Sắc ký cột lỏng HPLC

Bài tiểu luận nhỏ về phương pháp sắc ký cột lỏng HPLC(High Performance Liquid Chromatography).HPLC là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ. Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt.

ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP

HCM KHOA CNSH-TP-MT

TIỂU LUẬN

GVHD: ThS Chu Thị Bích Phượng

Lớp 14DSH04

Thành viên nhóm:

Nguyễn Thanh Hiếu 1411100748

Nguyễn Thị Thu Thủy 1411100788

Trần Minh Nhi 1411100761

Lê Huỳnh Phương Trúc 1411100738

Nguyễn Minh Luân 1411100758

Trương Ngọc Phân 1411100733

Hồ Gia Mẫn 1411100598

Phan Thị Thanh Như 1411100621

Dương Đức Toàn 1411100779

Lê Minh Đức 1411100746

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu nâng cao

(HPLC)

HPLC là chữ viết tắt 4 chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid

Chromatography), trước đây gọi là phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography).

1 Khái niệm

- Sắc ký là một họ các kỹ thuật phân tích hóa lý dùng để tách, phân ly các chất trong một hổn hợp dựa vào sự phân bố khác nhau của chúng giữa pha động và pha tĩnh

- Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển

HPLC là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang

đã được biến bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do: có

độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt

- Phạm vi ứng dụng của phương pháp HPLC rất rộng, như phân tích các hợp chất thuốc trừ sâu, thuốc kháng sinh, các chất phụ gia thực phẩm trong lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, môi trường…

2 Phân loại

Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, người

ta chia HPLC thành 4 loại:

• Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn (adsorption/liquid

chromatography)

• Sắc ký phân bố (partition chromatography).

• Sắc ký ion (ion chromatography)

• Sắc ký rây phân tử (size exclusion/gel permeation

chromatography)

- Trong đó, sắc ký phân bố (SKPB) được ứng dụng nhiều nhất vì

có thể phân tích được những hợp chất từ không phân cực đến những hợp chất rất phân cực, hợp chất ion có khối lượng phân

tử không quá lớn (<3000)

SKPB được chia thành hai loại dựa trên độ phân cực tương đối giữa pha tĩnh và pha động: sắc ký pha thường – SKPT (normal phase chromatography) và sắc ký pha đảo – SKPĐ (reversed phase chromatography)

Trong SKPT, pha tĩnh sử dụng có độ phân cực cao hơn pha động Pha tĩnh loại này sẽ có ái lực với các hợp chất phân cực SKPT dùng để tách và phân tích các hợp chất có độ phân cực cao với phân tử lượng không lớn lắm

SKPĐ là thuật ngữ để chỉ một loại sắc ký trong đó pha tĩnh ít phân cực hơn pha động Phương pháp này dùng phân tích các hợp chất từ không phân cực đến phân cực Hầu hết các hợp chất hữu cơ có mạch carbon dài (ít phân cực) rất thích hợp cho phân tích bằng SKPĐ Dung môi sử dụng trong SKPĐ là các dung môi phân cực, trong đó dung môi nước đóng vai trò quan trọng

mà lại rẻ tiền Do đó, SKPĐ được ứng dụng nhiều và phổ biến hơn SKPT

3 Cấu tạo của hệ thống máy HPLC

- Bơm cao áp : Bơm pha động vào cột tách ; Điều khiển tốc độ dòng , áp suất của pha động.Bơm phải tạt được áp suất cao khỏang 250-600bar và tạo dòng liên tục Lưu lượng bơm từ 0.1 đến 10ml/phút

- Bình chứa pha động : Máy HPLC thường có 4 đường dung môi vào đầu bơm cao áp cho phép chúng ta sử dụng 4 bình chứa dung môi cùng một lần để rửa giải theo tỉ lệ mong muốn và tổng tỉ lệ của 4 đường là 100%.Tuy nhiên, theo kinh nghiệm, ít khi sử dụng 4 đường dung môi cùng một lúc mà thường sử dụng 2 hoặc 3 đường để cho hệ pha động luôn được pha trộn đồng nhất hơn, hệ pha động đơn giản hơn giúp ổn định quá trình rửa giải

Lưu ý: Tất cả dung môi dùng cho HPLC đều phải là dung môi tinh khiết

sử dùng cho HPLC Tất cả các hóa chất dùng để chuẩn bị mẫu và pha hệ đệm đều phải là hóa chất tích khiết dùng cho phân tích

- Van bơm mẫu : Bơm mẫu phân tích vào cột tách theo những lượng mẫu nhất định

- Cột tách : Cột chứa pha tĩnh ; yếu tố quyết định quá trình tách sắc

ký.Cột pha tĩnh thông thường làm bằng thép không rỉ, chiều dài cột thay đổi từ 5-25cm đường kính trong 1-10mm, hạt nhồi cỡ 0.3-5µm,…Chất nhồi cột phụ thuộc vào lọai cột và kiểu sắc ký

- Đầu dò ( Detector ) : Thiết bị phát hiện chất phân tích ; Có nhiều loại khác nhau tuỳ mục đích phân tích ( UV – VIS , Huỳnh Quang ,… )Có một số cách phát hiện khi một chất đã đi qua cột Một phương pháp phổ biến là dễ dàng để giải thích sử dụng đầu dò tử ngoại Nhiều hợp chất hữu cơ hấp thụ ánh sáng tia cực tím bước sóng khác nhau Nếu bạn có một chùm ánh sáng tia cực tím chiếu sáng qua các dòng chất lỏng đi ra khỏi cột, và một đầu dò tử ngoại ở phía đối diện của dòng, bạn có thể đọc trực tiếp ánh sáng được hấp thụ Lượng ánh sáng hấp thụ phụ thuộc vào số lượng của một hợp chất đặc biệt đó đi qua chùm tia vào thời điểm đó

- Hệ thống ghi nhận và xử lý tín hiệu : Thu nhập và xử lý kết quả

4 Nguyên tắc

- HPLC được thực hiện dựa trên việc bơm để đẩy một lượng chất lỏng dưới áp suất cao và hỗn hợp mẫu cần phân tích đi qua một cột được nhồi đầy một loại chất hấp phụ và từ đó dẫn tới việc tách các thành phần của mẫu Chất hấp phụ – được nhồi trong cột, là các hạt rắn (như silica, polymers) với kích thước từ 2 – 50 µm Các thành phần trong hỗn hợp mẫu được tách ra khỏi nhau nhờ vào mức độ tương tác khác nhau với các hạt chất hấp phụ Dòng chất lỏng dưới áp suất cao thường là hỗn hợp của các dung môi (nước, acetonitrile và/hoặc methanol), được gọi là

“pha động” Thành phần và nhiệt độ dung môi đóng vai trò chính trong quá trình tách chất do tương tác xảy ra giữa các thành phần của mẫu và chất hấp phụ Về bản chất, các tương tác này là tương tác vật lý như tương tác kị nước (phân tán), tương tác lưỡng cực và tương tác ion, thông thường nhất là tổng hợp của tất cả các tương tác trên

- HPLC ưu việt hơn so với phương pháp sắc ký lỏng cổ điển (áp suất thấp) bởi vì áp suất hoạt động cao hơn nhiều (từ 50-400 bar) trong khi

kỹ thuật sắc ký cổ điển chỉ dựa trên lực hấp dẫn để đẩy pha động ra khỏi cột Do chỉ có một lượng nhỏ mẫu được tách trong phân tích HPLC, vì vậy cột thông thường có đường kính khoảng 2.1 – 4.6 mm và độ dài khoảng 30-250 mm Ngoài ra, cột sắc ký được nhồi các hạt hấp phụ có kích thước nhỏ hơn (kích thước trung bình từ 2-50 µm) Điều này cho phép HPLC khả tách các hỗn hợp một cách hữu hiệu và trở hành một kỹ thuật sắc ký phổ biến

5 Pha tĩnh trong sắc ký pha đảo

Trong sắc ký phân bố nói chung, pha tĩnh là những hợp chất hữu cơ được gắn lên chất mang rắn silica hoặc cấu thành từ silica theo hai kiểu:

• Pha tĩnh được giữ lại trên chất mang rắn bằng cơ chế hấp phụ vật

lý → sắc ký lỏng-lỏng (liquid-liquid chromatography)

• Pha tĩnh liên kết hóa học với chất nền → sắc ký pha liên kết

(bonded phase chromatography)

Trong quá trình sử dụng, người ta nhận thấy sắc ký pha liên kết có nhiều ưu điểm hơn sắc ký pha lỏng-lỏng vì một số nguyên nhân sau:

o Pha tĩnh trong hệ sắc ký lỏng-lỏng dễ bị hòa tan bởi pha động nên dễ bị mất mát pha tĩnh trong thời gian sử dụng và gây nhiễm đối với hợp chất phân tích

o Do pha tĩnh của sắc ký lỏng-lỏng dễ tan trong pha động nên người ta không thể ứng dụng phương pháp rửa giải gradient dung môi

Vì vậy, người ta thường chỉ quan tâm đến loại sắc ký phân bố pha liên kết và phần lớn các loại cột sử dụng hiện nay trong sắc ký phân bố đều

có cấu trúc dạng này

Bề mặt các hạt silica – SiO2 (các hạt này có đường kính 3, 5 hoặc 10 µm) được xử lý (thủy phân) bằng cách đun nóng với HCl 0,1M trong một hoặc hai ngày để tạo ra những nhóm SiOH như sau (thông thường chỉ có khoảng 8 µmol SiOH/m2 bề mặt):

Hình 1 Bề mặt silica đã thủy phân

Sau đó bề mặt silica đã thủy phân này sẽ được cho phản ứng với các organochlorosilan để tạo ra các pha tĩnh không phân cực, phân cực trung bình hoặc rất phân cực tùy theo nhóm R gắn vào

Hình 2: Tạo nhánh trên bề mặt silica

Thường chỉ khoảng 50% nhóm –OH mất H+ để tạo ra HCl (tức <

4µmol/m2 bề mặt bị silan hóa) vì sự kết hợp sẽ dần dần bị ảnh hưởng bởi hiệu ứng lập thể Ngoài nhóm Cl người ta còn sử dụng –OCH3

Hợp chất cần phân tích khi đi qua pha tĩnh sẽ bị giữ lại bởi những lực lượng tương tác khác nhau tùy thuộc tính chất, đặc điểm của chất tan và pha tĩnh

Trong SKPĐ, nhóm thế R trong hợp chất siloxan hầu như không phân cực hoặc ít phân cực Đó là các ankyl dây dài như C8 octyl), C18 (n-octadecyl) còn gọi là ODS (octadecylsilan) hoặc các nhóm alkyl ngắn hơn như C2; ngoài ra còn có cyclohexyl, phenyl trong đó nhóm phenyl

có độ phân cực cao hơn nhóm alkyl Người ta nhận thấy các alkyl dây dài cho kết quả tách ổn định hơn các loại khác nên đây là loại được sử dụng nhiều nhất

Hình 3: Cấu trúc của cột ODS

Tuy nhiên do hiệu ứng lập thể nên trong cấu trúc của pha tĩnh còn nhóm –OH chưa phản ứng, gây ảnh hưởng xấu đến quá trình tách sắc ký tùy môi trường pH phân tích

Trong môi trường quá acid (pH < 2) thì có sự phân ly các nhóm ether (-O-Si-C18) ra khỏi nền Lúc này cột sẽ mất hoạt tính dẫn đến chất cần phân tích không còn tương tác tốt với pha tĩnh nữa

Trong môi trường baz (pH > 7), chính nền silic mang pha tĩnh có thể bị hòa tan (SiO2 thành silicat), hệ quả là N giảm và số nhánh ghép cũng giảm, mũi rộng ra và thời gian lưu cũng có thể giảm Kết quả phân tích

như vậy sẽ mất đi độ chính xác.

Một trong những cách khắc phục hiện tượng này là dùng các chất như trimethylchlorosilan ClSi(CH3)3 hoặc hexamethyldisilazan (ít sử dụng hơn) để tương tác với nhóm –OH này (gọi là hiện tượng end-capping) Lúc này ta sẽ có loại cột ít tương tác với chất phân tích có tính baz (cột LC-DB của hãng SUPELCO)

Hình 4 Cấu trúc cột LC-DB

Có một cách khác để loại trừ bớt ảnh hưởng của nhóm –OH mà không cần tương tác với nó là thay những nhóm methyl của –Si(CH3)2-C18 bằng những nhóm thế lớn hơn như isopropyl để những nhóm này sẽ che

đi những nhóm –OH, cản trở tương tác của nhóm –OH với chất cần phân tích

Hình 5: Cấu trúc cột có gốc isopropyl

Người ta còn ghép lên dây C18 một số nhóm phân cực để tăng thêm độ phân cực của dây C18, làm cột có khả năng tách chọn lọc hơn đối với những hợp chất phân cực mạnh (cột EPS – Expended Polar Selectivity)

Ngoài sườn silica, thời gian gần đây người ta có sử dụng đến nền nhựa polystyren (Polystyren Reversed Phase – PRP) cho phép phân tích trong môi trường pH từ 1 – 13 Cột này dễ sử dụng trong môi trường acid và baz mạnh

6 Pha động trong sắc ký pha đảo

Pha động trong sắc ký lỏng nói chung phải đạt những yêu cầu sau:

• Hòa tan mẫu phân tích

• Phù hợp với đầu dò

• Không hòa tan hay làm mòn pha tĩnh

• Có độ nhớt thấp để tránh áp suất dội lại cao

• Tinh khiết dùng cho sắc ký (HPLC grade)

Trong sắc ký pha đảo, dung môi pha động có độ phân cực cao Trên lý thuyết chúng ta có thể sử dụng khá nhiều dung môi nhưng kinh nghiệm thực tế cho thấy methanol (MeOH), acetonitrile (ACN) và

tetrahydrofuran (THF) là đạt yêu cầu nhất Nước là một dung môi được cho vào các dung môi hữu cơ để giảm khả năng rửa giải

Mỗi dung môi đều đặc trưng bởi các hằng số vật lý như chỉ số khúc xạ (refractive index), độ nhớt (viscocity), nhiệt độ sôi (boiling point), độ phân cực (polarity index), độ rửa giải (eluent strength)…

Trong đó độ phân cực và độ rửa giải có tác động lớn lên khả năng phân tách của các mũi sắc ký

Bảng 1: Tính chất của một số pha động trong sắc ký lỏng

Có ba thông số gây ảnh hưởng lớn đến tách các mũi sắc ký: số đĩa lý thuyết N, hệ số dung lượng K’, độ chọn lọc α Khi sự thay đổi thành phần pha động không đem lại kết quả tách mũi theo yêu cầu thì chúng ta phải thay đổi bản chất pha động (sử dụng dung môi khác), tức thay đổi

α Đôi khi có thể phải thay đổi cả pha tĩnh

Trong quá trình tách của SKPĐ, sự tương tác giữa hợp chất cần phân tích và pha động phụ thuộc rất nhiều vào moment lưỡng cực, tính acid (cho proton) hoặc tính baz (nhận proton) của dung môi

Thông thường pha động trong SKPĐ bao gồm một hỗn hợp nước hoặc dung dịch đệm với một hoặc nhiều dung môi hữu cơ phân cực tan được trong nước Nước là một dung môi rất phân cực nên nó không tương tác với những nhóm alkyl không phân cực trong pha tĩnh, do đó nó được coi như pha động yếu nhất và có tốc độ rửa giải chậm nhất trong tất cả các dung môi động của SKPĐ

Hỗn hợp nước và dung môi hữu cơ thường làm gia tăng độ nhớt dẫn đến việc tăng áp suất cột

Hình 6: Độ nhớt của hỗn hợp nước và dung môi hữu cơ ở 25oC

Việc lựa chọn dung môi và thành phần dung môi trong pha động được tối ưu hóa cho những hợp chất cần phân tích Thông thường, người ta sử dụng hỗn hợp dung môi MeOH/nước trước, rồi ACN/nước hay

THF/nước Với một hỗn hợp chất phân tích phức tạp thì sẽ có sự trộn lẫn của các dung môi hữu cơ với nước Khi lựa chọn thì phải chọn các hỗn hợp MeOH, ACN và THF với nước có độ rửa giải tương đồng

Thành phần pha động có thể cố định trong suốt quá trình chạy sắc ký (chế độ isocratic) hoặc được thay đổi theo một chương trình đã định sẵn (chương trình gradien dung môi) để có hiệu quả tách tốt hơn

7 Một số đại lượng cơ bản trong phân tích sắc ký

7.1 Hệ số phân bố

Cân bằng của một cấu tử X trong hệ sắc ký có thể được mô tả bằng phương trình như sau:

Hằng số cân bằng K cho cân bằng này được gọi là tỉ lệ phân bố hay hằng

số phân bố (partition coefficient) và được tính như sau:

Với CS : nồng độ cấu tử trong pha tĩnh.

CM : nồng độ cấu tử trong pha động

Hệ số K tùy thuộc vào bản chất pha tĩnh, pha động và chất phân tích

7.2 Thời gian lưu:

tR : thời gian lưu của một cấu tử từ khi vào cột đến khi tách ra ngồi cột

tO : thời gian để cho chất nào đó không có ái lực với pha tĩnh đi qua cột;

đó cũng là thời gian pha động đi từ đầu cột đến cuối cột và còn gọi là thời gian lưu chết

tR' : thời gian lưu thật của một cấu tử

Hình 7 Thời gian lưu của cấu tử phân tích

7.3 Hệ số dung lượng k’

k’ được định nghĩa theo công thức sau:

Với VS : thể tích pha tĩnh

VM : thể tích pha động

Nếu k’~ 0, tR~ tO: chất ra rất nhanh, cột không có khả năng giữ chất lại

Nếu k’ càng lớn (tR càng lớn): chất ở trong cột càng lâu, thời gian phân tích càng lâu, mũi có khả năng bị tù

Khoảng k’ lý tưởng là 2-5, nhưng khi phân tích một hỗn hợp phức tạp, k’ có thể chấp nhận trong khoảng rộng 1-20

7.4 Hiệu năng

Hiệu năng hay số đĩa lý thuyết N của cột đặc trưng cho khả năng tách mũi sắc ký của các cấu tử trên cột N càng lớn, hiệu năng tách càng cao

Số đĩa lý thuyết có thể đo trên sắc ký đồ Người ta chứng minh được:

Hay

Với W1/2 là chiều rộng mũi sắc ký ở vị trí ½ chiều cao mũi (phút)

W là chiều rộng mũi sắc ký ở vị trí đáy mũi (phút)

7.5 Độ chọn lọc

Đặc trưng cho khả năng tách hai chất của cột

7.6 Độ phân giải:

Đây là đại lượng biểu thị rõ cả ba khả năng của cột sắc ký: sự giải hấp,

sự chọn lọc và hiệu quả tách Nó được xác định qua phương trình sau:

Hay

Với N được xác định từ phương trình (2.5) hoặc (2.6)

8 Ứng dụng sắc ký

- Tách các chất dẻo hóa

- Tách các phenol

- Tách các axit amin

- Tách gluxit

- Tách các phức chất

- Ưng dụng sắc ký lỏng cao áp trong hóa học lâm sàn

- Phương pháp tách dựa trên kích thước hình học phân tử

- Tách các axit nucleic