Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn từ mẫu trầm tích biển thu nhập được ở văn phong khánh hoà có hoạt tính kháng một số chủng vi sinh vật kiểm định gây bệnh đường ruột

Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn từ mẫu trầm tích biển thu nhập được ở Văn Phong – Khánh Hòa có hoạt tính kháng một số chủng vi sinh vật kiểm định gây bệnh đường ruột.. Tuyển

Viện Đại Học Mở Hà Nội

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn tới ban giám hiệu Viện Đại học mở

Hà Nội, đặc biệt các thầy cô trong khoa Công nghệ Sinh học đã dạy dỗ em trong suốt 4 năm học tại trường, trang bị cho em nền tảng kiến thức khoa học

để có thể học hỏi thêm nhiều điều bổ ích có thể áp dụng vào thực tế và đã tạo điều kiện tốt nhất cho em được làm bài báo cáo tốt nghiệp này

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến TS.Lê Thị Hồng Minh, Phó Trưởng phòng Công nghệSinh học– Viện Hóa sinh biển – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và NCS.Vũ Thị Quyên, người đã truyền cho em phương pháp học tập, nghiên cứu khoa học, đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ em trong suốt quá trình nghiên cứu vừa qua

Đồng thời, em cũng gửi lời cảm ơn tới các cô chú, anh chị và các bạn trong Phòng Công nghệ Sinh học– Viện Hóa Sinh Biển đã nhiệt tình giúp đỡ

em hoàn thành tốt đợt thực tập

Sau cùng, em xin kính chúc quý thầy cô trongkhoaCông nghệ Sinh học nói chung và thầy cô giáo Viện Đại học mở nói riêng thật nhiều sức khỏe, niềm tin để thực hiện sứ mệnh cao đẹp của mình là truyền kiến thức cho thế hệ mai sau

Trân trọng!

Sinh viên Trịnh Thị Thanh Lam

Viện Đại Học Mở Hà Nội

MỤC LỤC

PHẦN I: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu của đề tài 3

1.3 Nội dung của đề tài 3

1.4 Ý nghĩa của đề tài 3

PHẦN II TỔNG QUAN 4

2.1 Vi khuẩn 4

2.1.1 Vị trí và vai trò của vi khuẩn trong vi sinh vật 4

2.1.2 Cấu tạo của vi khuẩn.[1,42] 6

2.1.3 Đặc điểm hình thái của vi khuẩn 8

2.2 Chất kháng sinh 10

2.2.1 Khái niệm về chất kháng sinh [13] 10

2.2.2 Lịch sử nghiên cứu chất kháng sinh [13] 11

2.2.3 Sự hình thành chất kháng sinh ở vi khuẩn.[7,8,9] 15

2.2.4 Các chất kháng sinh có nguồn gốc từ vi khuẩn 15

2.3 Giới thiệu về vi sinh vật biển 16

2.4 Giới thiệu về một số vi sinh vật kiểm định gây bệnh đường ruột 18

2.4.1 Escherichia coli.[43] 18

2.4.2 Salmonella enterica.[43] 20

2.4.3 Bacillus cereus 22

PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

3.1 Vật liệu và hóa chất 24

3.1.1 Vật liệu nghiên cứu 24

3.1.2 Hóa chất, thiết bị 24

Viện Đại Học Mở Hà Nội

3.2.1 Thu thập các mẫu trầm tích 28

3.2.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn 28

3.2.3 Phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật bằng khuếch tán trên đĩa thạch [24] 28

3.2.4 Xác định khả năng sinh enzyme của các chủng nghiên cứu 29

3.2.5 Phương pháp tách chiết ADN tổng số 32

3.2.6 Phương pháp PCR 32

3.2.7: Phương pháp giải trình tự 36

PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37

4.1 Kết quả thu thập mẫu 37

4.2 Phân lập vi khuẩn từ trầm tích 38

4.3 Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng nghiên cứu 40

4.4 Khả năng sinh enzyme của các chủng nghiên cứu 42

4.4.1 Khả năng thủy phân tinh bột tan 42

4.4.2 Khả năng thủy phân protein (casein) 44

4.4.3 Khả năng thủy phân CMC 45

4.5 Định danh vi khuẩn bằng sinh học phân tử 46

4.5.1 Tách chiết AND từ vi khuẩn 46

4.5.2 Thiết kế các cặp mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR 46

4.5.3 Nhân gen 16S ADN riboxom 47

3.4.4 Kết quả giải trình tự gene 16S của ba chủng vi khuẩn 48

PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53

5.1 Kết luận 53

5.2 Kiến nghị 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55

Viện Đại Học Mở Hà Nội

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Viện Đại Học Mở Hà Nội

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Các chất kháng sinh được phát hiện qua các năm

Bảng 3.1 Thành phần phản ứng PCR

Bảng 3.2: Thành phần phản ứng để xác định trình tự

Bảng 4.1 Danh sách các mầu thu được ở Vịnh Văn Phong – Khánh Hòa

Bảng 4.2 Danh sách các chủng vi khuẩn phân lập được

Bảng 4.3 Kết quả thử hoạt tính vi sinh vật kiểm định

Bảng 4.4: Trình tự và thông số các cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR

Viện Đại Học Mở Hà Nội

Hình 2.4 Alexander Fleming và Penicillium notatum được phân lập

Hình 2.5 Ba nhà khoa học được nhận giải Nobel về Y học

Hình 2.6 Vi khuẩn E.coli

Hình 2.7 Vi khuẩn Salmonella enterica

Hình 2.8 Vi khuẩn Bacillus cereus

Hình 4.1 Một số hình ảnh khi thu thập mẫu ở Văn Phong

Hình 4.2 Một số hình ảnh phân lập vi khuẩn sau 2-7 ngày nuôi cấy

Hình 4.3 Một số hình ảnh làm sạch các chủng vi khuẩn

Hình 4.4 Một số hình ảnh thử hoạt tính kháng VSVKĐ

Hình 4.5 Khả năng thủy phân tinh bột tan

Hình 4.6 Khả năng phân giải casein

Hình 4.7 Khả năng phân giải cellulose

Viện Đại Học Mở Hà Nội

TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

1 Tên đề tài

Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn từ mẫu trầm tích biển thu nhập được ở Văn Phong – Khánh Hòa có hoạt tính kháng một số chủng vi sinh vật kiểm định gây bệnh đường ruột

2 Đối tượng

Các chủng vi khuẩn phân lập từ mẫu trầm tích biển thuộc khu vực biển Văn Phong – Khánh Hòa được dùng để tuyển chọn, sàng lọc, định danh và nghiên cứu hoạt tính sinh học

3 Mục tiêu

Tuyển chọn được 2-3 chủng vi khuẩn từ mẫu trầm tích biển có hoạt tính kháng một số chủng vi sinh vật kiểm định gây bệnh đường ruột và định danh bằng sinh học phân tử các chủng đã lựa chọn Nhằm chọn được những chủng vi sinh vật có khả năng tổng hợp các chất có hoạt tính sinh học tốt làm tiền đề cho các ứng dụng chăm sóc sức khỏe cộng đồng

4 Kết quả

- Phân lập và làm sạch các chủng vi khuẩn từ mẫu trầm tích biển

- Kiểm tra hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng nghiên cứu Các vi sinh vật kiểm định bao gồm:

+ 2 chủng vi khuẩn Gram âm (-): Escherichia coli ATCC25922,

Salmonella enterica ATCC13076

PHẦN I: MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Ngộ độc thực phẩm luôn là vấn đề có ý nghĩa rất lớn đến sức khỏe cộng đồng, ảnh huởng đến hầu hết các nuớc trên toàn thế giới.Theo thống kê của Cục An toàn Vệ sinh Thực phẩm, mỗi năm Việt Nam có chừng 250-500 vụ ngộ độc thực phẩm với 7.000-10.000 nạn nhân và 100 – 200 ca tử vong Có rất nhiều nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm, trong đó một trong những nguyên nhân chính là do thực phẩm bị nhiễm vi sinh vật (33-49%) chủ yếu do

Salmonella, E.coli, Clostridium perfringens , vi khuẩn Listeria

Trong một nghiên cứu ở Hà Nội mới được công bố trên tập san nhiễm trùng học quốc tế, các nhà nghiên cứu phân tích số liệu từ 587 trẻ em mắc bệnh tiêu chảy và 249 em không mắc bệnh Trong nhóm tiêu chảy, 41% xảy ra ở trẻ

em dưới 1 tuổi Phân tích vi sinh cho thấy rotavirut nhóm A hiện diện trong

47% trường hợp, kế đến là E.coli (22,5%), Shigella spp (khoảng 5%) và

Bacteroides fragilis (khoảng 7%).[39,40]

Các bệnh đường ruột là một trong những nỗi lo đáng ngại đối với con người, gây nguy hại nghiêm trọng đến sức khỏe con người.Khi đường ruột gặp phải bất kỳ vấn đề gì sẽ làm đảo lộn hoạt động bình thường của hệ tiêu hóa Vì vậy không thể xem nhẹ trước những tín hiệu bất thường để phòng ngừa các bệnh đường ruột Đa số vi sinh vật gây bệnh là loại sống ký sinh và lấy thức ăn

từ vật chủ Một sốvi sinh vật gây bệnh sản sinh ra các độc tố (khả năng tạo ra ngoại độc tố hoặc nội độc tố) đối với vật chủ,các đốc tố của vi khuẩn sẽ có tác

động đặc hiệu như: làm tổn thương màng não, tổn thương các cơ quan trong cơ thể như thận, gan, phổi…

Sau khi Alexander Fleming phát hiện ra penicillin vào năm 1929, vi sinh vật trên cạn trở thành tiêu điểm cho một trong các nổ lực khám phá nhiều thuốc uống nhất trong lịch sử Những khám phá về penicillin và sau đó là Actinomycin (1940) đã dẫn đến sự “Kỉ nguyên kháng sinh tuyệt vời” đã mang lại hơn 120 loại thuốc để điều trị bệnh truyền nhiễm ung thư, cholesterol cao, điều hòa miễn dịch và các bệnh khác Tuy nhiên, do việc sử dụng các chất kháng sinh không hợp lý đã làm cho hiện tượng kháng kháng sinh xuất hiện, phát triển và ngày càng lan rộng Việc sử dụng một số chất đặc hiệu để chữa trị một số loại bệnh đã không còn mang lại hiệu quả mong muốn Số lượng các vi khuẩn đề kháng với kháng sinh ngày càng gia tăng Chính vì vậy việc tìm kiếm

ra những chất kháng sinh mới luôn thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học[41]

Đại dương chiếm khoảng 70% diện tích bề mặt trái đất, là môi trường sống của rất nhiều loài động vật, thực vật và vi sinh vật, song các nghiên cứu

về hợp chất tự nhiên từ biển không phát triển trong suốt thế kỷ 19 và nửa đầu thế kỷ 20 Chỉ có một số lượng rất nhỏ các sinh vật từ biển đã được thu nhận và một số lượng rất nhỏ các hợp chất thứ cấp có nguồn gốc từ đại dương được tách chiết và phân lập

Hướng nghiên cứu các hợp chất từ vi sinh vật biển, từ đó xác định một số chất có hoạt tính sinh học kháng vi sinh vật có khả năng ứng dụng trong y dược, hứa hẹn nhiều tiềm năng trong tương lai Vì vậy, chúng tôi lựa chọn đề

tài: “Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn từ mẫu trầm tích biển

thu nhập được ở Văn Phong – Khánh Hòa có hoạt tính kháng một số chủng vi sinh vật kiểm định gây bệnh đường ruột”

1.2 Mục tiêu của đề tài

Tuyển chọn được 2-3 chủng vi khuẩn từ mẫu trầm tích biển có hoạt tính kháng một số chủng vi sinh vật kiểm định gây bệnh đường ruột và định danh bằng sinh học phân tử các chủng đã lựa chọn Nhằm chọn được những chủng

vi sinh vật có khả năng tổng hợp các chất có hoạt tính sinh học tốt làm tiền đề cho các ứng dụng trong chăm sóc sức khỏe cộng đồng

1.3 Nội dung của đề tài

• Phân lập vi sinh vật từ mẫu trầm tích biển

• Sàng lọc và tuyển chọn được vi khuẩn có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định gây bệnh đường ruột

• Định danh các chủng có hoạt tính cao nhất

1.4 Ý nghĩa của đề tài

Tiến hành các nghiên cứu về hệ vi khuẩn từ trầm tích biển, từ đó tiến tới khai thác nguồn dược liệu từ vi sinh vật biển nói chung và vi khuẩn từ trầm tích biển nói riêng

PHẦN II TỔNG QUAN

2.1 Vi khuẩn

Vi khuẩn (tiếng Anh và tiếng La Tinh là bacterium, số nhiều bacteria) đôi khi còn được gọi là vi trùng, là một nhóm vi sinh vật nhân sơ đơn bào có kích thước rất nhỏ, một số thuộc loại ký sinh trùng Vi khuẩn là một nhóm sinh vật đơn bào, có kích thước nhỏ (kích thước hiển vi) và thường có cấu trúc tế bào đơn giản không có nhân, bộ khung tế bào (cytoskeleton) và các bào quan như

ty thể và lục lạp.[4,5]

Hình 2.1 Một số hình ảnh về vi khuẩn

2.1.1 Vị trí và vai trò của vi khuẩn trong vi sinh vật

Vi khuẩn là nhóm hiện diện đông đảo nhất trong sinh giới Chúng hiện diện khắp nơi trong đất, nước, chất thải phóng xạ, suối nước nóng, ở dạng cộng sinh và kí sinh với các sinh vật khác Có khoảng 40 triệu tế bào vi khuẩn trong một gram đất và hàng triệu tế bào trong một mm nước ngọt Ước tính có

khoảng 5x1030 vikhuẩn trên Trái Đất tạo thành một lượng sinh khối vượt hơn tất cả động vật và thực vật [4,5]

Vi khuẩn có vai trò quan trọng trong vi sinh vật, vi khuẩn có thể có ích hoặc có hại cho môi trường và động vật, kể cả con người Vai trò của vi khuẩn trong gây bệnh và truyền bệnh rất quan trọng Một số là tác nhân gây bệnh gây

ra các bệnh như: uốn ván, sốt thương hàn, giang mai, tả, bệnh lây qua thực phẩm và lao Ở thực vật, vi khuẩn gây đốm lá, cháy lá và héo cây Các hình thức lây nhiễm gồm qua tiếp xúc, không khí, thực phẩm, nước và côn trùng Trong đất, các vi sinh vật sống trong nốt rễ (rhizosphere) biến nitơ thành amoniac bằng các enzyme của chính mình Một số khác lại dùng phân tử khí nitơ làm nguồn đạm cho mình, chuyển nitơ thành các hợp chất của nitơ, quá trình này gọi là quá trình cố định đạm Nhiều vi khuẩn được tìm thấy sống cộng sinh trong cơ thể người hay các sinh vật khác Ví dụ như sự hiện diện của các

vi khuẩn cộng sinh trong ruột già giúp ngăn cẳn sự phát triển của các vi sinh vật có hại Vi khuẩn có khả năng phân giải các hợp chất hữu cơ một cách đáng kinh ngạc Một số nhóm vi sinh “chuyển hóa” đóng một vai trò rất quan trọng trong việc hình thành các khoáng chất từ một số nhóm hợp chất hữu cơ Ví dụ,

sự phân giải cellulose, một trong những thành phần chiếm đa số trong mô thực vật, được thực hiện chủ yếu bởi các vi khuẩn hiếu khí thuộc chi Cytophaga Khả năng này cũng được con người ứng dụng trong công nghiệp và trong cải thiện sinh học (bioremediation) Các vi khuẩn có khả năng phân hủy hydrocarbon trong dầu mỏ thường được dùng để làm sạch các vết dầu loang…

Vi khuẩn cùng với nấm men và nấm mốc được dùng để chế biến các thực phẩm lên men như phô-mai, dưa chua, nước tương, dưa cải bắp, giấm, rượu…Sử

dụng công nghệ sinh học, các vi khuẩn có thể được “thiết kế” để sản xuất thuốc trị bệnh như insulin, hay để cải thiện sinh học đối với các chất thải độc hại.[1]

2.1.2 Cấu tạo của vi khuẩn.[1,42]

Dưới kính hiển vi điện tử, tế bào vi khuẩn được quan sát gồm các thành phần sau:

Hình 2.2 Cấu tạo của vi khuẩn

2.1.2.1 Nhân (nuclear body)

Vi khuẩn không có nhân điển hình vì không có màng nhân, nhưng có cơ quan chứa thông tin di truyền đó là nhiễm sắc thể (chromosome) tồn tại trong nguyên sinh chất Bản chất nhiễm sắc thể là ADN có hình cầu, hình que hoặc hình chữ V, sao chép theo kiểu bán bảo tồn dẫn đến sự phân bào Tuy nhiên, sự phân bào còn phụ thuộc vào dực phân chia màng sinh chất và vách tế bào

2.1.2.2 Chất nguyên sinh (cytoplasma)

Chứa những thành phần hòa tan như protein, peptid, acid amin, vitamin, ARN, ribosom, các muối khoáng, một số nguyên tố hiếm và sắc tố, ngoài ra nó còn chứa các hạt vùi Nguyên sinh chất của vi khuẩn không có ty lạp thể, lưới nội bào và cơ quan phân bào

2.1.2.3 Màng nguyên sinh (cytoplasma membrane)

Là một lớp màng mỏng có tính đàn hồi, bao gồm 60% protein, 40% lipid

chủ yếu là các phospholipid

2.1.2.4 Vách (cell wall)

Là bộ khung vững chắc bao bên ngoài màng sinh chất, được cấu tạo bởi đại phân tử glycopeptid, được tổng hợp liên tục bao gồm đường amin và acid amin Các acid amin khác nhau tùy từng vi khuẩn Chính vì vậy, vách của các

vi khuẩn Gr(+) và Gr(-) có những đặc điểm khác nhau

2.1.2.5 Vỏ (capsule)

Là một lớp nhầy lỏng lẻo, không rõ rệt bao quanh vi khuẩn, được quan sát bằng phương pháp nhuộm mực nho Chỉ có một số loài vi khuẩn và trong những điều kiện nhất định mới hình thành vỏ Khuẩn lạc của những vi khuẩn

có vỏ thường nhầy, ướt và sáng Vỏ bảo vệ vi khuẩn trong những điều kiện nhất định

2.1.2.6 Lông (flagella)

Lông là những sợi protein dài và xoắn tạo thành từ các acid amin dạng D Lông là cơ quan di động trong môi trường thích hợp, nó chỉ có ở một số loại vi khuẩn nhất định Vị trí lông của các vi khuẩn cũng có đặc điểm khác nhau, là

đặc điểm để phân loại vi khuẩn, ví dụ: phẩy khuẩn tả có lông ở một đầu, nhiều

loại vi khuẩn khác có lông quanh thân như (Salmonella, E.coli), một vài vi

khuẩn khác lại có một chùm lông ở đầu

2.1.2.7 Pilli

Là cơ quan phụ của vi khuẩn như lông, nó có thể mất đi nhưng không ảnh hưởng tới sự tồn tại của vi khuẩn Pilli bám vào các tế bào có màng nhân, khả năng gây bệnh của một số loại vi khuẩn cũng liên quan đến sự tồn tại của Pilli, nếu vi khuẩn lậu mất Pilli sẽ không thể gây bệnh được

2.1.2.8 Nha bào

Nhiều loại vi khuẩn có khả năng tạo nha bào khi điều kiện sống của chúng không thuận lợi Mỗi vi khuẩn chỉ tạo được một nha bào, khi điều kiện sống thuật lợi, nha bào vi khuẩn lại nẩy mầm để đưa vi khuẩn trở lại dạng sinh sản Nha bào có thể tồn tại lâu tới 150.000 năm, do ở dạng nha bào không có sự chuyển hóa và mất nước

2.1.3 Đặc điểm hình thái của vi khuẩn

Vi khuẩn có nhiều hình thái khác nhau: hình cầu, hình que, hình xoắn, hình dấu phẩy, hình sợi…Kích thước thay đổi tùy theo các loại hình và trong một loại hình kích thước cũng khác nhau So sới virus, kích thước của vi khuẩn lớn hơn nhiều, có thể quan sát vi khuẩn dưới kinh hiển vi quang học Dựa vào loại hình có thể chia ra một số nhóm sau:

• Trực khuẩn: Là những vi khuẩn hình que, hai đầu tròn hoặc vuông, có thể 1 hoặc 2 đầu phình to Kích thước rộng khoảng 1µm, dài 2-5µm, những trực khuẩn không gây bệnh có kích thước lớn hơn

• Xoắn khuẩn: Là những vi khuẩn hình sợi lượn sóng và di động, chiều dài trung bình từ 12-20µm, có thể dài tới 30µm Là loại gram dương, di đông được nhờ có một hay nhiều tiên mao mọc ở đỉnh.[42]

2.2 Chất kháng sinh

2.2.1 Khái niệm về chất kháng sinh [13]

Thời kì vàng son của kháng sinh bắt đầu từ khi sản xuất penicillin để dùng

trong lâm sàng (1941) Khi đó người ta đã định nghĩa: “Kháng sinh là những

s ản phẩm trao đổi chất tự nhiên được các vi sinh vật tiết ra (vi khuẩn, vi nấm),

có tác d ụng ức chế sự phát triển hoặc tiêu diệt chọn lọc đối với các vi sinh vật

khác”, theo Walsman 1942

Tuy nhiên, với sự phát triển của khoa học, người ta có thể tổng hợp, bán tổng hợp các kháng sinh tự nhiên (chloramphenicol); tổng hợp nhân tạo các chất có tính kháng sinh: sulfamid, quinolon hay chiết xuất từ vi sinh vật những chất diệt được tế bào ung thư (actinomycin) Vì thế định nghĩa kháng sinh đã được

thay đổi: “Kháng sinh là tất cả các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng

h ợp với nồng độ rất thấp có khả năng đặc hiệu kìm hãm sự phát triển hoặc tiêu

di ệt đối với các vi sinh vật gây bệnh, đồng thời không có tác dụng hoặc tác

d ụng yếu lên con người, động vật và thực vật bằng con đường cung cấp

chung”. [3]

Để biểu thị độ lớn giá trị hoạt tính sinh học của kháng sinh trong 1ml dung dịch (đơn vị/ml) hay 1 mg chế phẩm (đơn vị/mg), thường dùng đơn vị kháng sinh Đơn vị kháng sinh là lượng kháng sinh tối thiểu hòa tan trong một thể tích môi trường xác định, có tác dụng ức chế hay tiêu diệt vi sinh vật kiểm định trong thời gian xác định.[3] Đơn vị kháng sinh quốc tế là UI, ví dụ: 1 UI penicillin = 0,6 µg, còn 1 UI streptomycin = 1,0 µg (Hopwood, 2007)

2.2.2 Lịch sử nghiên cứu chất kháng sinh [13]

Năm 1928, nhà sinh vật học người Anh là Alexander Fleming trong nghiên cứu tụ cầu ông nhận thấy xung quanh khuẩn lạc mốc xanh nhiễm vào hộp petri nuôi tụ cầu tạo thành vòng vô khuẩn Hiện tượng kì lạ này đã được Fleming nghiên cứu, phân lập thuần khiết và xác định được mốc xanh đó là

Penicillium notatum – một chủng tạo penicillin

Hình 2.4.Alexander Fleming và Penicillium notatumđược phân lập

Năm 1938, Fleming nhận được thư của hai nhà khoa học từ trường Đại học Oxford là Ernst Boris Chain và Howard Walter Florey, với lời đề nghị được hợp tác với ông để tiếp tục thực hiện công trình nghiên cứu về penicillin và họ

đã thử nghiệm thành công penicillin trên chuột vào 1940

Năm 1941, nhóm đã chọn được loại nấm Penicilliumưu việt nhất là chủng

Penicillium chrysogenium, chế ra loại penicillin có hoạt tính cao hơn cả triệu lần penicillin do Fleming tìm thấy lần đầu năm 1928

Năm 1945, Fleming được giải thưởng Nobel về y học cùng với Ernst Boris Chain và Howard Walter Florey

Hình 2.5 Ba nhà khoa học được nhận giải Nobel về Y học

Một số kháng sinh khác: sulfornamid được Gerhard Domard (Đức) tìm ra vào năm 1932 và streptomycin được Selman Waksman và Albert Schat tìm ra vào năm 1934 Sau này đặc biệt ở hai thập kỷ cuối của thế kỷ XX, công nghệ sinh học và hóa dược phát triển mạnh, người ta đã tìm ra được rất nhiều loại kháng sinh mới Ngày nay con người biết được khoảng 8000 chất kháng sinh khác nhau có nguồn gốc từ nấm mốc, xạ khuẩn và vi khuẩn Có khoảng 100 loại được dùng trong Y khoa và Thú y

Kể từ đó, kháng sinh đã trở thành một dược phẩm thần kì sớm chiếm vị trí hàng đầu trong lĩnh vực dược phẩm thế giới, với những kết quả ngày càng mới lạ, với nhu cầu ngày càng tăng và lượng sản xuất ngày càng lớn Hơn thế nữa, bên

cạnh chất penicillin đầu đàn, có thêm nhiều loại kháng sinh được chiết xuất từ nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn

Bảng 2.1 Các chất kháng sinh được phát hiện qua các năm [7]

Những năm 1940 – 1959 được coi là thời kỳ hoàng kim của việc nghiên cứu CKS với hàng loạt CKS mới liên tiếp được phát hiện như: gramixidin, tiroxidin do Rene Jules Dobos phát hiện năm 1939, streptomycin do Waksman phát hiện năm 1941, erythromycin do Gurre phát hiện năm 1952…Cùng với việc phát hiện ra các CKS mới, công nghệ lên men sản xuất CKS cũng ra đời

và dần được hoàn thiện

Ngay từ những năm 1950, CKS đã được nghiên cứu sử dụng trong việc phòng chống bệnh, kích thích sự tăng trưởng của động vật nuôi và cây trồng CKS thu hút được sự quan tâm của các nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực khác nhau trên thế giới

Năm CKS được phát hiện Nước Năm CKS được phát hiện Nước

1943 Streptomycin Mỹ 1945 Cephalosporin Italia

Tốc độ tìm ra các CKS trong thời gian gần đây vẫn diễn ra nhanh chóng, nhiều trung tâm nghiên cứu khoa học về y học, dược phẩm và nông nghiệp tại nhiều nước trên thế giới vẫn liên tục phát triển được hàng loạt các CKS mới có giá trị ứng dụng trong thực tiễn

Năm 1999, một CKS mới được phát hiện có tác dụng ngăn chặn hiện tượng cholesterol, tăng sức đề kháng đối với các chất độc của chuột, ngoài ra kháng sinh này còn có hoạt tính chống nấm gây bệnh mạnh Đó là kháng sinh

loposomal HA-92, được tách từ xạ khuẩn Streptomyces CDRLL-312

Năm 2003, nhiều nước trên thế giới vẫn tiếp tục phát hiện được hàng loạt các CKS mới Tại Nhật Bản, chất kháng sinh mới là Yatakemycin đã được tách

chiết từ xạ khuẩn Streptomyces sp.TP – A0356 bằng phương pháp sắc ký cột CKS này có khả năng kìm hãm sự phát triển của nấm Aspergillus fumigalus và

Candida albicans Ngoài ra chất này còn có khả năng chống lại các tế bào ung thư

Năm 2007, tại Hàn Quốc đã phân lập được loài xạ khuẩn Streptomyces sp.C684 sinh CKS laidlomycin, chất này có thể tiêu diệt được cả những tụ cầu

đã kháng methicillin và các cầu khuẩn kháng vancomycin [28]

Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học hiện đại cùng sự hỗ trợ của nhiều ngành khoa học khác đã giúp cho việc tìm kiếm và ứng dụng CKS đạt được những thành tựu rực rỡ Để sản xuất CKS con người không chỉ tìm kiếm những chủng vi sinh vật sinh CKS từ tự nhiên mà còn cải tạo chúng bằng nhiều phương pháp như dùng kỹ thuật di truyền và công nghệ gen, gay đột biến định hướng, chọn dòng gene sinh tổng hợp, tạo và dung hợp tế bào trần để tạo

ra các chủng có hoạt tính kháng sinh cao, đồng thời nhằm mục đích tìm kiếm các loại kháng sinh mới và quý trong thời gian ngắn [10],[26]

2.2.3 Sự hình thành chất kháng sinh ở vi khuẩn.[7,8,9]

Một trong những đặc điểm quan trọng của vi khuẩn là có thể có khả năng hình thành chất kháng sinh Có nhiều chất kháng sinh dùng trong y học hiện nay có nguồn gốc từ vi khuẩn

Đa số các chất kháng sinh có nguồn gốc từ vi khuẩn đều có phổ kháng sinh rộng, kìm hãm hoặc ức chế sự sinh trưởng và phát triển của nhiều loại vi sinh vật khác nhau Ngày nay, người ta đã biết chất kháng sinh là sản phẩm trao đổi thứ cấp của vi sinh vật, dẫu vậy vẫn còn nhiều giả thuyết khác nhau về vai trò của chất kháng sinh đối với vi khuẩn Một số giả thuyết cho rằng, sự hình thành chất kháng sinh là cơ chế giúp vi khuẩn tồn tại trong môi trường tự nhiên, sự hình thành chất kháng sinh là do sự cạnh tranh môi trường dinh dưỡng Lại có giả thuyết cho rằng chất kháng sinh chỉ là sản phẩm thải ra của quá trình trao đổi chất của tế bào [1] [25]

2.2.4 Các chất kháng sinh có nguồn gốc từ vi khuẩn

Các kháng sinh là một nhom thuốc thiết yếu trong y học hiện đại Nhờ các thuốc kháng sinh mà y học đã có thể loại bỏ được các dịch bệnh nguy hiểm Hiện nay trên thế giới người ta đã phát hiện trên 8000 chất kháng sinh và mỗi năm có khoảng vài trăm chất kháng sinh mới được phát hiện ra Trong tương lại chắc chắn còn có nhiều chất kháng sinh khác nữa sẽ được tìm ra vì đa số các

vi sinh vật có khả năng tạo thành chất kháng sinh được nghiên cứu đến nay đều

kháng sinh đều được sản xuất từ xạ khuẩn Chỉ có số ít vi khuẩn được tìm ra để điều chế ra thuốc kháng sinh, đầu tiên phải kể đến vi khuẩn Bacillus subtilis: được Ferdinand Cohn – một cộng sự của Robert Koch mô tả và đặt tên năm

1872 Là vi khuẩn Gr+, cókhả năng tổng hợp một số chất kháng sinh có tác dụng ức chế sinh trưởng hoặc tiêu diệt một số vi sinh vật khác

Hiện nay, các nhà khoa học ở thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng vẫn đang tìm tòi nghiên cứu, đưa ra những thuốc kháng sinh có nguồn gốc từ vi khuẩn có thể kháng lại các bệnh nguy hiểm gây cho con người và động vật

2.3 Giới thiệu về vi sinh vật biển

Vùng biển Việt Nam trải dài trên 15 vĩ độ, nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa Đông Nam Á Vị trí địa lý cũng như những đặt trưng về lịch sử phát triển địa chất, điều kiện khí hậu, thủy lý hóa học…đã tạo nên nơi đây một môi trường sống riêng, liên quan chặt chẽ với đời sống vi sinh vật biển trong vùng biển này Biển ở Việt Nam có địa hình tương đối bằng phẳng, thuận lợi cho việc khai thác các khoáng sản, sinh vật quý Đây là một điều kiện thuận lợi để nước ta phát triển đa dạng các ngành kinh tế biển và ven biển trong hơn 50 năm qua Hiện nay, trong xu thế cả thế giới đang vươn mạnh ra biển để khai thác tiềm năng sẵn có của đại dương, việc điều tra nghiên cứu môi trường và tài nguyên sinh vật biển ngày càng khẳng định những ý nghĩa quan trọng với đất nước trong giai đoạn mới [18] [16]

Các đại dương trên thế giới chứa các mức độ khác nhau của sự da dạng vi khuẩn Mặc dù phần lớn sự đa dạng này chưa có đặc tính riêng biệt, môi trường nuôi cấy đặc trưng có từ một phạm vi rộng lớn của các nhóm vi sinh vật đã

được chứng minh là nguồn chất chuyển hóa thứ cấp mới quan trọng Các chất chuyển hóa đó bao gồm những bộ khung cacbon mới cũng như các hợp chất có mức độ halogen hóa cao- một tính chất tương đối phổ biến của các chất chuyển hóa thứ cấp có nguồn gốc từ biển Các vi khuẩn được nuôi cấy từ môi trường biển bao gồm loài mới được chứng minh là nguồn đặc biệt quan trọng của các thực thể hóa học mới

Môi trường biển bao gồm vô số các môi trường sống với sinh thái khác nhau Vì vậy, không đáng ngạc nhiên khi vi khuẩn thích nghi với cuộc sống trong môi trường biển rất đa dạng, khác biệt và duy trì sự thích nghi sinh tồn khác với vi khuẩn trên đất Một trong những khác biệt sinh lý sớm nhận ra nhất giữa các vi khuẩn có nguồn gốc từ biển là yêu cầu của nước biển, hay cụ thể hơn natri, dùng cho sự tăng trưởng Vi khuẩn nuôi cấy từ mẫu biển mọc tốt như nhau trong môi trường được chuẩn bị bằng nước biển hoặc nước khử ion Ngược lại, vi khuẩn có khả năng tăng trưởng trên môi trường chuẩn bị với nồng

độ muối tương đương với nước biển có thể được dễ dàng nuôi cấy từ mẫu không thuộc biển Những chủng này, nó có thể được coi là có tiềm năng tăng trưởng trong cả hai môi trường [8] [15]

Năm 1997, Heidi Schulz đã tìm thấy vi khuẩn Thiomargarita namibiensis trong tầng lắng đọng ở vùng biển Namibia – bờ biển phía Tây của Châu Phi Được coi là vi khuẩn lớn nhất hành tinh (thường có đường kính 0,1-0,3mm) Người ta phát hiện ra bên trong tế bào vi khuẩn chứa rất nhiều hạt lưu huỳnh dự trữmàu trắng, nhận thấy mặt có ích, có hại của chủng vi khuẩn này, nhiều nhà khoa học

đã tiến hành nghiên cứu và tìm tòi ra các phát hiện mới mẻ [45]

Theo kết quả nghiên cứu nguồn lợi vi sinh vật biển ở Việt Nam trải qua ba giai đoạn phát triển (trước năm 1954, từ năm 1954-1975 và từ năm 1976 đến nay), công tác điều tra, nghiên cứu biển Việt Nam đã không ngừng gặt hái được những thành công đáng kể Đặc biệt là giai đoạn sau khi đất nước thống nhất, tình hình nghiên cứu biển nói chung và nguồn lợi sinh vật biển nói riêng đã có những bước tiến khá mạnh mẽ cả về số lượng và chất lượng Kết quả đáng ngạc nhiên là đã xác định được danh mục gần 12.000 loài sinh vật biển Việt Nam, bao gồm cả động, thực vật và vi sinh vật Trong xu thế cả thế giới đang vươn mạnh ra biển để khai thác tiềm năng sẵn có của đại dương, việc điều tra nghiên cứu môi trường và tài nguyên vi sinh vật biển Đông ngày càng khẳng định những ý nghĩa quan trọng với đất nước trong giai đoạn mới.[44]

2.4 Giới thiệu về một số vi sinh vật kiểm định gây bệnh đường ruột

2.4.1 Escherichia coli.[43]

2.4.1.1 Giới thiệu về Escherichia coli

Hình 2.6 Vi khuẩn E.coli

• Được phát hiện vào năm 1885, do Theodore Escherich (1857-1911) –

một bác sĩ nhi khoa người Áo tìm ra

• E.coli là một trong những thành viên chính của hệ vi khuẩn bình thường

ở đường ruột, nhưng cũng là căn nguyên của nhiều bệnh nhiễm trùng

• E.coli đã được sử dụng làm mô hình nghiên cứu về sinh học phân tử trong lĩnh vực vi sinh học nói riêng và sinh học nói chung

• E.coli có khả năng lên men nhiều loại đường và có khả năng sinh hơi

E.coli có khả năng sinh Indol, không sinh H2S, không sử dụng được nguồn carbon của citrat trong môi trường Simmons, có deoxycarboxylase nên có khả năng phân giải carborxyl của lysin, ornithin, arginin và acid glutamic

Thử nghiệm VP (Voges – Proskauer) sau 24h âm tính, sau 48h có thể dương

sau đó Schweinittz và Dorset 1903 đã chứng minh bệnh dịch tả là do một

loại vi rút gây nên và đã xác định là vi khuẩn gây bệnh thương hàn

• Salmonella đã từng được chia thành các chi phụ và nhiều loài, mỗi loài lại

có khả năng có chi phụ Salmonella enterica được chia thành 6 loài phụ gồm S.enterica, S.salamae, S.arizonae, S.diarizonae, S.houtenae và

• Salmonella enterica là trực khuẩn Gram âm, kích thước trung bình từ

2-3×0,5-1µm, di chuyển nhờ tiên mao, không tạo bào tử, chúng phát triển tốt ở nhiệt độ 6oC – 42oC, thích hợp nhất ở 35oC – 37oC, pH từ 6 – 9 và thích hợp nhất ở pH =7,2 Ở nhiệt độ từ 18oC- 40oC vi khuẩn có thể sống đến 15 ngày

• Salmonella enterica là vi khuẩn kị khí, phát triển được trên các môi

trường nuôi cấy thông thường Trên môi trường thích hợp, vi khuẩn sẽ phát triển sau 24h Đây là loại vi khuẩn có thể sống trong các ống ruột của người và động vật và gây nên hiện tượng ngộ độc thực phẩm trong điều kiện không đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm [28] [29]

2.4.3 Bacillus cereus

2.4.3.1 Giới thiệu:

Hình 2.8 Vi khuẩn Bacillus cereus

Phát hiện đầu tiên về các mầm bệnh gây ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn B.cereus là từ năm 1949 khi Hauge đã phân lập mẫu từ xốt vani sau khi có một

ca ngộ độc thực phẩm gây tiêu chảy tại bệnh viện ở Oslo, Norway [30] [31]

Chi: Bacillus

Loài: Cereus

2.4.3.3 Đặc điểm:

• Bacillus cereus là trực khuẩn Gr+, có khả năng tạo nội bào tử, có kích

thước 0,5-1,5×2-4µm Không tạo giáp mô, không có khả năng di động

• Bacillus cereuslà loài vi khuẩn hiếu khí, bào tử dạng hình ovan, có khả

năng sinh nha bào

• Nhiệt độ tối thích: 35-40oC

• pH tối thích: 4,5-9,3

• Phân bố nhiều trong tự nhiên, nhiễm vào các loại thức ăn qua đêm hay trữ lạnh lâu, thường gây ngộ độc thực phẩm

PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu và hóa chất

3.1.1 Vật liệu nghiên cứu

Năm mẫu trầm tích được lấy tại ba tọa độ khác nhau bằng hai phương pháp dùng cuốc và Scuba từ khu vực đáy biển ở Văn Phong – Khánh Hòa, được chuyển tới phòng Công nghệ Sinh học, Viện Hóa sinh biển – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam để phân lập và giữ chủng

3 chủng vi sinh vật kiểm định bao gồm:2 chủng vi khuẩn Gram (–)

(Escherichia coli ATCC25922, Salmonella enterica ATCC12228), 1 chủng Gram (+)Bacillus cereus ATCC 13245)

3.1.2 Hóa chất, thiết bị

3.1.2.1 Hóa chất

-Hóa chất được sử dụng trong phân lập và nuôi cấy vi khuẩn : agar, cao nấm men, peptone, tinh bột tan, NaCl, KBr, FeSO4, CaCO3, NaCl 0,9%, nước biển nhân tạo (H20 11, MgSO.7H2O 3.50g, NaHCO3 0,11g, MgCl2.6 H2O 4.80g, CaCl2.2 H2O - 1.60g, KCl 0,77g, NaCl 28,13g)

- Hóa chất dùng trong Sinh học phân tử : Mồi, MgCl2, dNTP, Taq polymerase, EDTA 0,5 M (pH 8), tris base, ethidium bromide, Tris HCl (pH 8) 0,01 M, EDTA (pH 8) 0,025m, SDS, enzyme lysozyme, phenol, chloroform, isoamyl alcohol, isobutanol, ethanol, iso propanol, cồn, NaOH pH 7,3

3.1.2.2 Thiết bị

Tên thiết bị Hãng sản xuất

Tủ cấy vô trùng Sanyo (Nhật)

Máy lắc Gyromax 737R Amerex Instrument (Đức)

20mg/ml KBr 5ml 8mg/ml FeSO4 5ml