NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT

Trong những năm gần đây, nuôi cấy mô tế bào thực vật đã không ngừng phát triển và đem lại hiệu quả thiết thực trong công tác chọn tạo và nhân giống cây trồng. Những thành tựu trên đã góp phần to lớn vào việc thúc đẩy sự phát triển nền nông nghiệp công nghệ cao manh tính cạnh tranh trong thị trường quốc tế. Do đó để có cái nhìn hoàn thiện và toàn cảnh hơn về CNSH nuôi cấy mô tế bào thực vật nhóm đã chọn nó làm đề tài báo cáo.Nhằm mục đích tìm hiểu được vị trí và các phương pháp của nuôi cấy mô tế bào thực vật trong nước và ngoài nước

MỤC LỤC

A ĐẶC VẤN ĐỀ 4

B NỘI DUNG 5

1.KHÁI QUÁT VỀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT 5

1.1 Sơ lược lịch sử phát triển 5

1.2 Những ưu thế của nuôi cấy mô 5

1.3 Vai trò của CNSH TV trong tương lai 5

2 KHÁI NIỆM 6

3 NGUYÊN TẮC 6

4 PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ 6

4.1 Nuôi cấy mô phân sinh 6

4.2 Nuôi cấy cơ quan thực vật 7

4.3 Tế bào trần (Protoplast) 8

4.4 Nuôi cấy phôi 8

4.5 Thụ phấn in-vitro 8

5 LĨNH VỰC ÁP DỤNG 8

5.1.1 Nhân giống vô tính 8

5.1.2 Nuôi cấy phôi 9

5.1.3 Phôi hữu tính 9

5.1.4 Phôi vô tính 10

5.1.5 Quy trình nhân giống vô tính in vitro 11

5.2 Biến dị dòng soma trong nuôi cấy phôi 14

5.2.1 Khái niệm .14

5.2.2 Phân loại các loại biến dị dòng soma 14

5.2.3 Các nguyên nhân chính gây biến dị dòng soma 15

5.2.4 Tác động của các yếu tố trong quá trình nuôi cấy 15

5.2.5 Cơ chế tạo các biến dị dòng soma 16

5.2.6 Khả năng ứng dụng của chọn lọc dòng tế bào soma 17

5.2.7 Chọn lọc biến dị soma 17

5.2.8 Xác định các biến dị trong nuôi cấy mô 17

5.3 Kỹ thuật tạo cây đơn bội 17

5.3.1 Khái niệm chung về đơn bội 17

5.3.2 Tình hình nghiên cứu cây đơn bội trong và ngoài nước 18

5.3.3 Tạo cây đơn bội bằng nuôi c ấy bao phấn, hạt phấn 19

5.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy bao phấn hạt phấn 19

5.3.5 Chọn lọc cây đơn bội 20

5.3.6 Tạo cây đơn bội bằng nuôi c ấy noãn chưa được thụ tinh 20

5.4 Lĩnh vực khác 23

5.4.1 Làm sạch bệnh vius bằng nuôi cấy mô phân sinh (meristem) 23

5.4.1.1 Tác hại của virus 23

5.4.1.2 Nuôi cấy meristem trong làm sạch virus cho cây trồng 24

5.4.1.3Các kỹ thuật làm sạch virus in vitro 26

C KẾT LUẬN 32

D TÀI LIỆU THAM KHẢO 35

A ĐẶC VẤN ĐỀ

Trong những năm gần đây, nuôi cấy mô tế bào thực vật đã không ngừng phát triển và đem lại hiệu quả thiết thực trong công tác chọn tạo và nhân giống cây trồng Những thành tựu trên đã góp phần to lớn vào việc thúc đẩy sự phát triển nền nông nghiệp công nghệ cao manh tính c ạnh tranh trong thị trường quốc tế Do đó để có cái nhìn hoàn thiện và toàn cảnh hơn về CNSH nuôi cấy mô tế bào thực vật nhóm đã chọn

nó làm đề tài báo cáo.Nhằm mục đích tìm hiểu được vị trí và các phương pháp của nuôi cấy mô tế bào thực vật trong nước và ngoài nước

B NỘI DUNG

1 KHÁI QUÁT VỀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT

1.1 Sơ lược lịch sử phát triển

Cuối thế kỉ XIX con người thử tách tế bào thực vật nuôi cấy mô thực vật đến những năm 1930-1940 mới có những kết quả ban đầu và được hoàn thiện dần đến nay.Sự phát triển của CNSH TV có thể chia thành 4 giai đoạn:

-Giai đoạn I (1902-1930):Thử nghiệm ban đầu

-Giai đoạn II (1934-1954): Năm 1937,Gautheret đã nuôi thành công mô tế bào cà rốt -Giai đoạn III (1957-1992): Thực hiện tách và nuôi tế bào đơn

-Giai đoạn IV: Ứng dụng các thành tựu vào sản xuất với quy mô lớn và diện rộng

1.2 Những ưu thế của nuôi cấy mô

- Vi nhân giống bằng nuôi cấy mô

- Chọn giống invitro dựa trên các công nghệ tế bào

- Khai thác các hóa chất bằng nuôi cấy tế bào đơn

1.3 Vai trò của CNSH TV trong tương lai

Sự bùng nổ dân số toàn cầu trong thế kỉ XX đã mang lại hậu quả bi thảm cho hành tinh chúng ta Đây là thách thức đối với nhân loại thế kỉ XXI là tăng sản lượng lương thực gấp đôi bằng nông nghiệp bền vững.CNSH TV sẽ đóng vai trò quan trọng trong việc giải quyết các vấn đề nêu trên

Trong 50 năm qua, nhờ cách mạng xanh và những tiến bộ của CNSH TV, sản xuất lương thực đã tăng nhanh kịp đà bùng nổ dân số và đảm bảo đủ nhu cầu lương thực,mặc

2 KHÁI NIỆM

Là kỹ thuật cấy tế bào thực vật phân lập hay mảnh mô thực vật tách rời trên môi trường dinh dưỡng trong điều kiện vô trùng

N TẮC

Môi trường gồm có các chất căn bản:

- Các chất vô cơ đa lượng: N (NO3 và NH4 ), P, K, S, Ca và Mg

- Các nguyên tố vi lượng: Fe,Mn,Zn,Br, Cu, Co và Mo

- Các vitamin: nhiều loại (nicotinic acid, biotin,…) mà quan trọng nhất là thiamine (vitamin B1) dưới dạng thiamine – HCl

- Nguồn carbon: sucrose hoặc glucose

- Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật: Các auxin và cytokin kích thích sự phân bào,kiểm soát sự biệt hóa tế bào và phát sinh hình thái Các auxin thường dùng:

2,4-D (2,4 Dichlorophenoxyacetic),IAA (indole 3-acetic acid),IBA (indole 3-butyric acid).Các cytokinin có Bap (6- benzylaminopurine), zea (zeatin), Ngoài ra còn có GA (gibberllic acid) và ABA (abscisic acid)

Agar sử dụng cho môi trường đặc Hệ thống chiếu sáng hợp lí cần cho sự phát triển của thực vật

4 PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY

4.1 Nuôi cấy mô phân sinh

Mẫu cho nuôi cấy có nhiều lo ại, nhưng thường dùng là đỉnh sinh trưởng (meristem) Công việc tiến hành theo trình tự: mẫu cấy khử trùng bề mặt  rửa mẫu nhiều lần cho sạch chất sát trùng  môi trường nuôi  tạo mô sẹo tạo cụm chồi  nhân giống

Meristem được cắt, khử trùng và đặt trên môi trường thạch trong hộp petri hay chai

thành một khối nổi lên gọi là mô sẹo Thời gian hình thành mô sẹo thường sau 3-8 tuần cấy mẫu Việc hình thành mô sẹo có tầm quan trọng then chốt trong cả quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật Ở giai đoạn tiếp theo có thể sử dụng mô sẹo theo hướng khác nhau:

 Tạo cụm chồi: Nếu để tiếp thì các chồi sẽ mọc lên thành c ụm và các chồi sẽ phát triển thành cây con Có thể tách các chồi ra để chúng mọc rễ đưa ra trồng

 Tách ra nhiều phần duy nhất: Có thể tách mô sẹo non ra thành nhiều dòng thứ cấp (subculture ) và tiếp tục nhân khối tế bào tăng trưởng nhanh để phục vụ cho nhiều mục đích khác nhau như tạo tế bào trần ( protoplast) hay xử lý thành tế bào rời để nuôi tế bào đơn

4.2 Nuôi cấy cơ quan thực vật

Đặt mảnh meristem vào môi trường không có kích thích tố sinh trưởng thực vật thì

tự nó sẽ mọc lên cấu trúc tương tự chồi Nếu môi trường có thể bổ sung cytokinin, mẫu

sẽ mọc chồi nhánh ở nách lá và sẹo tạo cụm chồi Các cụm chồi này có thể tách thành cụm thứ cấp và nếu cung c ấp đủ dinh dưỡng chúng sẽ phát triển thành cây con hoặc có thể tách thêm nhân giống tiếp Nhân giống kiểu này gọi là vi nhân giống được ứng dụng vào sản xuất Rễ cây có thể nhân ra liên tục theo cách tương tự, chỉ khác là bổ sung auxin vào môi trường

4.3 Tế bào trần (Protoplast)

Nếu các tế bào mô sẹo được xử lý bằng hai enzyme cellulose và pectinase làm tiêu hủy và tế bào thì nhận được tế bào trần, mà chúng thường có dạng khối cầu Các tế bào trần, thậm chí khác loài, có thể kết hợp nhau tạo tế bào lai và quá trình này gọi là sự dung hợp tế bào trần (proplast fusion) Tế bào trần có thể được tạo ra bằng nhiều cách:

từ dịch huyền phù tế bào; từ mô sẹo hay mô tươi nguyên tr ạng như lá qua tác động của pectinase và cellulose Pectinase cắt mảnh mô rời ra từng tế bào riêng lẻ và cellulose làm tan vách tế bào Các tế bào trần nếu để trên môi trường dinh dưỡng thì sau 5-10 ngày sẽ tạo vách tế bào và phân chia Nuôi trong môi trường lỏng thì tế bào trần sẽ không phân chia

4.4 Nuôi cấy phôi

Khi môi trường nuôi giàu kích thích tố tăng trưởng ( auxin và cytokinin) thì các tế bào mất biệt hóa và mô sẹo hình thành Ngược lại, trong môi trường giảm nồng độ các chất điều hòa tăng trưởng thì nó có hình thành nhiều cấu trúc tái biệt hóa như phôi soma, chồi hay rễ Dựa vào khả năng tái sinh này, có thể điều khiển sự phát triển của mô sẹo như nhau:

 Tạo phôi soma trong môi trường với nồng độ kích thích tố nhất định

 Vi nhân giống: nếu nồng độ auxin và cytokinin thấp thì nó tạo cụm chồi và có thể tách cụm hoặc tách mẫu lá đem nhân giống tiếp

 Tạo thân khi cho cytokinin nhiều trong môi trường

 Tạo rễ nếu auxin có nhiều trong môi trường

Một ví dụ minh họa rõ ứng dụng c ủa phương

pháp này là việc nuôi rễ nhân sâm cấy mô Cây nhân

sâm tạo chất sâm saponin chủ yếu ở rễ Dùng nuôi cấy

mô cho nhiều auxin kích thích tạo rễ thu được nhiều

saponin với thời gian nhanh hơn nhiều so với trong tự

nhiên

4.5 Thụ phấn in-vitro

Thụ phấn in-vitro là quá trình tạo hợp tử không phụ thuộc cơ thể mẹ Được sử dụng cho: thụ phấn nõan, thụ phấn bầu quả, thụ phấn giá noãn, thụ phấn núm nhụy Quy trình: thu nhập noãn chưa thụ tinh  cấy noãn  thụ phấn  thụ tinh cho tế bào trứng.Ở đây chúng tôi chỉ nói sơ lược về thụ phấn in-vitro chi tiết sẻ được trình bày trong nhân giống vô tính và nuôi cấy phôi

5 LĨNH VỰC ÁP DỤNG

5.1 Nhân giống vô tính và nuôi cấy phôi

5.1.1 Nhân giống vô tính

Nuôi cấy cây nhân sâm

Nhân giống vô tính chính là phương pháp nhân lên hoặc tạo ra cơ thể mới dựa theo sinh sản vô tính, nghĩa là phương pháp tạo nhân lên hoặc tạo ra cơ thể mới từ tế bào, mô,

cơ quan của cơ thể bố hoặc mẹ

5.1.2 Nuôi cấy phôi

Phôi là một nhóm tế bào có khả năng phát triển tạo thành cơ thể hoàn chỉnh là pha phát triển trung gian giữa hợp tử hay tế bào soma và bào tử thể

Có hai loại phôi: Phôi hữu tính và phôi vô tính

5.1.3 Phôi hữu tính ( Kĩ thuật cứu phôi )

Phôi hữu tính: được hình thành và phát triển từ những tế bào sinh dục sau khi sự thụ tinh đôi xảy ra: một hạt phấn thụ tinh với noãn và thành lập hợp tử lưỡng bội, một loạt các phân cắt đẳng nhiễm xảy ra, hợp tử phát triển thành phôi ( bào tử thực vật mới)

Sự lai giữa các loài thường tạo ra cây lai có ưu thế do sự tổ hợp di truyền, nhưng cây lai thường tạo

ra hột không sống được lâu Sự nuôi cấy in vitro để phát triển phôi từ noãn đã thụ tinh của cây lai được dùng theo phương pháp

gọi là sự cứu phôi lai (hay nói

tắt là cứu phôi) Thí dụ, lai giữa

hai loài Cỏ ba lá Trifolium ambiguum và Trifolium repens thuộc họ Ðậu (Fabaceae) đã được

sử dụng để tạo ra một nguồn giống cỏ mới cho đồng cỏ ở New Zealand Loài đậu cha mẹ là các cây tự thụ phấn; phôi bình thường phát triển từ hình cầu, hình tim đến hình trái ngư lôi khi trưởng thành Tuy nhiên, phôi từ cây lai giữa hai loài trong hai ngày đầu sau khi thụ phấn chúng tăng trưởng nhanh, nhưng sau đó chậm lại và dừng lại

ở giai đoạn hình tim khi phôi có khoảng 1.000 tế bào Quá trình phát triển của phôi bị ngưng lại là do các gen gây hại hoạt động, chúng hoạt động như những cái khóa ngăn chận sự cung cấp chất dinh dưỡng đến để nuôi phôi

Một số kỹ thuật cứu phôi đã sử dụng thành công Ghép phôi lai vào phôi nhũ bình thường đã được lấy phôi ra Phôi cũng có thể được cấy trực tiếp trên môi trường nhân tạo với các chất dinh dưỡng được cung cấp theo yêu cầu Kỷ thuật cứu phôi này đã tạo được cây cỏ Ba lá lai mới (Hình 16)

5.1.4 Phôi vô tính( phôi sôma )

Phát sinh từ tế bào sinh dưỡng 2n chỉ của bố hoặc mẹ, có cấu trúc như một phôi gọi

là phôi vô tính ( phôi soma) Đều phát triển qua 3 giai đoạn trước khi trưởng thành: Hình cầu, Hình tim, Hình thủy lôi

Hình cầu Hình tim Hình thủy lôi (hình cá đuối)

Trong kỷ thuật nuôi cấy phôi soma như ở cà rốt, thường các dung dịch treo tế bào

có thể được lưu giữ một cách không chuyên biệt trong môi trường có chứa chất tăng trưởng thực vật acid 2,4-dichloro-phenoxy acetic (2,4-D) Nếu chất 2,4-D bị lấy đi sẽ cảm ứng sự tạo phôi; phôi ở đây là phôi soma, chúng được tạo ra từ những tế bào của cơ thể thực vật, nhưng chúng hoạt động như một hợp tử, trải qua một quá trình phát triển như một cấu trúc phôi Phôi soma cũng có thể được sản sinh từ tế bào biểu bì của trục

hạ diệp của hột khi nuôi cấy trong môi trường có hormon; đặc biệt là cytokinin

• Sự nảy mầm của phôi vô tính

5.1.5 Quy trình nhân gi ống vô tính in vi tro (Vi nhân gi ống cây trồng)

Chọn mẫu cấy

Mô non, ít chuyên hóa ( đỉnh chồi, lá non,…)

Các tế bào sinh sản không phải là tế bào sinh dục

Khử trùng bề mặt

• Dùng các dung dịch khử trùng như Ca-hypochlorite , Na-hypochlorite, HgCl2

0.1% xử lý trong 5 – 10 phút,

• Ngoài ra còn dùng thêm các chất hoạt động bề mặt như Tween 80 , teepol , mannoxol… để tăng tính thấm của mô

Nhân nhanh

• Kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh số lượng thông qua con đường: hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định, phôi vô tính

• Xác định môi trường, điều kiện ngoại cảnh

• Xytokinin kích thích tạo chồi, nhiệt độ 25 - 270C, 16h chiếu sáng/ ngày, cường độ

Đảm bảo yêu cầu:

• Cây trong ống nghiệm đã đạt tiêu chuẩn hình thái nhất định( số lá, rễ, chiều cao)

• Giá thể tiếp nhận in vitro thích hợp

• Điều chỉnh được nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng, chất dinh dưỡng

Ứng dụng

• Duy trì, nhân nhanh các gen quý

• Nhân nhanh các loài hoa, cây cảnh khó trồng bằng hạt

• Nhân nhanh két hợp làm sạch virus

• Bảo quản nguồn gen

 Ưu điểm:

• Có hệ số nhân cao

• Nhân giống ở quy mô công nghiệp

• Tạo cây sạch virus

Biến dị dòng soma là khái niệm dùng để chỉ tất cả các biến dị thể hiện ở các tế bào,

mô nuôi cấy và cây có nguồn gốc từ nuôi cấy mô.còn được gọi là biến dị dòng vô tính Phân biệt khái niện giữa biến dị và đột biến:

Biến dị dùng để chỉ những thay đổi cụ thể và không theo quy luật Mendel trong quá trình di truyền của chúng

Đột biến chỉ cho các trường hợp khi mà có các bằng chứng rõ ràng thể hiện các

biến đổi di truyền

5.2.2 Phân loại các loại biến dị dòng soma:

Các biến dị kiểu gen: Là các biến dị có khả năng di truyền, xảy ra với tỷ lệ rất thấp (10^-5-10^-7) và không có tính thuận nghịch chúng được chia làm ba nhóm chính

- Các đột biến gen là các biến đổi về nhiễm sắc thể loại thổ biến lá sai khác về số lượng nhiễm sắc thể như thể đa bội , dị bội hay thể khảm các loài có số bội cao thường dễ biến

5.2.3 Các nguyên nhân chính gây bi ến dị dòng soma

Sự đa dạng di truyền của tế bào nuôi cấy: các mẫu thực tế bào gồm nhìêu loại tế bào khác nhau như là xylem, nhu mô, mô vỏ, phloem Nhiều thực vật tồn tại ở dạng thể khảm chúng chứa những tế bào hoặc mô có c ấu trúc di truyền khác nhau được phát triển

từ meristem có chứa lớp hay bộ phận mô bị đột biến

5.2.4 Tác động của các yếu tố trong quá trình nuôi cấy

 Loại và nồng độ của chất điều tiết sinh trưởng sử dụng các mô nuôi cấy ngày dài trong môi trường axit mạnh như auxin 2,4-D hoặc 2,4,5-T thường gây sai khác trong cây tái sinh

 Thời gian nuôi cấy và số lần cấy truyền cũng tăng xuất hiện biến dị dòng soma

 Loại mẫu cấy: các lo ại mẫu cấy thường thể hiện mức độ biến dị khác nhau các mẫu có nguồn gốc từ chồi nách , chồi đỉnh hay meristem

 Phương thức nhân giống in vitro: các phương thức nhân giống khác nhau sẽ có các

tỉ lệ biến dị khác nhau nhìn chung nếu chồi bất định được tái sinh từ một loại tế bào thì

5.2.5 Cơ chế tạo các biến dị dòng soma

Sự thay đổi các kiểu methyl hóa bình thường của ADN genom:

-Qúa trình methyl là một quá trình mà một nucleotit cụ thể thường là adenin hay cytocin

có một nhóm methyl gắn liền với nó

-Sự sắp xếp lại nhiễm sắc thể : sự mất nhân đôi và tái tổ hợp vô tính là các nguồn chính của biến dị dòng tế bào soma

-Sự hoạt hóa các nhân tố chuyển vị: sự tách hay xen vào các nhân tố này ảnh hưởng trực tiếp đến các gen cấu trúc ở gần nó Hơn nữa sự tách ra không chính xác của các nhân tố chuyển vị có thể dẫn đến sự tái sắp xếp của các nucleotit phụ cận, các nhân tố chuyển vị -Đột biến điểm:chúng có thể là đột biến lặn hay trội Các đột biến gen đã tìm thấy trong cây chua, lúa mì, thuốc lá