Công nghệ sản xuất chất kháng sinh penicillin

Penicillin là chất kháng sinh được tìm ra đầu tiên và được sản xuất sớm nhất dùng chữa một số bệnh do vi khuẩn vào những năm đầu của chiến tranh thế giới thứ hai.. Ngày nay chất kháng si

Trang 1

Từ thế kỷ XIX người ta đã biết các vi sinh vật có thế sổng cộng sinh,

cũng như có tác dụng đối kháng giữa chúng với nhau Đen năm 1929,

A.Fleming quan sát thấy nhũng khuấn lạc của mốc penicillin notatum ức chế

sinh trưởng tụ cầu khuấn Staphylococus Chất có tác dụng ức chế do mốc này

tiết ra được gọi là penicillin Từ đó đến nay việc nghiên cứu chất có hoạt tính

kháng sinh được chú trọng rất nhiều và đạt được nhiều kết quả rực rỡ

Ngày nay người ta đâ biết trên 2000 chất kháng sinh, nhung chỉ mới có

khoảng 50 chất được dùng vào tư liệu hóa học chữa các bệnh nhiễm vi sinh

vật

trong y học và một số ngành khác Một trong những chế phẩm chất kháng sinh

phổ biến là penicillin.

Penicillin là chất kháng sinh được tìm ra đầu tiên và được sản xuất sớm

nhất dùng chữa một số bệnh do vi khuẩn vào những năm đầu của chiến tranh

thế giới thứ hai Ngày nay chất kháng sinh này được sản xuất với một lượng

rất

lớn và được dùng khá phổ biến trong y học

Trong đề tài này, chúng tôi đã nêu ra những tìm hiểu của mình về lịch

sử phát hiện và sản xuất penicillin, các nguyên liệu sản xuất, công nghệ sản

xuất penicillin cũng như các chế phẩm của loại thuốc kháng sinh này

Chúng tôi xin chân thành cảm ơn GV hướng dẫn, Kỹ sư Nguyễn Thị

Câm Vi, người đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ chúng tôi trong suốt quá trình

thực hiện đề tài này

Trang 3

Ĩ.Lich sử phát hiên và sàn xuất penicillỉn:

Chất kháng sinh penicillin được phát hiện tình cờ vào năm 1928: trong

khi làm vệ sinh phòng thí nghiệm của mình, Alexander Fleming đã chú ý đến

một hộp petri nuôi Staphylococcus bị nhiễm nấm mốc Penicillium notatum có

penicillin để đặt tên cho kháng

trình khoa học của Fleming

sự quan tâm chú ý của nhiều

giới Gần như đồng thời, nhiều

các nước đều triến khai nghiên

sinh này (1929) Côngngay lập tóc thu hútnhà khoa học trên thếphòng thí nghiệm ởcún thu nhận

penicillin và chỉ sau khoảng thời gian ngắn các nhà khoa học Mỹ đã triển khai

lên men thành công penicillin bằng phương pháp lên men bề mặt (1931) Tuy

nhiên cũng trong khoảng thời gian đó mọi nổ lực nhằm tách và tinh chế

penicillin từ dịch lên men đều thất bại do không bảo vệ được hoạt tính kháng

sinh của chế phẩm tinh chế, do đó vấn đề penicillin tạm thời bị lãng quên

Năm 1938 ở Oxíbrd, khi tìm lại các tài liệu đã được công bố Ernst

Boris Chain lại đế tâm đến phát minh của Fleming và ông đã đề nghị Howara

walter Florey cho tiếp tục triển khai nghiên cứu này Chỉ sau hai năm, phòng

thí nghiệm của ông đã tinh chế được một lượng lớn penicillin, đủ đế thí

nghiệm

trên các loại động vật thí nghiệm và kết quả điều trị thử nghiệm đã cho kết quả

mỹ mãn: ngày 25/5/1940 penicillin đã được thử nghiệm rất thành công trên

chuột Một thời gian ngắn sau đó, trong nồ lực cuối cùng nhằm cứu sống các

Trang 4

www.08shln.uni.ee -admin 08 lh@gmaii

com

Công nghệ sản xuât Penicilin

trị cho người, và cũng thật bất ngờ, kết quả điều trị này đã thành công ngoài cả

sự trông đợi: chỉ duy nhất một thương binh bị tử vong do lượng thuốc tại chỗ

không còn đủ liều yêu cầu đế điều trị cho thương binh đó (1941)

Nhóm nghiên cún của Chain đã báo cáo lên chính phủ Hoàng gia Anh,

nhưng do chính phủ đang tập trung mọi no lực cho chiến tranh nên đã không

tài trợ cho dự án Vì vậy, đề xuất trên được chuyến sang triển khai tiếp ở

Peoria (Illionis Mỹ) Nhận thức được ý nghĩa to lớn của nghiên cún này,

chính

quyền bang Illinois và cả chính quyền liên bang đã xếp chương trình penicillin

vào loại đặc biệt ưu tiên và chính phủ trực tiếp đứng ra tổ chức triển khai Nhờ

vậy, chỉ sau một thời gian ngắn người ta đã triển khai thành công công nghệ

lên men chìm sản xuất penicillin (1942); đã tuyến chọn được chủng công

nghiệp Penicillium chrysogenum NRRL-1951 (1943) và sau đó đã tạo được

biến chủng Penicillium chrysogenum Wis Q-176 (chủng này được xem là

chủng gốc của hầu hết các chủng công nghiệp đang sử dụng hiện nay trên toàn

Thiêí bị làm lạnh và bôn lên men được sử dụng năm 1945

GVHướng dẫn: Nguyễn Thị cẩm Vy

Trang 5

Các tác giả nhận được giải Nobel năm 1945 về công trình

penỉcỉllỉn.

Vài năm sau người ta thấy xuất hiện các trường hợp kháng thuốc và

hiện tượng này ngày nay càng phố biến hơn Trên con đường nhằm vô hiệu

hoá

khả năng kháng thuốc của vi khuẩn và mở rộng thêm tính năng ứng dụng điều

trị của penicillin, năm 1959, Batcherlor và đồng nghiệp đã tách ra được axit

6-aminopenicillanic về sau, axit này được sử dụng làm nguyên liệu đế sản xuất

ra hàng loạt chế phâm penicillin bán tống hợp khác nhau Nguyên lý sản xuất

chế phẩm bán tổng hợp trên đã mở ra con đường mới rất hiệu quả và kinh tế

đế

đấu tranh chống lại sự kháng thuốc Ngày nay trên thế giới đã sản xuất được

trên 500 chế phẩm penicillin (trong đó chỉ lên men trực tiếp hai sản phẩm là

penicillin V và penicillin G) và xu thế nghiên cún sản xuất các chế phấm

penicillin bán tổng hợp mới vẫn tiếp tục được triến khai

Trang 6

com

Penicillium chrysogenum trên môi trường Raistrik tạo thành hai kiếu

khuân lạc:

> Kiếu I: khuẩn lạc tròn trăn, các nếp nhăn rõ nét Khuẩn ty khí

sinh mọc tốt và có màu xanh; theo rìa khuẩn lạc có đường viền rộng 2-5 mm

của những khuấn ty bạc trắng không có bào tử; các khuấn ty cơ chất màu nâu;

chất màu không hoà vào môi trường

> Kiếu II: khuấn lạc có nhũng khuân ty màu trắng, phát triến yếu;

khuẩn ty cơ chất cũng có màu nâu Khuẩn lạc kiểu I cho hoạt lự cao, kiểu II

thường xuyên cho hoạt tính kháng sinh thấp Vì vậy cần phải tách những

Chủng penicillium được nuôi cấy trên đìa petri

Trang 7

Các chủng penicillium ở các giai đoạn phát triên khác nhau

Những chủng Penicillium thường có hoạt lực cao lại kém ốn định Đặc

tính này đặt cho những nhà vi sinh vật một nhiệm vụ khó khăn: tạo được khả

năng sinh kháng sinh cao nhất, giữ được ổn định trong quá trình nghiên cứu

và

sản xuất Nhiệm vụ này có một ý nghĩa rất lớn trong công nghiệp các giống

này bảo vệ ở kệ, ở trạng thái đông khô có thể tới ba năm, ở đất vô trùng là hai

năm Ngày nay nhờ di truyền học đã tạo được những giống ổn định, ít nhất

sau

sáu thế hệ không giảm hoạt tính kháng sinh

Chúng ta cần phải nhận thức rằng các nấm penicillium thường dễ biến

đối về hình thái và giảm khả năng sinh kháng sinh Khi xảy ra biến đối thì sẽ

sinh ra hàng loạt những chủng mới từ giống cơ bản và nhiệm vụ của các nhà

vi

sinh vật lúc này là phải chọn lại những khuấn lạc khoẻ có nhiều ưu điếm, tiếp

theo cần phải tiến hành những biện pháp bảo quản thích hợp

Trang 8

com

2. Giai đoạn II: Khuẩn ty phát triển, tế bào chất ưa kiềm, những

hạt nhỏ trong không bào dần dần biến mất Ở cuối giai đoạn này xuất hiện

những giọt chất béo nhỏ

3. Giai đoạn III: Tạo thành những giọt chất béo to, không còn

không bào, tế bào chất rất ưa kiềm

4. Giai đoạn IV: Xuất hiện không bào với những hạt dễ bắt màu

đỏ

trung tính, những hạt chất béo nhỏ hơn ở giai đoạn III, tính ưa kiềm giảm

5. Giai đoạn V: Khuẩn ty có hình trống và có chứa những không

bào,ở giữa có một hoặc một vài hạt lớn Các hạt chất béo biến mất Tính ưa

kiềm tiếp tục giảm

6. Giai đoạn VI: Khuẩn ty vẫn giữ được dạng hình trống nhưng

không còn những hạt bắt màu trung tính, các không bào bắt màu da cam hoặc

màu hồng đồng đều Các hạt chất béo không còn Xuất hiện những tế bào

riêng

biệt bắt đầu tụ’ phân

Quá trình lên men penicillin cũng thuộc vào loại lên men hai pha: pha

sinh trưởng (úng với nhũng giai đoạn phát triến I, II, III) và pha sinh penicillin

(ứng với những giai đoạn IV, V, VI)

Trang 9

dưỡng, hệ sợi nấm bắt đầu tự phân, nếu tiếp tục lên men nồng độ penicillin sẽ

giảm, trong thực tế sản xuất cần phải kết thúc lên men trước thời điếm này

Nguồn nitơ dùng trong sinh tống hợp penicillin có thế là những hợp

chất

hữu cơ (axit amin, pepton, protein) và vô cơ (amoniac, các muối amon và

nitrat).Amoniac được nấm penicillium chrysogenum đồng hoá nhanh hơn cả

Trong quá trình nuôi cấy N-NH3 được tạo thành tù' cao ngô do phản ứng khử

amin các hợp chất nitơ Nấm mốc sử dụng N-NH3 trước tiên và nồng độ của

chất này trong thời gian đầu tăng lên, vì tốc độ tạo thành nó nhanh hơn tốc độ

sử dụng, tiếp theo đó được giảm rất nhanh cùng với tốc độ sinh trưởng, phát

triển của nấm mốc và tiếp tục giảm cho đến khi hệ sợi của mốc bị tự phân

Tốc

độ sử dụng amoniac phụ thuộc vào nguồn cacbon trong môi trường Trong

trường hợp nguồn cacbon là glucoza, sacaroza hoặc các nguồn cacbon dễ tiêu

hoá khác, amoniac được sử dụng nhanh hơn khi môi trường có lactoza Nitrat

được nấm mốc đồng hoá khi trong môi trường không có nguồn nitơ hữu cơ

Lưu huỳnh có ý nghĩa đặc biệt quan trọng trong quá trình sinh trưởng

và

sinh tổng hợp của nấm mốc Nguồn lưu huỳnh thường dùng là muối sunfat

của

kali, natri và amon Các chất này tham gia vào tổng hợp metionin, sixtin,

biotin, tiamin hoặc trạng thái liên kết yếu là tốt hơn cả Nhiều công trình

nghiên cứu cho biết, khi trong môi trường có mặt đồng thời L-sixtin và sunfat

thì lun huỳnh của axit amin này dễ đi vào phân tử penicillin hơn lun huỳnh

của

Trang 10

com

Trong tế bào sixtin dễ biến thành sixtein và ngược lại Sixtein có một ý

nhĩa lớn như một tác nhân khử nhờ nhóm suníuhydrin (-SH )

pH môi trường thích hợp cho penicillium chrysogenum phát triến nằm

trong khoảng 6 - 6.5 Môi trường kiềm hoặc axit hon đều làm cho mốc phát

triến chậm Trong quá trình lên men pH môi trường thay đối tuỳ thuộc vào tốc

III Môt số quá trình tồng hop penicillỉn:

Trang 11

Sự tống hợp và biến dưỡng peniciỉlin

Trang 12

www.08shln.uni.cc -Công nghệ săn xuất Penicilin

admin 08 lh@gmail com

3 ATP +

3 AMP + 3 PPj

"OOC

(The dotted lines show wheie the

bonds w01 be íormed.)

02EJc 121.3.1

2-deacetoxycephalospoiin c

Qther cephalospoĩỉns~|

CH, COCT

Sự tông họp penicillin N và deasetoxycephaỉosporin c

GVHướng dẫn: Nguyễn Thị cấm Vy

Trang 14

com

Công nghệ lên men sản xuất penicillin mang nét đặc thù riêng của từng

cơ sở sản xuất và các thông tin này rất hạn chế cung cấp công khai Ngay cả

bằng sáng chế cũng có giới hạn ở những công đoạn nhất định; vì vậy rất khó

đưa ra công nghệ sản xuất công nghiệp Theo hãng gist-brocades, tòan bộ dây

chuyền chia làm 4 công đọan chính:

• Lên men sản xuất penicillin tự nhiên (thương thu penicillin V

Thu nhận và tinh chế

Quy trình lên men sán xuất penicillin

Trang 15

IĨ.Công nghê sàn xuất:

Hiện nay người ta sản xuất penicillin theo hai phương pháp:

• Phương pháp lên men bề mặt.

• Phương pháp lên men chìm.

1 Phương pháp lên men bể mất.

Trong nhũng năm 30 đến những năm 50 của thế kỷ XX, phương pháp

nuôi cấy bề mặt được áp dụng rộng rãi đế sản xuất kháng sinh tù’ nấm

penicillin chrysogenum

a) Giống Penicillin chrysogenum là nấm sợi đơn bào hở Khi mới

phát triển trong môi trường đặt thì tạo ra 2 khuẩn ty: khuẩn ty khí sinh và

Nấm sợi penicillium chrysogenum.

Nấm penicillin: thuộc họ hiếu khí bắt buộc, do đó trong quá trình nuôi

phải cung cấp khí liên tục Phương pháp bảo quản được dùng nhiều nhất là

Trang 16

com

phương pháp cấy truyền định kì trên thạch hàng tháng kết hợp với bảo quản

lạnh, phương pháp bảo quản bằng hạt ngũ cốc bảo quản theo phương pháp

đông khô cũng được sử dụng

b) Nguyên liệu: Cám và hạt ngũ cốc các lọai, nguyên liệu được bố

sung

nước sao cho độ âm đạt 55-60%W và được hấp thanh trùng ở 121°c trong

30-45 phút Ngay sau khi kết thúc thanh trùng, chúng được tải vào những khay

hình chữ nhật có kích thước dài 1-1.2 m, rộng 0.6-0.8 m, cao 5-6 em Lớp môi

trường cho vào đấy dày 2-3 em đế đảm bảo độ thóang khí trên tòan bộ bề mặt

và mặt dưới của môi trường Một số cơ sở dùng nguyên liệu là các hạt ngũ cốc

thì lớp môi trường dày hơn (3-4 em) do các hạt ngũ cốc tạo ra môi trường có

độ thoáng khí hơn

Trong trường hợp cám quá mịn thì phải trộn thêm trấu xay nhở (thêm

khoảng 20-25%) hoặc cùi bắp xay nhỏ trước khi thanh trùng

Đế làm môi trường nhân giống, người ta cũng làm như trên Chỉ có

một

điểm khác là sau khi làm ẩm môi trường đến độ ẩm nhất định, người ta phân

phối chúng vào các dụng cụ thủy tinh (chai thủy tinh hay bình tam giác) với

khối lượng bằng 1/5 hay 1/6 dung tích của dụng cụ, đậy kín bằng nút bông và

thanh trùng ở 121°C(0.5 at) trong 30 phút rồi đế nguội mới cấy giống

c) Quá trình nhân giong: bắt đầu từ giống có trong ống nghiệm Trong

các nhà máy, mỗi lần cấy truyền giống, người ta thường cấy làm 3 ống Một

ống dùng để kiểm tra trước khi sản xuất, một dùng đế sản xuất và một dùng đế

com

các tủ cấy vô trùng) chuyển toàn bộ vào bình tam giác trên, lắc cho thật đều rồi

chuyến chúng sang tủ ấm30-37°c Nuôi ở điều kiện này cho đến khi bào tử

nấm

xuất hiện và phát triến đều khắp môi trường

Ta gọi quá trình thực hiện như trên là quá trình nhân giống cấp l.Cứ

tiếp tục thực hiện ta có giống cấp 2, cấp 3 cho đến khi đủ 5-10% giống cho

sản

xuất

Cứ mỗi một cấp độ nhân giống tù' cấp này sang cấp khác, khối lượng

môi trường tăng từ 10-15 lần Trong trường hợp vượt quá 1 ký người ta nuôi

trên những khay

Trong công nghiệp sản xuất kháng sinh hiện nay, thường là dùng

nhũng

chủng biến đổi gen Công nghệ biến đổi gen đã tạo ra những chủng siêu tổng

hợp kháng sinh Theo Talaro (1993), từ chủng penicillin chrysogenum đầu tiên

chỉ có khả năng sinh tống hợp 6mg/l, hiện nay người ta đã có những chủng

biến đối gen từ chủng gốc có khả năng sinh tổng hợp 85000ng/l penicillin

d)Quá trình lên men: khi môi trường đã được khử trùng và làm nguội

đến 30°c, tiến hành trộn giống với tỉ lệ 5-10% Các khay được xếp chồng lên

nhau trên những giá đỡ với khoảng cách nhất định đế thoáng khí và thoáng

Trang 17

Dung dịch lên men được khử trùng ở 121°c (0.5 at) trong 30 phút, được phân

khối vào các khay giống các khay nuôi cấy bề mặt với môi trường bán rắn Ớ đáycác khay này không được đục lồ vì phải chứa môi trường lỏng Chiều cao của dungdịch môi trường trong các khay là 3-4 em Người ta cũng tiến hành lên men trongkhoảng thời gian là 6-7 ngày ở nhiệt độ lên men là 24-28°C

Váng nấm sợi được giữ lại sau khi đã rút hết dịch lên men, được tiếp tục sửdụng cho những lần lên men kế tiếp Ớ những lần lên mentiếp theo người ta chỉ đổ

Khu vực lên men sản xuất penicillin.

2. Phương pháp lên men chìm :

Phương pháp lên men chìm là phương pháp được áp dụng nhiều từ nhữngnăm 1950 trở lai đây, thay thế dần phương pháp nuôi cấy bề mặt (trong những nămgần đây thế giới lại quan tâm đến phương pháp nuôi cấy bề mặt vì nó có nhiều ưuđiểm)

Trang 18

2 Khô hạt có dầu (lạc, đậu - 2.0-2.4

admin 08 lh@gmaii com

www.08shln.uni.ee -Công nghệ sản xuât Penicilin

hydrol, lactose, các muối amon, thiosunfat, photphat kali hoặc natri, các muốisunfat magiê, natri, đồng

a) Quá trình nhân giống: quá trình lên men chìm người ta nhân giống

trongmôi trường lỏng Mục tiêu của quá trình nhân giống là thu nhận được số lượng tếbào cao (thường tính tống lượng tế bào/ml)

Môi trường nhân giống trong lên men penicillin khác với môi trường sản xuất

là chúng không chứa lactose (nếu có chỉ cần một lượng nhở ), một số khoáng chất

và tiền chất

Người ta thường nhân giống penicillium trong môi trường có thành phần sau:

Nitrat amon 0.125% Sunfat magiê0.025 sunfat natri 0.05%

Môi trường được thanh trùng ở 121°c trong thời gian 30 phút, để nguội vànhân giống Quá trình nhân giống được bắt đầu bằng việc chuyển giống từ ốngnghiệm sang bình tam giác đã chứa sẵn môi trường nhân giống

Pha thứ nhất: hệ sợi phát triển rất mạnh, hay còn gọi là pha sinh khối, trong

pha này các chất dinh dưỡng dễ đồng hóa sẽ được tế bào nấm hấp thu rất mạnh Tốc

độ sinh sản của nấm xảy ra rất nhanh Sự tạo thành penicillin mới bắt đầu

Pha thứ hai: hệ sợi phát triển chậm lại, pH tăng dần và đạt đến giá trị

khoảng7-7.5 Trong pha này penicillin được tạo ra với mức độ cực đại

Giống nấm mốc penicillin chrysogenum là loại hiếu khí bắt buộc Hơn thếnữa quá trình tống hợp penicillin xảy ra trong điều kiện hiếu khí mạnh Do đó trongsuốt quá trình lên men, việc thổi khí là điều hết sức cần thiết

• Nhiệt độ nên duy trì khoảng 26 ± l°c

Môi trường được thanh trùng ở 121°c trong 30 phút, sau đó làm nguội vàtiếp giong từ quá trình nhân giong vào Quá trình này được đảm bảo ở tính vô trùng

Hiệu xuất thu nhận penicillin phụ thuộc vào lượng sinh khối có trong môitrường Nhiều kết quả cho thấy khi penicillium phát triển mạnh, tạo nhiều sinh khốithì hàm lượng penicillin thu được sẽ nhiều Do đó các muối dinh dường phải đượccung cấp đầy đủ Mặt khác, còn cần cung cấp nhiều oxy vì nấm penicillin rất cầnoxy ở dạng hòa tan đế phát triển Lượng oxy phụ thuộc rất nhiều vào lượng các chấtdinh dưỡng Mối quan hệ này thường tỷ lệ thuận với nhau

III Thu nhân và tinh chế kháng sinh:

Có ba phương pháp thu nhân và tinh chế kháng sinh penicillin từ môi trườngnuôi cấy (cả phương pháp bề mặt và phương pháp chìm):

Định dạng
Số trang	28
Dung lượng	618,98 KB