Sinh lý hô hấp thực vật

Các acid hữu cơ được oxy hoá trong chu trình acid citric ty thể, và tạo ra NADH, FADH 2 và cung cấp năng lượng cho tổng hợp ATP nhờ chuỗi vận chuyển điện tử và ATP synthase trong quá trì

SINH LÝ HÔ HẤP THỰC VẬT

Quang hợp cung cấp các chất hữu cơ cơ bản cho thực vật (và gần như tất

cả sự sống khác) phụ thuộc vào Hô hấp, với sự trao đổi chất carbon liên quan

của nó, giải phóng năng lượng lưu trữ trong các hợp chất carbon một cách kiểm soát để sử dụng Đồng thời nó tạo ra nhiều tiền chất carbon cho sinh tổng hợp

Chuyên đề này sẽ xem xét về quá trình chuyển hoá của hô hấp, nhấn mạnh đến các đặc điểm đặc trưng ở thực vật Một phần bản chất của hô hấp cũng sẽ được lí giải dựa trên những thành tựu gần đây về hoá sinh và sinh học phân tử ty thể thực vật Đồng thời, xem xét đến những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình hô hấp, từ đó ứng dụng vào bảo quản sản phẩm nông nghiệp

1 KHÁI QUÁT VỀ HÔ HẤP THỰC VẬT

Hô hấp hiếu khí (cần oxy phân tử) phổ biến gần như tất cả các sinh vật nhân chuẩn và nhiều cơ thể nhân sơ, và quá trình hô hấp ở thực vật cũng được tìm thấy tương tự ở động vật và vi sinh vật Tuy nhiên, hô hấp thực vật có một số khía cạnh đặc trưng để phân biệt với hô hấp động vật Hô hấp hiếu khí là quá trình sinh học, mà các chất hữu cơ được huy động và sau đó bị oxy hoá một cách kiểm soát Trong quá trình hô hấp, năng lượng tự do được tạo ra và được lưu giữ trong một hợp chất là ATP – được sử dụng cho sự tồn tại và phát triển của thực vật

Glucose là cơ chất phổ biến nhất cho quá trình hô hấp Tuy nhiên, trong một tế bào thực vật carbon được khử có thể từ sucrose, hexose phosphate và triose phosphate xuất phát từ phân giải tinh bột và quang hợp, polyme có chứa fructose (fructan), các loại đường khác, lipid (chủ yếu là triacylglycerol), các acid hữu cơ, và một vài trường hợp là protein (hình 1)

Hình 1: Khái quát về hô hấp Cơ chất cho hô hấp được tạo ra bởi các quá trình khác nhau của tế bào và đi vào con

đường hô hấp Đường phân và con đường pentose phosphate trong tế bào chất và lạp thể (plastid) chuyển hóa đường thành các acid hữu cơ, thông qua hexose phosphate và triose phosphate, tạo ra NADH hoặc NADPH và ATP Các acid hữu cơ được oxy hoá trong chu trình acid citric ty thể, và tạo ra NADH, FADH 2 và cung cấp năng lượng cho tổng hợp ATP nhờ chuỗi vận chuyển điện tử và ATP synthase trong quá trình phosphoryl hoá oxy hoá Trong sự hình thành đường glucose mới(gluconeogenesis), carbon từ lipid được chia nhỏ trong glyoxysome, chuyển hoá trong chu trình acid citric, và sau đó được sử dụng để tổng hợp đường trong tế bào chất bởi quá trình ngược với đường phân.

Theo quan điểm hoá học, hô hấp thực vật có thể được thể hiện như là quá trình oxy hoá phân tử 12 carbon – đường sucrose và quá trình khử của 12 phân tử của O2:

C12H22O11 + 13H2O Æ 12CO2 + 48H+ + 48e

-12O2 + 48H+ + 48e- Æ 24H2O

Quá trình hô hấp được khái quát theo sơ đồ dưới đây:

Từ sơ đồ trên, đưa đến phản ứng thực sau:

C12H22O11 + 12O2 Æ 12CO2 + 11H2O Phản ứng này “dường như” là ngược chiều của quá trình quang hợp, nó đại diện cho một phản ứng oxy hoá khử trong đó sucrose bị oxy hoá hoàn toàn tới

CO2 trong khi O2 đóng vai trò như chất nhận (acceptor) điện tử cuối cùng, bị khử

thành nước Năng lượng tự do chuẩn cho các phản ứng là 5.760 kJ (1380 kcal)/mol (342g) đường sucrose bị oxy hoá Kiểm soát việc giải phóng năng lượng tự do này, kết hợp với sinh tổng hợp ATP là nội dung chủ yếu của quá trình

hô hấp

Để tránh nguy hại (đốt cháy) các cấu trúc tế bào, tế bào huy động số lượng lớn năng lượng tự do được giải phóng trong quá trình oxy hoá sucrose bằng cách thực hiện một dãy các phản ứng theo từng bước một (dạng bậc thang) Các phản

ứng này có thể được chia thành các nhóm bốn quá trình chính: đường phân, chu trình acid citric, các phản ứng của con đường pentose phosphate, và phosphoryl hóa oxy hoá Cơ chất của hô hấp đi vào quá trình hô hấp tại các điểm

khác nhau trong các con đường, được tóm tắt trong hình 1

• Đường phân (glycolysis): liên quan đến một loạt các phản ứng được thực hiện

bởi một nhóm các enzyme hoà tan nằm trong tế bào chất và cả các lạp thể

(plastid) Một loại đường - ví dụ, sucrose - một phần bị oxy hoá thông qua đường 6-carbon phosphate (hexose photphat) và đường 3-carbon phosphate (triose photphat) để tạo ra một hữu cơ acid – ví dụ như pyruvate Hiệu suất năng lượng của quá trình này nhỏ gồm ATP, và một nucleotide pyridin khử - NADH

• Con đường pentose phosphate, cũng nằm trong tế bào chất và trong các lạp

thể, đường 6-carbon (glucose-6-phosphate) ban đầu bị oxy hoá thành đường carbon (ribulose-5-phosphate) Tạo thành CO2, và năng lượng tạo ra được tích luỹ dưới dạng hai phân tử của một nucleotide pyridin khử - NADPH Trong các phản ứng sau gần trạng thái cân bằng, ribulose-5-phosphate được chuyển thành đường

5-3 đến 7 carbon

• Trong chu trình acid citric (citric acid cycle), pyruvate được oxy hoá hoàn

toàn tới CO2, và tạo ra một lượng đáng kể lực khử tương đương (16 NADH + 4FADH2)/sucrose được tạo ra trong quá trình Các phản ứng liên quan đến một loạt các enzyme nằm trong chất nền ty thể (xem hình 5) và chỉ có Succinate dehydrogenase nằm trên màng trong của ty thể

• Trong quá trình phosphoryl hoá oxy hoá, điện tử được vận chuyển nhờ một

chuỗi vận chuyển điện tử gồm các protein vận chuyển điện tử nằm ở màng trong

ty thể Hệ thống này chuyển các điện tử từ NADH (và các loại có liên quan) - tạo

ra trong đường phân, con đường pentose phosphate, và chu trình acid citric tới oxy Sự vận chuyển điện tử này giải phóng một lượng lớn năng lượng tự do được tích lũy trong ATP (tổng hợp từ ADP và Pi - phosphate vô cơ) được xúc tác bởi

enzyme ATP synthase Tập hợp các phản ứng oxy hoá khử của chuỗi vận chuyển

điện tử và sinh tổng hợp ATP được gọi là phosphoryl hóa oxy hoá Đây là giai đoạn cuối cùng quá trình oxy hoá hoàn toàn sucrose

Nicotinamid adenine dinucleotide (NAD+/NADH) là một cofactor hữu cơ (coenzyme) gắn liền với nhiều enzyme xúc tác cho nhiều phản ứng oxy hoá khử trong tế bào NAD+ là dạng cofactor oxy hoá và nó trải qua một phản ứng thuận nghịch, và trở thành dạng khử NADH khi phản ứng với 2 điện tử (hình 2):

NAD+ + 2e- + H+ Æ NADH

Hình 2: Các cấu trúc và các phản ứng của các cofactor chủ yếu mang điện tử tham gia vào năng lượng sinh học hô

hấp (A) Sự khử NAD(P) + tới NAD(P)H; (B) Sự khử của FAD tới FADH 2 FMN là giống hệt với một phần flavin

và được hiển thị trong khung trên hình 2 Các khu vực màu xanh hiển thị phần của các phân tử được tham gia trong phản ứng oxy hoá khử

Thế năng khử chuẩn cho cặp phản ứng oxy hoá khử là khoảng -320mV, tạo

ra một chất khử mạnh (tức là chất cho điện tử) Như vậy, NADH là một phân tử thuận tiện để tích lũy năng lượng tự do của các điện tử được giải phóng ra trong phản ứng oxy hoá của đường phân và chu trình acid citric Một hợp chất có liên quan là nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP+/NADPH), hoạt động trong các phản ứng oxy hoá khử của quang hợp và trong con đường pentose phosphate, nó còn tham gia vào sự trao đổi chất ty thể

Sự oxy hoá NADH bởi oxy qua chuỗi vận chuyển điện tử giải phóng năng lượng tự do (220 kJ/mol-1, hoặc 52 kcal/mol-1) được sử dụng để tổng hợp ATP Bây giờ chúng ta có thể xây dựng một bức tranh hoàn chỉnh hơn về mối liên quan giữa hô hấp và vai trò của nó trong quá trình chuyển hoá năng lượng tế bào qua hai phản ứng sau đây:

C12H22O11 + 12O2 Æ 12CO2 + 11H2O 60ADP + 60Pi Æ 60ATP + 60H2O Không phải tất cả carbon đi vào con đường hô hấp đều kết thúc là CO2 Nhiều sản phẩm trung gian của hô hấp là tiền chất cho các quá trình chuyển hóa khác (xem hình 13)

2 ĐƯỜNG PHÂN: QUÁ TRÌNH DIỄN RA TRONG TẾ BÀO CHẤT VÀ LẠP THỂ

Trong những bước đầu của đường phân (glycolysis bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp “glykos”: đường và “lysis”: tách), carbohydrate được chuyển thành hexose

phosphate, sau đó được phân chia thành hai đường triose phosphate Trong giai đoạn tiếp theo, năng lượng được tích luỹ trong đường triose phosphate được oxy hoá và sắp xếp lại để tạo ra hai phân tử pyruvate

Bên cạnh việc chuẩn bị cơ chất cho quá trình oxy hoá trong chu trình acid citric, hiệu suất năng lượng của đường phân nhỏ, năng lượng được tích luỹ trong các hợp chất hoá học gồm ATP và NADH Khi phân tử oxy không có sẵn chẳng

hạn như ở rễ cây trồng trong vùng đất ngập nước thì con đường lên men

(fermentation pathway), với các phản ứng diễn ra trùng khớp với quá trình đường

phân, diễn ra trong tế bào chất, khử pyruvate để tuần hoàn NADH được tạo ra từ đường phân

2.1 Đường phân chuyển hóa carbohydrate thành pyruvate, tạo ra NADH và ATP

Đường phân xảy ra ở tất cả các cơ thể sống (sinh vật nhân sơ và sinh vật nhân chuẩn) Các phản ứng chính gắn liền với quá trình đường phân và lên men trong các ty thể gần như giống với trong tế bào động vật (hình 3) Tuy nhiên, đường phân thực vật có đặc trưng điều hoà riêng, ví dụ như một phần con đường đường phân diễn ra song song trong lạp thể và enzyme xúc tác thay đổi ở một vài bước trong tế bào chất

Trong động vật, cơ chất của đường phân là glucose và sản phẩm cuối cùng

là pyruvate Nhưng vì sucrose lại là đường chủ yếu trong hầu hết các loài thực vật, do đó đường này là cơ chất cho cây hô hấp ở các mô không quang hợp (không phải glucose) Sản phẩm cuối cùng của đường phân thực vật bao gồm acid hữu cơ gồm pyruvate và malate

Trước khi diễn ra đường phân, sucrose dễ dàng được “bẻ” thành hai monosaccharid (glucose và fructose) có thể đi vào con đường đường phân Hai con đường cho sự phân giải sucrose được biết trong thực vật đều lấy sucrose từ

libe Trong hầu hết các mô thực vật, sucrose synthase có trong tế bào chất, được

sử dụng để phân giải sucrose bằng cách kết hợp sucrose với UDP để sản xuất fructose và UDP-glucose UDP-glucose pyrophosphorylase xúc tác chuyển UDP-glucose và pyrophosphate (PPi) thành UTP và glucose-6-phosphate theo sơ đồ dưới đây (và xem thêm ở hình 3)

Trong một số mô, sự có mặt của invertase ở trong thành tế bào, không bào,

hoặc tế bào chất sẽ thuỷ phân sucrose để tạo thành hai thành phần của nó là đường 6-carbon (glucose và fructose) Các hexose này sau đó được phosphoryl hoá trong phản ứng có sử dụng ATP Ngược lại, khi phản ứng xúc tác bởi sucrose synthase gần tới trạng thái cân bằng, phản ứng xúc tác bởi invertase giải phóng đủ năng lượng về cơ bản đây là phản ứng không thuận nghịch

Lạp thể (có thể là lục lạp hoặc bột lạp) cũng có thể cung cấp cơ chất cho đường phân Tinh bột được tổng hợp và được phân giải chỉ trong các lạp thể, và carbon thu được từ sự phân giải tinh bột đi vào con đường đường phân trong tế bào chất chủ yếu như hexose phosphate (được di chuyển ra khỏi bột lạp) hoặc triose phosphate (được di chuyển ra khỏi lục lạp) Sản phẩm quang hợp cũng có thể trực tiếp vào con đường đường phân như triose phosphate

Các lạp thể chuyển tinh bột thành triose phosphate sử dụng một dãy isozyme riêng biệt xúc tác phản ứng chuyển hexose phosphate thành triose photphat Tất cả các enzyme được thể hiện trong hình 3 đã được đánh giá ở mức

vừa đủ để hỗ trợ hô hấp và kết quả đã được quan sát trong các mô thực vật nguyên vẹn

Trong giai đoạn đầu tiên của đường phân, mỗi đơn vị hexose được phosphoryl hóa hai lần và sau đó chia tách, cuối cùng tạo ra hai phân tử triose phosphate Các phản ứng này tiêu thụ 2-4 phân tử ATP trên một đơn vị sucrose, tuỳ thuộc vào việc sucrose được tách ra bởi sucrose synthase hoặc invertase Các phản ứng này cũng bao gồm hai trong ba phản ứng cơ bản không thuận nghịch của con đường đường phân được xúc tác bởi hexokinase và phosphofructokinase (xem hình 3) Phản ứng phosphofructokinase là một trong những điểm kiểm soát (điều khiển) ở cả đường phân thực vật và động vật

2.2 Phase tích lũy năng lượng của đường phân

Các phản ứng chuyển carbon từ các “bể” (tạm dịch: “bể”) cơ chất khác nhau đến triose phosphate Khi glyceraldehyde-3-phosphate được hình thành, con đường đường phân có thể bắt đầu trích xuất năng lượng để tích lũy Enzyme glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase xúc tác quá trình oxy hóa aldehyde thành một acid carboxylic, khử NAD+ tạo NADH Phản ứng này giải phóng năng lượng tự do để sử dụng cho phosphoryl hóa (sử dụng phosphate vô cơ) glyceraldehyde-3-phosphate để tạo ra 1,3-bisphosphoglycerate Sự phosphoryl hóa acid carboxylic ở carbon số 1 của 1,3-bisphosphoglycrerate (xem hình 3) tạo

ra một năng lượng tự do chuẩn lớn (-49,3 kJ/mol-1, hoặc -11,8 kcal.mol-1) Do đó, 1,3-bisphosphoglycerate là một chất khử mạnh của các nhóm phosphate

Trong bước tiếp theo của đường phân, được xúc tác bởi phospho glycerate kinase, phosphate ở carbon số 1 được chuyển tới một phân tử ADP, tạo ra ATP và 3-phosphoglycerate Mỗi phân tử sucrose đi vào con đường này có 4 phân tử ATP được hình thành – mỗi phân tử ATP được hình thành từ một phân tử 1,3-bisphosphoglycerate

Loại tổng hợp ATP theo kiểu này được gọi là phosphoryl hóa ở mức cơ chất có nghĩa là diễn ra sự chuyển giao trực tiếp một nhóm phosphate từ một

phân tử cơ chất cho ADP để tạo thành ATP ATP tổng hợp bằng cách phosphoryl hóa ở mức cơ chất có cơ chế khác biệt với ATP được tổng hợp bởi ATP synthase tham gia vào việc phosphoryl hóa oxy hóa trong ty thể hoặc quang phosphoryl hóa trong lục lạp

Trong phản ứng tiếp theo, phosphate ở 3-phosphoglyxerat được chuyển đến carbon số 2 và một phân tử nước bị loại bỏ, sự linh động của hợp chất phosphoenolpyruvate (PEP) Nhóm phosphate của PEP có năng lượng tự do chuẩn cao (-61,9 kJ / mol-1, hoặc -14,8 kcalmol-1), điều đó làm cho PEP là một chất khử rất tốt cho hình thành ATP Bằng cách sử dụng PEP như là cơ chất, các enzyme pyruvate kinase xúc tác một phản ứng phosphoryl hóa ở mức cơ chất lần

2 để tạo ra ATP và pyruvate Bước cuối cùng, đó là bước thứ ba về cơ bản không thể thuận nghịch trong đường phân, hiệu suất năng lượng là thêm bốn phân tử ATP cho mỗi phân tử sucrose vào con đường đường phân

2.3 Thực vật có các phản ứng đường phân biến thể

Trình tự của các phản ứng tạo thành pyruvate từ đường xảy ra ở tất cả các sinh vật nhờ thực hiện đường phân Ngoài ra, các sinh vật có thể tổng hợp đường

từ các acid hữu cơ Quá trình này được gọi là tổng hợp đường mới -

gluconeogenesis

Gluconeogenesis không phổ biến ở thực vật, nhưng nó hoạt động trong hạt của một số loài thực vật, chẳng hạn như đậu castor và hướng dương, lưu trữ số lượng đáng kể carbon dự trữ dưới dạng các loại dầu (triacylglycerol) Sau khi các hạt giống nảy mầm, dầu được chuyển theo gluconeogenesis tạo ra sucrose, mà sau đó sẽ được sử dụng để hỗ trợ cây giống Trong giai đoạn đầu tiên của đường phân, gluconeogenesis trùng lặp với các lộ trình tổng hợp sucrose từ quang tổng hợp triose phosphate, là điển hình cho các thực vật

Bởi vì phản ứng phân giải đường được xúc tác bởi phosphofructokinase phụ thuộc ATP (ATP-dependent phosphofructokinase) cơ bản là không thuận nghịch (xem hình 3), thêm vào đó là một loại enzyme được bổ sung, fructose-1,6-

bisphosphatease, chuyển fructose-1,6-bisphosphate tạo thành phosphate và Pi trong suốt quá trình gluconeogenesis Phosphofructokinase phụ thuộc ATP và fructose-1,6-bisphosphatease kiểm soát điểm chính của dòng carbon thông qua con đường phân giải đường /gluconeogenic trong cả thực vật và động vật, cũng như trong tổng hợp sucrose ở thực vật

fructose-6-Trong thực vật, sự chuyển hóa qua lại giữa fructose-6-phosphate và fructose-1,6-bisphosphate phức tạp hơn bởi sự hiện diện của một enzyme (bổ sung trong tế bào chất) đó là phosphofructokinase phụ thuộc -PPi (pyrophosphate: fructose-6-phosphate 1-phosphotransferase), xúc tác phản ứng thuận nghịch (xem hình 3):

Fructose-6-P + PPi ↔ Fructose-1,6-P2 + Pi Trong đó P là phosphate và P2 và bisphosphate phosphate

Phosphofructokinase phụ thuộc PPi được tìm thấy trong tế bào chất của hầu hết các mô thực vật với hàm lượng cao hơn đáng kể so với của phosphofructokinase phụ thuộc ATP Sự ngăn cản của phosphofructokinase phụ thuộc PPi ở khoai tây biến đổi gen đã chỉ ra rằng của enzyme này giúp đường phân diễn ra mạnh mẽ, nhưng mà nó không phải là thiết yếu cho sự sống còn của thực vật, các enzyme khác có thể giữ chức năng này Phản ứng xúc tác của phosphofructokinase phụ thuộc PPi là dễ dàng thuận nghịch, nhưng nó không hoạt động trong tổng hợp sucrose Giống như phosphofructokinase phụ thuộc ATP và fructose bisphosphatease, enzyme này dường như xuất hiện để điều hòa quá trình chuyển hóa tế bào, điều đó gợi ý rằng trong một số trường hợp hoạt động của con đường phân giải đường ở thực vật có sự khác biệt với các sinh vật khác

Sản phẩm cuối cùng của quá trình đường phân trong tế bào chất của tế bào được xác định bởi hoạt động của 3 enzyme có liên quan, các enzyme này sử dụng phosphoenolpyruvate làm cơ chất Hai enzyme pyruvate kinase và PEP phosphatase xúc tác phản ứng tạo thành pyruvate, riêng PEP carboxylase xúc tác

phản ứng tạo thành oxaloacetate Pyruvate được chuyển trực tiếp vào trong ty thể OAA có thể hoặc chuyển trực tiếp vào ty thể hoặc đầu tiên bị khử tới malate bởi enzyme malate dehydrogenase tế bào chất, theo phương trình sau:

Màng trong của ty thể có chứa các chất mang riêng biệt nơi mà malate và pyruvate có thể được chuyển vào trong chất nền ty thể Trong chất nền ty thể, malate có thể bị oxy hóa bởi hai enzyme: isoenzyme của malate dehydrogenase ty thể tạo thành OAA và NADH, và một enzyme nữa là NAD+ liên kết malic enzyme xúc tác hình thành pyruvate, CO2, và NADH, cả hai enzyme này đều nằm trong chất nền ty thể, phản ứng được chỉ ra theo phương trình dưới đây Trước đó malate có thể đi vào trong ty thể từ tế bào chất nhờ sự khử tương đương (reducing equivalents)

Hình 3: Các phản ứng của đường phân và lên men ở thực vật (A) Trong con đường chính, sucrose bị oxy hóa

thành acid hữu cơ pyruvic Các mũi tên kép chỉ chiều phản ứng thuận nghịch; các mũi tên đơn, chủ yếu là phản ứng không thuận nghịch (B) Các cấu trúc của chất trung gian chứa P, phosphate P 2 , biphosphate

2.4 Trong điều kiện thiếu (không có) O 2 , lên men tái sinh NAD + cần thiết cho đường phân

Nếu không có oxy, chu trình acid citric và phosphoryl hóa oxy hóa không thể hoạt động, đường phân do đó không thể tiếp tục vì cung cấp NAD+ của tế bào

bị hạn chế vì tất cả các NAD+ chuyển lên trạng thái khử (NADH), các phản ứng xúc tác bằng glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase không thể xảy ra (NAD+ giống như con thuyền chở điện tử và proton) Để khắc phục vấn đề này, thực vật và các sinh vật khác có thể chuyển hóa pyruvate bằng cách thực hiện một hoặc nhiều hình thức trao đổi chất lên men (xem hình 3)

Trong quá trình lên men rượu (phổ biến trong các thực vật, nhưng được biết đến rộng rãi hơn ở nấm men rượu), hai enzyme pyruvate decarboxylase và alcohol pyruvate dehydrogenase hoạt động trên pyruvate, cuối cùng tạo ra ethanol

và khí CO2 và oxy hóa NADH trong quá trình Trong quá trình lên men acid lactic (thường có ở bắp thịt động vật có vú và còn tìm thấy ở thực vật), các loại enzyme lactate dehydrogenase sử dụng NADH để khử pyruvate tới lactate, do đó tái sinh NAD+ Trong một số trường hợp, mô thực vật có thể chịu nồng độ thấp (hypoxic) hay không có (anoxic) oxy xung quanh, khiến chúng phải thực hiện

chuyển hóa lên men Ví dụ tốt nhất để thực hiện nghiên cứu này bao gồm các loại đất bị ngập lụt hoặc no nước mà ở đó sự khuếch tán oxy giảm là nguyên nhân để các mô gốc bị thiếu oxy

Ở ngô, các phản ứng ban đầu với oxy thấp là quá trình lên men acid lactic, nhưng các phản ứng tiếp theo là lên men rượu Ethanol được cho là một sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men ít độc hại vì nó có thể khuếch tán ra khỏi tế bào, trong khi tích lũy lactate sự đẩy nhanh quá trình axit hóa tế bào chất Trong nhiều trường hợp, chức năng thực vật tùy theo điều kiện gần/kỵ khí mà thực hiện một

tử sucrose Năng lượng tự do chuẩn (ΔG0’) thay đổi trong quá trình oxy hóa hoàn toàn sucrose là -5.760 kJmol-1 (1380 kcal.mol-1) Giá trị của ΔG0' để tổng hợp ATP là 32 kJ mol-1 (7,7 kcal.mol-1) Tuy nhiên, dưới các điều kiện bình thường không chuẩn tồn tại ở cả tế bào động vật có vú và các tế bào thực vật, tổng hợp ATP đòi hỏi phải cung cấp năng lượng tự do khoảng 50 kJ.mol-1 (12 kcal.mol-1)

Đem lại sự tổng hợp thực là bốn phân tử ATP từ mỗi phân tử sucrose được chuyển thành ethanol (hoặc lactate), hiệu quả của quá trình lên men kỵ khí chỉ khoảng 4% Hầu hết năng lượng có sẵn trong sucrose vẫn trong sản phẩm khử của quá trình lên men: lactate hoặc ethanol Trong hô hấp hiếu khí, các pyruvate tạo

ra qua đường phân được vận chuyển vào ty thể, nơi nó được tiếp tục bị oxy hóa, tạo ra năng lượng tự do nhiều hơn giá trị ban đầu có trong sucrose Bởi vì hiệu quả tích lũy năng lượng qua lên men thấp, nên việc tăng tỷ lệ đường phân là cần thiết để duy trì sản xuất ATP rất cần thiết cho sự sống còn của tế bào Điều này được gọi là hiệu ứng Pasteur sau khi Louis Pasteur nhà vi sinh Pháp, người đầu

tiên ghi nhận nó khi nấm men chuyển từ hô hấp hiếu khí tới lên men rượu kỵ khí

Tỷ lệ cao hơn của đường phân là kết quả từ những thay đổi trong mức độ chuyển hóa phân giải đường, cũng như từ các gia tăng biểu hiện của các gen mã hoá enzyme của đường phân và lên men

2.6 Đường phân thực vật được điều khiển bởi các sản phẩm của nó

Trong in vivo, đường phân dường như được điều hòa bởi mức độ của sự

phosphoryl hóa fructose-6-phosphate và sự quay vòng PEP

Trái ngược với động vật, AMP và ATP không phải là phân tử chính trả lời kích thích của phosphofructokinase và pyruvate kinase thực vật Nồng độ PEP của tế bào chất, là một chất ức chế mạnh phosphofructokinase phụ thuộc ATP thực vật, đóng vai trò quan trọng trong điều hòa đường phân của thực vật Hiệu quả ức chế này của PEP lên phosphofructokinase bị giảm mạnh bởi phosphate vô

cơ, làm cho tỷ lệ của PEP/Pi trong tế bào chất là một yếu tố quan trọng trong sự kiểm soát hoạt động phân giải đường ở thực vật Pyruvate kinase và PEP cacboxylase, các enzyme chuyển hóa PEP trong các bước cuối cùng của đường phân (xem hình 3), nhạy cảm với ức chế ngược (feed-back) bởi các chất trung gian của chu trình acid citric và dẫn xuất của chúng, bao gồm malate, citrate, 2-oxoglutarate và glutamate

Trong thực vật, sự kiểm soát đường phân xuất phát từ “dưới lên" (bottom - up) (xem hình 12), với chuyển hóa PEP được điều hòa ở mức sơ cấp bởi pyruvate kinase và PEP carboxylase và điều hòa thứ cấp được thực hiện bởi PEP trong chuyển hóa của fructose-6-phosphate tạo fructose-1,6-bisphosphate (xem hình 3)

Ở động vật, điều hòa sơ cấp có hiệu lực ở các phosphofructokinase, và điều hòa thứ cấp tại pyruvate kinase

Một lợi ích có thể được thấy ở kiểm soát từ “dưới lên” đối với đường phân

là nó cho phép thực vật kiểm soát thực sự phân giải đường để pyruvate độc lập với các quá trình trao đổi chất có liên quan chẳng hạn như các chu trình Calvin và chuyển đổi qua lại sucrose ↔ triose phosphate ↔ tinh bột Một lợi ích khác của

cơ chế kiểm soát này là đường phân có thể điều chỉnh cho nhu cầu sinh tổng hợp các tiền chất

Sự có mặt của hai enzyme trong chuyển hóa PEP trong các tế bào thực vật

- pyruvate kinase và PEP carboxylase – dẫn tới sự kiểm soát của đường phân là không rõ ràng Mặc dù hai enzyme bị ức chế bởi chất chuyển hóa tương tự, PEP carboxylase dưới một số điều kiện có thể thực hiện một phản ứng vượt qua pyruvate kinase Kết quả là malate sau đó có thể nhập chu trình acid citric ty thể

Do vậy, điều hòa “dưới lên” cho phép một sự linh hoạt cao trong sự kiểm soát của đường phân thực vật

Thực nghiệm ủng hộ cho các con đường chuyển hóa PEP là các nghiên cứu

về cây thuốc lá chuyển gen có pyruvate kinase trong tế bào chất ít hơn 5% so với mức bình thường trong lá của chúng Trong thực vật đó, tỷ lệ của hô hấp lá và quang hợp đều không bị ảnh hưởng liên quan với việc điều khiển các mức độ của pyruvate kinase ở kiểu hình dại Tuy nhiên, sự giảm tăng trưởng ở rễ các cây trồng chuyển gen chỉ ra rằng phản ứng pyruvate kinase không thể bị phá vỡ mà không có một số tác động có hại

Sự điều hòa của chuyển hóa fructose-6-phosphate tới bisphosphate cũng phức tạp Fructose-2,6-bisphosphate, các hexose bisphosphate còn lại, có ở các mức độ khác nhau trong tế bào chất Nó ức chế rõ rệt hoạt động của fructose-1,6-bisphosphatese tế bào chất nhưng kích thích hoạt động của phosphofructokinase phụ thuộc PPi Những quan sát này cho thấy rằng fructose-2,6-bisphosphate đóng một vai trò trung tâm trong dòng “thông” giữa con đường phụ thuộc ATP và con đường phụ thuộc PPi của chuyển hóa fructose phosphate tại điểm giữa tổng hợp sucrose và đường phân

fructose-1,6-2.7 Con đường pentose phosphate tạo ra NADPH và sinh tổng hợp các sản phẩm trung gian

Con đường đường phân + chu trình Krep không phải là con đường duy nhất

cho quá trình oxy hóa đường trong tế bào thực vật Con đường oxy hóa pentose

phosphate (còn được gọi là con đường hexose monophosphate) cũng có thể thực

hiện nhiệm vụ này (hình 4)

Hình 4: Các phản ứng oxy hóa theo con đường pentose phophat ở thực vật bậc cao P, phosphate

Các phản ứng được thực hiện bởi các enzyme hòa tan có trong tế bào chất

và trong các lạp thể Nói chung, các con đường trong các lạp thể chiếm ưu thế hơn con đường trong tế bào chất

Hai phản ứng đầu tiên của con đường này bao gồm các phản ứng oxy hoá chuyển đường 6-carbon: glucose-6-phosphate đến một đường 5-carbon, ribulose-5-phosphate, một phân tử CO2 và sinh ra 2 phân tử NADPH (không phải NADH) Các phản ứng còn lại của con đường là chuyển ribulose-5-phosphate tới chất trung gian của phân giải đường glyceraldehyde-3-phosphate và fructose-6-phosphate Bởi vì glucose-6-phosphate có thể được tái sinh từ glyceraldehyde-3-phosphate và fructose-6-phosphate bởi enzyme đường phân, trong sáu vòng của chu trình, chúng ta có thể viết những phản ứng như sau:

6 glucose – 6 P + 12 NADP+ + 7H2O Æ

5 glucose-6-P + 6CO2 + Pi + 12NADPH + 12H+Kết quả thu được từ quá trình oxy hóa hoàn toàn của một phân tử glucose-6-phosphate tới CO2 là tổng hợp đồng thời 12 phân tử NADPH

Nghiên cứu sử dụng đồng vị phóng xạ 14C của glucose đã chỉ ra rằng đường phân là con đường phổ biến, chiếm 80-95% tổng dòng carbon trong hầu hết các mô thực vật Tuy nhiên, con đường pentose phosphate cũng góp phần vào chuyển hóa dòng carbon này, và những nghiên cứu về sinh học phát triển đã chỉ

ra rằng vai trò của nó tăng cùng với sự phát triển của tế bào thực vật từ tế bào phân sinh đến trạng thái đã biệt hóa

Vai trò của con đường pentose phosphate được thể hiện:

* Sản phẩm NADPH sẽ tham gia vào các phản ứng của các con đường sinh tổng hợp khác xảy ra trong tế bào chất Con đường này cũng cung cấp NADPH cho quá trình sinh tổng hợp lipit và đồng hóa nitơ ở các thể vô sắc như bột lạp và lạp thể hoạt động trong tối

* Do ty thể ở thực vật có khả năng oxy hóa NADPH trong tế bào chất nhờ enzyme NADPH dehydrogenase nằm trên bề mặt ngoài của màng trong nên một

số phân tử NADPH tạo ra bởi con đường này sẽ tham gia vào quá trình trao đổi năng lượng của tế bào; cụ thể là các điện tử từ NADPH có thể khử O2 và tạo ra ATP

* Con đường này tạo ra ribose-5-phosphate, một phân tử tiền chất của đường ribose và deoxyribose cần thiết trong quá trình sinh tổng hợp ARN và ADN tương ứng

* Các chất trung gian khác trong con đường này, như đường phosphate, kết hợp với PEP trong phản ứng khởi đầu để tạo ra các hợp chất phenolic thực vật bao gồm các acid amin thơm và các tiền chất của lignin, flavonid và phytoalexin

erythrose-4-* Trong các giai đoạn đầu của phát triển, trước khi mô lá có khả năng thực hiện quang tự dưỡng hoàn toàn thì người ta cho rằng con đường pentose phosphate có vai trò trung gian tạo ra các chất cho chu trình calvin

Điều hòa con đường pentose phosphate

Con đường oxy hóa pentose phosphate được điều hòa ở phản ứng đầu tiên xúc tác bởi enzyme glucose-6-phosphate dehydrogenase Hoạt tính của enzyme này bị ức chế mạnh khi tỷ lệ NADPH/NADP+ cao Tuy nhiên, dưới điều kiện ánh sáng con đường pentose phosphate ít xảy ra trong lạp thể bởi vì các sản phẩm cuối cùng của con đường này bao gồm fructose-6-phosphate và glyxeral-3-phosphate đang được tổng hợp bởi chu trình calvin Vì vậy, mà sẽ hướng các phản ứng biến đổi trong pha không oxy hóa của con đường này theo chiều tổng hợp nên các đường pentose Hơn nữa, enzyme glucose-6-phosphate dehydrogenase sẽ bị ức chế trong quá trình quang hợp do tỷ lệ NADPH/NADP+cao ở lục lạp, cũng như bị bất hoạt do hệ thống ferredoxyn–thioredoxyn

3 CHU TRÌNH ACID CITRIC: QUÁ TRÌNH DIỄN RA TRONG CHẤT NỀN TY THỂ

Trong thế kỉ thứ 19, các nhà sinh học đã phát hiện ra rằng trong điều kiện yếm khí tế bào sẽ sản sinh ethanol hoặc acid lactic còn trái lại trong điều kiện hiếu khí tế bào sẽ sử dụng oxy để tạo ra CO2 và H2O Vào năm 1937, một nhà hóa sinh người Anh gốc Đức, tên là Hans A Krebs đã công bố rằng phát hiện ra chu

trình acid citric hay còn gọi là chu trình acid tricarboxylic (TCA) hoặc chu trình Krebs Việc làm sáng tỏ chu trình acid citric không chỉ giúp giải thích quá trình

pyruvate bị phân giải thành CO2 và H2O như thế nào mà nó còn giúp đánh giá vai trò của chu trình trong các con đường trao đổi chất Nhờ công trình trên ông được giải Nobel về sinh lí và y học năm 1953

Bởi vì chu trình acid citric xảy ra trong chất nền của ty thể nên trước hết chúng ta sẽ xem xét cấu trúc và chức năng của ty thể Sau đó chúng ta sẽ tìm hiểu các bước của chu trình acid citric, nhấn mạnh vào các đặc điểm đặc trưng với thực vật

3.1 Đặc điểm siêu cấu trúc ty thể ở thực vật

Phân giải đường sucrose thành pyruvate sẽ giải phóng ít hơn 25% năng lượng trong đường sucrose, phần năng lượng còn lại sẽ được dự trữ trong 2 phân

tử pyruvate Hai giai đoạn tiếp theo của quá trình hô hấp (đó là chu trình acid citric và phosphoryl hóa oxy hóa) sẽ xảy ra trong một cơ quan tử được gọi là ty thể

Quan sát dưới kính hiển vi điện tử thấy rằng, ty thể ở thực vật dù cho là

trong tế bào hay trong in vitro có hình cầu hoặc hình que có đường kính 0,5 – 1

µm vào dài tới 3 µm Trừ một số trường hợp ngoại lệ, thông thường các tế bào thực vật có số lượng ty thể ít hơn số ty thể của tế bào động vật Số lượng ty thể trên mỗi tế bào là khác nhau liên quan trực tiếp đến hoạt động trao đổi chất của

mô và nó phản ánh mức độ trao đổi chất Ví dụ như các tế bào bảo vệ thường không có nhiều ty thể

Giống với ty thể ở các mô không phải của thực vật Ty thể thực vật có 2 màng một màng ngoài trơn bao bọc hoàn toàn một màng trong gấp khúc Sự gấp khúc màng trong của ty thể được gọi là cristae (còn được gọi là lược) Việc gấp khúc này sẽ tạo ra một diện tích

bề mặt lớn, do đó màng trong của

ty thể chứa tới >50% protein của

ty thể Phần chất nhầy chứa trong

màng trong được gọi là chất nhày

ty thể và khoảng trống giữa hai

màng được gọi là khoảng không

(hình 5)

Một ty thể ở trạng thái

nguyên vẹn có tính chất thấm tích

cực đó là chúng lấy nước và

trương lên khi đặt trong môi

trường nhược trương Hầu hết các

ion vô cơ và các phân tử hữu cơ

tích điện không có khả năng qua

lại tự do qua màng Màng trong

của ty thể là một vật cản thẩm

thấu, còn màng ngoài là có khả

năng thấm đối với các phân tử có

khối lượng phân tử nhỏ hơn

10kDa Phần lipid của cả hai

màng chủ yếu cấu tạo bởi phospholipid mà 80% trong số chúng là phosphateidylcholine hoặc phosphateidylethanolamine

Hình 5: Cấu trúc ty thể thực vật

Giống như lạp thể, ty thể là một bào quan bán tự động, bởi vì chúng chứa ribosome, ADN và ARN và có khả năng tổng hợp nên một số lượng protein nhất định của ty thể Vì vậy ty thể của thực vật có khả năng thực hiện nhiều bước trong quá trình tổng hợp protein và truyền thông tin di truyền của chúng Ty thể tăng sinh qua quá trình phân chia một ty thể tồn tại trước đó mà không có sự tổng hợp mới ty thể

3.2 Pyruvate có thể vào ty thể và được oxy hóa qua chu trình acid citric

Như đã đề cập ở trên, chu trình acid citric hay còn gọi là TCA do phần quan trọng của acid citric và acid isocitric như là các chất trung gian ban đầu Chu trình này cấu thành nên giai đoạn thứ hai của quá trình hô hấp xảy ra trong chất nền ty thể hoạt động của nó đòi hỏi pyruvate tạo ra trong quá trình đường phân ở trong tế bào chất phải được vận chuyển vào ty thể thông qua một protein đặc hiệu

Khi vào trong chất nền ty thể, pyruvate sẽ bị loại bỏ đi một phân tử carbon trong một phản ứng xúc tác bởi pyruvate dehydrogenase, sản phẩm của phản ứng này bao gồm NADH, CO2 và axetyl CoA (hình 6)

Enzyme pyruvate dehydrogenase là một phức hệ lớn gồm ba enzyme khác nhau: pyruvate dehydrogenase (E1), dihydrolipoyl transacetylase (E2), và dihydrolipoyl dehydrogenase (E3) Trình tự các bước của phản ứng này gồm:

- Pyruvate phản ứng với thiamine pyrophosphate (TPP) ở vùng biên của pyruvate dehydrogenase (E1) dẫn đến tách CO2 khỏi phân tử pyruvate và tạo thành dẫn xuất của hydroxylethyl

- Pyruvate dehydrogenase chuyển hai điện tử và nhóm acetyl từ TPP tới dạng oxy hóa của nhóm lipoyllysyl của lõi enzyme dihydrolipoyl transacetylase (E2), để hình thành acetyl thioester của nhóm lipoyl khử

- Bước này là sự chuyển ester hóa mà nhóm –SH của CoA thay nhóm –SH của E2 tạo acetyl-CoA và dạng khử đầy đủ của (dithiol) nhóm lipoyl

- Dihydrolipoyl dehydrogenase (E3) định hướng chuyển hai nguyên tử hydro từ nhóm khử lipoyl của E2 tới FAD – được gắn vào E3, trở lại dạng oxy hóa của nhóm lipoyllysyl của E2

- FADH2 dạng khử của E3 chuyển một ion hydride (:H-) tới NAD+ hình thành dạng NADH Phức hệ enzyme này xúc tác theo trình tự và quay vòng cho phản ứng xúc tác tiếp theo

Trong phản ứng tiếp theo của chu trình acid citric, enzyme citratesynthase kết hợp nhóm acetyl của acetyl-CoA với một phân tử 4 carbon là acid oxaloacetate (OAA) để tạo thành một phân tử 6-carbon là acid citric (citrate) Citrate sau đó được đồng phân hóa thành isocitrate, bởi enzyme asconitase

Hai phản ứng tiếp theo là hai phản ứng decarboxyl hóa oxy hóa, mỗi phản ứng tạo ra một NADH và giải phóng một phân tử CO2 và một phân tử succinyl-CoA Đến thời điểm này, mỗi phân tử pyruvate khi vào ty thể đã tạo ra 3 phân tử

CO2 hoặc 12 phân tử CO2 khi mỗi phân tử sucrose bị oxy hóa

Trong phần còn lại của chu trình acid citric, succinyl-CoA sẽ được oxy hóa trở lại thành oxaloaccetate Ban đầu, năng lượng tự do lớn trong liên kết thioeste của succinyl-CoA được tích lũy thông qua quá trình tổng hợp từ ADP và Pi trong một phản ứng phosphoryl hóa ở mức cơ chất, xúc tác bởi enzyme succinyl-CoA synthetase Succinate tạo ra sẽ được oxy hóa tiếp tạo thành fumarate bởi enzyme succinate dehydrogenase đây là enzyme duy nhất của chu trình acid citric liên kết với màng và cũng là một phần của chuỗi truyền điện tử

Các điện tử và proton được tạo ra từ sucinate sẽ không chuyển tới NAD+

mà được chuyển tới FAD FAD liên kết cộng hóa trị với vị trí hoạt động của enzyme sucinate dehydrogenase và diễn ra một phản ứng khử tạo thành FDAH2

Trong 2 phản ứng cuối cùng của chu trình acid citric, fumarate bị thủy phân tạo thành malate, malate sau đó sẽ được oxy hóa bởi enzyme malate dehydrogenase tái tạo oxaloacetate tạo ra một phân tử NADH Oxaloacetate phản ứng với một phân tử acetyl-CoA khác và tiếp tục chu trình Như vậy, quá trình oxy hóa một phân tử pyruvate sẽ tạo ra 3 phân tử CO2, và năng lượng tự do giải phóng trong những phản ứng oxy hóa này sẽ được tích lũy trong 4 phân tử NADH và 1 phân tử FADH2 Ngoài ra, một phân tử ATP được tạo ra ở mức phosphoryl hóa cơ chất trong chu trình

Tất cả các enzyme tham gia trong chu trình TCA đều được tìm thấy trong

ty thể của thực vật Một vài trong số chúng sẽ liên kết với nhau thành phức hệ enzyme, điều này sẽ giúp quá trình vận chuyển các chất trao đổi giữa các enzyme

Hình 6: Các phản ứng và enzyme trong chu trình acid citric ở thực vật

3.3 Chu trình TCA của thực vật có những nét độc đáo

Các phản ứng của chu trình acid citric nêu trong hình 6 không phải tất cả giống hệt với các phản ứng xảy ra ở ty thể động vật Ví dụ, bước xúc tác của succinyl-CoA synthetase sản xuất ATP ở thực vật và GTP ở động vật

Một đặc trưng của chu trình acid citric thực vật mà không có mặt trong các sinh vật khác là hoạt động quan trọng của enzyme NAD+ malic, đã được tìm thấy trong chất nền của tất cả ty thể được phân tích Enzyme này xúc tác decarboxyl hóa oxy hoá của malate:

Malate + NAD+ Æ Pyruvate + CO2 + NADH

Sự hiện diện của enzyme NAD+ malic cho phép ty thể thực vật hoạt động con đường “biến thể” (alternative pathways) chuyển hóa PEP bắt nguồn từ đường phân Như đã mô tả, malate có thể được tổng hợp từ PEP trong tế bào chất thông qua các enzyme PEP carboxylase và malate dehydrogenase (xem hình 3) Malate sau đó được vận chuyển vào trong chất nền ty thể, nơi enzyme NAD+ malic có thể oxy hóa nó thành pyruvate Phản ứng này có thể làm cho quá trình oxy hóa hoàn toàn các trung gian trong chu trình acid citric như malate (hình 7A) hoặc citrate (hình 7B)

Nói cách khác, malate được sản xuất thông qua PEP carboxylase có thể thay thế chu trình acid citric trung gian được sử dụng trong sinh tổng hợp Phản ứng có thể bổ sung sản phẩm trung gian trong một chu trình trao đổi chất được

gọi là anaplerotic Ví dụ, tạo ra 2-oxoglutarate cho đồng hóa nitơ trong lục lạp sẽ

gây thiếu malate cần thiết trong phản ứng tổng hợp citrate Malate có thể được tạo

ra thông qua các con đường PEP carboxylase (hình 7C)

Sự hiện diện của một con đường “biến thể” cho quá trình oxy hóa của malate là phù hợp với quan sát ở nhiều thực vật, ngoài ra nó còn thực hiện chu trình chuyển hóa acid ở họ Xương rồng (thực vật CAM), malate được lưu trữ trong không bào trung tâm của chúng

Hình 7: Enzyme malic và PEP carboxylase cung cấp cho thực vật với sự linh động trong chuyển hóa

phosphoenolpyruvate enzyme malic làm cho ty thể thực vật có thể oxy hóa cả malate (A) và citrate (B) tới CO 2

mà không liên quan đến pyruvate qua đường phân Các hoạt động chung của PEP cacboxylase và pyruvate kinase

có thể chuyển đổi PEP đường phân đến 2-oxoglutarate, được dùng để đồng hóa nitơ (C)

3.4 Chu trình acid citric có thể oxy hóa các amino acid và các acid béo

Pyruvate và malate là một dạng cơ chất phổ biến cho ty thể in vitro, đặc

biệt các mô trong bóng tối hoặc các mô không quang hợp Tuy nhiên, các hợp chất khác cũng được chuyển hóa trong chất nền ty thể và tương tác với chu trình acid citric Glycine được tạo ra trong suốt quá trình quang hô hấp là một trường hợp đặc biệt, nhưng các amino acid khác có thể cung cấp cơ chất cho hô hấp thực vật ở một số mô cụ thể là ở hạt giàu protein tích lũy Sự oxy hóa amino acid có thể trước đó diễn ra sự chuyển amin để hình thành nên một chất trung cho chu trình acid citric, hoặc có thể oxy hóa trực tiếp Một ví dụ của sự oxy hóa trực tiếp trong ty thể bao gồm phản ứng thuận nghịch được xúc tác bởi glutamate dehydrogenase theo phản ứng:

Glutamate + NAD+ + H2O ↔ α-ketoglutarate + NADH + NH4+

Vai trò của enzyme này vẫn chưa biết được rõ ràng trong tất cả các mô thực vật Trong lá mầm của cây ho Đậu (chẳng hạn như đậu Hà Lan, đậu tương), glutamate dehydrogenase và aspartate aminotransferase ty thể tham gia vào biến tính protein tích lũy, oxy hóa glutamate như nguồn năng lượng Amon được giải phóng bởi phản ứng này được đồng hóa trở lại Trong lá, glutamate dehydrogenase cũng tham gia hoạt động theo hướng ngược lại như một enzyme phụ thuộc trong quá trình đồng hóa lại amon trong suốt quá trình quang hô hấp, mặc dù những sàng

lọc gần đây ở thể đột biến với quang hô hấp cây lúa mạch và Arabidosis chưa

được nhận thấy vai trò glutamate dehydrogenase

Cũng có bằng chứng cho rằng β-oxy hóa các acid béo thành acetyl-CoA có thể diễn ra trong ty thể thực vật Tuy nhiên, gần như sự oxy hóa acid béo ở thực vật dường như chỉ xảy ra ở peroxisome

4 VẬN CHUYỂN ĐIỆN TỬ VÀ TỔNG HỢP ATP Ở MÀNG TRONG CỦA

TY THỂ

ATP là chất mang năng lượng được tế bào sử dụng cho tất cả các quá trình sống, và hóa năng tích lũy trong suốt chu trình acid citric ở dạng NADH và FADH2 (quá trình oxy hóa – khử tương đương với các điện tử mang năng lượng cao) được chuyển sang cho ATP để thực hiện công hữu ích trong tế bào Quá trình này phụ thuộc vào O2, được gọi là phosphoryl hóa oxy hóa, xảy ra ở màng

trong ty thể

Trong phần này, chúng ta sẽ mô tả quá trình mà theo đó mức năng lượng của các điện tử được giảm theo bậc thang và tích lũy dưới hình thức một gradient proton điện hóa qua màng trong ty thể Mặc dù về cơ bản là tương tự như trong các tế bào hiếu khí, chuỗi vận chuyển điện tử của thực vật (và nấm) có chứa nhiều NAD(P)H dehydrogenase và một oxidase biến thể không được tìm thấy trong ty thể động vật có vú

Chúng ta cũng sẽ xem xét các enzyme sử dụng năng lượng của gradient proton để tổng hợp ATP: FoF1-ATP synthase Sau khi kiểm tra các giai đoạn khác nhau trong sản phẩm của ATP, chúng ta sẽ tóm tắt các bước tích lũy năng lượng ở từng giai đoạn, cũng như các cơ chế điều hòa phối hợp các con đường khác nhau

4.1 Chuỗi vận chuyển điện tử xúc tác một dòng “chảy” điện tử từ NADH tới

O 2

Đối với mỗi phân tử sucrose bị oxy hóa thông qua con đường đường phân

và chu trình acid citric, 4 phân tử NADH được tạo ra trong tế bào chất và 16 phân

tử của NADH cộng với 4 phân tử FADH2 (liên kết với succinate dehydrogenase) được tạo ra trong chất nền ty thể Các hợp chất khử này phải bị oxy hóa lại hoặc toàn bộ quá trình hô hấp sẽ ngưng

Chuỗi vận chuyển điện tử xúc tác một dòng điện tử từ NADH (và FADH2) tới oxy, chất nhận điện tử cuối cùng của quá trình hô hấp Đối với quá trình oxy hóa toàn bộ NADH là chuyển được hai điện tử có thể được viết như sau:

NADH + H+ + 1/2O2 Æ NAD+ + H2O

Sự giảm thế năng khử từ cặp NADH-NAD+(-320 mV) và cặp H2O-1/2O2 (+810 mV), nó có thể được tính toán bằng năng lượng tự do chuẩn được giải phóng trong suốt quá trình phản ứng (-nFΔE0') khoảng 220 kJ mol-1 (52 kcal mol-

1) trên hai điện tử

Vì thế năng khử của succinate - fumarate cao hơn (+30 mV), chỉ có 152 kJ mol-1 (36 kcal mol-1) năng lượng được giải phóng cho mỗi cặp điện tử được tạo ra trong quá trình oxy hóa succinat Vai trò của chuỗi vận chuyển điện tử là để thực hiện các quá trình oxy hóa NADH (và FADH2), và trong quá trình, sử dụng năng lượng tự do được giải phóng ra để tạo ra một gradient proton điện hóa (Δμ%H +) qua màng trong ty thể

Chuỗi vận chuyển điện tử bao gồm tập hợp các chất vận chuyển điện tử hoạt động liên tục, gần như chúng đều là các protein xuyên màng với các nhóm được gắn vào có khả năng nhận và cho một hoặc hai điện tử (hình 8) Có ba kiểu vận chuyển điện tử diễn ra trong quá trình phosphoryl hóa oxy hóa: (1) chuyển trực tiếp các điện tử như dạng khử của Fe3+ thành Fe2+; (2) chuyển một nguyên tử hydro (H+ + e-); (3) chuyển một ion hydride (:H-) có mang 2 điện tử Các protein vận chuyển điện tử riêng biệt được tổ chức thành phức hệ (được xác định bởi chữ

số La Mã từ I đến IV), tất cả đều được định vị ở màng trong ty thể

Phức hệ I (NADH dehydrogenase): Điện tử từ NADH được sinh ra trong chất

nền ty thể trong chu trình acid citric được oxy hóa bởi phức hệ I (NADH dehydrogenase) Các chất mang điện tử trong phức hệ I bao gồm một cofactor liên kết chặt chẽ (flavin mononucleotide [FMN], về mặt hóa học tương tự như FAD; xem hình 2B) và một số trung tâm Fe-S Sau đó phức hệ này chuyển điện

tử tới ubiquinone Bốn proton được bơm từ chất nền vào gian màng khi mỗi cặp

điện tử đi qua phức hệ này Ubiquinone (hay còn gọi là coenzyme Q hoặc đơn

giản hơn là Q) là một lipid tan trong benzoquinone với một chuỗi isoprenoid dài

có cấu trúc gần giống với plastoquinone (của thực vật) và menaquinone (của vi khuẩn) đóng vai trò tương tự ubiquinone, đó là vận chuyển điện tử trong màng- liên kết với chuỗi vận chuyển điên tử Ubiquinone có thể nhận một điện tử và trở thành gốc semiquinone (.QH) hoặc hai điện tử để hình thành ubiquinol (QH2)

Và giống như flavoprotein, nó có thể hoạt động trung gian giữa một chất cho và một chất nhận điện tử Vì kích thước phân tử nhỏ và kỵ nước, nên linh động trong màng lipid kép của màng trong ty thể và có thể khử tương đương kiểu

“con thoi” giữa các chất vận chuyển điện tử trong màng Và với khả năng vận chuyển cả điện tử và proton nên CoQ đóng vai trò trung tâm trong dòng điện tử

và sự vận chuyển proton

Phức hệ II (Succinate dehydrogenase): Sự oxy hóa succinate trong chu trình

acid citric được xúc tác bởi phức hệ này, và sự khử tương đương được chuyển qua FADH2 và một nhóm Fe-S của các protein vào “bể” ubiquinone Phức hệ này không bơm proton

Phức hệ III (phức hệ cytocrome bc 1 ): Phức hệ oxy hóa này khử ubiquinone

(ubiquinol) và vận chuyển các điện tử qua trung tâm Fe-S, của hai loại cytochrome b (b565, b560), và một cytochrome c1 ở biên của màng tới cytochrome

c 4 proton được bơm bởi phức hệ III khi có 1 cặp điện tử chuyển qua

Cytocrom C là một protein nhỏ nằm phía mặt ngoài của màng trong ty thể

và hoạt động linh động để vận chuyển điện tử giữa phức hệ II và III

Phức hệ IV (cytochrome c oxydase): phức hệ này chứa hai trung tâm Cu (CuA và

CuB) và cytochrome a và a3 Phức hệ IV là oxidase cuối cùng và mang 4 điện tử khử tới O2 tạo thành 2 phân tử nước Hai proton được bơm qua khi mỗi cặp điện

tử được vận chuyển qua (hình 8)

Cả về cấu trúc và chức năng, ubiquinone và hệ thống cytochrome bc1 tương

tự plastoquinone và hệ thống cytochrome b6f, tương ứng ở chuỗi vận chuyển điện

tử quang hợp

Hình 8: Tổ chức của chuỗi vận chuyển điện tử và tổng hợp ATP ở màng trong ty thể thực vật Ngoài 5 phức hệ

protein chuẩn gần như được tìm thấy ở hầu hết các ty thể, chuỗi vận chuyển điện tử của ty thể thực vật còn chứa 5 enzyme được đánh dấu màu xanh lá cây Không có enzyme nào trong 5 enzyme đó bơm proton Sự ức chế cụ thể:

(SHAM) cho oxidase biến thể , là các công cụ rất quan trọng để nghiên cứu chuỗi vận chuyển điện tử của ty thể thực vật

4.2 Một số enzyme vận chuyển điện tử duy nhất có trong ty thể thực vật

Ngoài các enzyme của chuỗi vận chuyển điện tử được mô tả trong phần trên, ty thể thực vật còn chứa một số thành phần không có trong ty thể động vật

có vú (xem hình 8) Lưu ý rằng không có enzyme nào bơm proton và do đó sự tích lũy năng lượng là thấp hơn bất cứ khi nào chúng được sử dụng:

• Cả hai enzyme NAD(P)H dehydrogenase đều phụ thuộc Ca2+, gắn liền với bề mặt ngoài của màng trong ty thể phía tiếp xúc với không gian gian màng (gian màng) có thể oxy hóa NADH và NADPH tạo ra trong tế bào chất Các điện tử từ enzyme NAD(P)H dehydrogenase ở bề mặt ngoài của màng trong ty thể -NDex(NADH) và NDex (NADPH)- đi vào chuỗi vận chuyển điện tử tại các “bể” ubiquinone

• Ty thể thực vật có hai con đường oxy hóa NADH chất nền ty thể Điện tử đi qua phức hệ I, được mô tả trong phần trước, nhạy cảm với sự ức chế bởi một số hợp chất, bao gồm rotenone và piericidin Ngoài ra, ty thể thực vật có một dehydrogenase kháng rotenone - NDin (NADH), giúp quá trình oxy hóa của NADH xuất phát từ cơ chất chu trình acid citric Vai trò của cơ chế này có lợi và xảy ra khi phức hệ I quá tải chẳng hạn như trong điều kiện hô hấp sáng

• Một enzyme NADPH dehydrogenase, NDin (NADPH), hiện diện trên bề mặt chất nền ty thể Sự hiểu biết về enzyme này còn rất hạn chế

• Phần lớn, nếu không phải tất cả, thực vật có một con đường hô hấp “biến thể”

để khử oxy Con đường này được gọi là oxidase biến thể (alternative oxidase), không giống như cytochrome c oxidase, nhạy cảm với ức chế bởi xyanua, azide, hoặc carbon monoxyde (CO)

4.3 Sinh tổng hợp ATP trong ty thể diễn ra cùng với vận chuyển điện tử