Giáo trình kỹ thuật điện di

Tầm quan trọng của hoạt động đệm gọi là khả năng đệm β và được ước lượng bằng lượng base mạnh cần có để làm thay đổi một đơn vị: β = db/ dpH trong đó dpH là sự gia tăng pH do thêm db của

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP

BỘ MÔN KHOA HỌC CÂY TRỒNG

Giáo trình

KỸ THUẬT ĐIỆN DI

Cán bộ biên soạn: tiến sĩ VÕ CÔNG THÀNH

12-2004

LỜI MỞ ĐẦUTrong việc ứng dụng công nghệ sinh học vào lĩnh vực chuyên môn của từng ngành nói chung và di truyền chọn giống nói riêng thì môn học kỹ thuật điện di đóng góp vai trò quan trọng nhằm giúp người phân tích phát hiện được các biến dị, độ thuần hạt giống, đa dạng di truyền, ở mức phân tử DNA, enzyme hay protein Giáo trình nầy nhằm trang bị cho các sinh viên bậc đại học, cao học, nghiên cứu sinh, và cán bộ nghiên cứu thuộc nhiều ngành như trồng trọt, chăn nuôi, thủy sản, công nghệ sinh học, bảo vệ thực vật, y khoa nắm bắt cơ sở lý thuyết và vận dụng vào công tác chuyên môn của mình.

Nhằm đáp ứng yêu cầu cấp thiết của bạn đọc và sinh viên hiện nay, tác giả đã cố gắng biên sọan giáo trình theo hướng lý thuyết trong thực hành nhằm giúp đọc giả nhanh chóng tiếp cận một

số kỹ thuật điện di phổ biến trên thế giới, qua đó người đọc có thể tiếp cận cơ sở lý luận và có năng lực đọc và giải thích được phần nào các công trình nghiên cứu đã đăng tải trên các tạp chí, bài báo trong và ngòai nước về lĩnh vực ứng dụng công nghệ sinh học, nhất là lãnh vực đa dạng sinh học và

di truyền chọn giống

Xin chân thành cám ơn hội đồng khoa học của Bộ môn Khoa Học Cây Trồng, khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng, phòng đào tạo Trường Đại Học Cần Thơ đã tích cực tạo điều kiện cho việc xuất bản giáo trình nầy

Tác giả rất mong được các đồng chí giáo viên, sinh viên và các bạn đọc, trong quá trình sử dụng, sẽ đóng góp cho nhiều ý kiến để giúp cho việc biên sọan lần sau được tốt hơn

Tác giả

MỤC LỤC

Tựa đề Trang

Chương 1: Kỹ thuật điện di Protein

1.1 Các dung dịch đệm 1

1.2 Thiết bị điện di 3

1.3 Quá trình điện di 3

1.4 Các loại gel Polyacrylamide 4

1.5 Điện di Protein 5

1.6 Phát hiện các protein trong gel SDS Polyacrylamide 7

1.7 Ghi nhận kết quả và sấy gel 8

1.8 Các ứng dụng của SDS-PAGE 8

1.9 Điện di gel đơn giản 11

1.10 Điện di gel gradient 11

1.11 Isoelectric focusing (IEF) 12

Chương 2: Kỹ thuật điện di Isoenzyme 2.1 Giới thiệu 18

2.2 Phương tiện & phương pháp 19

2.3 Phương pháp ước lượng tần số allele 24

2.4 Phương pháp ước lượng độ biến dị di truyền 32

2.5 Phương pháp tính độ phân hóa di truyền 34

Chương 3: Kỹ thuật điện di ADN 3.1 Vài quá trình ly trích ADN phổ biến 42

3.2 Chuẩn bị gel agarose 49

3.3 Định lượng ADN 50

3.4 Phương pháp minigel 50

3.5 Chụp hình kết quả điện di 50

3.6 Một số phương pháp PCR phổ biến 50

Chương 4: Phương pháp ước lượng tính đa hình bên trong và giữa các quần thể 4.1 Định nghĩa 59

4.2 Tính đa dạng và tính phân hóa ở mức độ allele 62

4.3 Tính đa dạng và tính phân hóa ở mức độ nucleotide 64

pH trung tính Tại pH trung tính thường các quá trình biến dưỡng xảy ra với tốc độ tối đa Tuy nhiên, các hydrolases cua lysosomes có hoạt tính cao nhất ở vùng pH 5 (tại pH nầy đa

số tế bào bị chết) Dịch tiêu hoá (gastric juice) tại dạ dày của động vật hữu nhũ có hoạt tính tối đa với pH 1, tại pH này enzyme pepsin khởi động tiêu hoá tối đa protein

Các hệ thống dung dịch đệm chủ yếu được phát hiện trong dịch tế bào là phosphate, bicarbonate, amino acid, và protein

Tính mẫn cảm các quá trình sinh học với pH có lẽ là do một vài nguyên nhân Quá trình có thể bị xúc tác do các ion hydrogen hoặc có thể ion hydrogen là chất phản ứng hay

là sản phẩm Sự thay đổi pH làm thay đổi sự phân bố của một hợp chất hay ion xuyên qua màng, có thể là do tính thấm (permeability) của màng tế bào Giống như các cấu trúc sinh học và các phân tử khác các màng tế bào có các nhóm có khả năng ion trạng thái chính xác của ion hoá ảnh hưởng đến cấu hình phân tử nên ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học Điều này đặc biệt đúng với trường hợp protein và enzyme Vài protein tuỳ thuộc vào sự thay đổi nhẹ về pH của môi trường để hoàn thành chức năng sinh học của chúng

Một dung dịch đệm chống lại sự thay đổi nồng độ ion hydrogen khi thêm acid hay chất kiềm Tính chống lại này được gọi là hoạt động đệm (buffer action) Tầm quan trọng của hoạt động đệm gọi là khả năng đệm (β) và được ước lượng bằng lượng base mạnh cần có

để làm thay đổi một đơn vị:

β = db/ d(pH) trong đó d(pH) là sự gia tăng pH do thêm db của base

Trong thực hành, các dung dịch đệm thường bao gồm hỗn hợp một acid hay base yếu và muối của nó, thí dụ như acetic acid và sodium acetate (theo thuật ngữ của Bronsted và Lowry, là hỗn hợp một acid yếu và base liên hợp của nó) Trong một dung dịch acid yếu (RCOOH) và muối của nó (RCOO-), ion hydrogen được thêm vào bị trung hoà do các anion của muối, do đó nó có hoạt tính như là một base yếu, và ngược lại khi thêm các ion hydrogen bị loại đi do trung hoà acid Như vậy, khả năng đệm của một acid đặc biệt và base liên hợp của nó sẽ tối đa khi nồng độ của chúng bằng nhau Thí dụ khi pH=pKa của acid Khả năng đệm cũng tuỳ thuộc vào nồng độ tổng số của acid và muối cũng như tỷ lệ tương đối - nồng độ tổng cộng càng lớn thì khả năng đệm càng lớn Nồng độ thông thường của acid và muối trong các dung dịch đệm dao động khoảng 0,05 - 0,20M và các hỗn hợp

có khả năng đệm chấp nhận được trong khoảng pH = pKa ±1

Tiêu chuẩn dung dịch đệm trong nghiên cứu sinh học có thể tổng kết như sau:

(1) có khả năng đệm đủ trong khoảng pH yêu cầu;

(2) có độ tinh khiết cao;

(3) hoà tan nước cao và không thấm với các màng sinh học;

(4) ổn định với enzyme và thuỷ phân

(5) có pH ít bị ảnh hưởng do nồng độ của chúng, nhiệt độ và ảnh hưởng môi trường có thành phần ion hoặc muối;

(6) không độc;

(7) chỉ có các dạng phức với cation hoà tan;

(8) không bị hấp thu trong vùng ánh sáng thấy được hay tia cực tím

Bảng 1 Giá trị pKa của một số acid và base thường dùng trong dung dịch đệm

aHepes: N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethanesulphonic acid

bPipes: piperazine-N-N'-bis(2-ethanesulphonic acid)

cTris: 2-amino-2hydroxymethylpropane-1,3-diol

RCOOH = RCOO- + H+

Hằng số ion Ka được biểu thị theo công thức sau đây:

Ka= [RCOO-] [H+]/ [RCOOH]

Trong trường hợp base yếu như amine ion theo phương trình

RNH2 + H20 = RNH+3 + 0HBase Acid liên hợpHằng số ion có thể biểu thị theo giá trị Kb:

-Kb= [RNH+3] [0H-]/ [RNH2] [H20]

thông thường người ta biểu thị trị số Ka theo acid liên hợp

Ka= [RNH2] [H+]/ [RNH+3]Trong các trường hợp như vậy, tích số Ka và Kb bằng với Kw của nước

Trong thực hành, do trị số Ka có giá trị rất nhỏ nên người ta thường dùng trị số pKa, với

pKa= -log10Ka Với base yếu, pKa+pKb = 14; acid yếu được tính như sau:

pH = pKa+ log10 [base liên hợp]/[acid]

Trong trường hợp base yếu phương trình được biểu thị theo acid liên hợp như sau:

pH = pKa+ log10 [base]/[acid liên hợp]

2 Thiết bị điện di

Có nhiều thiết bị điện di đã được dùng để phân tách protein trên nền gel polyacrylamide; hầu hết các thiết bị có dạng hình ống (tube) hay bản (slab) Gel dạng bản có điểm thuận lợi là chúng ta có thể so sánh hỗn hợp các protein với nhau trong cùng một gel nên loại gel này được dùng rất thông dụng trong phân tích sinh hoá và sinh học phân tử

Gel dạng bản có cấu tạo bên ngoài là hai cặp kiếng thuỷ tinh, một mặt được chế tạo sẵn gờ cao từ 1 mm đến 1.5 mm ở hai bên nhưng phía đáy để trống, xung quanh gờ ta dùng một miếng roan (spacer) bằng plastic có độ dầy tương ứng bao quanh Khi đổ gel bằng agarose hay polyacrylamide lỏng, sau đó đặt lược (comb) xen giữa hai miếng kính thuỷ tinh ở phía trên để tạo giếng (well) Khi gel đặt và trước khi lắp vào bộ khung điện di, tháo kẹp phía đáy ra.

Để được sự phân tách các protein khác nhau trong hỗn hợp ly trích được tốt, giống như sắc ký lọc gel (gel-filtration chromatography), ta nên dùng một lượng protein nhỏ Điều này là do lớp gel cô (stacking gel) có chiều dài ngắn ở phía trên gel phân tách (separating gel), lớp gel cô này có đặc điểm là các protein của mẫu đem phân tích tập trung và cho phép phân tách các protein bao quanh với kích cỡ khác nhau Lớp gel cô được trùng hợp với tỷ lệ (%) acrylamide và bisacrylamide thấp để có cỡ lỗ to, dung dịch đệm là Tris-HCl có pH 6,8 trong khi lớp gel phân tách có tỷ lệ (%) acrylamide cao hơn với dung dịch đệm Tris-HCl có pH 8,8 Dung dịch đệm điện di phía trên và phía dưới bể chứa thường có pH 8,3 và chất glycine Cùng với hỗn hợp protein với pH 6,8 người ta thêm một ít thuốc nhuộm để theo dõi quá trình điện di do thuốc nhuộm bám vào protein nhẹ nhất.

3 Quá trình điện di

Khi một điện trường được đặt trong dung dịch có chứa ion, một dòng điện sẽ phát sinh trong đó các anion di chuyển hướng về cực dương (anode) và các cation di chuyển hướng về cực âm (cathode), Một dung dịch chứa vài ion như nước tinh khiết hay benzene sẽ có sức kháng cao và sẽ mang dòng điện rất thấp Điện di là một quá trình mà các phân tử mang điện tích được tách ra trong một điện trường do khả năng di chuyển khác nhau của các phân tử Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng chuyển động (mobility) của một phân tử trong điện trường bao gồm điện tích của phân tử q và gradient của điện trường E, cả hai cùng cung cấp với nhau tạo lực di chuyển ion, và sức kháng ma sát của môi trường f làm thúc đẩy sự di chuyển Khả năng chuyển động được định nghĩa là tốc độ di chuyển với một gradient hiệu thế 1V/cm và được ước lượng bằng cm2/giây/volt Trong thực hành người ta thường xác định khả năng chuyển động tương đối của protein Rf, là tỷ số khoảng cách của mỗi protein di chuyển so với khoảng cách của chất nhuộm anion nhỏ nhất (vạch

đánh dấu) Tỷ lệ khối lượng với điện tích (charge-to-mass ratio) của chất nhuộm cao tạo cho chất nhuộm di chuyển phía trước các protein.

Rf= q.E/f Các protein có một điện tích thuần ở bất kỳ pH nên khi đặt gel trong một điện trường , các protein sẽ di chuyển hướng về cực mang điện tích trái dấu Đa số các protein có điểm đẳng điện pI = 3-10, phổ biến là pI <8 Do đó, pH 8 hay cao hơn đa số các protein mang thuần điện tích âm và sẽ di chuyển trong điện trường hướng về anode (cực dương) Nhằm ngăn cản sự mất độ phân giải gây ra do sự phân tán và nhiễu do rung động và truyền nhiệt và để giữ lại sự phân tách của các protein sau khi hoàn tất thí nghiệm người ta sử dụng một môi trường hỗ trợ (a support medium) Môi trường hỗ trợ lý tưởng phải mạnh, ưa nước (để ngăn cản các tương tác kỵ nước giữa các protein trong mẫu phân tích và dung dịch đệm điện di), không mang điện tích, và ổn định với độ rộng thay đổi của nhiệt độ, pH, và khả năng thẩm thấu; và nó phải có khả năng hiệu chỉnh tính kết lỗ (porosity) Kích cỡ lỗ của môi trường hỗ trợ là rất quan trọng bởi vì nó đóng góp chủ yếu hệ số ma sát f (frictional coefficient) Hiệu quả rây (sieving effect) của môi trường hỗ trợ cũng như tỷ sộ́ điện tích với khối lượng (charge-to-mass) của các phân tử làm phân đoạn các phân tử trong mẫu phân tích Với điện di gel bằng acrylamide có chất tẩy sodium dodecyl sulfate (SDS-PAGE), hiệu quả rây là các phương thức chủ yếu của

sự phân đoạn Điều này cho phép phân tách các phân tử có điện tích đồng nhất so với khối lượng phân tử nhưng có kích cỡ khác nhau Trong điện di gel, matrix gel là một chất giống như mắt lưới (mesh) nên nó hoạt động như là cái rây hay là cái sàng, tại đây các lực ma sát làm giảm khả năng chuyển động của các phân tử có kích cỡ lớn so với các phân tử có kích cỡ nhỏ Do đó, các phân tử có kích cở lớn di chuyển chậm hơn so với các phân tử có kích cỡ bé hơn

Các chất khác nhau đã được sử dụng làm môi trường hỗ trợ (matrix) để phân tách trong quá trình điện di Tính về mặt thời gian, gel bằng giấy và gel tinh bột đã đóng vai trò quan trọng trong kỹ thuật điện di protein, mặc dù các môi trường hỗ trợ thiếu nhiều đặc điểm mong muốn như đã đề cập phía trên Hiện nay, môi trường hỗ trợ được chọn trong hầu hết các ứng dụng điện di protein (và acid nhân, ADN hay ARN) là chất trùng hợp acrylamide thoả mãn được tất cả các đặc điểm yêu cầu như trên Lỗ của gel acrylamide trùng hợp có thể kiểm soát tuỳ theo phần trăm acrylamide và/hay độ liên kết của chuỗi acrylamide.

Cảnh báo: Chất acrylamide la chất độc đến thần kinh trừ khi nó đã được trùng hợp

thành gel Hãy cẩn thận mang găng tay khi thao tác với chất này Khi cân bột acrylamide khô nhớ mang mặt nạ Các dung dịch không sử dụng phải cho trùng hợp hay pha loãng nhiều lần và rửa cẩn thận lọ chai Nếu có rơi rớt phải được rửa bằng

xà phòng với khăn giấy, khăn giấy phải để vào thùng đựng rác thích hợp Sau khi trùng hợp acrylamide mất đi tính độc nhưng khó lấy ra từ dụng cụ (thuỷ tinh).

4 Các loại gel polyacrylamide

Các gel polyacrylamide được tạo thành do đồng trùng hợp của chất acrylamide (CH2=CH-CO-NH2), chất đơn phân hoà tan trong nước, với một tác

nhân tạo liên kết để tạo thành một lattice ba chiều Tác nhân tạo liên kết trong hầu hết các trường hợp là N,N'-methylene bisacrylamide có công thức như sau:

(CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2) Bisacrylamide bao gồm hai nối đôi nên trong các phản ứng trùng hợp chúng liên kết chéo với các chuỗi polyacrylamide kế bên Nếu trùng hợp mà không có tác nhân liên kết chéo thì acrylamide chỉ tạo thành các polymer dạng thẳng, dung dịch

ở dạng chất nhầy chưa đạt gel mong muốn Các phản ứng trùng hợp xảy ra do một

cơ chế gốc tự do; các gốc tự do được tạo ra hoặc là do quang phân ly của một hợp chất labile như riboflavin hoặc là do sự phân rã chất hoá học của một hợp chất labile Người ta thường dùng chất ammonium persulfate và tetra methylethylenediamine (TEMED, (CH3)2N-CH2-CH2-N(CH3)2) Ammonium persulfate là một di-sulfate ester của hydrogen peroxide (-O3S-O-O-SO3-), và từ từ homolyze thành các gốc ·SO4 không ổn định TEMED là một amine bậc ba phản ứng với các gốc ·SO4 để tạo thành TEMED có các gốc tự do để phản ứng với acrylamide khởi đầu cho sự trùng hợp.

Cỡ lỗ trung bình trong một gel polyacrylamide có thể kiểm soát bằng cách thay đổi lượng monomere hay bằng cách thay đổi độ liên kết chéo (cross-linking), với độ liên kết chéo cao ta sẽ có cỡ lỗ hẹp hơn Tuy nhiên, trong mục đích sử dụng

độ liên kết chéo thường được cố định, và phần trăm monomere thay đổi để có cỡ lỗ khác nhau Các protein có cỡ nhỏ tương đối sẽ di chuyển trong gel ít bị chướng ngại trong khi các protein có cỡ lớn sẽ không thể đi qua tất cả các lỗ trong gel Các protein rất lớn sẽ không đi vào gel được Do đó, chỉ có protein trong khoảng cỡ đặc biệt (khoảng trọng lượng phân tử) sẽ được tách ra trên bất kỳ gel nào Bảng xx biểu thị phần trăm monomere dùng để trùng hợp và cỡ phân tử protein được tách ra Gel gradien là mộtdang đặc biệt của gel trong đó độ của lỗ được thay đổi từ đáy lên đỉnh bằng cách tạo gradient theo phần trăm acrylamide Gel gradient có thể phân tách các protein có trọng lượng phân tử (Mr) lớn.

Bảng 2 Khoảng phân đoạn các gel polyacrylamide

đặc điểm trên bù trừ nhau, các protein có điện tích và cỡ khác nhau thỉnh thoảng di chuyển với cùng tốc độ trong một thí nghiệm điện di Để đơn giản sự phân tích hỗn hợp các protein chúng ta có thể phân tách bằng cách tạo cỡ các chuỗi polypeptide Điều này có được khi chúng ta cho protein biến tính với chất tẩy sodium dodecyl sulfate Chất tẩy SDS bám rất mạnh vào các protein làm cho protein đang bị gấp trở thành bị biến tính thành dạng que (rod) và được bao bọc bởi chất tẩy SDS Một chất tẩy SDS trung bình hiện diện với hai amino acid Bởi vì mỗi phân tử dodecyl sulfate

có hai điện tích âm ở trị số pH dùng cho điện di, điện tích thuần của các chuỗi polypeptide được bao bọc sẽ có rất nhiều điện tích âm hơn là các chuỗi được bao bọc Hơn nữa, tỷ lệ khối lượng - điện tích sẽ đồng nhất đối với các protein khác nhau bởi vì chất tẩy SDS bao bọc chiếm ưu thế điện tích Do đó, sự phân tách các chuỗi polypeptide được bao bọc biến tính do chất tẩy sẽ riêng biệt đối với các chuỗi polypeptide.

Khi glycine từ bể chứa phía trên (upper reservoir) đi vào lớp gel cô có

pH 6,8 nó trở thành dạng lưỡng cực trung hoà, chỉ khoảng 1% ở dạng glycinate mang điện tích âm Điều này giúp ngăn cản tính chất mang dòng điện của glycine Các ion Cl- duy trì hiệu quả là chất mang dòng điện ở pH 6,8 và di chuyển đến cực dương Trong thời gian điện di tại lớp gel cô nồng độ ion Cl-trở nên ít ở cực âm phía trên, tạo ra một gradient nồng độ hướng về cực dương phía đáy khung Các phân tử protein mang SDS và chất nhuộm có tỷ khối-điện tích lớn hơn so với tỷ khối-điện tích của glycine nhưng nhỏ hơn tỷ khối-điện tích của Cl-và ở phía trước glycine Khi điện di tiếp tục, các phân tử protein tiến về lớp gel phân tách di chuyển rất chậm, cho phép các phân tử protein theo kịp, đảm bảo thể tích của mẫu protein hiện có đến lớp gel phân tách sẽ nhỏ hơn thể tích của mẫu protein ban đầu được bơm vào giếng Sự di chuyển của các protein và chất nhuộm trong lớp gel cô cũng tạo nên một gradient ion, vì thế cuối cùng glycine phải mang dòng điện ở phía sau các phân tử protein Điều này giúp tập trung các protein thành một băng mỏng nằm giữa các ion Cl-và các phân tử glycine nằm phía trên giữa lớp mặt phân cách lớp gel

cô và lớp gel phân tách Điều cần nhấn mạnh ở đây là trong lớp gel cô có chức năng riêng với pH 6,8 trong khi glycine có đặc tính là chất lưỡng cực và nghiêng nhẹ về phía điện tích dương.

Khi các băng protein cô lại và đi vào lớp gel phân tách có pH cao hơn, glycine trở thành chất mang điện tích dương, mang tỷ khối-điện tích cao hơn so với các protein Đến đây các ion glycinate mới vừa thành lập di chuyển nhanh hơn các protein, với tính di động gần với tính di động của các ion Cl- Một nồng độ gradient mới được hình thành đòi hỏi các protein và chất nhuộm mang dòng điện theo sau các ion Cl-và ion glycinate Các protein di chuyển tuỳ theo tính linh động tương đối của chúng và được phân tách do ảnh hưởng sàng lọc của gel phân tách tuỳ theo kích cỡ Khi chất nhuộm di chuyển đến phía đầu dưới của gel, điện di được cho ngừng lại vì thế các protein không chạy ra khỏi gel.

Để SDS - polyacrylamide gel phân tách các protein dựa trên cơ sở kích cỡ các protein phải mang chất tẩy SDS bám đồng đều Điều này có thể có được khi nồng độ của chất tẩy SDS là 0,1% (khối lượng/thể tích) Do đó, nồng độ của chất tẩy SDS phải hiện diện trong dung dịch đệm điện di và trong các gel cô và gel phân tách Mẫu protein thường được hỗn hợp trong một dung dịch có chứa chất tẩy SDS

có nồng độ sau cùng là 1% Sau đó, mẫu phân tích được đun nóng để làm biến tính

protein và được bao phủ với chất dodecyl sulfate Cách xử lý như vậy là phổ biến cho hầu hết các loại protein; tuy nhiên, một vài loại protein không bị biến tính và/ hoặc mang chất tẩy dodecyl sulfate Đặc biệt, các protein có tính acid rất cao (điện tích âm) không bám với chất tẩy tốt và không phân tách theo kích cỡ của nó trong SDS-PAGE.

Sự hiện diện của chất tẩy và các chuỗi polypeptide không gấp nếp phá vỡ hầu hết các tương tác (tạo nên các protein mutimeric, protein đa phân), kết quả ta có các chuỗi polypeptide dạng đơn phân (monomeric polypeptide) Tuy nhiên, các cầu nối chéo disulfide giữa các chuỗi polypeptide không bị phân huỷ mặc dù có mặt của chất tẩy SDS, do đó các chuỗi polypeptide có liên kết nhau sẽ duy trì tính liên kết đồng hoá trị Để loại bỏ các cầu nối liên kết chéo này, chất khử 2-mercaptoethanol thường được thêm vào trong mẫu protein cùng với chất tẩy SDS.

6 Phát hiện các protein trong gel SDS-polyacrylamide

Các kỹ thuật phát hiện

Có nhiều kỹ thuật để thấy được sự hiện diện của protein sau khi chạy điện di trong gel SDS-polyacrylamide Kỹ thuật thông dụng nhất là dùng chất nhuộm protein Có một số chất nhuộm nhưng thông dụng nhất là chất Coomassie Brilliant Blue R-250, chất nhuộm có liên quan đến kỹ thuật định lượng protein tổng số theo phương pháp Bradford Để nhuộm các băng polypeptide, gel được lấy cẩn thận ra khỏi cặp kính thuỷ tinh và để trong một khay nhỏ có chứa chất nhuộm Các băng protein được cố định, chất dodecyl sulfate sẽ bị loại ra khỏi gel bằng cách ngâm trong một dung dịch có chứa acetic acid và methanol Kế đến gel được ngâm trong trong dung dịch Coomassie Brilliant Blue R-250 đã được hoà tan với acetic acid và methanol Các kết quả thường được xuất hiện bằng cách cố định và nhuộm đồng thời trong một dung dịch có chất nhuộm Để thấy được các băng protein trong thực hành toàn bộ gel được nhuộm có màu xanh rồi loại bỏ thuốc nhuộm dư thừa bằng cách ngâm gel trong một dung dịch acid loãng và methanol Các gel được nhuộm có thể đem quét bằng máy densitometer để định lượng hàm lượng tương đối của các băng protein Điều cần chú ý là định lượng protein bằng thuốc nhuộm chỉ có giá trị tương đối, gần đúng.

Một kỹ thuật nhuộm rất nhạy nhưng tốn công và khá đắt tiền để thấy được các protein trong gel polyacrylamide là kỹ thuật nhuộm bạc Kỹ thuật này được dựa trên tính chất hoá học dùng trong rửa phim ảnh Gel được ngâm trong một dung dịch methanol pha loãng để cố định các protein trong gel Kế đến gel được ủ trong một dung dịch acid của nitrate bạc, nitrate bạc phản ứng với các protein Hình ảnh của băng protein được hình thành do tính khử của ion bạc thành dạng kim loại của

nó khi có formaldehyde ở pH kiềm (sodium carbonate) Sự hiện màu sẽ dừng lại bằng cách acid hoá dung dịch với acetic acid Các protein khác nhau phản ứng khác nhau với nitrate bạc, do đó định lượng theo phương pháp này cũng có giá trị gần đúng như các phương pháp phát hiện protein khác Hiệu quả của phương pháp này

là từ 10 đến 100 lần nhạy hơn phương pháp nhuộm bằng chất nhuộm Coomassie Brilliant Blue R-250.

Nếu các protein được đánh dấu bằng chất đồng vị phóng xạ, các protein sẽ được phát hiện bằng máy phóng xạ tự ghi Thí dụ, ta có thể tạo protein chứa lưu

huỳnh phóng xạ 35S bằng cách tổng hợp chúng trong ống nghiệm để chuyển methionine sang [35S]-methionine, hoặc bằng cách tạo ra chúng trong in vivo (mẫu sống) của các sinh vật sử dụng đến amino acid đã được đánh dấu Trong các trường hợp này, các băng protein sẽ được phát hiện bằng cách đặt gel trực tiếp đối diện với phim chiếu tia X trong tối Kỹ thuật phóng xạ tự ghi đã được áp dụng để tìm hiểu kết quả phosphoryl hoá hay dephosphoryl hoá của protein trong các thí nghiệm với các protein kinase và phosphatase bởi vì các trường hợp này ta có thể theo dõi sự hoà nhập hay phóng thích 32P từ các protein Trong một số trường hợp chất đồng vị phóng xạ có nặnglương thấp như 14C hoặc 3H sẽ hoà nhập vào các protein Trong trường hợp này, máy phóng xạ tự ghi không phát hiện được vì sự phân huỷ chất phóng xạ không phóng thích phân tử có đủ năng lượng để thoát khỏi gel và đập vào

bề mặt của phim Để cho phép phát hiện sự phát xạ có năng lượng thấp này, gel phải ngâm trong các chất huỳnh quang (fluorophores) Những chất fluor hấp thu phát xạ có năng lượng thấp bằng cách va chạm gần và phát sáng và phim tia X bắt được.

Nếu một kháng thể đối với một protein nào đó biết trước, protein có thể được phát hiện trong gel SDS-polyacrylamide bằng phản ứng với kháng thể chuyên biệt

7 Ghi nhận kết quả và sấy gel

Kết quả điện di protein bằng SDS-polyacrylamide có thể ghi nhận được bằng cách chụp gel đã được nhuộm Cách chọn lựa này rất thông dụng dùng để ghi lại các hình ảnh dự kiến dùng cho báo cáo, đăng bài Tuy nhiên, chụp ảnh thường tốn kém và không cần thiết với các mục đích của phòng thí nghiệm chuẩn Với những gel ít quan trọng, chúng ta có thể đem sấy khô trực tiếp để ghi nhận và báo cáo Có nhiều cách sấy gel, phương pháp chuẩn đơn giản là đặt gel lên miếng giấy lọc (Whatman 3 mm), phủ phía trên bề mặt gel một miếng plastic, làm khô gel bằng máy sấy gel có hút chân không và tạo nhiệt độ Sau khi gel khô, gel có khuynh hướng uốn cong vì vậy nên đặt một quyển sách dầy lên phía trên gel vài ngày để gel được phẳng Cách sấy gel khác là gel có thể được sấy khô bằng giấy cellophane hoặc kẹp gel trong giấy cellophane và để khô chậm trong điều kiện nhiệt độ phòng,

8 Các ứng dụng của SDS-PAGE

8.1 Phân tích mẫu tinh sạch protein

Do tính đơn giản của phương pháp, SDS-PAGE được áp dụng phổ biến đánh giá tinh sạch và định lượng protein Thí dụ, SDS-PAGE áp dụng phổ biến để theo dõi protein sạch hay không mà phép thử nghiệm enzyme không làm được Ngay cả khi có một trắc nghiệm enzyme tốt đi nữa, ta cũng nên kiểm tra các mẫu protein bằng SDS-PAGE trong quá trình tinh sạch protein bởi vì phưong pháp điện di cho phép chúng ta thấy được sự lẫn tạp có thể có Chúng ta có thể phân biệt sự lẫn tạp

do một lượng nhỏ do nhiều loại protein, hoặc một lượng khá lớn protein Với trường hợp sau, dùng phương pháp điện di cho phép chúng ta thiết lập các điều kiện phân tách tối hảo từ sự lẫn tạp gây ra Do nhận diện các lẫn tạp thường chưa biết, phương pháp điện di là cách đơn giản duy nhất có thể kiểm soát sự lẫn tạp trong các cách thức phân đoạn khác nhau Do tính lịnhđông của polypeptide trong SDS-

PAGE chọn lọc được riêng biệt hầu hết kích cỡ Điều không thể phát hiện sữ lẫn tạp khi các protein có cỡ giống nhau Tuy nhiên, đôi khi đây là một vấn đề khi năng lực của một kỹ thuật thường có thể phân biệt sự khác biệt khoảng 1% khối lượng phân tử.

Bởi vì nhiều protein do sự phối hợp từ nhiều tiểu đơn vị polypeptide, sự hiện diện của nhiều băng trên SDS-PAGE không nhất thiết phải biểu thị tính không sạch của enzyme Tuy nhiên, trong những trường hợp như vậy, có mối liên hệ hợp lý giữa lượng protein trong mỗi băng Nếu nhiều polypeptide là phần của một oligomeric enzyme (enzyme đơn phân), tỷ số của các đơn vị khác nhau sẽ duy trì hằng số trong suốt quá trình tinh sạch.

8.2 Xác định khối lượng phân tử của các chuỗi polypeptide

Như đã đề cập ở trên, tính linh động khác nhau của hầu hết các protein trong SDS-PAGE là do kích cỡ của chúng Do đặc tính như vậy, SDS-PAGE thường được dùng để ước lượng khối lượng phân tử của các chuỗi polypeptide Để chuẩn

độ thí nghiệm điện di, một số polypeptide có khối lượng phân tử đã được biết trước được đem chạy điện di đồng thời với các chuỗi polypeptide chưa biết, và tính linh động tương đối Rf của mỗi loài được xác định Tính linh động tương đối được tính bằng cách chia khoảng cách protein di chuyển cho khoảng cách của chất nhuộm di chuyển Chất nhuộm là một phân tử nhỏ mang điện tích và có màu nên di chuyển nhanh hơn nhiều so với các protein Do chất nhuộm có màu nên cho phép ta thấy được dấu vết của nó đi trước và từ đó ta tính được giá trị Rf ngay cả khi vệt dấu chạy không chính xác như nhau Đối với phân tích này điều quan trọng là không để vệt dấu ăn màu đi ra khỏi gel, nếu không ta không thể tính được giá trị Rf Với protein chuẩn nên có ít nhất năm loại protein biết khối lượng phân tử khác nhau để chúng tạo phân bố khắp trong gel để ta có thể ước lượng khối lượng protein chưa biết của mẫu Các điểm của các trọng lượng phân tử protein chuẩn tương đối được chuyển qua dạng log để được dạng tuyến tính, trọng lượng phân tử của các polypeptide qua đó có thể được ước lượng Ngược lại, khoảng cách di chuyển so với trọng lượng phân tử sẽ được chấm ghi nhận, nhưng kết quả đường cong chỉ tuyến tính ở phần vùng trung tâm, và phân tích cần có mặt trước của chất nhuộm có cùng vị trí trong gel.

8.3 Thấm western (western blotting, Immunoblotting)

Một trong các kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử ngày nay là kỹ thuật thấm miễn dịch (immunoblotting) hay còn gọi là thấm Wertern (Western blotting) Kỹ thuật dùng để phát hiện và định lượng các protein mà nó phản ứng với một kháng thể (antibody) đặc biệt Thí dụ, kỹ thuật áp dụng xác định nồng độ protein kháng nguyên (antigenic protein) trong các tế bào đang ở trạng thái sinh lý đặc biệt, hoặc xác định một kháng nguyên có mặt hay không Trong kỹ thuật này, một phân đoạn SDS-PAGE của các protein trong mẫu được tiến hành Gel được lấy ra từ kính thuỷ tinh và đặt trên màng phẳng nitrocellulose Một bộ đệm thấm (pad) được dùng để

hỗ trợ gel và màng như bánh sandwich, lắp đặt và kẹp lại Một điện trường đi ngang qua phần sandwich tạo lực đẩy protein di chuyển ra ngoài gel và lên trên màng và

dính lại màng Do màng có các vị trí tự do nó được bao phủ với một hỗn hợp của các protein không chuyên biệt để che lấp các vị trí tự do này, người ta thường dùng sữa cho mục đích này Kế đến màng được ngâm trong một dung dịch có chứa kháng thể đối với protein mong muốn (kháng thể này được gọi là kháng thể sơ cấp) Do tất

cả các vị trí bám protein bị che lấp, kháng thể có thể bám chặt vào màng chỉ khi nó tương tác với kháng nguyên chuyên biệt Sau khi kháng thể không bám được rửa ,

sự hiện diện của kháng thể sẽ được phát hiện bằng nhiều cách Cách thông dụng là thêm vào một kháng thể thứ hai (được gọi là kháng thể thứ cấp) Kháng thể thứ cấp

sẽ phản ứng với bất kỳ kháng thể nào từ nguồn sinh học giống nhau như là kháng thể sơ cấp Thí dụ, nếu kháng thể sơ cấp có từ một con thỏ, kháng thể thứ cấp có thể

là kháng thể dê chống lại immunoglobulin thỏ Kháng thể thứ cấp thường được nối kết tương ứng với enzyme làm xúc tác phản ứng tạo màu, sự hiện diện của kháng thể thứ cấp có thể được xét nghiệm bằng cách ngâm màng trong chất nền của enzyme nối kết Cách này giúp phát hiện protein kháng nguyên rất nhạy.

8.4 Tinh chế các protein biến tính

Các protein được phân tách bằng điện di gel SDS-PAGE được bao phủ bởi chất tẩy và không gấp Vì vậy, trong gel thường không có enzyme có hoạt tính Tuy nhiên, có một vài ứng dụng protein biến tính lại hữu ích, và với ứng dụng như vậy SDS-PAGE được dùng như là phương pháp chuẩn bị trước Thí dụ, khi các mẫu đang được chuẩn bị để tiêm vào động vật để nâng lượng kháng thể ta làm tinh sạch sau cùng bằng phương pháp SDS-PAGE là tiện ích, sau đó thôi protein ra khỏi gel hoặc đơn giản hơn là tiêm băng protein đã được nghiền nhừ vào động vật Một cách khác nữa là phân lập băng protein tinh sạch để phân tích trình tự đầu tận cùng N (N- terminal sequencing analysis) Kế đến chuỗi trình tự này được dùng để thiết kế các con mồi (primer) oligonucleotide để nhân dòng gen hoặc là kiểm tra biểu hiện sản phẩm của một băng protein của một gen đã biết.

Trong hầu hết các trường hợp để tìm hoạt tính của protein, chúng ta không nên dùng SDS-PAGE như là phương pháp chuẩn bị trước Tuy nhiên, thỉnh thoảng SDS-PAGE là phương pháp chọn lựa để tinh chế lượng nhỏ protein, chẳng hạn như các yếu tố sigma của vi khuẩn Các yếu tố sigma là các protein nhỏ mang tính rất acid và là các thành phần của bộ phận phiên mã Sau khi phân tách bằng SDS- PAGE, gel nhuộm còn rất mờ nhạt, các băng protein mong muốn được cắt ra, sau

đó băng protein được làm nhỏ mịn, có thể dùng ống kim chích để làm mịn, ngâm trong các dung dịch có lực ion cao để thôi protein ra khỏi gel Các miếng gel bị loại

đi bằng cách ly tâm, các protein trong dịch nổi cho trầm tủa với 80% acetone Các bước này giúp ta không dùng chất tẩy SDS Kế đến chất trầm tủa d8ược hoà tan trong một dung dịch có chứa một chất gây biến tính mạnh như guanidine-HCl, chất này làm biến tính hoàn toàn các protein Mẫu sẽ được thẩm tích với nồng độ thấp guanidine-HCl và sau cùng thẩm tích trong dịch đệm không có chất gây biến tính Trong suốt các giai đoạn thẩm tích, các yếu tố sigma gấp lại và trở nên có hoạt tính

Về nguyên lý, các protein khác cũng gấp lại theo cách này.

9 Điện di gel đơn giản ( không biến tính)

Như đã đề cập phần trên, phương pháp SDS-PAGE dùng điện di các protein

bị biến tính Một phương pháp khác là điện di gel không biến tính, thượng goi là điện di đơn giản Với phương pháp này chất tẩy không được dùng và các protein giữ được cấu trúc nguyên thể (native structure) và hoạt tính Điện di đơn giản có thể thực hiện trong các ống nghiệm hay trên slab gel (gel có bản đứng) Khi tạo gel cô

và gel phân tách giống như phương pháp SDS-PAGE nhưng không sử dụng chất tẩy SDS, kể cả dung dịch đệm điện di cũng không được dùng Sự di chuyển của các protein trong gel đơn giản là do cả hai điện tích thuần và kích cỡ protein Thường gel phân tách có pH= 8-9 tuỳ thuộc vào protein cần thấy Các băng protein được thấy bằng cách dùng chất nhuộm giống như phương pháp SDS-PAGE.

Mặc dù năng lực của điện di đơn giản không lớn bằng phương pháp PAGE nhưng có vài ứng dụng kỹ thuật cũng hữu ích Thí dụ, kỹ thuật cho phép phát hiện và xác định một enzyme bằng cách nhuộm để biết hoạt tính của nó Trường hợp đơn giản nhất là khi enzyme xúc tác một phản ứng tạo màu sản phẩm

SDS-có màu gần đúng sẽ đủ sáng cho ta xem trực tiếp sau khi ngâm gel trong chất nền Thí dụ, phát hiện alkaline phosphatase Trong các trường hợp khác để kết nối hoạt tính enzyme cần được đánh giá với một phản ứng phụ sẽ cho một sản phẩm tạo màu.

Điện di gel đơn giản cũng tỏ ra hữu ích trong nghiên cứu cấu trúc và chức năng của enzyme Hiệu chỉnh tính đồng hoá trị của protein mà nó làm thay đổi điện tích và/hay khối lượng protein thường có thể được phát hiện bằng điện di gel đơn giản Thí dụ, uridylyl hoá và de-uridylyl hoá của protein tín hiệu biến nạp

homotrimeric E coli PII được kiểm tra bằng điện di gel đơn giản Mặc dù lượng

uridine monophosphate (UMP) được thêm vào protein II sự gia tăng khối lượng phân tử chỉ tăng lên một ít, mỗi hiệu chỉnh đồng hoá trị giúp thêm các điện tích vào protein, gây nên sự thay đổi tỷ số khối lượng-điện tích và do đó thay đổi tính linh động điện di Phương pháp điện di gel đơn giản phát hiện được các chất trung gian của protein II như protein tam phân (trimeric protein) có ba nhóm uridylyl

Để tinh sạch lượng nhỏ protein của một enzyme đơn phân (oligomeric enzyme) bằng điện di đơn giản và sau đó xác định enzyme được phối hợp từ các tiểu đơn vị khác nhau hay không bằng phương pháp điện di SDS-PAGE Trước hết, chúng ta phân tách enzyme trên một gel đơn giản và xác định băng có hoạt tính Băng này được cắt và cho chạy điện di SDS để tách các tiểu đơn vị ra nhờ sự sai khác về khối lượng của chúng Điện di gel đơn giản của dạng nhị phân của protein NRII tín hiệu biến nạp (signal transduction protein NRII) và một protein hoà lẫn

chứa NRII và E coli maltose-binding protein (MBP), cùng với nhị phân lai (hybtrid

dimer) được hình thành từ các dạng đơn phân trong ống nghiệm Sau khi cắt các băng nhị phân, enzyme được cho biến tính và phân đoạn bằng SDS-PAGE để quan

sát số lượng và kích cỡ các tiểu đơn vị khác nhau (hình xxx, phía dưới).

10 Điện di gel gradient (giới hạn cỡ lỗ)

Tốc độ di chuyển (tính linh động) của các protein trong điện di gel đơn giản được xác định bởi điện tích ở một pH được chọn và lực kháng ma sát của môi

trường hỗ trợ Vì vậy, sự phân tách không phải do riêng kích cỡ gây ra, và kỹ thuật thường không thích hợp để xác định trọng lượng phân tử Một vài loại điện di đơn giản chuyên biệt như điện di giới hạn cỡ lỗ là thích hợp cho việc xác định khối lượng phân tử của các protein đơn phân tự nhiên Kỹ thuật thì tương tự như kỹ thuật điện di đơn giản như đã đề cập phần trên, ngoại trừ gel phân tách được đổ với gradient polyacrylamide từ 30% ở phía dưới đáy gel đến 3% ở phía trên của gel Trong kỹ thuật này, gel cô không cần đến, và pH của hệ thống thường đủ kiềm để đảm bảo rằng hầu hết các protein hướng về cực dương (anode) Các protein di chuyển qua gel cho đến khi chúng đến một điểm ở đó cỡ lỗ của môi trường là quá nhỏ không đi qua được Do vậy, các protein riêng trở nên tập trung tại điểm ở đó cỡ

lỗ trở nên giới hạn Trong gel cho marker chuẩn để ta có thể ước lượng khối lượng phân tử protein chưa biết.

11 Isoelectric focusing (IEF)

Trong gel đơn giản, tính linh động của protein là do điện tích của chúng, điện tích tuỳ thuộc vào pH Tại pH đẳng điện của nó (pI), một protein không mang điện tích và do đó nó không di chuyển trong điện trường điện di Đặc tính này được khai thác bằng kỹ thuật IEF do khả năng tách theo các giá trị pI

Để phân tích IEF, phương thức thông thường là dùng ống thuỷ tinh có đường kính nhỏ để đổ gel Gradient pH được thiết lập bên trong IEF gel bao gồm các thành phần đệm polymer gọi là các chất điện ly lưỡng tính (ampholite) Giống như protein, các chất này có điện tích dương và điện tích âm và có giá trị pI khác nhau

Để tạo IEF, hỗn hợp chứa hàng nghìn chất ampholite khác nhau được sử dụng; nếu

pI của một protein mong muốn đã biết, một bộ ampholite với pI tập trungtrên gradient pH sẽ được dùng Các ampholite được pha trong gel, gel được đặt trong một điện trường trong vài giờ Cực âm thì tiếp xúc với một base yếu trong khi cực dương tiếp xúc với một acid yếu Trong suốt giai đoạn "chạy trước", mỗi chất ampholite di chuyển về một vị trí mà tại đây giá trị pH bằng với giá trị pI, tạo ra một gradient pH trong gel Kế đến mẫu protein cần phân tích được thêm vào, và điện di được tiếp tục cho đến khi cường độ dòng điện gần bằng không Tại điểm nầy, mỗi thành phần phải di chuyển đến vị trí trong gel nơi có giá trị pH bằng với giá trị pI

Dùng kỹ thuật IEF là hữu ích để xác định giá trị pI của các protein Kỹ thuật IEF có độ phân giải rất cao và có thể sử dụng để phát hiện các thay đổi nhỏ trong các protein, chẳng hạn như hiệu chỉnh đồng hoá trị và sự ly giải protein có giới hạn Tuy nhiên, giới hạn của kỹ thuật nầy là giá mua các chất ampholite và thiết bị chuyên biệt tương ứng rất đắt Tuy vậy, nếu phối hợp với kỹ thuật SDS-PAGE với phương pháp điện di hai chiều thì kỹ thuật IEF đóng vai trò cực kỳ quan trọng để xác định được đồng thời nhiều loại protein.

12 Điện di gel hai chiều

Điện di gel hai chiều là sự phối hợp của IEF và SDS-PAGE Một gel trong ống tube IEF được chạy, kế đến gel được đặt nằm ngang phía trên gel cô của gel SDS-polyacrylamide Do đó các protein được phân tách theo giá trị pItrong chiều

thứ nhất (IEF) và tuỳ thuộc vào khối lượng phân tử của chiều thứ hai (SDS-PAGE)

Do cả hai kỹ thuật nầy có độ phân giải cao nên khi phối hợp cho kết quả rất tốt Điện di hai chiều cho protein tế bào tổng số từ nhiều loại sinh vật khác nhau có thể phân giải được hàng trăm loại protein khác nhau.

Điện di hai chiều đóng một vai trò quan trọng trong việc xác định các protein

mà mức độ biểu hiện bị ảnh hưởng do một điều kiện sinh lý hay do đột biến Thí dụ, các protein bị cảm ứng do xử lý nhiệt được phát hiện bằng phương pháp kỹ thuật điện di hai chiều Có nhiều phương pháp để xác định các protein dưới dạng điểm (spot) sau khi chạy điện di hai chiều Nếu một đột biến điểm trong một gen đã biết, điểm mới của protein chuyên biệt nầy sẽ được quan sát do có thay đổi tính linh động, điều này chứng tỏ gen mã hoá protein này bị thay đổi Hơn nữa, các điểm protein có thể được cắt ra khỏi gel để xác định trình tự amino acid và chuỗi tận cùng

N Cuối cùng, gen mã hoá protein có thể được đem nhân dòng bằng cách dùng enzyme protease cắt protein, tinh sạch các peptide và xác định trình tự chuỗi 10-20 gốc N tận cùng, thiết kế các con mồi oligonucleotide mà nó mã hoá các trình tự này,

và xác định gen từ một thư viện gen bằng cách lai với oligonucleotide dẫn xuất.

Tài liệu tham khảo

David A Micklos and Greg A Freyer (1990) DNA science Cold spring harbor

laboratory press Pp 477

Douglas E Soltis and Pamela S Soltis (1989) Isozymes in plant biology Advances in

Plant Sciences Dioscorides Press, Portland, Oregon Vol 4, pp 200

Keith Wilson and John Walker (1994) Principles and techniques of practical

biochemistry Cambridge University press Pp 584

Reiner Westermeier Electrophoresis in practice (1993) A guide to theory and

Các tạp chí Crop Science 1975-2004 (Khoa Nông Nghiệp)

Các tạp chí Science, plant cell, plant physiology (Khoa Nông Nghiệp)

Hình 1.3 Phổ điện di protein loại albumin (bên trái) và globulin

(bên phải) trong hạt bắp bình thường (N) và opaque-2

Mũi tên chỉ các protein ở bắp opaque-2 bị thay đổi (C.M

Wilson 1987)

Hinh 1.4 Hệ thống đánh số băng protein theo phương pháp IEF

trên 6 dòng cận huyết bắp (Wilson 1985)

Hình 1.6 Phổ điện di hai chiều của Zein-I (bên trái) và Zein-2 (bên phải) Phía trên chiều ngang là IEF, chiều dọc là SDS-PAGE.

Hình 1.8 Trọng lượng của protein chuẩn dạng cao phân tử (HMW, từ 330KDa

đến 18.5 KDa) và dạng phân tử thấp (LMW, từ 94KDa đến 14.4KDa)

Hình 1.7 Phương trình hồi qui giữa giá trị Rf và trọng lượng phân tử protein

chuẩn dùng để nội qui trọng lượng phân tử của các băng protein cần tìm

giấm Drosophila (Lewontin và ctv., 1966)) và sau đó không lâu người ta tiếp tục nghiên

cứu trên thực vật bậc cao Kể từ đó kỹ thuật isozyme được sử dụng rộng rãi để làm dấu di truyền trong nghiên cứu đa dạng động vật và thực vật (Hamrick và ctv.; Soltis D.E và Soltis P.S., 1989)

Isozyme là các dạng phân tử của một hệ enzyme khác nhau về mặt cấu trúc nhưng

có cùng một chức năng xúc tác Theo hội đồng enzyme (Enzyme Comimission), isozyme được chấp nhận là có sự biến dị chuyên biệt trong loài Các isozyme bắt nguồn qua sự thay đổi amino acid tạo nên sự thay đổi về điện tích hoặc cấu trúc không gian (cấu hình) của các phân tử enzyme, do đó ảnh hưởng đến khả năng di chuyển trong điện trường Bằng chứng điện di của những amino acid bị thay đổi như thế cung cấp một tiềm lực kiểm soát

sự thay đổi chuỗi nucleotide của gen được mã hoá tương ứng Như vậy, isozyme có thể đánh dấu biến dị allele tại các locus gen có cấu trúc đơn giản, các allele khác nhau được đại diện bởi các isozyme theo tính chuyển động điện di khác nhau Các isozyme đã được chứng minh là được mã hoá bởi các allele khác nhau của cùng một locus gen và được gọi

là đồng enzyme hay allozyme

Các isozyme có nhiều thuận lợi quan trọng như là các dấu di truyền quan trọng (allozyme):

(a) Tính chuyên biệt của cơ chất của các hệ enzyme cung cấp cơ sở để kiểm soát sự biến dị

di truyền tại các locus gen có cấu trúc chuyên biệt

(b) Allozyme thường biểu hiện tính đồng trội cho nên thể đồng hợp và thể dị hợp được phân biệt dễ dàng

(c) Zymogram có thể giải thích đơn giản, tác động át chế biểu hiện rất hiếm

(d) Các phân tích isozyme dễ thực hiện trên động vật và thực vật

(e) kỹ thuật cho phép kiểm soát và giải thích nhanh nhờ so sánh giữa nhiều dữ kiện

Chức năng của các allozyme xem như là các dấu (marker) chuyên biệt của loài trong việc định lượng tính dị hợp tử, đa dạng di truyền, sự phân hoá di truyền, và các đo lường khác để định lượng biến dị di truyền bên trong và giữa các quần thể Hơn nữa, allozyme có thể dùng trong việc xác định các dòng vô tính, phân tích cha mẹ, đặc tính hoá các vật liệu và các quần thể khác nhau, các tính trạng tiền trội (predominant) của nhân giống (cận huyết), và hậu quả di truyền của việc thuần hoá hay do tác động của môi trường lên quần thể

Tuy nhiên, chúng cũng có một số giới hạn như sau:

(a) Các gen mã hoá các enzyme tiêu biểu cho một mẫu các locus gen cấu trúc không ngẫu nhiên ( và nhỏ)

(b) Chỉ có sự thay thế nucleotide mà nó gây ra sự thay đổi tính di chuyển điện di của các phân tử enzyme

(c) Khả năng không thể loại trừ là một và band isozyme giống nhau tiêu biểu cho các allele khác nhau nhưng chúng lại có cùng tính di chuyển

(d) Vấn đề đặt ra là sự đa hình allozyme là thích nghi hay trung tính, vấn đề nầy còn đang tranh cải

Đa số các phương pháp điện di có thể áp dụng để phân tích các isozyme Điện di gel nằm ngang là hướng thường áp dụng vì kỹ thuật nầy thường dùng trong các khảo sát quần thể và dễ làm Hai môi trường gel được dùng trong kỹ thuật là: polyacrylamide và tinh bột thuỷ phân Polyacrylamide có độ phân giải cao nhưng là chất hoá học gây độc thần kinh Vì vậy, với phương pháp nầy nên tiến hành cẩn thận Gel tinh bột không độc nhưng không được trong như gel polyacrylamide Với gel tinh bột chúng ta có thể cắt lát thành nhiều lát mõng nên nhuộm gel một lần được nhiều hệ Dịch trích thô có thể đưa ngay vào giếng bằng giấy lọc Trong thực hành, chất tinh bột có chất lượng cao là loại tinh bột do hãng Toronto sản xuất có thể đáp ứng hầu hết các trường hợp phân giải các enzyme Nếu muốn có độ phân giải tối đa, nên áp dụng thêm phương pháp isoelectric focusing gel (IEF), gel polyacrylamide gradient hay điện di hai chiều

2 Phương tiện và phương pháp

2.1 Vật liệu thực vật hay động vật

Các mô khác nhau có thể được sử dụng để điện di Đối với nụ (bud), ngọn rễ, hạt, hạt phấn và vật liệu trong ống nghiệm(in vitro) của cây trồng bậc cao việc nghiền cho đồng nhất (homogenize) và cho năng suất nồng độ enzyme đủ trong dịch trích thô là việc dễ dàng

Riêng với các vật liệu khác như mô tượng tầng (cambial tissues) hoặc lá kim (needle) cần có phương thức khác để làm đồng nhất như sau:

Hỗn hợp các mãnh mô nhỏ (< 5mm) với PVP (Polyclar AT, 25% (v/v)) không hoà tan, cẩn thận để trong ly plastic 100ml, đổ nitơ lỏng vào Nghiền với thiết bị Ultra Turrax T25/N 18 Sau khi khuấy mạnh với tốc độ cao (10-20 giây), cho nitơ lỏng bốc hơi, bảo quản bột trong -80oC

2.2 Dịch trích (extraction buffer)

0,05-0,1 M TrisHCl (pH 7,0-7,5) chứa 2-3% (w/v) polyvinylpyrrolidone

(PVP-40) hoà tan, 0,05% (v/v) 2-mercaptoethanol

2.3 Dung dịch gel và điện cực (bảng 1, các thí dụ dùng cho cây đại mộc).

2.4 Các dung dịch nhuộm các hệ enzyme được chọn lọc:

Các dung dịch gốc:

Dung dịch nhuộm: 0,08 M Tris-0,04MHCl (pH8,0)

2.5 Thành phần gel:

11% (10-12%) tinh bột Toronto

2-3% saccharose (hay 6-8M urea trong trường hợp đệm Tris-citric)

Đệm gel : 200ml cho mỗi gel 20 x 12 cm, 3 hay 4 mãnh để nhuộm khác nhau

2.6 Thiết bị cơ bản

Lò sóng viba để tạo gel nhanh

Khuôn gel (gel mould)

Thiết bị điện di với hệ thống làm lạnh

Bộ nguồn (500mA, 500V)

Thiết bị cắt gel ( 0,2-0,5 mm dây điện hay dây đờn)

Sấy gel ( tuỳ chọn)

2.7 Phương pháp

Chuẩn bị gel

1 Đun nóng 2/3 đệm gel trong lò vi sóng trong 2-3 phút

2 Khuấy tinh bột và saccharose, hay urea trong phần còn lại 1/3 của đệm gel cho đến

khi dịch huyền phù (suspension) không còn chứa vón cục

gel được cắt thành từng mãnh, mãnh phía trên không thể dùng để nhuộm)

Làm đồng nhất và cách đưa mẫu vào gel

7 Phá vở (rupture) mẫu bằng cơ học trong dịch trích bằng tay hay chày nghiền

(grinding pestle) Có thể dùng nitơ lỏng để nghiền

mẫu giấy lọc đưa vào một giếng, tránh làm lẫn tạp với giếng khác

và để luôn trong quá trình chạy gel Sửa vị trí mẫu giấy lọc cho đúng vị trí

10 Điện di

Để chạy điện di, đổ đầy chất đệm (để tiết kiệm dịch đệm để chạy nhiều lần, đệm

cực đã dùng từ hai bể chứa đệm (buffer tank) có thể hỗn hợp lại), làm bảo hoà cầu nối (vải hay giấy thấm để phía trên mặt gel, tránh bọt khí) với dịch đệm Gắn điện vào hệ thống ( 30V/cm đối với khoảng cách cầu nối 12cm), chạy gel trong vài giờ (3-5 giờ)

Bảng 2.1 Thành phần hóa chất pH dùng cho đệm điện cực, đệm gel và các hệ enzyme có

thể áp dụng

PEPCA), NDH, PER

PGM, SKDH,IDH, 6PGDH

độ với N (3-aminopropyl)- (tối thiểu)/7,0

morpholine/7,0

* Thêm 10% đệm ly trích

+ AP: alanine và leucine aminopeptidase

Bảng 2.2 Các hệ enzyme, dung dịch nhuộm và cách pha hoá chất

MgCl2, 3,3ml PMS, 0,6ml Isocitrate dehydrogenase

mide-HCl), 50mg Fast Black K

salt

pyridoxal-5'- phosphate

mg MTT

ml PMS

NAD, 3,5 mlPMS

NADP, 3,5ml MgCl2, 3,5ml PMS

NAD, 3,5ml MgCl2, 3,5 ml PMS

NADH 1.6.99.3, di,po,II

hydrogen peroxide,10,4 ml acetone

salt

3,5 ml PMS

glucose-6-Phosphate dehydrogenase, 25mg MTT, 13,5ml NADP, 3,5ml MgCl2, 3,5ml PMS

glucose-6-Phosphate dehydrogenase, 25mg MTT, 13,5 mlNADP, 3,5 ml MgCl2, 3,5ml PMS

MgCl2, 3,5ml PMS

* DIA và MNR cả hai có liên quan đến con đường hoá sinh của quinone, chúng được nhuộm với cơ chất (substrate) không chuyên biệt Để tránh nhầm lẫn trong phân loại,

ta nên nhuộm đồng thời cho cả hai hệ enzyme nầy

Các chữ viết tắt: EC = Enzyme Commission; mo = monomeric, đơn phân; di = dimeric, nhị phân; te = tetrameric; tứ phân; po = polymeric, đa phân; I, II biểu thị loại biến dưỡng (I= primary, sơ cấp; II= secondary, thứ cấp)

3 Phương pháp ước lượng tần số allele

3.1 Phương pháp ước lượng tần số allele

Tại một locus có 2 allele A và B, số kiểu gen có thể có là A/A, A/B, và B/B với số

σ(qA1) = √ qA1 (1- qA1)/2n

: σ(qAm) = √ qA1 (1- qAm)/2n

Thí dụ: locus 6 Pgd của quần thể cá green mussel ở Thailand có allele A, B, và C

Bảy quần thể được thu thập các tỉnh Trat, Rayong, Chon Buri, Samut Sakhon, Phetchaburi, Songkhla, và Phuket (Hình 2.1) được phân tích Điện di đồ của tất cả các cá thể cá được trình bày qua Hình 2.2

Tần số kiểu gen tại locus 6Pgd của 7 quần thể cá green mussel tại Thailand được

trình bày trong Bảng 2.3

26

Bảng 2.3 Tần số kiểu gen tại locus 6Pgd của 7 quần thể cá green mussel của Thailand

A/A B/B C/C A/B A/C B/C cá thể

3.2 Kiểm định sự khác biệt tần số allele

Kiểm định tính khác biệt tần số allele giữa các quần thể có thể ước lượng theo test Khi tần số allele của một quần thể là X1, sai số chuẩn là SE1, quần thể khác là X2 với sai số chuẩn là X2 Giá trị kiểm định t được tính theo công thức:

Với n đủ lớn (>30) giá trị chuẩn của t = 1,960 khác biệt ở mức ý nghĩa 5% giá trị t phải lớn hơn 1,960 và không khác biệt có ý nghĩa khi giá trị t < 0,960

Bảng 2.4 Tần số allele ở locus 6Pgd của 7 quần thể cá green mussel của Thailand.

Độ dị hợp thường được dùng để ước lượng độ biến dị di truyền trong một quần thể

Độ dị hợp được định nghĩa là tần số tương đối của số cá thể phát sinh tính dị hợp (heterogenesis) cho mỗi locus

Có hai dạng độ dị hợp la độ dị hợp quan sát (Ho) và độ dị hợp lý thuyết (He)

Độ dị hợp quan sát là trung bình số cá thể được quan sát thực tế của cá thể phát sinh tính hợp tử tại mỗi locus

Độ dị hợp tử quan sát là (Ho) được tính như sau:

Ho = Σtần số kiểu gen dị hợp tử / Σ(kiểu gen đồng hợp + kiểu gen dị hợp)

4.2 Ứơc lượng lượng độ dị hợp tử

Quá trình tính toán được dựa trên các dữ liệu thu thập cá trơn (catfish) từ các tỉnh Chiang Rai, Prachin Buri, Chachoeng Sao, Pattani và Yala (hình)

Tại tỉnh Prachin Buri, độ biến dị được tìm thấy tại các locus Gpi, Me, Mpi và Pgm

(Bảng 2.6)

Bảng 2.6 Kiểu gen của quần thể cá trơn tại tỉnh Prachin Buri

Tổng số locus được quan sát là 9

Tần số allele của 5 quần thể cá trơn được trình bày ở bảng 4 Các giá trị từ Bảng

trên ta ước lượng độ dị hợp lý thuyết ở các locus biến dị (Gpi, Me, Mpi và Pgm) theo công

Bảng 2.7 Tần số các allele của 5 quần thể cá trơn