Kỹ thuật thụ phấn và nuôi cấy phôi invitro

Kỹ thuật thụ phấn và nuôi cấy phôi invitro

Kỹ thuật thụ phấn và nuôi cấy

phôi invitro

Giảng viên: Nguyễn Thị Lý Anh Sinh viên :Nguyễn Ngọc Hoà

Hoàng Thị Lê Hoàng Khánh Hà Đinh Thị Phương Nguyễn Phương Thảo

Phạm Thị Hân

Nội dung

 Thụ phấn (pollination) là sự tiếp nhận các hạt phấn từ bao phấn tới núm nhụy

để thực hiện thụ tinh ở hoa

Ở thực vật có hai phương thức thụ phấn là thụ phấn chéo và tự thụ phấn

 Thụ tinh (fertilization): Ở thực vật thụ tinh

là sự kết hợp của hai giao tử đực và cái (tinh trùng và noãn) thành hợp tử (phôi, bào tử hoặc hạt) là đặc trưng cơ bản của sinh sản hữu tính, sinh sản lưỡng tính

Ở thực vật hạt kín có phương thức thụ tinh kép

 Phôi là một nhóm tế bào có khả năng phát triển tạo thành cơ thể hoàn chỉnh là pha

phát triển trung gian giữa hợp tử hay tế bào soma và bào tử thể

tính ( phôi soma)

 Phôi hữu tính : là phôi trong hạt được tạo ra

do thụ tinh giữa tế bào trứng và giao tử đực (do lai hoặc tự thụ) còn gọi phôi hợp tử

sinh dưỡng 2n chỉ của bố hoặc mẹ và tế

bào ấy có cấu trúc như một phôi gọi là phôi

vô tính ( phôi soma)

 Thụ phấn invitro là thực hiện quá trình thụ phấn trong ống nghiệm không phụ thuộc vào cơ thể mẹ.

nuôi cấy invitro phôi hợp tử đã thành thục hoặc chưa thành thục thành cây hoàn

chỉnh

II K ỹ thuật thụ phấn invitro

II.1 Mục đích phải tiến hành kỹ thuật

này

tinh

ra cơ hội sản xuất các phôi lai giữa các loài thực vật không thể lai bằng các

phương pháp gây giống cây trồng truyền thống

II.2 Điều kiện có thể thụ phấn in vitro

công bầu quả hay noãn phân lập (noãn trần) của cây mẹ

của hạt phấn cây bố trong môi trường nuôi cấy vô trùng

ra và nuôi cấy hợp tử phát triển thành phôi lai trên môi trường dinh dưỡng vô trùng

II.3 Các bước tiến hành

 Lấy nụ của hoa mẹ ở thời điểm trước khi nở hoa 2 ngày, khử trùng, tách lấy bầu quả hay

lá noãn nuôi cấy invitro.

 Lấy nụ hoa của cây bố vào ngày nở hoa,

khử trùng, tách lấy bao phấn và để trong

điều kiện vô trùng đến khi chúng tung phấn.

 Lấy hạt phấn rắc trực tiếp lên mặt cắt của

bầu quả hay lá noãn để thụ phấn in vitro.

 Khi noãn thụ tinh, chúng hình thành hợp tử

và tạo phôi Các phôi lai in vitro thường bỏ qua giai đoạn ngủ, nghỉ và mọc thành cây in vitro

II.4 Các phương pháp thụ phấn in vitro

II.4.1 Thụ phấn bằng phương pháp cắt ngắn vòi nhụy

 Là phương pháp dễ và hiệu quả Núm nhụy

và 1 phần hoặc toàn bộ vòi nhụy của hoa được cắt ngắn, sau đó hạt phấn của cây bố được thụ trực tiếp lên vòi nhụy đã cắt ngắn

và kết quả là có rất nhiều ống phấn đã kéo dài được tới bầu nhụy

Có thể do ống phấn gặp khó khăn trong khi đâm xuyên qua vách bầu

II.4.2 Thụ phấn bằng phương pháp ghép vòi nhụy

 Hạt phấn cần thụ được “gửi” trên 1 núm nhụy

thích hợp và nảy mầm, 1 ngày sau vòi nhụy và

1/3 bầu của hoa chứa hạt phấn được cắt và ghép lên 3/4 bầu nhụy của hoa cây mẹ cần thụ phấn

khi “gửi” hạt phấn vòi nhụy được cắt ngắn cách trên bầu 1-2mm và được gắn lên bầu nhụy của

hoa cây mẹ Bầu và vòi nhụy ngoài đồng ruộng

được kết hợp với nhau = ống nối còn trong invitro chỉ cần sử dụng agar để cố định là đủ

II.4.3 Thụ phấn cho giá noãn

 Bầu được cắt theo chiều dọc thành nhiều

miếng vào ngày núm nhụy tiết ra dịch nhầy

hoặc 1-2 ngày sau đó Mỗi 1 miếng sẽ chứa 1 giá noãn và 1 hàng noãn, có thể để lại hoặc không để lại vách bầu Một lượng lớn hạt

phấn cần thụ được đặt theo giá noãn Để kích thích hạt phấn nảy mầm và đâm xuyên vào

noãn có thể đặt vào môi trường nuôi cấy 1

hay 2 vòi nhụy

 Có thể nuôi cấy ngoài sáng hay trong tối Noãn nảy mầm sau 5-7 tuần thụ phấn và tiếp tục được thụ phấn

pollionation): cả vòi nhụy hoặc 1 phần

của nó có thể được tách ra và hạt phấn hoặc được đặt trên bề mặt vết cắt bầu

quả hoặc chuyển qua lỗ trên thành vòi

nhụy đến bầu quả

III Kỹ thuật cứu phôi

III.1 Mục đích

phôi khi lai xa

yến mạch dẫn đến sự loại bỏ một bộ

nhiễm sắc thể)

quả hạch chín (đào, mận, mơ…)

III.2 Nuôi cấy phôi hữu tính

-Xảy ra quá trình thụ tinh giữa hạt phấn và noãn hình thành hợp tử

-Hợp tử trải qua quá trình nguyên phân liên tiếp tạo thành phôi

-Tách phôi

-Nuôi cấy phôi để tạo cây

III.2.1 Tách phôi

trường vô trùng của noãn và mô bầu hoa -Ở một số loài phôi có kích thước lớn,

thuận tiện cho quá trình tách phôi (cây họ đậu), nhưng một số loài hoa khó tách phôi (hoa lan_hạt có kích thước nhỏ, vỏ hạt tiêu giảm và thiếu nội nhũ)

-Ở thực vật hoa dạng chùm, mô non

thường xếp ở đỉnh của chùm hoa

 Trong quá trình thu nhận phôi cần hạn chế

sự tổn thương của dây treo phôi Dây treo phôi có kích thước nhỏ và cấu trúc mỏng

manh nên khó tách nó nguyên vẹn cùng với phôi để đưa vào nuôi cấy Không có dây

treo phôi làm giảm đáng kể tỉ lệ hình thành cây con từ nuôi cấy phôi non

III.2.2 Thành phần môi trường nuôi cấy

Sau khi tách từ hạt phôi được nuôi cấy trong môi trường chứa:

Muối khoáng

K+, Ca2+ đảm bảo cho tỷ lệ sống cao của phôi và khả năng thúc đẩy sinh

trưởng tốt đối với phôi của một số loài thực vật

Chất điều hoà sinh trưởng

nhiều trong nuôi cấy phôi do chúng cảm ứng tạo callus

thích sự nảy mầm sớm của phôi

 Glucose và sucrose ngoài vai trò dinh dưỡng, còn

có khả năng duy trì áp suất thẩm thấu của môi

trường Phôi trưởng thành sinh trưởng khá tốt ở nồng độ thấp nhưng phôi non đòi hỏi nồng độ

sucarose cao hơn.

Aminoaxit và thành phần hữu cơ

phức hợp

nuôi cấy phôi nhiều loài thực vật

1951) là hỗn hợp các a.a được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy phôi Làm tăng kích thước và tỷ lệ phân hoá phôi

 Ngoài ra một số chất tự nhiên như nước dừa (Overbeek, 1942), nước chiết malt

(Blackeslee & Satina, 1944), là những chất

mà khi được bổ sung vào môi trường nuôi cấy sẽ đem lại hiệu quả cao hơn… vì trong các chất này có chứa nhiều vitamin, DNA, RNA, và một số chất điều tiết sinh trưởng khác

III.3 Các yếu tố ảnh hưởng

III.3.1 pH môi trường

môi trường có pH 5.0-7.5

 VD: Loài Zamia, Phaseolus, bông: 27-30°C

Loài lai Brassica, lúa, lúa mạch: 17-22°C

III.3.3 Ánh sáng

lúa mạch, lanh, các cá thể loài lai Allium

tiến hành trong tối trước khi chuyển

sang điều kiện sáng để nảy mầm

III.4 Ứng dụng của nuôi cấy phôi hữu tính

III.4.1 Thu nhận thể đơn bội

Nuôi cấy phôi hữu tính để thu nhận các thể đơn bội thông qua quá trình loại bỏ

trực tiếp NST sau khi lai xa Tổ hợp giữa hai loài càng khác xa nhau thì sự đào thải hoàn toàn NST đơn bội của một loài càng

dễ xảy ra

III.4.2 Kiểm tra nhanh sức nảy mầm của

hạt

Nuôi cấy phôi hữu tính được dùng để

kiểm tra nhanh khả năng nảy mầm của hạt, đặc biệt là các hạt giống có sức sống kém

và hạt sau thời gian bảo quản dài Phương pháp này cho độ chính xác cao

III.4.3 Nhân giống các cây hiếm

Hạt của một số cây rất khó nảy mầm trong điều kiện tự nhiên, vì vậy làm giảm khả năng sinh sản hữu tính của chúng Bằng cách nuôi cấy phôi tách rời đã thu được rất nhiều cây con Áp dụng với loài mà hạt

có sức sống kém, hạt không có nội nhũ hoặc ít nội

III.4.4 Thụ phấn trong ống nghiệm

trên núm nhụy loài khác

vào thời điểm thích hợp

bằng kĩ thuật thụ phấn trong ống nghiệm

IV.1 Ví dụ về thụ phấn invitro và cứu phôi

Thụ phấn invitro

cứu phôi trong

lai tạo giống

hoa Lily ở Việt

Nam

 Lily là tên gọi chung của tất cả các cây

thuộc chi Lilium, họ

Liliaceae, bộ phụ

của thực vật một lá mầm



 Hiện nay, ở Việt Nam lily được xếp vào loại hoa cao cấp, tiềm năng thị trường rất lớn

 Tuy nhiên các giống hoa lily có mặt trên thị

trường Việt Nam hiện nay chủ yếu là nhập nội từ Trung Quốc, Nhật Bản và Hà Lan với giá thành cực cao, thêm vào đó một số giống nhập nội từ Trung Quốc rất nhanh bị thoái hóa do chất

lượng giống kém…

 Vấn đề đặt ra là chúng ta phải nhanh chóng chủ động về giống đối với loại hoa quý này.

IV.1.1 Thí nghiệm thụ phấn invitro

 Chọn nụ hoa trước khi nở 1-2 ngày, khử trùng: rửa sạch bụi đất bằng nước thường trước khi đưa vào buồng cấy, khử trùng bằng cồn Ethanol trong

30giây, tráng lại = nước cất vô trùng, tiếp tục khử= HgCl2 0.1% trong 10 phút, lắc đều mẫu, tráng lại

bằng nước cất vô trùng 3 lần.

 Tách cánh hoa: -Hoa bố: tách lấy bao phấn giữ trong điều kiện vô trùng.

-Hoa mẹ: giữ toàn bộ cơ quan sinh sản cái: bầu nhụy, vòi nhụy và núm nhụy Chúng được đạt đứng thẳng trong ống nghiệm hoặc bình, trên nền môi trường thụ phấn

bầu 2mm và gắn vào bầu nhụy nhờ 1 miếng

agar.

- Kỹ thuât thụ phấn giá noãn: Hạt phấn bố được thu trực tiếp vào hàng giá noãn được tách từ bầu hoa mẹ.

IV.1.2 Thí nghiệm cứu phôi

hành cứu phôi vào các thời điểm khác nhau

bằng kỹ thuật nuôi cấy lát cắt bầu nhụy Quả

được cắt thành những lát mỏng thành 2-3mm

và nuôi cấy trên môi trường trên môi trường lát

90g/l sucrose

Sau đó phát triển thành cây hoàn chỉnh

IV.2 Thí nghiệm cứu phôi hữu tính

3 Ngâm quả trong hỗn hợp dung dịch

hypoclorit canxi 5% và nước cất vô trùng trong 15 phút

4 Trong tủ cấy vô trùng, tiến hành tách hạt từ quả và chuyển sang đĩa petri

5 Bóc vỏ hạt và tách rời phôi

6 Cấy phôi vào đĩa petri đã chứa sẵn môi

trường dinh dưỡng và nuôi ở nhiệt độ từ

18-22ºC với ánh sáng yếu

7 Các phôi được tách tốt từ hạt sẽ phát triển dần thành cây khoai tây con sau đó có thể chuyển ra trồng trong vườn ươm

Nhìn chung, nguồn gen khai thác từ các loài lily là vô cùng đa dạng, tạo điều kiện

thuận lợi cho quá trình chọn tạo giống Việc phát triển các phương pháp thụ phấn và

cứu phôi thích hợp sẽ là công cụ hữu ích

tạo ra nhiều giống mới với nhiều đặc tính

quý

Tài liệu tham khảo

Đình Đạt Nhà xuất bản Giáo dục

vật PGS-TSKH Lê Văn Hoàng Bộ giáo dục và đào tạo đại học Đà Nẵng

khóa48 và khóa 49

Xin chân thành cảm ơn cô và

các bạn!