Bài Giảng Kỹ Thuật Bế Bào Gốc

Marker mark: dấu, nhãn hiệuCD: Cluster Designation cụm, chỉ định Các marker ung thư Các marker TBG phôi Các marker TBG trung mô Các marker TBG nội mô Các marker TBG các mô Các marker TB

XÁC ĐỊNH MỤC TIÊU

TÁCH CHIẾT TỪ MÔ

THU NHẬN THÔ - TINH KIỂM TRA NHIỀU BƯỚC LẬP LÝ LỊCH DÒNG TB BẢO QUẢN - SỬ DỤNG

TBG

Marker (mark): dấu, nhãn hiệu

CD: Cluster Designation (cụm, chỉ định)

Các marker ung thư

Các marker TBG phôi

Các marker TBG trung mô

Các marker TBG nội mô

Các marker TBG các mô

Các marker TBG tạo máu

…

(TÌM KIẾM - THU NHẬN)

TÌM Ở ĐÂU ?

1- Ngân hàng (tế bào, mô)

2- Phôi (người, động vật)

3- Mô (người bệnh, người hiến)

4- Biến đổi gen TB soma

+ Mềm (máu, tuỷ, dịch ối…) + Cứng (Mô mỡ, khối u,

mô nhũ nhi, các mô khác…)

Thai bỏ

Phải tách rời tế bào ?

.Loại bỏ giá thể mô

.Loại bỏ tín hiệu mô

.Loại bỏ vi môi trường cũ

.Tạo không gian mới

.Giải phóng protein bề mặt

.Thu được TB ứng viên

.Loại bỏ các nhân tố tạp

TB SẴN SÀNGCHO MỘT CƠCHẾ HOẠTĐỘNG MỚI

MÔ CỨNG

MÔ LỎNG HỘP NUÔI TRƯỚC ĐÓ Tách từ

NUÔI SƠ CẤP (Thu tế bào ứng viên)

LỌC

NUÔI ĐẶC HIỆU FLOW CYTOMETRY

HUYỀN PHÙ HỖN HỢP TB - HOẶC MÔ LỎNG

LY TÂM

Phôi nguyên được tách bỏ lớp dưỡng bào bằng micropipette dưới kính HV vi thao tác

THU NHẬN TBG PHÔI

- Phôi thường (EN)

- Phôi hỗ trợ SS (ART)

Blastomere

- Phôi ngân hàng (G & E-B)

- Phôi nhân bản (E-cloning)

TBG CHỈ CÓ THỂ BÁM DÍNH VÀ PHÁT TRIỂN TRÊN CÁC NUÔI CHUYÊN BIỆT

PÉTRI

Các marker Integrin, CD 133…

ROUX

scaffold

Clip : Nuôi tách TB bám dính và huyền phù

Flow cytometer: Becton Dickinson

sản xuất, dòng FACS-Caliburs

FACS Calibur: bộ phận thu nhận (catcher) di chuyển vào - ra dòng tb để thu nhận các tb đích

Tốc độ nhận 300 tb/giây

Có lớp feeder

Không lớp feeder

Feeder có thể được phát triển từ lớp nguyên bào sợi của một số chủng chuột (lớp tb này được ức chế tăng trưởng)

Sử dụng cho các TBG có thể bám và phát triển trên giá thể plastic, thủy tinh của

dụng cụ nuôi chuyên biệt

Vài trường hợp, cần lót lớp gelatin trên bề mặt đĩa nuôi để tăng sự bám dính của tb

Cho phép tb biệt hóa tự phát trong

môi trường

Thao tác điều khiển tb biệt hóa để

hình thành các loại tb chuyên biệt

Tiêm tb vào chuột suy giảm miễn dịch để kiểm tra sự hình thành khối teratoma Các phương pháp khác…

Kiểm tra tb gốc phôi

Nếu mES toàn năng, thế hệ con sẽ khảm, bởi nó

chứa trộn lẫn các mô và cơ quan thu nhận từ cả

mES và những tb có sẵn của blastocyst nhận Kiểm tra tính đa năng mES

* Test đầu tiên (Nagy và cs; 1998) và khắt khe nhất:

- Tiêm mES vào khoang của phôi blastocyst

- Sau đó, blastocyst được chuyển vào tử cung

(B) (C)

Tiêm TB vào tinh hoàn hay dưới da,

vỏ thận ĐV khiếm khuyết miễn dịch

Nếu có tính đa năng, các tb bắt đầu hình

thành khối u (teratoma) chứa các mô khác

nhau phát sinh từ cả 3 lá phôi

Một số cấu trúc như dạ dày, các loại cơ,

mô thần kinh, sụn, xương và tóc được hình

thành, sắp xếp một cách rất rối loạn

(Martin)

kiểm tra mES

TB gốc người tạo khối u trong cơ thể chuột

(từ các bệnh viện, viện thẩm mỹ, hiệp hội )

Tách các tế bào thành tb đơn

Thu nhận TBG từ huyền phù

Tính chất bám dính Tính chất phát triển phân chia Marker chuyên biệt bề mặt

Các tính chất khác

SAU ĐÓ DỰA VÀO

Thuï theå keânh ion Thuï theå Protein G

VK

Biệt hóa tạo cơ tim

CLIP 10

- Một số hormon, cytokine,

vitamin, các ion Ca2+…

- Acid retinoic, DMSO,

Acid ascorbic và 5-Azacytidine

Dexamethasone

TẠO CÁC YẾU TỐ BIỆT HÓA TBG THEO HƯỚNG MONG MUỐN

(directed differentiation)

Trong nuôi cấy, các chất này tác động lên

marker bề mặt TBG- qua đó hoạt hóa gen

Chuột được làm suy giảm miễn dịch

CLIP 11

- Xung điện,

- Các lực cơ học và xử lý nhiệt…

Làm giảm nhiệt độ tế bào cơ tim phôi chuột sẽ tăng sự biểu hiện của TGF-β

Hệ quả của chiến lược này là một gen

hoạt động được đưa vào bộ gen TBG

và sau đó kích hoạt biệt hoá

Biệt hóa đồng nuôi cấy

Hai loại tb sẽ tương tác và dẫn đến sự truyền

các tín hiệu phân tử một cách hiệu quả gây cảm

ứng sự biệt hoá TBG thành kiểu tb quan tâm

(trong in vivo: Tb A là mô cơ thể người bệnh)

Tb A

TBG

Tb A sẽ chết

Tb cần thu nhận

Các TBG có thể được nuôi cấy với một quần thể tb đã (hay đang) biệt hoá

Làm lạnh và thuỷ tinh hoá

Tb huyền phù trong môi trường thích hợp (yếu tố phụ trợ đông lạnh thường DMSO)Nguyên tắc 3 bước: -400C, -800C,

cuối cùng -1960C trong nitơ lỏng

ĐIỀU HÒA HOẠT ĐỘNG

NGUYÊN LÝ CHUNG

CỦA CÁC CON ĐƯỜNG

TRUYỀN TÍN HIỆU TẾ BÀO

Làm thay đổi tính thấm màng tb

R

F

Adenyl cylase

5’- AMP

Phospho-diesterase

Kênh ion

Màng tế bào

(Cơ chế thông tin nội bào)

(Protein G)

Hoạt hóa enzyme (thông tin nội bào)

E

+ ATP

cAMP ADP

Các protein

kinase

Tạo dòng thác E’