sạch protein, sắc

ký, tái tạo tế bào, cố định tế bào, …

Ở Việt nam, sản phẩm được sử dụng phổ biến và giá cả phù hợp chính vì ưu điểm này giúp cho quy trình sản xuất enzyme giảm được phần chi phí rất lớn

Các dạng xử lý của chitosan: thường tồn tại với 3 dạng: dung dịch, gel và màng

Dung dịch: Trộn chitosan hàm lượng 1 – 4 % (w/v) với acetic acid hoặc formic

acid tao dung dịch keo, độ keo tăng khi hàm lượng chitosan và nhiệt độ giảm

Gel: gồm có 2 nhóm: gel do N-acyl tạo thành và gel do sự hình thành Schiff’s base

Trong đó, gel N-acylchitosan, chitosan được tạo trong dung dịch acetic acid 10 %

13

hoặc 5 % trong hệ nước-methanol và một loại acyl anhydride gồm dodecanoic anhydride và benzoic anhydride

Màng: được tạo bằng cách đỗ dung dịch chitosan lên một tấm kính phẳng, khi

formic acid bốc hơi hoàn toàn, tấm kính được đặt ở nơi không khí lạnh để màng có thể dễ dàng bóc ra khỏi bề mặt tấm kính Sau đó, nhúng lớp màng này vào dung dịch NaOH 1M để trung hòa acid và rữa lại nhiều lần với nước cất đến trung tính Cuối cùng, đặt lên tấm kính sạch và giữ ở 60oC cho đến khô

1.5.2 Glutaraldehyde – chitosan

Glutaraldehyde là chất mang có chứa 2 nhóm aldehyde hoạt hóa Một nhóm gắn với – NH2 của chất mang, một nhóm gắn với enzyme Nhờ liên kết giữa glutaraldehyde-chitosan giúp các mạch polymer chitosan liên kết với nhau, và khi tao hạt các liên kết này giúp hạt có độ rắn chắc hơn

Hình 1.7 : Mô hình liên kết giữa chitosan và glutaraldehyde

14

araldehyde v

yme, tạo th

HO còn lại kết spacer– CHO có

hành các

của

r Các thể tạo

và enzyme

1.6 CÁC NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT CỐ ĐỊNH ENZYME PENICILLIN G ACYLASE TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC

1.6.1 Nghiên cứu trong nước

Trong nước, đã có công trình nghiên cứu sản xuất Penicillin acylase cố định tế bào:

TS Lê Gia Hy và cộng sự (2001-2002), nghiên cứu công nghệ lên men sản xuất

penicillin G acylase (P-G acylase) từ Escherichia coli [31] Năm 2003, nghiên cứu

sự cố định tế bào của enzyme PGA

Cho đến nay, các nghiên cứu cũng chỉ dừng lại ở phạm vi cố định tế bào để sản xuất enzyme Penicillin Acylase

1.6.2 Nghiên cứu ngoài nước

Các nghiên cứu về enzyme Penicillin Acylase đến nay vẫn và đang còn được nghiên cứu liên tục nhằm cải tiến quy trình một cách tối ưu trong sản xuất Sơ lược một số công trình đã được nghiên cứu của quy trình sản xuất enzyme như sau:

• Penicillin amidase được cố định trên sephadex G200 được hoạt hóa bởi cyanogen bromide [3]

• Penicillin amidase được cố định trên CMC (cellulose, dẫn xuất carboxymethyl)(Carley smith, 1980)

• Penicillin amidase được cố định trên cellulose acetate (Marconi và cộng sự, 1973)

• Penicillin amidase được cố định trên poly acrylamide (Szewczuk, 1979)

• Penicillin amidase được cố định trên iso-propyl acrylamide N-N-methylene bis acrylamide (Prabhune và cộng sự, 1991)

• Penicillin amidase được cố định trên hydroxyethylmethacrylate (Boccu và cộng sự, 1987)

16

17

Một số công nghệ tiên tiến trong những năm gần đây:

• Cố định enzyme penicillin G acylase lên chất mang Non-Porous Ultrafine Silica Particles [12]

• Cố định enzyme penicillin G acylase lên chất mang Porous Polyacrylonitrile Fibers [13] Hoạt tính riêng enzyme có thể đạt đến 82% năng suất

• Cố định enzyme penicillin G acylase trong hoạt hóa epoxy hạt cellulose từ tính

• Năm 2009, Sun H cố định enzyme PGA lên Oxirane-modified Mesoporous Silicas

Chương 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

18

2.1 VI SINH VẬT

Chủng Alcaligenes faecalis được cung cấp từ bộ môn Công nghệ Sinh học thuộc

trường Đại học Bách Khoa Tp.HCM

Hóa chất tủa enzyme: (NH4)2SO4, ethanol

Hóa chất thử hoạt tính enzyme: Sodium dodecyl sulfate, dimethylaminobenzaldehyde, Penicillin G Potassium

p-Hóa chất cố định: Chitosan, acetic acid, glutaraldehyde, NaHCO3

2.3 ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN LUẬN VĂN

Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm bộ môn Công nghệ sinh học, trường ĐH Bách Khoa Tp.HCM

19

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Hình 2.1: Quy trình nghiên cứu sản xuất enzyme cố định

2.4.1 Khảo sát đặc điểm giống

Quan sát đại thể khuẩn lạc giống trên đĩa thạch: hình dạng, màu sắc, độ nổi, kiểm tra

độ thuần, nhuộm Gram kiểm tra tính thuần

Quan sát vi thể thông qua nhuộm Gram

- Bảo quản giống

Giống được giữ bằng phương pháp cấy ria trên môi trường thạch (Blood agar) ủ ở nhiệt độ 37oC trong 1 ngày, giữ 4oC, sau 3 tuần thì cấy chuyền một lần

• Xây dựng đường chuẩn để định lượng Alcaligenes faecalis [6]

Nguyên tắc: Số lượng photon ánh sáng bị phân tán tỉ lệ thuận với lượng sinh khối tế

bào có trong mẫu đem đo, hoặc nếu trong những điều kiện sinh trưởng nhất định sẽ

tỉ lệ thuận với nồng độ tế bào

Tiến hành:

o Đưa 10 ml giống vào 400 ml môi trường nuôi cấy

21

o Sau một thời gian, lấy mẫu đo độ đục (OD660)[1,14] của dịch nuôi ở các giá trị lân cận 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; và 0,5

o Dùng phương pháp đếm khuẩn lạc phát triển trên đĩa thạch, xác định mật độ

tế bào (N/ml)

o Lập bảng tương quan tuyến tính giữa OD660 và mật độ tế bào

o Dựng đường chủng OD660 và mật độ tế bào

• Xây dựng đường cong sinh trưởng Alcaligenes faecalis

o Thu nhận mẫu nuôi cấy

o Đo độ đục bằng máy quang phổ

o Từ kết quả đo OD660, thay vào phương trình đường chuẩn và định mật độ tế bào ở các thời điểm tương ứng

o Dựng đường cong sinh trưởng

2.4.2 Phương pháp lên men

Nguyên tắc: Trong điều kiện môi trường thích hợp, quá trình sinh lý vi sinh vật ổn

định, sinh khối tế bào tăng lên

Chế độ khảo sát:

- Khảo sát nhiệt độ nuôi cấy

• Nhiệt độ thường: quá trình lên men xảy ra ở điều kiện nhiệt độ phòng Trong

thời điểm thí nghiệm ở phòng thí nghiệm sự dao động nhiệt độ 28 – 35oC

• Nhiệt độ 37 o C: quá trình lên men được đặt trong máy lắc ổn nhiệt, nhiệt độ

tương đối ổn định trong suốt quá trình

• Chế độ nuôi cấy tĩnh: quá trình lên men được để yên

• Chế độ nuôi cấy lắc: quá trình lên men được đặt trong máy lắc ổn nhiệt, nhiệt

độ tương đối ổn định trong suốt quá trình

23

2.4.3 Phương pháp tách chiết enzyme

Dịch sau lên men

Hình 2.2: Quy trình tách chiết và tinh sạch enzyme

- Ly tâm thu sinh khối: Lấy dịch sau nuôi cấy ly tâm 12 000 rpm; 20 phút

Sau đó, thu nhận phần kết lắng, rửa tủa bằng nước muối sinh lý 0.85% và thêm đệm

K3PO4 0.05 M ở pH 7.5 để hòa tan sinh khối

Nguyên tắc: Sóng siêu âm là những sóng có tần số cao hơn 18 kHz Khi sóng siêu

âm được truyền vào môi trường chất lỏng, các chu trình kéo và nén liên tiếp được tạo thành Áp lực âm trong chu trình kéo đủ mạnh để thắng các lực liên kết giữa các phân tử Các liên kết ở thành tế bào vi khuẩn bị phá vỡ, enzyme nội bào được giải phóng

24

Tiến hành:

Khảo sát các chế độ của hệ thống thiết bị phá vỡ tế bào bằng sóng siêu âm: thể tích sinh khối, thời gian (timer), xung (pulser) và biên độ sóng (amplitude) đến năng suất phá vỡ tế bào ở điều kiện nhiệt độ 5oC

Bảng 2.1: Bố trí thí nghiệm khảo sát các chế độ của hệ thống thiết bị

Mẫu Thể tích, ml Thời gian, p Xung (mở: tắc), s Biên độ sóng, %

Mẫu A1, A2, A3, B1, B2: Sinh khối tế bào của dịch lên men

Mẫu C1: là mẫu B2 sau khi ly tâm tách dịch, phần lắng tủa được pha với đệm phosphate 0.05 M pH 7.5 Chế độ phá vỡ tế bào giống với mẫu B2

Xác định năng suất bằng phương pháp định lương protein toàn phần

2.4.4 Phương pháp định lượng protein tổng bằng phương pháp Bradford

Nguyên tắc: Trong điều kiện phù hợp, các mạch nhánh có tính acid và tính base

của chuỗi protein sẽ tương tác với phẩm màu hữu cơ để tạo thành chất kết tủa có màu Coomassie Brilliant Blue G-25, có mức hấp thu cực đại 465 nm (màu đỏ), khi gắn vào protein sẽ tạo thành phức có mức hấp thu cực đại 595 nm (màu xanh dương)

25

Quy trình định lượng [7]

Pha chế dung dịch Bradford phẩm nhuộm:

• 50 ml 95% ethanol

• 100 ml 85% (w/v) phosphoric acid

• 100 mg Coomassie Brilliant Blue G-25

Thêm nước cất đủ 1 lít Dung dịch được lọc bằng giấy lọc Whatman No 1, trữ ở nhiệt độ phòng trong lọ có màu tối Có thể sử dụng trong nhiều tuần, nhưng phải lọc lại trước khi dùng

Định lượng protein:

• Cho 1 ml dung dịch chứa enzyme

• Thêm 5 ml dung dịch Bradford phẩm nhuộm, lắc đều và để yên trong 5 – 30 phút

• Đo mật độ quang ở bước sóng 595nm

Lập đường chủng OD với nồng độ protein: mẫu dung dịch BSA (Bovin Serum

Albumin 10 mg/ml) và nước cất theo các tỷ lệ khác nhau

Xác định nồng độ protein: dựa vào giá trị OD đo được và căn cứ vào đường chủng

suy ra nồng độ protein (mg/ml) trong dung dịch

Tổng protein = nồng độ protein x thể tích

2.4.5 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme penicillin G acylase

Hình 2.3: Phương trình phản ứng hóa học thủy phân

26