VI SINH VẬT HỌC THÚ Y

VI SINH VẬT HỌC THÚ Y

bé gi¸o dôc vμ ®μo t¹o bé n«ng nghiÖp vμ PTNT

ViÖn Thó Y

Ph¹m quang th¸i

Nghiªn cøu chÕ t¹o vacxin nhò dÇu

tô huyÕt trïng tr©u bß tõ chñng p52

Chuyªn ngµnh : Vi sinh vËt häc thó y

M· sè: 62 42 50 10

Tãm t¾t luËn ¸n tiÕn sÜ n«ng nghiÖp

Hμ Néi - 2008

Công trình được hoμn thμnh tại Viện thú y

Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Trương Văn Dung

GS TSKH Phan Thanh Phượng

Phản biện 1: gs ts Hồ Đình Chúc

Cục Thú y Phản biện 2: pgs ts Hoàng Đạo Phấn

Cục Thú y Phản biện 3: pgs Ts Trần Đình Từ

Trường Đại học Hồng Bàng

Luận án được bảo vệ tại hội đồng chấm luận án Nhà nước

Vào hồi: 8 giờ30 ngày 23 tháng 5 năm 2008

Có thể tìm luận án tại:

- Thư viện Quốc gia

- Thư viện Thú y Quốc gia

Các công trình nghiên cứu đ∙ công bố có liên quan

1 Phạm Quang Thái (2006), “Kiểm tra độ an toàn và hiệu lực của vacxin vô hoạt phèn chua phòng bệnh tụ huyết trùng trâu

bò sản xuất theo công nghệ lên men cải tiến”, Tạp chí khoa

học kỹ thuật thú y tập VIII, số 4, trang 85-91

2 Phạm Quang Thái, Trần Xuân Hạnh, Tô Thị Phấn, Nguyễn Thiên Thu, Phạm Hào Quang, Đỗ Văn Dũng (2007), “An toàn

và hiệu lực vacxin tụ huyết trùng nhũ hoá chủng P52” Tạp chí

khoa học kỹ thuật thú y tập XIV, số 2, trang 16-23

3 Phạm Quang Thái, Trần Xuân Hạnh, Tô Thị Phấn, Nguyễn Thiên Thu, Phạm Hào Quang, Trương Văn Dung (2007), “Độ dài bảo quản và độ dài miễn dịch của vacxin tụ huyết trùng

nhũ dầu chủng P52”, Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y tập XIV,

số 5, trang 17-22.

đầu tiên được mô tả bởi Bollinger (1878) tại Đức và ở Việt Nam, bệnh

được phát hiện lần đầu tiên vào cuối thế kỷ XIX (Phan Đình Đỗ, Trịnh Văn Thịnh, 1958) Đến nay bệnh đã có mặt ở hầu hết các tỉnh thành trong cả nước và gây thiệt hại đáng kể cho chăn nuôi trâu bò

Để giảm bớt thiệt hại do bệnh THT trâu bò gây ra, việc dùng vacxin phòng bệnh là biện pháp kinh tế và hiệu quả nhất Tuy nhiên trong thực tế sử dụng vacxin hiện nay cho thấy chất lượng của vacxin còn nhiều hạn chế, do vậy việc nghiên cứu chế tạo vacxin mới có chất lượng tốt là một đòi hỏi chính đáng nhằm phục vụ tốt hơn cho công tác phòng chống dịch bệnh THT trâu bò Chúng tôi tiến hành thực

hiện đề tài: "Nghiên cứu chế tạo vacxin nhũ dầu Tụ huyết trùng

trâu bò từ chủng P52"

Mục tiêu của đề tài:

Nghiên cứu sản xuất vacxin THT nhũ dầu có chất lượng cao

để cung cấp cho người chăn nuôi, làm cơ sở tốt xây dựng một chương trình tiêm phòng vacxin hiệu quả, góp phần mang lại lợi ích cho người chăn nuôi trâu bò

Nội dung nghiên cứu bao gồm:

- Một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn P multocida chủng P52

- Nghiên cứu sản xuất vacxin và đánh giá chất lượng của vacxin

- So sánh đáp ứng miễn dịch của vacxin tụ huyết trùng trâu bò keo phèn và nhũ dầu

- Xác định độ dài bảo quản và độ dài miễn dịch của vacxin

- Thử nghiệm tiêm phòng vacxin trong thực tế sản xuất

Một số đóng góp mới của đề tài

- Nghiên cứu sản xuất được vacxin tụ huyết trùng trâu bò nhũ dầu

từ chủng P52, có chất lượng cao so với các vacxin nghiên cứu trước đây Ưu điểm của nó là vacxin có độ nhớt thấp, dễ sử dụng, nguyên vật liệu dễ kiếm và có thể sản xuất ở qui mô công nghiệp

- Là vacxin nhũ dầu tụ huyết trùng được nghiên cứu khá đầy đủ về

độ dài bảo quản và độ dài miễn dịch

Là công trình đầu tiên ở Việt Nam áp dụng thành công kỹ thuật ELISA để kiểm tra mức độ đáp ứng miễn dịch trong bệnh tụ huyết trùng và nghiên cứu đánh giá sự tương quan giữa các phương pháp dùng, kỹ thuật ELISA, PMPT và công độc trực tiếp cho bê

Cấu trúc của Luận án

Cấu trúc của luận án gồm 135 trang: Mở đầu 3 trang, Chương 1: Tổng quan tài liệu 45 trang, Chương 2: Nội dung và phương pháp nghiên cứu 17 trang, Chương 3: Kết quả và thảo luận 48 trang, Chương 4: Kết luận và đề nghị 2 trang, tài liệu tham khảo 18 trang gồm: 24 tài liệu tiếng Việt và 116 tài liệu tiếng nước ngoài và một số phụ lục Luận án có 27 bảng biểu, 1 đồ thị và 12 hình ảnh minh họa

Chương 1 Tổng quan tμi liệu

1.1 Vi khuẩn Pasteurella multocida

Vi khuẩn P.multocida được Kitt phân lập lần đầu tiên vào

năm 1879 Tới năm 1939 Rosenbusch và Merchant đề nghị tên gọi là

P.multocida (Rimler và Glisson, 1997) Vi khuẩn P.multocida

serotype B:2 và serotype E:2 được xác định gây bệnh tụ huyết trùng thể bại huyết xuất huyết cho trâu bò

Hiện nay một số loại vacxin THT trâu bò được sản xuất và sử dụng rộng rãi ở nước ta là : Vacxin tụ huyết trùng vô hoạt keo phèn chủng P52, sản xuất tại Công ty Thuốc Thú y TW-NAVETCO; vacxin

tụ huyết trùng vô hoạt keo phèn chủng 4T, sản xuất tại Xí nghiệp Thuốc Thú y TW; vacxin tụ huyết trùng vô hoạt keo phèn chủng Iran, sản xuất tại Phân viện Thú y Miền Trung Tuy nhiên trong thực tế vacxin keo phèn hoặc phèn chua vẫn tồn tại một số nhược điểm như

đáp ứng miễn dịch chưa cao, độ dài miễn dịch ngắn, phản ứng của vacxin sau khi tiêm vẫn xảy ra gây lo ngại cho người chăn nuôi

Nghiên cứu vacxin nhũ dầu tụ huyết trùng trâu bò đầu tiên

được Phan Thanh Phượng và cs (1990) thực hiện tại Việt Nam Mặc

dù thu được một số kết quả đáng khích lệ, nhưng vacxin vẫn còn một

số nhược điểm cần giải quyết như độ nhớt cao, gây phản ứng cục bộ; không chủ động được nguyên vật liệu do phải nhập từ nước ngoài và giá nguyên liệu thường cao; đặc biệt một số chỉ tiêu kỹ thuật về độ dài miễn dịch và độ dài bảo quản của vacxin chưa được nghiên cứu

đầy đủ

Trên cở sở những hiểu biết về vi khuẩn P multocida và bệnh

gây ra do vi khuẩn này ở động vật, xuất phát từ thực tế sản xuất và đòi hỏi của người chăn nuôi cần có vacxin THT trâu bò đạt chất lượng tốt, nhằm nâng cao hiệu quả cho công tác phòng chống bệnh tụ huyết trùng cho đàn trâu bò nuôi ở nước ta chúng tôi tiến hành nghiên cứu chế tạo vacxin nhũ dầu tụ huyết trùng trâu bò từ chủng P52 Đây là giống vi khuẩn đã được dùng để sản xuất vacxin tụ huyết trùng trâu

bò với chất bổ trợ là keo phèn hoặc phèn chua tại Công Ty Thuốc Thú

Y TW từ năm 1991 đến nay

Chương 2 NỘI DUNG Vμ PHƯƠNG PHáP NGHIêN CỨU

2.1 Nội dung

- Một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn P multocida chủng P52

- Nghiên cứu sản xuất vacxin và đánh giá chất lượng của vacxin

- So sánh đáp ứng miễn dịch của vacxin tụ huyết trùng trâu bò keo phèn và nhũ dầu

- Xác định độ dài bảo quản và độ dài miễn dịch của vacxin

- Thử nghiệm tiêm phòng vacxin trong thực tế sản xuất

2.2 Nguyên vật liệu, thiết bị

Vi khuẩn P multocida chủng P52 dùng để sản xuất và kiểm nghiệm vacxin Một số chủng P multocida phân lập: PKT99 và VP

250 (phân lập từ bò); VP 251 (phân lập từ trâu); HKT99, VP 247, VP

712, VP 366 và PLA2 (phân lập từ heo) và chủng vacxin FgHC dùng

để nghiên cứu so sánh Bê, thỏ, chuột bạch khỏe mạnh Các chất bổ trợ, môi trường nuôi cấy, các cặp mồi, hoá chất thuốc thử, dụng cụ, thiết bị cần thiết cho sản xuất và kiểm nghiệm vacxin

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp giám định vi khuẩn P.multocida

- Thử phản ứng lên men đường

- Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)

- Kỹ thuật REP-PCR (Repetitive Extragenic Palindromic -PCR)

2.3.3 Phương pháp đánh giá chất lượng vacxin

- Phương pháp kiểm tra tính chất và tính ổn định của vacxin nhũ dầu

- Phương pháp kiểm tra độ nhớt của vacxin

- Phương pháp kiểm tra vô trùng theo “Qui trình kỹ thuật kiểm nghiệm vacxin dùng trong thú y” TCN 162-92, 1994

- Phương pháp kiểm tra an toàn của vacxin theo “Qui trình kỹ thuật kiểm nghiệm vacxin dùng trong thú y” TCN 162-92, 1994

- Phương pháp kiểm tra hiệu lực của vacxin trên bê theo “Qui trình

kỹ thuật kiểm nghiệm vacxin dùng trong thú y” TCN 162-92,

- Phương pháp xác định độ dài bảo quản vacxin trên thỏ và bê

- Phương pháp đánh giá độ dài miễn dịch của vacxin bằng kỹ thuật

ELISA và công cường độc cho bê

2.3.4 Một số phương pháp khác

- Phương pháp lấy huyết thanh bê

- Phương pháp xác định số lượng vi khuẩn của canh trùng

Chương 3 Kết quả vμ thảo luận

3.1 Một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn P.multocida chủng

P52

3.1.1 Đặc điểm sinh hóa học của vi khuẩn

Vi khuẩn P.multocida chủng P52 không gây dung huyết,

không phát triển khi cấy trên môi trường MacConkey, phản ứng catalase, oxidase, indol, ornithine dương tính, phản ứng ure âm tính

Vi khuẩn lên men đường glucose, mannitol, sorbitol, sucrose, xylose; không lên men lactose, arabinose, dulcitol, maltose, dulcitol và

trehalose Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn P.multocida chủng P52

tương tự các chủng PKT99, VP 251 phân lập được trong các ổ dịch tụ huyết trùng trâu bò (bảng 3.1)

Bảng 3.1: Tính chất sinh hoá của vi khuẩn P multocida chủng P52

Chủng vi khuẩn Các chất

- +

-

-

-

- + + +

- +

-

- + + + +

- +

-

-

-

- + + +

- +

-

- + + + +

- +

-

-

-

- + + +

- +

-

- + + + +

- +

-

-

-

- + + +

- +

-

- + + + +

- +

-

-

-

- + + +

- +

3.1.2 Giám định vi khuẩn P multocida bằng kỹ thuật PCR

Kết quả giám định cho thấy vi khuẩn chủng P52 và các chủng khác PKT99, VP 251 đều cho kết quả dương tính với các cặp mồi PM, HSB và CAP-B (hình 3.2) Theo nghiên cứu của Townsend (1998) bất

cứ chủng vi khuẩn P.multocida nào dương tính với ba cặp mồi nêu

trên đều thuộc serotype B:2 hoặc B:2,5 Như vậy vi khuẩn

P.multocida thuộc serotype B:2 như các chủng PKT99, VP 251

3.1.3 So sánh chủng P52 và các chủng P multocida dựa trên kỹ thuật REP-PCR và SDS-PAGE

Vi khuẩn P.multocida chủng P52 cho sản phẩm REP-PCR

giống như các chủng khác dùng nghiên cứu (Hình 3.2) Sản phẩm này gồm 12 đoạn DNA với kích thước khác nhau, phân bố trong khoảng

từ 250 bp đến 3000 bp

H×nh 3.2: KÕt qu¶ PCR víi cÆp måi PM vµ CAP-B C¸c mÉu: PLA2

(Ph©n lËp tõ heo, serotype A:1); P52 (chñng vacxin); PKT99 (Ph©n lËp tõ bß, serotype B:2); VP 251 (Ph©n lËp tõ tr©u, serogroup B:2); HKT99 (Ph©n lËp tõ heo, serotype B:2); M thang DNA chuÈn (1kb DNA ladder, GeneRulerTM, MBI Fermentas)

H×nh 3.3: KÕt qu¶ REP - PCR cña chñng PCR vµ c¸c chñng vi khuÈn

P multocida serotype B:2 ph©n lËp tõ tr©u, bß, heo bÞ bÖnh THT Tõ

tr¸i qua ph¶i: (P52 - chñng vacxin; PKT99 - chñng ph©n lËp tõ bß, serotype B:2; VP 251 - chñng ph©n lËp tõ tr©u, serotype B:2; HKT99 - chñng ph©n lËp tõ heo, serotype B:2; FgHC - chñng vacxin cña heo, serotype B:2; VP 247 - chñngph©n lËp tõ heo, serotype B:2; VP 250 - chñng ph©n lËp tõ bß, serotype B:2; M- thang DNA chuÈn

Kỹ thuật điện di trên gel sodium dedocyl sulfate polyarcrylamide (SDS-PAGE) cũng chứng minh tính đồng nhất giữa

chủng P52 và các chủng vi khuẩn P.multocida thuộc serotype B:2

Kết quả trên gel cho thấy sự phân bố của các phần protein của vi

khuẩn P.multocida nằm trong dãy từ 14 kDa đến 97 kDa

3.2 Nghiên cứu chế tạo vacxin và đánh giá chất lượng của vacxin THT nhũ dầu chủng P52

3.2.1 Nghiên cứu chế tạo vacxin THT nhũ dầu

Canh khuẩn P multocida chủng P52 được sản xuất bằng phương pháp

lên men vi sinh vật Thu họach canh khuẩn sau 6 giờ nuôi cấy Trước khi làm vô hoạt, lấy mẫu canh khuẩn để kiểm tra thuần khiết, xác

định số lượng vi khuẩn và sau khi vô hoạt, canh khuẩn được kiểm tra vô trùng Dầu montanide ISA 50 của hãng SEPTIC hay hỗn hợp dầu gồm span 80, polysorbate 80 và dầu khoáng trộn với tỷ lệ thích hợp

được chuẩn bị trong thùng inox và tiệt trùng ở 121oC trong 20 phút Các loại dầu trên sau đó được phối trộn với canh khuẩn theo tỷ lệ hợp

lý phụ thuộc vào loại dầu dùng, trong điều kiện khuấy liên tục với tốc

độ 2.000 vòng/phút Nếu dùng MontanideTM ISA 50, tỷ lệ phối hợp là 50/50, còn khi dùng span 80, polysorbate 80 và dầu khoáng, tỷ lệ là 2/1 Số lượng vi khuẩn trong một ml vacxin phải chứa ít nhất 10x109

CFU Bằng phương pháp này chúng tôi đã sản xuất được 5 lô vac xin nhũ dầu, với số lô 1(a) (dùng montanide 50), 1(b), 2, 3 và 4 (dùng hỗn hợp dầu khoáng) Các lô vacxin này được kiểm tra vô trùng và tất cả

đều đạt yêu cầu để làm các thí nghiệm tiếp theo

Điểm mới trong sản xuất vacxin của chúng tôi so với các nghiên cứu trước là sử dụng span 80, polysorbate 80 được làm chất tạo nhũ khi phối hợp cùng với dầu khoáng và canh khuẩn Đây là những nguyên liệu dễ kiếm nên rất chủ động cho sản xuất và giá thành cũng rẻ hơn với nguyên liệu dùng trong các nghiên cứu trước

đây Thứ hai: Chủng dùng để chế tạo vacxin là chủng P52, có nguồn gốc từ Viện thú y Izatnagar của ấn Độ, do chuyên gia FAO chuyển giao cho Công ty NAVETCO Giống ổn định và đã được sử dụng sản xuất vacxin THT trâu bò keo phèn trong thời gian dài (từ 1991 đến 2007)

3.2.2 Kiểm tra chất lượng của vacxin THT nhũ dầu chủng P52

3.2.2.1 Tính ổn định của vac xin nhũ dầu

Để kiểm tra tính chất của nhũ dầu và tính ổn định của vacxin nhũ dầu do chúng tôi sử dụng các phương pháp: nhỏ vào nước lạnh,

để ở các nhiệt độ khác nhau, ly tâm, đo tốc độ chảy của vacxin

Bảng 3.2 Kết quả kiểm tra tính chất và tính ổn định của vacxin

nhũ dầu Nhiệt độ thử * Lô

Ly tâm

Ghi chú: *Thời gian theo dõi 14 ngày KTĐ: Không nhận thấy có sự

thay đổi TLD: tách lớp dầu

Kết quả ở (bảng 3.2) cho thấy vacxin khi thử ở các nhiệt độ khác nhau 2-8oC, 25-28oC và 37oC trong vòng 14 ngày, không có những thay đổi về mặt vật lý Theo tiêu chuẩn của hãng Seppic (Pháp) thì sự tách lớp dầu trên bề mặt vacxin cho phép <10% và trong thời gian bảo quản chấp nhận dưới đáy của bình có một lớp cặn (theo Emulsification process designed for MontanideTM ISA) So với tiêu

chuẩn của Công ty sản xuất chế phẩm sinh học Harbin và Nhà máy sản xuất vacxin tại Chengdu, CAHIC Trung Quốc thì các lô vacxin

do chúng tôi sản xuất cũng đạt tính ổn định

3.2.2.2 Kiểm tra an toàn của vacxin nhũ dầu THT chủng P52

Chỉ tiêu an toàn là một trong những chỉ tiêu quan trọng khi

đánh giá chất lượng của vacxin An toàn của vacxin được kiểm tra trên thỏ liều 2ml Theo dõi trong mười ngày Tất cả thỏ thí nghiệm đều không có bất cứ phản ứng bất thường nào Thỏ sống khỏe mạnh và phát triển bình thường (bảng 3.3)

Bảng 3.3: Kết quả kiểm tra an toàn vacxin nhũ dầu THT trâu bò

chủng P52 trên thỏ Lô

vacxin

Số lượng

(con)

Đường tiêm

Liều tiêm (ml/con)

Kết quả số sống/số TN

Ghi chú: dd dưới da; số sống/số thí nghiệm

Song song với kiểm tra an toàn trên thỏ, chúng tôi cũng tiến hành

kiểm tra an toàn trên bê đối với các lô vacxin 1(b), 2 và 4

Bảng 3.4: Kết quả kiểm tra an toàn của vacxin nhũ dầu

THT trâu bò chủng P52 trên bê Lô

vacxin

Số lượng

(con)

Đường tiêm

Liều tiêm (ml)

Kết quả số sống/số TN

Tiêm cho bê với liều 4,0ml/con Sau 10 ngày theo dõi thấy tất cả các

bê đều không bị chết, không có biểu hiện phản ứng phụ Bê ăn uống

và hoạt động bình thường Kết quả kiểm tra an toàn trong sản xuất với 36 bê của lô vacxin 4, liều 2,0ml/con cũng cho thấy vacxin an

toàn

3.2.2.3 Kiểm tra hiệu lực của vacxin THT nhũ dầu chủng P52

Hiệu lực của vacxin được kiểm tra theo “Qui trình kỹ thuật kiểm nghiệm vacxin dùng trong thú y” TCN 162-92, 1994

Bảng 3.5: Kết quả kiểm tra hiệu lực của vacxin nhũ dầu THT

Liều vacxin (ml)

Liều công (MLD)

Sống/tổng

số công

Kết quả

Ghi chú: MD: Miễn dịch; ĐC: Đối chứng; dd: dưới da

Tiêm vacxin cho thỏ với liều 1,0 ml/con, sau 21 ngày công

cường độc bằng vi khuẩn P.multocida chủng P52 Kết quả cho thấy

tất cả các lô kiểm tra trên thỏ đều đạt tiêu chuẩn hiệu lực, với tỷ lệ bảo

hộ 100% và 100% thỏ đối chứng chết trong vòng 18-24 giờ sau khi công (bảng 3.5) Thậm chí thỏ được miễn dịch với liều thấp hơn 0.5ml/con (lô vacxin 4), 75% thỏ miễn dịch cũng được bảo hộ, trong khi 100% thỏ đối chứng chết

Kết quả kiểm nghiệm vacxin trên bê cũng cho thấy vacxin có khả năng bảo hộ tốt, tất cả bê miễn dịch đều sống, trong khi 100% bê