Tài liệu Báo cáo " Liệu pháp Gene Dùng Adenovirus gián tiếp tạo ra kháng thể HER-2" pptx

HER-2 Là Gi?HER-2 là thụ thể trên màng tế bào thượng bì Thuộc nhóm thụ thể của yếu tố tăng trưởng Thụ thể của yếu tố tăng trưởng thượng bì – gọi là EGFR Bản chất là một glycoprotein

Vũ Đình Kỳ: 0615056

Giáo Viên hướng dẩn:

Trần Hoàng Minh Tú

Bùi Bảo Ngọc

Nội Dung Bài Báo

HER-2 Là Gi?

HER-2 là thụ thể trên màng tế bào thượng bì

Thuộc nhóm thụ thể của yếu tố tăng trưởng

Thụ thể của yếu tố tăng trưởng thượng bì – gọi là

EGFR

Bản chất là một glycoprotein xuyên màng

Gen quy định thụ thể này nằm trên nhánh q của nhiễm sắc thể số 17

Thúc đẩy tăng sinh, sinh mạch tế bào

Tế Bào Thượng Bì Và Thù Thể HER-2

Thụ Thể HER-2 trên màng tể bào thượng bì

Mô hình tế bào và thụ thể HER-2

Không gắn vào bộ gene tế bào vật chủ nhưg có

thể biểu hiện gene

Adenovirus gây ra bệnh cảm cúm

Mô hình sâm nhập của Adenovirus vào tế bào chủ

Nhóm 10: shptyd

Fig 1 Full-length trastuzumab antibody expression cassette using IRES.

Schematic illustration of adenoviral vector pDC315 with expression cassette

inserteda t E1 region Antibody light andheavy chains, with separate signal peptide,are linkedb y IRES VL, variable region of light chain; CL, constant region of lightchain;VH, variable region of heavy chain; CH, constant region of heavy chain;

SP, signal peptide

Nguyên liệu

 Trastuzumab thương mại: một loại kháng thể

đơn dòng đã được thương mại hóa.

 Vector pDC315, pBGHE3.

 Protein tái tổ hợp Erb-2/Fc Chimera.

 Các loại kháng thể.

Các dòng tế bào

 HEK293: dòng tế bào thận phôi người.

 SKOV-3: tế bào ung thư buồng trứng người (HER-2+).

 BT549: tế bào bình thường (HER-2-).

 L-02: tế bào gan người bình thường.

Phương pháp và kết quả

Tế bào L-02 có chứa vector Ad5-Tab

 Tế bào L-02 cho vào môi trường 10%huyết thanh

thai bò.

 Ủ trong lò ủ ẩm (t=24h, t0=37 0 C, CO 2 =5%).

 Chuyển tế bào vào môi trường không huyết thanh.

 Tế bào được làm nhiễm với Ad5-Tab có nồng độ

cao

Tế bào L-02 có chứa vector Ad5-Tab

 Sau 2h, chuyển tế bào vào môi trường 5% huyết

thanh thai bò.

 Thu hoạch các tế bào nổi (vào ngày thứ 3 và thứ 7).

chuột làm bất động kháng thể tạo ra do Tab.

450nm.

Sơ đồ

Kháng thể tạo ra từ Ad5-Tab (trong tế bào L-02).

mAb horseradish-peroxidase

Nhóm 10: shptyd

Fig 2 In vitro antibody expression in Ad5-TAb -infected L-02 cells.The L-02 cells were infectedw ith Ad5-TAb at a multiplicity of infection of 10 Cell culture supernatants were harvestedat different time points after

infection for protein analysis A, ELISA analysis of supernatants of Ad-TAb

- infected L-02 cells

Western Blot

 Các tế bào: dịch nổi, huyết thanh chuột,

trastuzumab thương mại điện di trên PAGE 12%.

SDS- ở điều kiện khử và không.

 Chuyển protein trên gel polyacrylamid lên

màng nitrocellulose.

 Dò với goat anti-human IgG1 (H+L)

polyclonal (gắn với horseradish peroxidase).

Các bản sao kháng thể dê kháng IgG1 người.

Gắn horseradish peroxidase

X-RAY Huyết thanh chuột, Trastuzumab, Ad5-Tab

Nhóm 10: shptyd

Fig 3 Columns, mean; bars, SD.Western blot analysis of commercial trastuzumab and supernatants from Ad5-TAb – or Ad5-LacZ - infected L-02 cells under nonreducing (B) and reducing (C) conditions

analysis A, ELISA analysis of supernatants of Ad-TAb -infected L-02 cells Columns, mean; bars, SD.Western blot analysis of commercial trastuzumab and supernatants from Ad5-TAb - orAd5-LacZ - infected L-02 cells under

nonreducing (B) andr educing (C) conditions

Nhóm 10: shptyd

Fig 4 Specific binding of HER-2 antibody expressed byAd5-TAb.Two celllines SKOV-3 and BT549 are chosen for this binding

anti-specificity determination Cellculture supernatant from Ad5-TAb - infectedL-02 cells was used, and commercial

trastuzumab was usedascontrol Immunofluorescent microscopy analysis for the specific binding of anti-HER-2 antibody to HER-2 A to

B, BT549 incubatedw ith supernatant and trastuzumab, respectively C to D, SKOV-3incubatedw ith trastuzumab and culture supernatant, respectively.

Nhóm 10: shptyd

Fig 5 Affinity constant of anti-HER-2 antibody Indirect ELISA was applied forestimation of the antibody binding capacity.The proper working concentration ofanti-HER-2 antibody were shown to be in the range of 1 ×10- 5to 5.0 ×10- 5 mg/

mL, andt hen 2.5 × 10- 5 mg/mL was appliedf or the determination of affinityconstant Straight slope is the affinity constant of the antibody.

Nhóm 10: shptyd

Fig 6 Anti-HER-2 antibody expression level in the serum of SKOV-3-inoculatednudemice Ad5-TAbwas given through the tail vein at the dose of 2 × 109

plaque-forming units per mouse at early stage.Mice were bleda t days 3, 7, 10, 14,

21, 28, and3 5, and then serum antibody concentrations were determined by

indirect ELISA on HER2-coated 96-well plates and detected with horseradish

peroxidase - conjugated mouse anti-human IgGmonoclonal antibody Points,

mean (ng/mL); bars, SD.Ten mice were analyzeda t each time point

Fig 7 Antitumor activity of Ad5-TAb -generated anti-HER-2 antibody via gene transfer in tumor-burdened nude mice A, early stage with smaller size (˜20mm3) B, late stage with large size (˜200 mm3).

Nhóm 10: shptyd

Thí nghiệm phát huỳnh quang

 Rửa SKOV-3 và BT549 bằng PBS ba lần.

 cố định bằng paraformaldehid 4% (5 phút).

 ủ với dịch nổi hoặc trastuzumab (40C, 2h).

 Kháng thể thỏ kháng IgG người tiếp hợp với

FITC.

 Quan sát tế bào được đánh dấu dưới kính hiển

vi huỳnh quang.

Nhóm 10: shptyd

Tác động cùa kháng thể lên sự phát triển khối u.

 Thí nghiệm 1: điều trị sau khi tiêm SKOV-3

ba ngày.

 Thí nghiệm 2: điều trị sau khi tiêm SKOV-3

16 ngày

 Có 2 nhóm: nhóm 1 được tiêm Ad5-Tab

nhóm 2 (đối chứng)được tiêm Ad5-LacZ.

 So sánh thể tích khối u chữa trị bời 2 phương

pháp và giữa 2 thí nghiệm.

Nhóm 10: shptyd

 Tuy nhiên đây chỉ mới là thử nghiệm ban đầu,

cần phải nghiên cứu thêm.

 Hiệu quả chữa trị tốt nhất ở giai đoạn còn sớm.

Nhóm 10: shptyd