quy chình xác định shighella

quy trình phân tích xác định shigella trong mẫu thực phẩm: tổng quan, loài , uy trình phân tích, các bước tiến hành, test sinh hóa, khẳng định kháng huyết thanh, môi trường phân lập, biến đổi trong quá trình phân lập cũng như định danh, biểu hiện cơ bản của shigella trong môi trường phân lập, tân sinh chọn lọc, mãu sắc biến đổi test sinh hóa, biểu hiện kháng huyết thanh

Quy trình định tính Shigella

NHÓM: 10

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

GVHD:

Danh sách sinh viên:

1 Trần Thị Diễm Kiều 2005140251

2 Nguyễn Phương Hồng Thúy 2005140591

4.Nguyễn Hồng Ngọc 2006140213 5.Nguyễn Thị Ánh tuyết 2006140393

• Lỵ do Shigella là một bệnh phổ biển, tỷ lệ mắc bệnh và tử vong cao.

• Hàng năm có 165 triệu đợt lỵ trong đó : 99% ở các nước đang phát triển, 69% ở trẻ em dưới 5 tuổi

• Trong 1,1 triệu người bị tử vong do Shigella ở các nước đang phát triển thì 60% là trẻ dưới 5 tuổi

Theo nhóm huyết thanh:

 Theo tuyp huyết thanh: Các địa dư khác nhau thì phân phó theo các tuyp huyết thanh khác nhau

I Tình hình ngộ độc Thực phẩm

- Những trực khuẩn gram âm dài 1-3 m

- Không sinh nha bào, không di động

hiếu khí kỵ khí tuỳ nghi Thuộc họ enterobacteriaceae

- Topt 370C nhưng có thể phát triển ở To 8-400C

- pHopt là 7,8 nhưng phát triển được ở pH 6,6 -8, 8

+ Nội độc tố: Nội độc tố có tính độc mạnh, là một kháng nguyên yếu tác dụng chủ yếu là gây phản

 Hình thể và tính chất bắt màu

 Shigelia có dạng hình que thẳng dài 1-3 m, không có lông, không di động, không

có vỏ, không sinh bào tử, bắt màu Gram âm.

•  

Shigella flexneri Shigella dưới kính hiển vi

Đặc điểm sinh hóa khác

 Hầu hết các loài không lên men và tạo axit từ lactose, saccarose (trừ S

sonnei lên men chậm sau 48 giờ)

 Không có enzym lysine decarboxylase => Có phản ứng LDC âm tính

 Lên men đường mannitol (trừ S dysenteria).

 Lên men đường glucose không sinh hơi (trừ S.Flexneri 6,

S Boydii 14 sinh hơi yếu).

 Không có khả năng sử dụng citrate và molonate Không sinh indol

 Shigella thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae nên có các tính chất chung của họ này là oxydase (-), glucose (+).

 Không làm lỏng gelatin.

Nhóm A:

S dysenteria (có 10 typ huyết

thanh; S.shiga có 1 typ huyết

thanh).

Nhóm A:

S dysenteria (có 10 typ huyết

thanh; S.shiga có 1 typ huyết

thanh).

Nhóm B:

S flexneri (có 6 typ huyết thanh

chính và 6 typ huyết thanh phụ).

Nhóm B:

S flexneri (có 6 typ huyết thanh

chính và 6 typ huyết thanh phụ).

− Shigella có kháng nguyên thân O, không có kháng nguyên H Dựa vào kháng nguyên O

và tính chất sinh hoá, Shigella được chia thành 4 nhóm với nhiều typ huyết thanh:

+ Nhóm A: S.dysenteriae: có 15 typ huyết thanh, đáng chú ý là S.dysenteriae typ 1 (Sh.shiga).

+ Nhóm B: S.flexneri (có 8 typ huyết thanh).

+ Nhóm C: S.boydii (có 19 typ huyết thanh).

+ Nhóm D: S.sonnei (có 1 typ huyết thanh).

 Tăng sinh trong môi trường lỏng chọn lọc

Phần mẫu thử được cấy vào canh thang Shigella có chứa novobioxin 0,5 µg/ml, rồi được ủ kỵ khí ở 41,5oC ± 1 oC trong 16h-20h.

 Đổ đĩa và nhận biết các khuẩn lạc

Cấy các dịch cấy tăng sinh thu được vào ba môi trường phân biệt chọn lọc: thạch MacConkey agar có tính chọn lọc thấp; thạch XLD

agar có tính chọn lọc trung bình và thạch Hektoen enteric agar có độ nhạy cao nhất Tất cả các đĩa này được ủ ở 37oC trong 20h-24h.

 Khẳng định bằng thử ngiệm sinh hóa và kháng huyết thanh

Sau thời gian ủ, những khuẩn lạc điển hình và nghi ngờ trong mỗi môi trường từ ba môi trường thạch chọn lọc sẽ được kiểm tra khẳng định sinh hóa và kháng huyết thanh

III Nguyên tắc xác định Shigella

IV Môi trường và hóa chất

- Canh thang shigella broth

- kháng huyết thanh bằng huyết thanh đa giá A, B, C, D

Test sinh hóa + kháng huyết thanh

Đồng nhất 25g mẫu trong 225 mL TSA hay canh thang shigella, bổ

trường dinh dưỡng NA/TSA

Ủ 41,5oC, 16 - 20h

Ủ 37oC, 20h-24h

Quy trình phân tích

Thử nghiệm sinh hóa chuyên biệt và thực hiện ngưng kết huyết thanh để phân

loại

Thử nghiệm sinh hóa chuyên biệt và thực hiện ngưng kết huyết thanh để phân

loại

Kết luận: Shigella dương tính/âm tính trong 25g mẫu

Thử nghiệm sinh hóa khẳng định

Thử nghiệm sinh hóa cho kết quả:

Thử nghiệm sinh hóa cho kết quả:

Test sinh hóa + kháng huyết thanh

Lấy 25g mẫu cho vào túi dập mẫu, thêm 225ml canh thang shigella bổ

sung thêm 5ml Novobioxin

Lấy 25g mẫu cho vào túi dập mẫu, thêm 225ml canh thang shigella bổ

sung thêm 5ml Novobioxin

Đồng nhất mẫu (không quá 2 phút), đo và chỉnh pH về 7± 0,2

Buộc chặt túi và đem ủ ở 47oC trong 16- 20 giờ

6.1 Tăng sinh chọn lọc

Môi trường canh thang shigella

- Dịch thủy phân casein bằng enzym

1 000 ml 5ml

Dùng que cấy vòng cấy dịch tăng sinh lên các môi trường thạch đĩa chọn lọc

như : XLD agar, Hektoen enteric agar và MacConkey agar

Dùng que cấy vòng cấy dịch tăng sinh lên các môi trường thạch đĩa chọn lọc

như : XLD agar, Hektoen enteric agar và MacConkey agar

Sau khi cấy,lật ngược đĩa, ủ các đĩa ở 37oC trong 24h lấy ra xem

Kết quả 6.2 Phân lập

MÔI TRƯỜNG MAC

Shigella sonneia Không màu đến hồng nhạt,

trong mờ, lactoza âm tính

Shigella, các loài khác Không màu, trong mờ, lactoza

9 g đến 18 g a

1 000 ml

Đỏ phenol

12 g đến 18 g a

1 000 ml

Xanh bromothymol Sắt (III) amoni xitrat

Lactoza

6.3 Phục hồi

Chọn ủ trong môi trường không chọn lọc NA/TSA

Test sinh hóa

Chọn ít nhất 5 khuẩn lạc cấy trên môi trường không chọn

lọc (NA/TSA)

Chọn ít nhất 5 khuẩn lạc cấy trên môi trường không chọn

lọc (NA/TSA)

Nếu không có khuẩn lạc điển hình ủ thêm 24h

TH1: từ mỗi đĩa thử 1 khuẩn lạc đặc

trưng, nếu cho các kết quả thử nghiệm sinh hóa phù hợp thid kết luận phát hiện

Shigella trong mẫu

TH1:từ mỗi đĩa thử 1 khuẩn lạc đặc trưng, nếu cho các kết quả thử nghiệm sinh hóa phù hợp thid kết luận phát hiện

Shigella trong mẫu

TH2: nếu khuẩn lạc đầu tiên cho kết quả

sinh hóa không phù hợp Tiến hành thử

các khuẩn lạc còn lại

TH2: nếu khuẩn lạc đầu tiên cho kết quả

sinh hóa không phù hợp Tiến hành thử

các khuẩn lạc còn lại

6.4 Test sinh hóa + kháng huyết thanh

 Thạch sắt ba đường (thạch nghiêng TSI )

- Cấy đâm sâu và cấy vạch trên bề mặt thạch nghiêng.

- Ủ các đĩa trong tủ ở 37 oC trong 24h đến 48h.

Diễn giải các thay đổi trong môi trường như sau:

Vùng cấy Biểu hiện Cho thấy

Cấy đâm sâu

Màu vàng không có màu đen không bọt khí và không rạn nứt

Lên men glucoza: dương tính không Sinh khí

Cấy bề mặt

nghiêng Màu đỏ hoặc không đổi màu Không sử dụng lactoza và sacaroza:

âm tính

 Thạch dinh dưỡng nửa đặc để dùng cho các phép thử tính di động

• Dùng kim cấy cấy đâm sâu một khuẩn lạc vào thạch dinh dưỡng nửa đặc

• Ủ trong tủ ở 37 oC ± 1 oC trong 18 h đến 24 h

• Kiểm tra đường cấy về sự phát triển lan rộng Các vi sinh vật không di động sẽ cho đường rời rạc; các chủng di động sẽ phát triển phân tán xung quanh đường cấy

• Tất cả các loài Shigella là không di động.

 Thạch ure

- Cấy ria trên bề mặt thạch

-Ủ trong tủ ở 37 oC trong 24 h ± 3 h

-Thuốc thử: phenol red

Nếu ure bị thủy phân thì sẽ có màu hồng đến hồng đậm

do giải phóng amoniac từ việc phân hủy ure với sự đổi

màu của chất chỉ thị pH Khi không có sự đổi màu của

thạch chứng tỏ phản ứng âm tính

Các loài Shigella không thủy phân ure.=> âm tính

6.4 Test sinh hóa + kháng huyết thanh

Môi trường L-Lysin decacboxylaza (LDC)

 Cấy ngay phía dưới bề mặt của canh thang

 Thuốc thử: bromocresol đỏ tía

 Ủ trong tủ ở 37 oC trong 24 h

 Sau thời gian ủ:

– Thấy đục và đỏ tía chứng tỏ phản ứng dương tính.

– Màu vàng là phản ứng âm tính.

 Các loài Shigella không khử nhóm carboxyl của lysin

CHÚ THÍCH: Sử dụng parafin phủ lên trên các ống có thể đảm

bảo được các điều kiện kỵ khí

Loại trừ chủng tự ngưng kết:

Nhỏ 1 giọt NaCl 0,85% lên lam kính

Dùng que cấy lấy một ít Khuẩn lạc lên lam kính

Lắc nhẹ trong 30-60 giây

Nếu thấy có hạt ngưng kết thì không tiếp tục thử tiếp

6.4 Test sinh hóa + kháng huyết thanh

Ngưng kết với kháng nguyên O:

• Làm tương tự, thay NaCl bằng kháng nguyên O đa giá

• Nếu có ngưng kết thì tiếp tục thử với các kháng nguyên (A,B,C,D)

• Nếu có kháng nguyên bề mặt K: đun sôi dịch 30 phút, sau tiến hành lại từ biết thử nghiệm kháng nguyên O

6.4 Test sinh hóa + kháng huyết thanh

Shigella, các loài khác Không màu, trong mờ, 

lactoza âm tính

Trong mờ, có tâm màu đỏ/đỏ hồng, màu giống thạch

Màu xanh lam và ẩm ướt

trên tất cả các môi trường này có các khuẩn lạc tròn có bề mặt trơn nhẵn và viền

mép liền

CHÀO TẠM BIỆT!!!

CẢM ƠN CÔ VÀ CÁC BẠN ĐÃ LẮNG NGHE