báo cáo THỰC HÀNH hóa SINH đại CƯƠNG

Kết tủa này là Albumin- Cho các kết tủa 1 và 2 vào 2 ống nghiệm khác - Thêm vào mỗi ống 2 – 3 ml nước cất, lắc đều → Kết Quả: Kết tủa tan hết tạo dung dịch keo - Giải thích kết quả: Dun

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÂM NGHIỆP

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ VI SINH - HÓA SINH

MỞ ĐẦU THỰC HÀNH HÓA SINH ĐẠI CƯƠNG

1 Mục đích:

- Thông qua các bài thực hành giúp sinh viên củng cố, hệ thống hoá phần kiến thức

lý thuyết đã được học trên lớp môn học “Hóa Sinh Học”

- Thông qua thực hiện các bài thực tập cụ thể tại phòng thí nghiệm Hóa sinh giúp sinh viên bước đầu làm quen, nắm được các nguyên lý và được thực hiện một số phương pháp hóa sinh thường được dùng trong các phòng thí nghiệm, như: định tính các hợp chất của cơ thể (Protein; axit amin; Lipid; Saccarit; Vitamin ) và định lượng các hợp chất đó

- Tăng cường kỹ năng nghiên cứu và làm thực nghiệm của sinh viên chuyên ngành Công nghệ sinh học

- Thông qua thực hiện các nội dung cụ thể, sinh viên phải có kỹ năng thực hiện:+ Sử dụng và thực hiện thành thạo các thao tác sử dụng các loại máy móc, thiết bị

và các dụng cụ cần thiết dùng trong phòng thí nghiệm hóa sinh: máy ly tâm, máy

đo pH, , cân điện tử, cân phân tích, pipet mant, ống đong, cốc đong định mức, bình định mức, bếp từ, bể ổn nhiệt

+ Thực hiện được các tính toán chính xác khối lượng các hóa chất cần thiết để pha dung dịch chuẩn và dung dịch đệm thường được sử dụng trong thí nghiệm hóa sinh

+ Thực hiện được các thí nghiệm chứng minh tính chất, định tính các hợp chất: Protein; axit amin; Saccarit; Lipid; Vitamin

- Thực hiện được các thí nghiệm định tính các hợp chất: Protein; Saccarit

BÀI 1: TÍNH CHẤT CỦA PROTEIN – AXIT AMIN

I Tính chất của Protein

I.1 Tính chất keo của dung dịch Protein

Dung dịch protein là keo ưa nước, chúng bền vững là nhờ màng nước bao quanh phân tử Các yếu tố vật lý hay hóa học có khả năng tác dụng lên phá hủy màng nước xung quanh phân tử protein sẽ ảnh hưởng đến protein có thể làm chúngkết tủa

Kết tủa có thể là thuận nghịch hoặc không thuận nghịch Ứng dụng các

phương pháp kết tủa thuận nghịch protein để tách protein và enzym ở dạng tinh khiết

a Kết tủa bằng muối trung tính

Muối trung tính làm trung hòa điện và làm loại đi lớp vỏ nước của phân tử keo protein làm chúng kết tủa Protein khác nhau kết tủa ở nồng độ muối khác nhau

- Cho vào ống nghiệm 2ml lòng trắng trứng

- Thêm vào 2ml (NH4)2SO4 bão hòa, lắc đều

→ Kết quả:Thu được một kết tủa trắng dẻo (1) Kết tủa này là Globumin

- Để yên 5 phút, lọc thu dịch lọc sang ống nghiệm khác

- Cho vào dịch lọc 2-3 gam tinh thể (NH4)2SO4 , lắc đều

→ Kết quả: Thu được kết tủa thứ hai màu trắng bông, hơi đặc và có tính dẻo kém (2) Kết tủa này là Albumin

- Cho các kết tủa 1 và 2 vào 2 ống nghiệm khác

- Thêm vào mỗi ống 2 – 3 ml nước cất, lắc đều

→ Kết Quả: Kết tủa tan hết tạo dung dịch keo

- Giải thích kết quả:

Dung dịch protein là keo ưa nước, chúng bền vững là nhờ màng nước bao

quanh phân tử Các phân tử keo có kích thước lớn, không đi qua màng bán thấm Do trên bề mặt phân tử protein có các nhóm phân cực, khi hào vào nước cac phân tử nước lưỡng cực được hấp thụ bởi các nhóm này tạo thành màng nước bao quanh phân tử protein gọi là các lớp vỏ hidrat Khi có mặt của các tác nhân vật lý hay hóa học màng nước bao quanh bị phá vỡ làm trung hòa các diệntích sẽ ảnh hưởng đến protein có thể làm chúng kết tủa Sự kêt tủa này có thể thuận nghịch hoặc không thuận nghịch tùy thuộc vào bản chất của yếu tố gây kết tủa, thời gian và điều kiện phản ứng

Dưới tác động của nhân tố gây kết tủa protein sẽ trở lại trạnh thái ban đầu tạo thành dung dịch keo bền như trước Đó là hiện tượng kết tủa thuận nghịch hay mất khả năng tạo thành dung dịch keo Các nhân tố gây kết tủa thuận nghịch protein là: muối trung tính, kim loại kiềm, kiềm thổ, các dung môi hữu cơ, Muối (NH4)2SO4 là một loại muối trung tính (nhân tố gây kết tủa thuận

nghịch) vừa làm trung hòa điện vừa làm loại đi lớp vỏ nước của phân tử keo protein làm chúng kết tủa Các protein khác nhau kết tủa ở nồng độ khác nhau Lòng trắng trứng chứa hai loại protein chính: Albumin vafGlubulin người ta dùng muối (NH4)2SO4 có độ bão hòa khác nhau để tách riêng hai loại đó

Albumin bị kết tủa ở nồng độ muối (NH4)2SO4 khóa cao khoảng 70% - 100% Glubulin bị kết tủa ở nồng độ muối (NH4)2SO4 bán bão hòa Do đó khi thêm 5ml (NH4)2SO4 ta thu được kết tủa Albumin

Còn sau khi cho hai kết tủa tác dụng với nước, kết tủa tan ra tạo thành dung dịch keo là do muối trung tính (NH4)2SO4 là tác nhân thuận nghịch nên khi ta loại bỏ tác nhân này thì proteitnlaij trở lại trạng thái ban đầu.

I.2 Kết tủa protein bằng muối kim loại nặng

Những muối kim loại nặng (Cu2+; Fe3+; Pb2+ ) tác dụng với protein tạo thành kết tủa không tan Nhưng nếu dư muối, kết tủa lại tan do những phần tử keo hấp thụ ion kim loại nặng, trở nên tích điện Ion có hóa trị càng cao, kết tủa càng dễ tantrở lại

- Lấy 3 ống nghiệm sạch, khô

- Cho vào mỗi ống 2ml dung dịch lòng trắng trứng 5%

- Thêm vào ống I: 1 giọt dung dịch FeCl3 5%

ống II: 1 giọt chì axetat 5%

ống III: 1 giọt CuSO4 5%

- Quan sát kỹ, sau đó cho thêm vào lượng muối kim loại tương ứng vào từng ống

- So sánh sự hòa tan kết tủa ở các ống

d Kết quả và giải thích

- Kết Quả:→ Khi cho thêm 1 giọt muối vào các ống nghiệm

+ Ống I tạo thành kết tủa có màu đỏ cam

+ Ống II tạo thành kết tủa có màu trắng sữa

+ Ống III tạo thành kết tủa có màu xanh nhạt

→ Khi cho thêm dung dịch muối để kết tủa tan

+ Ống I mất 6 giọt để kết tủa tan

sự phá hủy sâu sắc cấu trúc bậc 2,3 của phân tử protein Nhưng nếu thừa các ionkim loại nặng kết tủa lại bị tan ra do phân tử keo hấp thụ các ion kim loại nặng

và trở thành trạng thái tích điện Ion có hóa trị càng cao kết tủa càng dễ tan trở lại Mặc dù protein tan nhưng bị bến tính hoàn toàn

Ứng dụng: khả năng tạo kết tủa không tan của protein với các muối kim loại nặng được sử dụng trong những trường hợp bị ngộ độc muối của Cu; Pb; Fe; khi cơ thể chưa hấp thu protein thì sữa, trứng thường được dùng để giải độc

BÀI 2: Các phản ứng màu của protein, axit amin

I Phản ứng biure

Là phản ứng đặc trưng của liên kết peptit Trong môi trường kiềm, các hợp chất

có chứa từ 2 liên kết peptit trở lên có thể phản ứng với CuSO4 tạo phức chất màu xanh tím, tím hoặc tím đỏ tùy thuộc số lượng liên kết peptit nhiều hay ít

- Cho vào ống nghiệm khô 1 ít tinh thể ure

- Đun trên ngọn lửa yếu để ure nóng chảy, đến khi cứng lại thì ngừng đun

- Để ống nguội, thêm vào 2ml NaOH 10%, lắc cho tan

- Thêm vài giọt CuSO4 1%, quan sát màu

→ Kết quả: thu được dung dịch có màu tím hồng

→ Giải thích: khi đun nóng 2 phân tử ure kết hợp lại tạo thành Biure làm xuất

hiện liên kết peptit: – CO – NH phản ứng Biure là phản ứng dặc trưng của liên

kết peptit Trong môi trường kiềm, Biure kết hợp với CuSO4 cho phức muối Cu

có màu tím hồng

Ta có phương trình:

• Phản ứng với Protein

- Cho vào ống nghiệm 3ml dung dịch lòng trắng trứng 5%

- Thêm vào 1ml NaOH 10% và 1-2 giọt dung dịch CuSO4 1%, lắc kỹ

→ Kết quả: Thu được dung dịch có màu tím.

→ Giải thích: trong dung dịch lòng trắng trứng có những liên kết peptit – CO –

NH – nên cũng cho phản ứng biure tạo phức chất muối Cu với poly peptit có màu tím

Các polypeptit chất phức màu Biure

Phản ứng biure là phản ứng đặc trưng của liên kết peptit Trong môi trường kiềm, các hợp chất có chứa từ hai liên kết peptit trở lên có thể phản ứng với CuSO4 tạo phức chất màu xanh tím, tím hoặc tím đỏ tùy thuộc số lượng liên kết peptit nhiều hay ít Phản ứng biure được sử dụng rộng rãi để phát hiện và định lượng protein

II Phản ứng xantoprotein của axit amin vòng

Các axit amin vòng: phenylalanin; tirozin; triptophan khi tác dụng với HNO3đặc tạo dẫn xuất nitro màu vàng Khi thêm dung dịch kiềm vào sẽ tạo thành muối

có màu da cam Các axit amin không vòng, protein không chứa axit amin vòng không cho phản ứng này

c Tiến hành:

- Lấy 2 ống nghiệm sạch, khô, đánh dấu

- Cho vào ống I: 3ml lòng trắng trứng 5%

- Cho vào ống II: 3ml gelatin 1%

- Thêm vào mỗi ống nghiệm 1ml HNO3 đặc

- Đun sôi cách thủy hỗn hợp phản ứng 1 phút

- Làm nguội, thêm từ từ vài giọt NH4OH đặc

→ Kết quả:

+ Ống 1: khi đun dung dịch có màu vàng của dẫn xuất nitro Khi thêm kiềm

NH4OH sản phẩm này chuyển thành muối có màu vàng da cam đặc trưng

+ Ống 2: Gelatin không có axit amin nhân thơm nên phản ứng không xảy ra.

→ Giải Thích: khi cho HNO3 vào protein lòng trắng trứng, các axit amin nhân thơm có trong protein lòng trắng trứng sẽ bị nitro hóa nhân thơm tạo dẫn xuất nitro có màu vàng

→ Kết Luận: Phản ứng xantoprotein là phản ứng đặc trưng để phát hiện axit

amin nhân thơm Các axit amin nhân thơm: phenylalanin; tirozin; triptophan; khi tác dụng với HNO3 đặc tạo ra dẫn xuất nitro màu vàng Khi thêm dung dịch kiềm vào sẽ tạo thành muối có màu da cam

III Phản ứng của axit amin chứa lưu huỳnh (phản ứng Folia)

Các axit amin chứa lưu huỳnh như: xistein; xistin; metionin dưới tác dụng của

kiềm bị phân hủy tạo thành natri sunfua

- Lấy 3 ống nghiệm khô, sạch

- Cho vào ống I: 2ml nước cất

- Cho vào ống II: 2ml lòng trắng trứng 1%

- Cho vào ống III: 2ml Xistein 1%

- Cho vào mỗi ống 2ml NaOH 10%

- Đun sôi 3 phút

- Lắc đều, thêm vào vài giọt Cu(CH3COO)2 1%

- Quan sát sự tạo thành kết tủa, giải thích

d Kết qua và giải thích:

→Kết quả:

- Ống I: Không có hiện tượng xảy ra

- Ống II và III: trong ốn nghiệm xuất hiện những kết tủa màu xám, đen, lơ lửng trong dung dịch

→ Giải thích: trong protein lòng trắng trứng có chứa cá axit amin có lưu huỳnh như: xistein, xistin Khi đun nóng với kiềm dư và muối chì thì sẽ tạo kết tủa chì

sunfua lơ lửng trong dung dịch

Pb(CH3COO)2 + 2NaOH 2CH3COONa + Pb(OH)2 + NaOH dư

Pb(OH)2 + 2NaOH Na2PbO2 + H2O + NaOH dư

Na2S + Na2PbO2 + 2H2O PbS đen + 4 NaOH

- Xistein là axit amin chứa lưu huỳnh (S) vì vậy cũng có phản ứng như trên

- Chì axetat them nước cất và có thêm NaOH dư thì có phản ứng xảy ra tuy nhiên

sản phẩm tạo thành là dung dịch trong suốt

Ta có các phương trình phản ứng sau:

Pb(CH3COO)2 + 2NaOH Pb(OH)2 Trắng + 2CH3COONa + NaOH

Pb(OH)2 + 2NaOH dư Pb(OH)4Na2 (Không màu)

→ Kết luận: Các axit amin chưa lưu huỳnh dưới tác dụng của kiềm bị phân hủy

tạo thành natri sunfua

- Cho vào ống nghiệm 2ml dung dịch glucoz 5%, 2ml dung dịch NaOH 10%

- Thêm từng giọt CuSO4 5% vào đến khi xuất hiện kết tủa xanh của Cu(OH)2

- Đun đến sôi, quan sát hiện tượng và giải thích

- Phương trình phản ứng:

CuSO4 + NaOH + C6H12O6 nhiệt độ Cu2O đỏ gạch + C6H11O7Na

(Glucozo) (Sodium gluconate)

Màu đen xuất hiện là do: CuSO4 dư, NaOH dư nên xảy ra phản ứng:

CuSO4 + 2NaOH Cu(OH)2 + Na2SO4

Cu(OH)2 nhiệt độ CuO đen + H2O

- Lấy 2 ống nghiệm, ống 1: cho 2ml nước, thêm 1 giọt xanh metylen 1% và 4 giọtNaOH 5%, đun sôi – quan sát

- Ống 2: làm như trên, thay nước cất bằng dung dịch glucoz 1% Quan sát

- Làm lạnh cả 2 ống trong vài phút Quan sát và giải thích

d Két quả và giải thích

→ Kết quả:

- Ống 1: dung dịch không thay đổi màu

- Ống 2: Dung dịch mất màu, trở thành dung dịch trong suốt khi đun nóng và màu xanh xuất hiện trở lại khi làm lạnh

→ Giải thích: Dưới tác dụng của glucozo, xanh metylen khử thành chất không màu

II Tính chất của enzym

1 Amilaz nước bọt

Amilaz nước bọt người thuộc loại alpha –amylaz, xúc tác cho phản ứng thủy phân tinh bột thành các dextrin khác nhau Các dextrin này khác nhau về khối lượng phân tử, khả năng cho phản ứng màu với I ốt và khả năng khử dung dịch Fehling

- Chuẩn bị dung dịch nước bọt: súc miệng sạch, lấy 50ml nước cất để súc miệng nhẹ vài lần khoảng 3-5 phút Lọc dịch nước bọt qua bông và dịch bọt dùng để thí nghiệm.

- Thủy phân tinh bột: chuẩn bị 2 ống nghiệm, cho vào mỗi ống 5ml dung dịch tinh bột Thêm vào ống thứ I: 5ml dung dịch nước bọt , ống thứ II: 5ml nước cất , lắc đều - Để vào mỗi ống một chiếc đũa thủy tinh, đặt cả 2 ống vào nồi cách thủy 40

oC Sau 1, 2, 4, 6, 8 phút dùng đũa thủy tinh lấy từ mỗi ống nghiệm 1giọt hỗn hợp phản ứng nhỏ vào các miếng trên bản sứ, thêm vào mỗi giếng 2 giọt thuốc thử liugôn

- Quan sát mầu ta thấy ở dẫy thí nghiệm (chứa nước bọt) có sự biến đổi màu các giọt trên bản sứ, tùy theo thời gian phản ứng: từ màu xanh tím đến đỏ nâu, đỏ và cuối cùng là màu vàng ở dãy kiểm tra, tất cả các giọt đều có màu xanh tím

- Giải thích kết quả thu được

- Thử khả năng khử hỗn hợp Fehling: Thêm vào ống I và II mỗi ống 2ml hỗn hợp Fehling, đun sôi, ở ống có amilaz xuất hiện kết tủa đỏ nâu của Cu2O

- Tiếp tục thêm vào cả hai ống nghiệm mỗi ống 2ml hốn hợp Fehling, đun sôi thì

ở ống 1 (amylaza) ta thấy xuất hiện kết tủa đỏ nâu của Cu2O

→ Giải thích: Trong nước bọt của chúng ta có chứa enzym amylaza Amylaza trong nước bọt người thuộc laoij alpha – amylaza, xúc tác cho các phản ứng thủa phân tinh bột thành các dextrin khác nhau Các dextrin này khác nhau về khối

lượng phân tử, khả năng cho phản ứng màu với I ốt và khả năng khử dung dịch Fehling.

- Ống 1: do enzym xúc tác thủy phân tinh bột thành các dextrin và hàm lượng tinh bột giảm dần cho đến hết Nếu tinh bột còn màu quan sát được là màu xanh tím Màu xanh tím nhạt dần có nghĩa là hàm lượng tinh bột đã bị thủy phân mất dần đi Khi trong ống nghiệm mất hết màu xanh tím chuyển qua màu vàng có nghĩa là chứng tỏ tinh bột đã bị enzym thủy phân hết Khi ở 8 phút ta nhận thấy màu đỏ nâu đó là do lượng còn dư của thuốc thử luigon gây nên

Khi Tiếp tục thêm vào cả hai ống nghiệm mỗi ống 2ml hốn hợp Fehling, đun sôi thì ở ống 1 (amylaza) ta thấy xuất hiện kết tủa đỏ nâu của Cu2O Đó là do dưới tác dụng của enzym amylaza đã thủy phân tinh bột thành nhiều loại dextrin khác nhau

 Giải thích thêm về thuốc thử Fehling là hỗn hợp của hai dung dịch: dung dịch CuSO4 là Fehling 1 và dung dịch kieemfcuar muối seignett(muối kalinatritactrat) gọi là Fehling 2 Khi trộng hai dung dịch này với nhau thì xảy ra phản ứng giữa chúng theo hai giai đoạn Đầu tiên là tạo kết tủa đồng hidroxit màu xanh da trời

PTPU: CuSO4 + 2NaOH Cu(OH)2 + Na2SO4Giai đoạn tiếp theodung dịch Cu(OH)2 tác dụng với dung dịch muối seignett tạo thành muối phức hòa tan, dung dịch có màu xanh thẫm Muối phức trên là hợp chất không bền Các đường có chứa nhóm andehit hoặc xeton dễ dàng khử Cu2+ tạo kết tủa đồng ô xít màu đỏ gạch và đường bị oxi hóa khi tác dụng với dung dịch Fehling

III Các phản ứng định tính lipid

1 Tính chất lý hóa của mỡ

1.1 Tính tan

Dưới tác dụng của các dung môi hữu cơ khác nhau, độ hòa tan của mỡ là khác nhau.

- Chuẩn bị 3 ống nghiệm sạch, khô

- Cho vào ống nghiệm 1: 2ml nước cất, ống 2, 3, mỗi ống tương ứng 2ml dung dịch etanol, cloroform

- Thêm từng giọt dầu lạc vào mỗi ống , lắc đều

- Quan sát sự sai khác độ hòa tan của dầu lạc trong các dung môi khác nhau

d Kết quả và giải thích:

→ Kết quả:

1 (nước cất) Dầu lạc không tan, nổi lên bề mặt

2 (Etanol) Dầu lạc không tan, chìm xuống đáy ống

3 (Cloroform) Dầu lạc tan hết tạo dung dịch đồng nhất

→ Giải thích: Do thành phần của lipit có chứa các gốc axit béo bậc cao không phân cực nên lipit tan tốt trong các dung môi hữu cơ và dung môi không phân cực Dầu lạc là một oại lipit được triết xuất từ thực vật nên có tính tan như tính chất chung của lipit

Ống nghiệm 1 và 2 là nước cất và etanol Mà nước cất là dung môi phân cực vàetanol là dung môi vô cơ nên dầu lạc khong tan trong hai dung môi này ống 1 dầu lạc nổi lên trên mặt là do dầu nhẹ hơn nước ống 2 dầu lạc chìm xuống là vì dầu lạcnặng hơn etanol

Cloroform là dung môi hữu cơ nên dầu lạc dễ dàng tan trong cloroform

1.2 Sự tạo thành nhũ tương

Mỡ không hòa tan trong nước, vì vậy, sau khi lắc mạnh mỡ với nước rồi để yên hỗn hợp một lúc, mỡ lại tạo thành một lớp nổi trên bề mặt, tuy nhiên, nếu có mặt của chất tạo nhũ tương (axit mật, xà phòng ) sẽ tạo nhũ tương mỡ trắng đục

- Lấy 2 ống nghiệm, cho vào ống mỗi ống 4ml nước cất

- cho vào mỗi ống thêm vài giọt dầu