KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN CẤY ĐẾN SỰ THỤ TINH VÀ QUÁ TRÌNH PHÁT TRIỂN CỦA PHÔI IN VITRO TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN CẤY ĐẾN SỰ THỤ TINH VÀ QUÁ TRÌNH PHÁT TRIỂN CỦA PHÔI IN VITRO TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN CẤY ĐẾN SỰ THỤ TINH VÀ QUÁ TRÌNH PHÁT TRIỂN CỦA PHÔI IN VITRO TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG

Ngày nay, khi nhắc đến lĩnh vực “Thụ tinh trong ống nghiệm” chúng ta đều nghĩ đến những thành tựu to lớn mà nó đem lại Ởû nước ta, việc ứng dụng “Thụ tinh trong ống nghiệm” trong Y học nhằm giải quyết vấn đề vô sinh đã có những thành công rực rỡ, việc bệnh viện phụ sản Từ Dũ đón chào đứa bé thụ tinh trong ống nghiệm thứ 1000 Như vậy, có thể thấy thụ tinh trong ống nghiệm là một ngành khoa học có nhiều tiềm năng, trong đó quan trọng hơn hết nó là một phương thức diệu kỳ nhằm khắc phục hiện tượng bất thụ của con người nói riêng cũng như động vật nói chung Tuy nhiên để đạt được những thành công to lớn ấy, việc đầu tư nghiên cứu những quy trình mới cũng như việc tìm tòi sáng tạo cải tiến quy trình cũ nhằm đưa ra một quy trình hợp lý mang tính thực tiễn cao thích hợp với điều kiện nước ta là vô cùng cấp thiết Ngày nay đối tượng được sử dụng rộng rãi nhất trong lĩnh vực này đó là chuột nhắt trắng bởi vấn đề đạo đức trong sinh học không cho phép chúng ta nghiên cứu trên con người

Trong bước đầu tiếp cận với quy trình thụ tinh trong ống nghiệm ở chuột nhắt trắng, chúng tôi đã gặp không ít khó nhăn do điều kiện của chúng ta còn nhiều hạn chế Nhưng thông qua đó, chúng tôi dần hoàn thiện thao tác của mình nhằm phù hợp với điều kiện hiện có Và

thông qua đó, chúng tôi nhận thấy rằng: “Nếu như chúng ta gia tăng thời gian cấy trứng thì chúng ta sẽ giảm thiểu thời gian hợp tử tồn tại trong môi trường ngoài, hơn nữa các chi phí tốn kém về môi trường nuôi cấy, đĩa petri nuôi cấy và các thành phần khác sẽ được giảm thiểu Ngoài ra, việc xác định chính xác những phôi đã thụ tinh (phôi 2 tế bào) sẽ dễ dàng hơn.”

Trong gần 3 tháng thực hiện luận văn tốt nghiệp tại Phòng thí nghiệm thụ tinh trong ống nghiệm Bệnh viện Phụ sản Từ Dũ, chúng tôi đã thực hiện đề tài này và đã thiết lập những thí nghiệm thụ tinh trong ống nghiệm theo 2 hướng :

ƒ Các thí nghiệm có thời gian cấy theo quy trình chuẩn

ƒ Các thí nghiệm có thời gian cấy dài hơn, tiện lợi hơn cho thao tác

Mục đích chính của các thí nghiệm trên là nhằm khảo sát ảnh hưởng của thời gian cấy trứng lên quá trình thụ tinh và sự phát triển của phôi trong giai phân chia sớm

Tuy nhiên, những nghiên cứu như trên ở nước ta còn quá mới mẻ và điều kiện thực hiện còn hạn chế do đó với tầm vóc khiêm tốn của đề tài cùng với quỹ thời gian ít ỏi, chúng tôi mong rằng đề tài này sẽ đem lại một cách nhìn đúng đắn cho quy trình thụ tinh trong ống nghiệm ở điều kiện nước ta hiện nay

Phần 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

I Vật liệu :

1) Đối tượng nghiên cứu :

Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng chuột nhắt trắng (Mus musculus var albino) có trọng lượng khoảng 20 – 30 g gồm chuột cái và chuột đực trưởng thành về

mặt sinh dục (khoảng 2 – 3 tháng tuổi) Nguồn chuột do viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh cung cấp

2) Dụng cụ hoá chất và thiết bị:

ƒ Đĩa petri nhựa (đường kính 35 mm)

ƒ Đĩa petri nhựa (đường kính 60 mm)

ƒ Pipette Pasteur vô trùng

ƒ Dụng cụ hút, rửa phôi 2.1.3) Dụng cụ đếm tế bào :

ƒ Gói Medipack dùng để đóng gói dụng cụ phẫu thuật trước khi hấp vô trùng

2.2) Hoá chất :

2.2.1) Hoá chất khử trùng:

ƒ Cồn 700 2.2.2) Hormon kích thích trứng chín và rụng:

PMSG : - Dạng đông khô

- Bảo quản : 250C, tránh ánh sáng

- Công dụng : kích thích nang trứng phát triển

- Pha chế : stock 1000UI + 10 ml nước cất 2 lần

- Tiêm 10 UI/ 1 con chuột

Pregnyl : - Dạng đông khô

- Bảo quản 2 – 15oC , tránh ánh sáng

- Công dụng : kích thích trứng chín và rụng

- Pha chế : stock 1500UI + 15 ml nước cất 2 lần

- Tiêm 10 UI/ 1 con chuột

2.2.3) Môi trường thu nhận ống dẫn trứng và mào tinh : Môi trường GameteTM Vitrolife : - dạng dung dịch

ƒ dạng dung dịch

- tỷ trọng 0.83 – 0.86 ở 20oC

- khử trùng dầu bằng phương pháp lọc bằng milipore filter

II Phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm:

™ Các phương pháp được thực hiện như sau :

1) Ổn định điều kiện sống của chuột khoảng 2 – 3 ngày trước khi làm thí nghiệm

Chuột nhắt trắng được nuôi ổn định trong chuồng bằng thuỷ tinh có thể tích 25cm

° 25 cm ° 12 cm tại phòng nuôi chuột thí nghiệm – Khoa Hiếm muộn bệnh viện Phụ sản Từ Dũ

Chuột đực và chuột cái được nuôi riêng Một chuồng có khoảng 3 con Chuột được ổn định chu kỳ sáng tối chu kỳ sáng 7 giờ đến 19 giờ, chu kỳ tối từ 19 giờ đến 7 giờ sáng hôm sau

Thức ăn dùng để nuôi chuột là cám viên chuyên biệt cho chuột của viện Pasteur, cùng với giá, rau muống, thóc mầm Cách cho chuột ăn như sau :

ƒ Sáng : cho chuột ăn cám viên

ƒ Chiều : cho chuột ăn thóc mầm hoặc giá hay thỉnh thoảng cho chuột ăn rau muống

Nước uống được lấy từ nguồn nước lọc dân dụng

Chú ý : Thức ăn rau cần phải rửa sạch trước khi cho chuột ăn Không nên cho chuột ăn quá nhiều cám viên trong một bữa, điều này sẽ làm cho chuột bị béo phì gây khó khăn cho thao tác sau này

2) Gây động dục ở chuột cái : sau thời gian ổn định, ta tiêm chuột cái hormon gây

• Tiêm 10 UI bằng ống tiêm 1ml, kim tiêm 26G

Tuân thủ theo các nguyên tắc khi tiêm thuốc như sau :

ƒ Không để chuột có thể quay đầu và cắn vào tay người chích

ƒ Tránh tiêm vào cơ hoành hay bàng quang

ƒ Thuốc sau khi tiêm không được chảy ra ngoài

ƒ Chỗ tiêm không bị chảy máu

ƒ Lớp da không bị phồng lên

3) Quy trình thu nhận giao tử :

3.1 Chuẩn bị dụng cụ và môi trường thao tác trước ngày thao tác ( D-1):

ƒ Toàn bộ dụng cụ giải phẩu chuột đều được đóng gói lại cẩn thận và đem hấp khử trùng bằng autoclave ở 121oC khoảng 30 phút trước khi sử dụng

ƒ Chuẩn bị một đĩa rửa (R) : dùng để rửa trứng sau khi thu và làm nơi để trứng chờ trước khi thụ tinh Trong đó, 3 giọt đầu (1,2,3) chứa khoảng 80 µl môi trường Gamete và một giọt còn lại chứa 80 µl môi trường IVF Sau đó, phủ ngập dầu khoáng đĩa rửa này và ủ trong tủ ấm ở 370C, 5% CO2

ƒ Chuẩn bị 4 ống tuýp loại 5ml trong đó :

Ngày thực hiện Chuột dùng để thu phôi Ngày - 3 (D-3) Tiêm 10 IU PMSG cho chuột cái Ngày -1 (D-1)

(46 – 48h sau khi tiêm PMSG) Tiêm 10 IU Pregnyl

ƒ C

hua

ån bị 2 ống tuýp loại 14 ml chứa khoảng 0,3 – 0,5 ml môi trường IVF dùng để xử lý tinh trùng bằng phương pháp Swim-up

Chú ý : các ống tuýp đều được ghi tên cẩn thận Nút được đóng ở nấc 1 để môi trường trong tuýp được cân bằng với không khí và nhiệt độ trong tủ nuôi cấy

ƒ Chuẩn bị một đĩa rửa tinh trùng (loại đường kính 60mm) : ta chia làm 4 phần bằng nhau, mỗi phần ta tạo được 3 giọt môi trường IVF (khoảng 80 µl một giọt) sau đó phủ dầu khoáng

3.2 Thao tác tạo giọt môi trường:

ƒ Dùng bút vẽ chia đều đĩa petri làm 4 phần đều nhau

ƒ Đánh số từng khoảng (từ 1 đến 4)

ƒ Ghi chú thật cụ thể trên đĩa cùng với ngày tạo giọt

ƒ Gắn pipette Pasteur vào ống tiêm có đầu silicon, sau đó hút môi trường rồi nhỏ vào từng khoảng, mỗi khoảng một giọt (mỗi giọt khoảng 80 µl)

ƒ Sau đó phủ dầu khoáng cho ngập các giọt môi trường

Tất cả môi trường được đặt vào trong tủ ấm 370C , 5% CO2 / 4-6h trước khi sử dụng Riêng đĩa rửa (R) được để qua đêm

Tên ống tuýp Môi trường Thể tích Mục đích sử dụng

SP1 Gamete 2 ml Thu mào tinh và rửa sạch máu, mỡ

OV1 Gamete 2 ml Thu ống dẫn trứng và rửa sạch máu, mỡ

Hình 17 : Thao tác tạo giọt môi trường và chuyển phôi vào giọt môi trường

3.3 Những chuẩn bị trước khi thao tác vào ngày D0 :

Gọi ngày D0 là ngày trứng được thụ tinh

Trước tiên ta chuẩn bị một đĩa nuôi phôi (D1) : trình tự chuẩn bị như trên, môi trường là môi trường IVF Đĩa này được dùng để nuôi phôi vào khoảng 4giờ sau khi cấy

Chuẩn bị sẵn các dụng cụ cần thiết :

o Ống tiêm có đầu silicon có gắn sẵn pipet Pasteur

o 2 ống tiêm 1ml có gắn kim 26G

o 2 đĩa pertri vô trùng

o Một bộ dụng cụ phẩu thuật và giấy thấm lót cho chuột khi phẩu thuật

o Một bao rác để bỏ xác chuột

Chú ý : Khi thu tinh trùng ta chuẩn bị 1 bộ như trên và khi thu trứng cũng vậy 3.4 Thu nhận tinh trùng :

3.4.1 Giải phẫu chuột đực và thu mào tinh :

- Giết chuột đột ngột bằng cách kéo giãn đốt sống cổ

- Mổ ổ bụng của chuột đực

- Kéo tinh hoàn và mào tinh ra khỏi ổ bụng Nếu như chuột đực quá mập, khi mổ ổ bụng ra ta sẽ thấy được 2 mô mỡ nối liền với tinh hoàn của chuột đực Kéo hai mô mỡ này lên ta sẽ thấy được 2 tinh hoàn Dùng pinch thẳng kéo tiếp tinh hoàn lên ta sẽ thấy được mào tinh Như đã trình bày ở trên, mào tinh có hình dấu chấm hỏi Dùng kéo thẳng thu lấy mào tinh Thao tác này phải khéo và thật cẩn thận nếu không ta sẽ thu mào tinh cùng với những mô mỡ bao quanh Điều này sẽ gây bất lợi cho thao tác sau này

- Chuyển mào tinh hoàn vào ống tuýp SP1

3.4.2 Thu nhận tinh trùng và xác định mật độ tinh trùng :

- Chuyển toàn bộ môi trường chứa mào tinh trong ống SP1 vào một đĩa petri vô trùng đã chuẩn bị trước

- Dùng 2 ống tiêm đã chuẩn bị trước rửa sạch máu và loại bỏ mỡ bám trên mào tinh

- Chuyển toàn bộ môi trường trong ống tuýp SP2 vào đĩa petri đã chuẩn bị trước

- Chuyển mào tinh này sang đĩa trên Dùng 2 ống tiêm đẩy tinh trùng ra khỏi mào tinh hoàn Để thu được lượng tinh trùng triệt để trong mào tinh, ta có thể dùng đầu ống tiêm trên tạo một vài vết cắt trên mào tinh rồi ấn nhẹ vào mào tinh để tinh trùng thoát ra dễ dàng Cứ thế ta sẽ thu được từng khối tinh trùng trào ra từ những vết cắt

- Dùng ống tiêm có đầu silicon đã gắn sẵn pipet pasteur thu tất cả môi trường chứa tinh trùng vào một ống tuýp mới Tiếp theo ta trộn đều môi trường chứa tinh trùng bằng cách hút nhả nhiều lần môi trường này Chú ý thao tác thật nhẹ nhàng nếu không lực cơ học khi hút đẩy sẽ làm chết tinh trùng chuột Sau đó, trích một ít môi trường để xác định mật độ tinh trùng bằng phương pháp phòng đếm Neubauer

3.4.3 Xử lý tinh trùng và xác định mật độ tinh trùng sau xử lý:

- Sau khi xác định mật độ tinh trùng lúc ban đầu Ta xử lý tinh trùng bằng phương pháp Swim – up

- Nguyên tắc của phương pháp này được trình bày ở phần tổng quan tài liệu

Cách tiến hành :

- Dùng ống tiêm đã dùng ở trên hút trộn môi trường chứa tinh một lần nữa

- Chia đôi môi trường này

- Chuyển từng phần môi trường chứa tinh trùng (khoảng 0,5 ml) đặt nhẹ nhàng bên dưới môi trường IVF trong ống tuýp 14 ml đã chuẩn bị sẵn

- Lúc này ta thấy rất rõ 2 phần môi trường : một phần trong phía trên và phần đục chứa tinh trùng ở dưới

- Dùng bút lông vạch nhẹ đánh dấu mặt phân cách của 2 môi trường

- Đặt nhẹ nhàng các ống tuýp vào một cốc nhựa sạch để tạo góc nghiêng tương đương một góc 450

- Đặt cốc này nhẹ nhàng vào tủ ấm Ủ ở 370C, 5% CO2

- Thời gian Swim-up thường là từ 30 – 45 phút

- Sau thời gian này, thật nhẹ nhàng thu lớp môi trường ở trên

Chú ý : ta nên sử dụng một pipet pasteur mới và chỉ chạm đầu pipet vào thành ống tuýp rồi thu phần môi trường phía trên vạch đánh dấu một chút để tránh việc thu nhầm những tinh trùng chết ở phía dưới

Xác định mật dộ tinh trùng :

Đếm mật độ tinh trùng bằng phòng đếm Neubauer Ta cần xác định :

ƒ Mật độ tinh trùng

ƒ Phần trăm tinh trùng di động

ƒ Ghi nhận về chất lượng tinh trùng

3.4.4 Tạo giọt cấy và hoạt hoá tinh trùng : Tạo các giọt cấy tuỳ vào thể tích tinh trùng thu được Sau đó, phủ một nửa dầu khoáng vào đĩa cấy và ủ 370C, 5% CO2

3.5 Thu nhận trứng :

3.5.1 Giải phẫu chuột cái và thu ống dẫn trứng:

ƒ Mổ ổ bụng của chuột cái

ƒ Đẩy nội quan sang một bên để thấy rõ nhánh tử cung

ƒ Kéo tử cung, ống dẫn trứng, buồng trứng, đệm mỡ ra khỏi xoang bụng

ƒ Tách màng ngoài tử cung

ƒ Dùng đầu kéo tách mỡ khỏi ống dẫn trứng và một phần tử cung gần ống dẫn trứng

ƒ Tách ống dẫn trứng bằng cách cắt ngang phần thắt giữa ống dẫn trứng và buồng trứng

ƒ Chuyển ống dẫn trứng vào ống tuýp OV1 3.5.2 Thu nhận trứng :

ƒ Chuyển toàn bộ môi trường thu ống dẫn trứng vào 1 đĩa petri đã chuẩn bị sẵn

ƒ Rửa sạch máu và mỡ

ƒ Chuyển các ống dẫn trứng sang một đĩa thứ 2 có chứa môi trường từ tuýp OV2

ƒ Xé đoạn bóng phình to của ống dẫn trứng

3.5.3 Rửa trứng trước khi thụ tinh:

ƒ Thu trứng

ƒ Tiến hành rửa từng cụm trứng trên từng giọt môi trường của đĩa rửa

ƒ Cho trứng chờ ở giọt thứ 4 ở 370C, 5% CO2

4 Quy trình thụ tinh trong ống nghiệm :

ƒ Đánh giá trứng trước khi thụ tinh

ƒ Chuẩn bị sẵn sàng đĩa cấy D0 : sau 1 giờ từ ta bắt đầu tạo giọt cấy, ta phủ tiếp dầu khoáng cho ngập các giọt tinh trùng

ƒ Cấy trứng vào từng giọt tinh trùng

5 Rửa trứng sau khi cấy và Chuyển trứng vào môi trường nuôi cấy :

ƒ Thao tác kéo ống: (xem hình ở phần phụ lục)

ƒ Rửa trứng trên đĩa rửa tinh trùng đã chuẩn bị vào ngày D-1

ƒ Chuyển trứng vào đĩa nuôi

6 Kiểm tra sự thụ tinh ngày hôm sau (D 1 ) và chuẩn bị đĩa nuôi D 3

7 Phác đồ thực hiện :

Ngày thực hiện Thời gian thực hiện Nội dung thực hiện

D -1 48 giờ sau khi tiêm PMSG Tiêm Pregnyl

12 giờ sau khi tiêm Pregnyl Thu và xử lý tinh trùng 13,5 giờ sau khi tiêm

13 giờ 50 phút sau khi tiêm Pregnyl Thu trứng, rửa trứng

14 giờ 20 phút sau khi tiêm Pregnyl Cấy trứng vào giọt cấy

D 0

4-6 giờ sau khi cấy Rửa trứng và chuyển trứng vào

đĩa nuôi (D-1)

D 1 24 giờ sau khi cấy Quan sát kết quả thụ tinh

Chuẩn bị đĩa nuôi ( D3)

** Chú ý : chu kỳ chuyển phôi là 48 giờ

III Cách bố trí các thí nghiệm:

Toàn bộ 20 thí nghiệm được bố trí như sau :

ƒ 12 thí nghiệm đầu : mục đích chính là luyện tập các thao tác và qua đó nhận định

một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thụ tinh Trong đó,

3 5 thí nghiệm đầu : chúng tôi khảo sát ảnh hưởng của chất lượng trứng (cụ thể là thời gian trứng chờ lâu trong giọt môi trường) đến hiệu quả thụ tinh, Như đã trình

bày ở trên, việc trứng chờ lâu sẽ là cho trứng sẽ rơi vào tình trạng trứng quá chín (post-matured) Cách tiến hành như sau : chúng tôi tiến hành thu nhận trứng trong thời gian chờ tinh trùng Swim-up và cho trứng chờ thêm khoảng thời gian nữa để các

tinh trùng gần như đã được hoạt hoá xong, thời chờ tổng cộng là 1 giờ 30 phút

3 7 thí nghiệm sau : chúng tôi khảo sát ảnh hưởng của chất lượng tinh trùng đến hiệu quả thụ tinh và cách thực hiện như quy trình được trình bày ở phần phương pháp

ƒ 8 thí nghiệm sau, chúng tôi chia làm 2 lô bằng cách tách đôi số cụm trứng (OCCs - Oocyte cumulus complexes) một cách ngẫu nhiên, cụ thể như sau :

- Lô đối chứng (lô a) : chúng tôi quy định thời gian cấy là từ 4 giờ Ở lô này,

sau 4 giờ cấy ta chuyển toàn bộ số trứng (có thể là trứng đã thụ tinh và cũng có thể là trứng chưa thụ tinh) sang đĩa nuôi D1

- Lô thử nghiệm (lô b) : chúng tôi quy định thời gian cấy là qua đêm Sáng

ngày hôm sau chúng tôi tiến hành chuyển toàn bộ số phôi 2 tế bào sang đĩa nuôi D1

Mật độ phôi khi nuôi cấy là 10 phôi trên 1 giọt 80 µl môi trường IVF

ƒ Sau đó, chúng tôi tiến hành ghi nhận số lượng các phôi phát triển và đảm bảo cho cả

2 lô có cùng 1 điều kiện nuôi cấy

KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

I Kết quả thu nhận :

Trong thời gian 3 tháng (4/2004 đến 6/2004) thực hiện khoá luận này tại Phòng thí nghiệm thụ tinh trong ống nghiệm bệnh viện Phụ sản Từ Dũ, chúng tôi đã thực hiện được tổng cộng được 20 thí nghiệm Trong đó, 12 thí nghiệm đầu chúng tôi nhận định lại một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thụ tinh và ở 8 thí nghiệm cuối, chúng tôi chia thành 2 lô để khảo sát mục tiêu đã đề ra Sau đây là kết quả chi tiết :

1 Các thí nghiệm nhận định ảnh hưởng của chất lượng tinh trùng và chất lượng trứng đến quá trình thụ tinh :

Có thể nói, có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thụ tinh Những yếu tố có thể kể đến như : chất lượng trứng, chất lượng tinh trùng, thời gian cấy, nhiệt độ,… Qua 12 thí nghiệm đầu, như đã trình bày ở phần vật liệu phương pháp:

ƒ 5 thí nghiệm đầu khảo sát ảnh hưởng của việc để trứng chờ lâu (khoảng 1,5 giờ) đến hiệu quả thụ tinh và sự phát triển của phôi

ƒ 7 thí nghiệm sau khảo sát ảnh hưởng của chất lượng tinh trùng đến hiệu quả thụ tinh và sự phát triển của phôi Tuy nhiên, trong quá trình ghi nhận số liệu, chúng tôi nhận thấy 5 thí nghiệm ở trên cũng có chất lượng tinh trùng rất kém nên kết quả khảo sát chất lượng tinh trùng chúng tôi sử dụng toàn bộ số liệu của 12 lô thí nghiệm này

ƒ Các kết quả được thu nhận và được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel