DI TRUYỀN HỌC CHỌN GIỐNG VI SINH VẬT

DI TRUYỀN HỌC CHỌN GIỐNG VI SINH VẬT

TiÓu luËn

Di truyÒn häc chän gièng vi sinh vËt

“phage vµ vai trß cña phage trong viÖc

t¹o vector t¸ch dßng”

GV – TS: NuyÔn Hång V©n

Hä tªn SV: TrÞnh KÕ Thi

Vi sinh vật chọn giốngCông nghệ sinh học hiện đại (công nghệ gen) tuy ra đời muộn nhng những thành tựu của ngành khoa học thực nghiệm này đã đóng góp vai trò rất to lớn trong sự sống còn của loài ngời CNSH liên quan trực tiếp đến những vấn đề thiết thực nhát của sự sống nh: lơng thực, thực phẩm, thuốc chữa bệnh, y học, xử lí môi trờng … Khi nghiên cứu về công nghệ sinh học hiện đại ta không Khi nghiên cứu về công nghệ sinh học hiện đại ta không thể không đề cập đến công nghệ chuyển gen, ghép gen, một trong số những phơng pháp ghép gen hiệu quả và phổ biến đó là phơng pháp tạo vector tách dòng nhờ thể

thực khuẩn (phage) Sau đâu tôi xin trình bày sơ lợc một số vấn đề về “phage và

vai trò của phage trong việc tạo vector tách dòng”

I Phage và các cơ chế sinh sản của phage

1) Thế nào là thực khuẩn thể

Thực khuẩn thể (phage) là một thể “ăn” vi khuẩn, hay nói cho đúng: là virus của vi khuẩn, nó có thể gây bệnh và tiêu diệt vi khuẩn Thực khuẩn thể không phải là phát hiện mới Nó đã đợc biết đến từ lâu do Twort phát hiện đầu tiên và

2 năm sau (1917) đợc d’He’relle nghiên cứu kỹ Từ nhiều công trình nghiên cứu và thực nghiệm d’He’relle nhận xét: nguyên nhân của hiện tợng thực khuẩn thể là một loại vi sinh vật rất nhỏ, có khả năng gây bệnh cho vi khuẩn với triệu chứng chính là dung giải Sau đó, càng ngày càng tìm ra nhiều loại thực khuẩn thể khác nhau tơng ứng với từng loại vi khuẩn nh: phẩy khuẩn tả, thực khuẩn thơng hàn, dịch hạch, các tụ cầu khuẩn, liên cầu, Brucella, Mycobacteria Về bản chất đó là sự tan vỡ của tế bào vi khuẩn, do tác dụng của một loại thực khuẩn thể tơng ứng Thí dụ trong môi trờng lỏng đã có vi khuẩn phát triển, nếu ngời ta cho vào đấy thực khuẩn thể tơng ứng, thì môi trờng trớc kia đục ngầu vì

có vi khuẩn sẽ trở thành trong suốt sau vài giờ Trên bề mặt môi trờng thạch

đặc vừa mới cấy vi khuẩn, ngời ta rỏ một giọt thực khuẩn thể tơng ứng vào một

điểm, thì sau một thời gian để ở tủ ấm 370C, chỗ đã rỏ giọt thực khuẩn thể sẽ trơ thạch ra, còn ở bề mặt còn lại vi khuẩn mọc kín hết

Nhà văn Sinclair Lewis là ngời đầu tiên đã nói về liệu pháp thực khuẩn thể chữa bệnh nhiễm trùng, trong cuốn tiểu thuyết mang tên Arrowsmith xuất bản vào năm 1925 của ông Các nớc Đông Âu và Liên Xô cũ, trong nhiều thập kỷ

đã ứng dụng liệu pháp thực khuẩn thể vào điều trị có hiệu quả cao, nhng chỉ

đ-ợc ít ngời biết đến Đặc biệt là sự xuất hiện của nhiều loại thuốc kháng sinh với những thắng lợi rực rỡ của nó, đợc coi là sử dụng đơn giản và hiệu quả, thực khuẩn thể hầu nh đã bị mọi ngời lãng quên

2) Cơ chế hoạt động của thực khuẩn thể

Hiện tợng thực khuẩn thể nói chung rất đặc hiệu, giống nh chìa nào chỉ mở

đợc ổ khóa ấy - một chuẩn vi khuẩn chỉ bị một thực khuẩn thể tơng ứng làm tan

vỡ mà thôi Cấu tạo hóa học chủ yếu của thực khuẩn thể là AND và protein Nó

có cấu tạo kháng nguyên đặc hiệu và riêng cho từng loại một Thực khuẩn thể chỉ có thể nhân lên khi ký sinh vào các tế bào vi khuẩn Trớc tiên thực khuẩn thể bám vào các tế bào vi khuẩn bằng bề mặt ở cuối đuôi, màng vi khuẩn sẽ bị thủy phân và AND chứa trong đầu thực khuẩn thể đợc bơm vào trong tế bào vi khuẩn Việc tổng hợp AND, ARN và protein của vi khuẩn bị đình chỉ ngay tức khắc, nhng việc tổng hợp AND và protein và thực khuẩn thể bắt đầu Các thí nghiệm về hóa học sinh vật đã cho thấy rằng các khả năng tổng hợp của tế bào

vi khuẩn vẫn đợc giữ nguyên vẹn ở mức độ vừa đủ để duy trì sự tồn tại và cung cấp năng lợng cho các hoạt động tế bào, nhng việc kiểm soát cái gì sẽ đợc tổng hợp ra bây giờ dới quyền hớng dẫn bởi AND của thực khuẩn thể, dẫn tới sự nhân lên của các thành phần đơn vị dới thực khuẩn thể, rồi cuối cùng chúng tự

nó Các thực khuẩn thể vừa đợc giải phóng lại tìm đến ký sinh vào tế bào vi khuẩn khác và lại tiếp tục xảy ra một loạt các quá trình nh nói trên, vi khuẩn mới lại bị hủy diệt

3) Các phơng thức sinh sản của phage

Gồm 2 dạng cơ bản là chu trình sinh tan (Lytic cycle) và chu trình tiềm tan (Lysogenic cycle)

3.1 Chu trình sinh tan

- Phage sinh tan là những phage luôn làm tan tế bào vi khuẩn khi chúng xâm nhập VK này, Ví dụ: phage

T2, T4

- Phage độc xâm nhập vi

khuẩn, sử dụng nguyên liệu của

tế bào vi khuẩn để tái bản ADN

của chúng, tạo vỏ protein rồi

phá vỡ tế bào vi khuẩn và giải

phóng ra các phage con Các

phage tạo thành tiếp tục xâm

nhiễm các tế bào vi khuẩn liền

kề

Sơ đồ: Khái quát hóa chu trình sinh tan của phage

- Tái tổ hợp di truyền trong chu trình sinh tan Hai phage có kiểu gen khác nhau cùng xâm nhiễm một tế bào vi khuẩn, chúng có thể tái tổ hợp với nhau tạo ra phage con có kiểu hình tái tổ hợp

Tần số tái tổ hợp: = Số l ượng phage t áitổ hợp

Số phage con x 100

VD: Hai thể đột biến phage T4 cùng xâm nhiễm E coli: một dạng là tạo vết tan đục, rộng, dạng kia là tạo vết tan sáng, nhỏ Sau một chu trình sinh tan,

chúng có thể tạo ra các phage con có kiểu hình mới: tạo vết tan đục, nhỏ

hoặc tạo vết tan sáng, rộng

Ngời ta cũng có thể lập bản đồ di truyền cho phage bằng Lây nhiễm kép E

coli bởi hai phage (Hình bên)

Thu đợc các dạng vết tan phage thế hệ sau từ phép lai h#r+ # h+r#

Trong lây nhiễm kép, genom của 2

phage đã tái tổ hợp và diễn ra sự trao

đổ chéo với nhau dẫn đến hiện tợng

hoán vị gen Tần số các kiểu hình hoán vị sẽ xác định khoảng cách tơng đối của các gen trên ARN phage

3.2 Chu trình tiềm tan

- Phage sau khi xâm nhiễm vào tế bào vi khuẩn chủ ADN của phage lồng ghép với ADN NST vi khuẩn và không phá vỡ tế bào vi khuẩn (thể tiềm tan), còn ADN phage nằm trên NST vi khuẩn đợc gọi là prophage

- Thể tiềm tan phân bào tạo thành các thể tiềm tan con

- Nếu môi trờng thuận lợi, prophage có thể đợc hoạt hóa, tách khỏi NST vi khuẩn và tạo vỏ bọc protein rồi bắt đầu chu trình sinh tan, phá vỡ tế bào chủ, giải phóng các phage con (Chu kỳ phage tiềm tan đối với tế bào chủ)

Cơ chế tái tổ hợp vật chất di truyền của phage: Lồng ghép ADN

phage với NST vi khuẩn

ở phage #, ADN có dạng mạch thẳng với hai đầu có trình tự bổ trợ nhau (là các đầu dính), có thể tạo thành dạng vòng

ADN phage và ADN vi khuẩn có chứa vị trí đặc thù gọi là vị trí đính

(attachment site - att #) Tại vị trí đính, ADN vòng cuả phage và ADN vi

khuẩn đính vào nhau, sau đó đứt nối và xảy ra quá trình trao đổi chéo để tạo ra NST lồng ghép, với sự tham gia của enzyme đặc hiệu (int) xúc tác

4.1 Tải nạp chung:

- Tải nạp chung là sự tải nạp trong đó bất kỳ gen nào của thể cho cũng có thể đợc truyền sang thể nhận bởi phage

VD: Phage T1 xâm nhiễm E coli là một phage tải nạp chung

- Bất kì gen nào của vi khuẩn cũng đều đợc tải nạp

- Tải nạp có đợc là do gói nhầm DNA của tế bào chủ khi phage trởng thành (1-2% genome TB chủ)

Cơ chế tải nạp chung

- Phage T1 tạo ra enzyme nuclease cắt ADN vi khuẩn thành các đoạn có

kích thớc tơng đơng với ADN phage

- Hình thành hạt tải nạp chứa các đoạn cắt ngẫu nhiên từ NST vi khuẩn,

- Hạt tải nạp xâm nhiễm tế bào vi khuẩn E coli khác, chúng có thể trao đổi chéo tại các đoạn tơng đồng với NST vi khuẩn nhận

4.2 Tải nạp đặc hiệu

- Là hiện tợng tải nạp trong đó phage chỉ có thể truyền một số gen nhất định

từ vi khuẩn cho sang vi khuẩn nhận

- Tải nạp đặc hiệu xảy ra do phage tiềm tan vi khuẩn chủ, ADN của nó xen vào NST vi khuẩn chủ tại vị trí đặc thù

- Những gen đợc chuyển nằm gần chỗ phage gắn vào

- Thờng ở prophage # thực hiện

- Do kết quả sự cắt sai của phage khi tách khỏi nhiễm sắc thể của tế bào chủ

Cơ chế tải nạp đặc hiệu

- Trong điều kiện cụ thể, ở các tế bào tiềm tan, sự sinh tan bắt đầu

- ADN phage tách khỏi NST vi khuẩn có thể tại vị trí khác với điểm đính, tạo ra ADN phage chứa một số gen nào đó của vi khuẩn

- Khi xâm nhiễm tế bào vi khuẩn khác, phage mang gen vi khuẩn có thể gây

ra sự trao đổi chéo ở các đoạn tơng đồng

II Vai trò của phage trong việc tạo vector tách dòng gen

1 Thế nào là vector chuyển gen.

Để chuyển gen từ sinh vật này sang sinh vật khác có thể đợc thực hiện bằng biến nạp AND hoặc bơm thẳng AND vào tế bào Tuy nhiên, bằng cách đơn giản này hiệu quả thấp vì phần lớn ADN lạ x/nhập vào TB sẽ bị phân hủy, ADN ko TTH thì ko thể tự sao chép thành nhiều bản Do đó nó sẽ mất dần Vì vậy cần pải có các vector để vận chuyển gen Vector chuyển gen là p/tử ADN có k/n tự tái sinh, tồn tại độc lập trong TB và mang đc gen cần thiết

Vector chuyển gen pải thỏa mãn các yêu cầu tối thiểu sau:

- Có trình tự khởi sự sao chép (Ori) để tự sao chép mà tồn tại độc lập

- Có các trình tự nhận biết cho E gới hạn cắt rồi để hở tạo nơi lắp ráp các đoạn gen lạ Các trình tự nhận biết này pải xa trình tự khởi sự sao chép

để tránh bị cắt nhầm

- Có trình tự điều hòa (promoter) tạo thuận lợi cho sự phiên mã gen lạ

- Có các gen đánh dấu để dễ dàng phát hiện các gen lạ trong q.trình chọn lọc TB mang gen TTH Thông thờng các vector chuyển gen có gen khác chất kháng sinh hoặc gen tổng hợp chất màu để dễ dàng phát hiện trên môi trờng thạch

- Vertor chuyển gen pải càng nhỏ càng tốt

- Chứa 1 số trình tự nhận biết để dễ dàng trong quá trình dịch mã (trình tự đặc biệt cần thiết cho sự biểu hiện gen)

=>Vertor chuyển gen trong kt dt : plasmid, cosmid, phagemid, NST nhân tạo nấm men, Ti-plasmid

Có nhiều loại vector chuyển gen nh các loại plasmid, cosmid phage Việc sử dụng phage có nhiều u điểm hơn

- Phage đc trang bị 1 hệ thống xâm nhập vào TB VK và có khả năng sinh sôi rất nhanh vì vậy hiệu quả xâm nhiễm của phage cao hơn nhiều so vơi plasmid

- Kích thớc đoạn gen lạ mà vector phage mag đợc lớn hơn rất nhiều so vơi plasmid Phage có thể tiếp nhận gen lạ có kích thớc đến 30kb

Hiện nay có 2 loại phage thờng đợc sử dụng cho mục đích chuyển

gen là: # (có ADN mạch kép kích thớc 18502bp) và M13.

2 Các bớc tạo vector tách dòng.

- Tách lập các DNA lạ cần tạo dòng: Chọn và cắt DNA lạ của tế bào cho bằng một enzyme cắt hạn chế (RE) Phân lập đoạn DNA (gen quí) phù hợp với vector và mục đích cần tạo dòng Tạo đầu dính khi cần thiết

- Chọn và xử lí vector: Chọn vector cần phải chú ý những yêu cầu sau: độ lớn của gen lạ (đoạn cài), loại tế bào chủ tiếp nhận vector và phơng pháp ứng dụng Xử lí vector: cắt vector bằng enzyme cắt hạn chế cùng loại với enzyme đã cắt DNA nói trên (để tạo những vết cắt giống nhau, thuận tiện cho việc nối ghép sau này) Khử nhóm phosphat bằng enzyme alkanline phosphotase để tránh hai đầu vector đóng kín trở lại

- Tạo DNA tái tổ hợp (Vector tái tổ hợp): Việc tạo DNA tái tổ hợp bằng cách ghép DNA lạ vào vector đã đợc cắt cùng một enzyme cắt hạn chế loại

II, khi đó, chúng sẽ ghép đôi những đầu dính lại với nhau nhờ bắt cặp bổ sung Một phản ứng ghép nối xảy ra với sự có mặt của enzyme DNA ligase của phage

- Chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ bằng phơng pháp tải nạp Công

chất di truyền trực tiếp từ tế bào thể cho D (Doner) sang tế bào thể nhận R (Reception) qua nhân tố trung gian là virus Tải nạp đợc thực hiện với vector chuyển gen có nguồn gốc là virus nh phage, cosmid, … Khi nghiên cứu về công nghệ sinh học hiện đại ta không

- Phát hiện dòng cần tìm Công việc tiếp theo là kiểm tra sự hiện diện của gen mong muốn Việc chọn lựa những chủng nh ý muốn là không đơn giản, vì cách tiến hành thí nghiệm trong một hỗn hợp không đồng nhất nên các dòng vi khuẩn có thể mọc lên theo ba khả năng:

+ Tế bào vi khuẩn không nhận plasmid tái tổ hợp, + Tế bào nhận plasmid nhng không có gen lạ

+ Tế bào vi khuẩn nhận đợc plasmid tái tổ hợp

Tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu mà ngời ta có các phơng pháp khác nhau để xác định dòng cần tìm Nếu mục đích là nghiên cứu đoạn gen cha biết, ngời ta thờng dùng đầu dò Nếu đoạn DNA đã biết (cDNA), công việc sẽ đơn giản và nhanh chóng

- Kiểm tra và thu nhận sản phẩm của gen tái tổ hợp

Tùy từng trờng hợp cụ thể mà ngời nghiên cứu đa ra những phơng pháp kiểm tra thu hồi sản phẩm của gen tái tổ hợp

3 Kết luận về vai trò của phage trong việc tạo vector tách dòng

Nhờ cơ chế tải nạp của phage ngời ta đã sử dụng nó nh một vật vận chuyển gen (vector) một cách tự nhiên Bằng nhiều phơng pháp sinh hoá mà ngời ta có thể chuyển vào hệ gen của phage những gen mong muốn, các gen này đợc truyền cho tế bào chủ với những mục dích khác nhau, nh; đẻ tạo ngân hàng gen (cDNA) hoặc để cấy ghép gen cho các sinh vật khác để các sinh vật này giúp biểu hiện những gen mong muốn, tạo sản phẩm cho con ngời Ví dụ nh: sản xuất vacxin, thuốc, nhiều loại axit amin khác … Khi nghiên cứu về công nghệ sinh học hiện đại ta không

Tóm lại, việc ứng dụng phage trong việc tạo vector tách dòng là bớc phát triển rất quan trọng trong công nghệ sinh học

Hng Yên , ngày 25 tháng 2 năm 2011