Nghiên cứu sản xuất igg KHÁNG DỊCH HẠCH

Trong những năm qua để chẩn đoán labo và điều tra giám sát dịch tễ học dịch hạch ngoài thực địa, hầu như tất cả các labo trong nước đều sử dụng các chế phẩm chẩn đoán dựa trên các bộ kít

Luận văn này được hoàn thành tại: Phân xưởng Vắc xin thành phẩm – Công ty Vắc xin Pasteur Đà Lạt

Người hướng dẫn khoa học: TS PHAN BỔN

Vào lúc: …… giờ, ngày……… tháng………năm 2010

Có thể tìm hiểu luận văn tại thư viện Đại học Đà Lạt

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:

 Ban giám hiệu và các thầy cô giáo Khoa Sau đại học - trường Đại học Đà Lạt đã tạo điều kiện cho tôi học tập, truyền đạt cho tôi những kiến thức bổ

ích trong suốt thời gian học tập tại trường

 Tiến sĩ Phan Bổn, Quản đốc phân xưởng Vắc xin thành phẩm, là người thầy đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt cho tôi những kiến thức, kinh

nghiệm trong suốt quá trình thực hiện đề tài

 Ban giám đốc Công ty Vắc xin Pasteur Đà Lạt đã cho phép và tạo điều

kiện cơ sở vật chất để tôi thực hiện đề tài

 TS Nguyễn Xuân Tùng đã tận tình giúp đỡ, cung cấp cho tôi một số tài

liệu để tôi hoàn thành luận văn

 Các anh chị cùng các cô kĩ thuật viên của phân xưởng Vắc xin thành phẩm

đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện

đề tài

 CN Trần Ngọc Nhơn, CN Đặng Hồng Vân Viện Vắc xin và Sinh phẩm y

tế Nha Trang đã tận tình giúp đỡ tôi thực hiện một số kĩ thuật trong phòng

thí nghiệm để tôi hoàn thành đề tài

 Thầy Nguyễn Văn Chức, cán bộ thư viện trường Đại học Đà Lạt đã nhiệt

tình giúp tôi tìm kiếm thông tin, tài liệu để tôi thực hiện đề tài

 Gia đình, bạn bè đã giúp đỡ và động viên tinh thần cho tôi trong suốt quá

trình học tập và thực hiện luận văn

Học viên: Nguyễn Thị Loan

ĐẶT VẤN ĐỀ

Dịch hạch là một bệnh truyền nhiễm tối nguy hiểm do Yersinia pestis gây ra

Bệnh lây truyền từ động vật sang người qua trung gian truyền bệnh là bọ chét Bệnh

đã được biết từ thời xa xưa và đã gây ra 3 vụ đại dịch lớn vào các thế kỉ XI, XIV và XIX với hàng trăm triệu người tử vong Tuy đã được phát hiện từ lâu nhưng hiện nay các ổ dịch thiên nhiên vẫn còn tồn tại và đang hoạt động trong nhiều khu vực trên trái đất Trong gần nửa thế kỉ qua có 7 quốc gia trên thế giới bệnh xảy ra hàng năm là Brazil, Cộng hòa Dân chủ Công Gô, Madagascar, Myanma, Pêru, Hoa Kì và Việt Nam [6,23,50]

Hiện nay bệnh dịch hạch vẫn còn tồn tại ở nhiều khu vực trên thế giới, đặc biệt

là ở Châu Phi Gần đây nhất tháng 08/2009 ở Trung Quốc dịch hạch thể phổi đã xuất hiện làm 3 người thiệt mạng, 12 người bị nhiễm bệnh và hơn 10.000 người bị cách ly [57]

Ở Việt Nam, dịch hạch đã xuất hiện lần đầu tiên ở Nha Trang ( 1898 ) và Sài Gòn (1906) Kể từ khi xuất hiện, dịch hạch tiếp tục lây lan ra các tỉnh, thành trong cả nước và trở thành dịch lưu hành địa phương Khu vực miền Trung, Tây Nguyên và Đông Nam Bộ là những nơi có tỉ lệ mắc dịch hạch cao nhất trong cả nước Đặc biệt

là giai đoạn 1966 – 1972 dịch lớn xảy ra ở Việt Nam chiếm hầu hết số mắc trên thế giới Số mắc và tử vong dịch hạch có chiều hướng giảm mạnh và phạm vi dịch hạch lưu hành thu hẹp nhiều Trong bốn năm từ 1999 – 2002 dịch chỉ còn ghi nhận tại một

số địa phương là hai tỉnh Đắc Lắc và Gia Lai Hiện nay, ở Việt Nam bệnh dịch hạch

đã được kiểm soát, chỉ còn tồn tại ở các ổ dịch trong thiên nhiên trong các loài gặm nhấm, không còn xuất hiện ở người và chủ yếu là ở Tây Nguyên [5, 6, 16]

Tuy dịch hạch đã được kiểm soát nhưng công tác điều tra giám sát dịch tễ học vẫn phải được tiến hành thường xuyên bởi dịch có thể xuất hiện bất cứ khi nào gặp điều kiện thuận lợi và gây ảnh hưởng to lớn đến cuộc sống của con người Điển hình

là dịch hạch thể phổi đã bùng phát ở Trung Quốc tháng 08 vừa qua cho thấy công tác

điều tra giám sát dịch tễ học dịch hạch không thể chủ quan Vì vậy để phát hiện sớm dịch hạch trong các vật chủ ở các ổ dịch hiện nay thì đòi hỏi phải có phương pháp chẩn đoán nhanh và chính xác

Trong những năm qua để chẩn đoán labo và điều tra giám sát dịch tễ học dịch hạch ngoài thực địa, hầu như tất cả các labo trong nước đều sử dụng các chế phẩm chẩn đoán dựa trên các bộ kít chẩn đoán dịch hạch của Liên Xô cũ là bộ kít kháng nguyên F1 gắn hồng cầu cừu đông khô và kháng thể F1 gắn hồng cầu cừu dạng đông khô hoặc dạng nước, nguồn cung cấp này ngày càng ít đi và hầu như không còn Hiện nay nhiều nước trên thế giới đã dùng kít chẩn đoán kháng thể gắn huỳnh quang để phát hiện kháng nguyên F1 đặc hiệu của vi khuẩn dịch hạch, đây là phương pháp chẩn đoán cho kết quả chỉ sau vài giờ và độ chính xác lên tới 98 – 99,4% Tuy vậy ở Việt Nam chưa có labo nào sản xuất bộ kít chẩn đoán kháng thể gắn huỳnh quang để phát hiện vi khuẩn dịch hạch, vì thế để có nguồn nguyên liệu IgG sản xuất kít chẩn đoán kháng thể gắn huỳnh quang đáp ứng nhu cầu giám sát dịch tễ học dịch hạch trong nước, chúng tôi tiến hành đề tài sau:

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT IgG KHÁNG DỊCH HẠCH

Mục tiêu đề tài:

- Sản xuất IgG kháng dịch hạch

- Đánh giá chất lượng IgG sản xuất được

Các nội dung đề tài cần tiến hành:

- Nghiên cứu ảnh hưởng của kháng nguyên đến đáp ứng miễn dịch

- Nghiên cứu phát đồ gây miễn dịch

- Ứng dụng các phương pháp tinh chế kháng thể IgG

- Đánh giá các chỉ tiêu chất lượng IgG sản xuất

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 DỊCH HẠCH

1.1.1 Tình hình dịch hạch trên thế giới [ 6, 20, 23, 57]

Vào năm 1894, Alexandre Yersin đã phát hiện ra vi khuẩn Yersinia pestis là

tác nhân gây ra bệnh dịch hạch Kể từ khi xuất hiện, dịch hạch đã gây ra các vụ đại dịch lớn trên thế giới

Đại dịch lần thứ I xảy ra ở Trung Phi ở thế kỉ VI sau đó lan đến Hy Lạp và Địa Trung Hải đã làm cho 100 triệu người chết

Đại dịch lần thứ II xuất hiện ở Trung Á quanh biển Caspies vào thế kỉ thứ XIV sau đó xâm nhập vào Châu Âu, làm chết khoảng 50 triệu người trên thế giới, trong đó một nửa số nạn nhân là ở Châu Âu chiếm 1/3 dân số Châu Âu thời kì đó

Đại dịch lần thứ III bắt đầu từ Yunnan Trung Quốc lan đến Hồng Kông (1894) Trong vòng 10 năm ( 1894 – 1903 ) dịch đã lan đến 77 thành phố cảng trên khắp 5 châu

Từ 1954 – 2001, tổ chức Y tế thế giới đã ghi nhận có 38 quốc gia xảy ra bệnh dịch hạch với tổng số mắc là 89.651 trường hợp và 7.715 bệnh nhân chết

Từ 1989 – 2003, bệnh dịch hạch có chiều hướng gia tăng, đặc biệt là ở Châu Phi với số mắc là 31.273 trường hợp, chiếm tỉ lệ 82,5% tổng số mắc trên thế giới và

số chết là 2.421, chiếm tỉ lệ 7,74%

Theo phát hiện mới nhất tháng 08/2009 tại thành phố Ziketan, tỉnh Thanh Hải, tây bắc Trung Quốc dịch hạch thể phổi đã bùng phát làm 3 người chết và 12 người bị nhiễm bệnh, 10.000 người đã bị cách ly để ngăn chặn dịch

Sau nhiều năm im lặng, việc xuất hiện lại bệnh dịch hạch trên người ở Ấn Độ

1994, ở Algeria vào năm 2003 và gần đây nhất là năm 2009 ở Trung Quốc đã cho

thấy rằng bệnh dịch hạch chưa được loại trừ hoàn toàn và là bệnh nguy hiểm có nguy

cơ bùng phát bất cứ khi nào gặp điều kiện thuận lợi

1.1.2 Tình hình dịch hạch ở Việt Nam [ 5, 6, 16 ]

Từ đại dịch lần thứ III ở Hồng Kông, dịch hạch đã xâm nhập vào Việt Nam lần đầu tiên năm 1898 Trong suốt hơn một thế kỉ qua dịch hạch vẫn luôn tồn tại với những thời kì khác nhau và chưa được loại trừ hoàn toàn

Thời kì xâm nhập và lây lan nội địa ( 1898 – 1922 )

Xuất hiện lần đầu tiên tại Nha Trang ( 1898 ) dịch hạch tiếp tục lưu hành ở Sài Gòn ( 1906 ); Lạng Sơn ( 1909 ); Sóc Trăng ( 1907 ); Hà Nội, Phan Thiết và Huế (1908); Phan Rí , Đà Nẵng ( 1910 )

Thời kì lắng dịu và trở thành dịch hạch lưu hành tại địa phương ( 1923 –

1990 ) Thời kì này bệnh chỉ còn lưu hành ở một số tỉnh như: Phan Thiết, Sài Gòn Từ hai nơi này có một số thời điểm dịch lan rộng như Lâm Đồng ( 1947, 1948, 1950 ), Bình Long và Tây Ninh ( 1955 – 1956)

Thời kì bùng phát lan tràn và lưu hành trên diện rộng ( 1961 – 1990) + 1961 – 1975: dịch hạch bùng phát, lan tràn hầu hết các tỉnh thành ở miền Nam Đặc biệt giai đoạn 1967 – 1971 dịch lớn xảy ra ở Việt Nam với số mắc là 21.716 bệnh nhân, chiếm 97,2% số mắc ở Châu Á và 89,2% số mắc trên toàn thế giới

+ 1976 – 1990: dịch lây lan trên diện rộng ở các tỉnh phía bắc như Hà Nội, Hải Phòng, Bắc Thái, Hà Sơn Bình, Hải Hưng, Hà Nam Ninh, Thanh Hóa và Nghệ Tĩnh

Thời kì thu hẹp và lưu hành dai dẳng tại một số ổ dịch ( từ 1991 đến nay )

Từ 1991 đến nay dịch hạch ở nước ta có xu hướng giảm xuống nhưng vẫn còn tồn tại ở một số tỉnh miền Trung, Đông Nam Bộ, nhiều nhất là ở các tỉnh Tây

Nguyên Trong 4 năm ( 1999 – 2002 ) dịch chỉ còn ghi nhận tại 2 tỉnh Đắc Lắc với

194 bệnh nhân và Gia Lai 61 bệnh nhân

Nhìn chung, tình hình dịch hạch ở Việt Nam hiện nay đã được khống chế Tuy nhiên vẫn tồn tại một số ổ dịch lẻ tẻ trong tự nhiên, chủ yếu là trên loài động vật gặm nhấm Do đó công tác chẩn đoán huyết thanh và điều tra giám sát dịch tễ học vẫn cần tiến hành thường xuyên

1.2 ĐẶC ĐIỂM CỦA VI KHUẨN DỊCH HẠCH

1.2.1 Phân loại vi khuẩn dịch hạch

Tại hội nghị quốc tế vi sinh vật học lần thứ 10 ( 1970 ) đã quyết định phân loại

vi khuẩn dịch hạch như sau:

Vi khuẩn dịch hạch thuộc giống Yersinia, loài pestis, họ Enterobacteriace Giống Yersinia có 11 loài nhưng chỉ có 3 loài gây bệnh cho người:

Yersinia pestis: gây bệnh dịch hạch Yersinia pseudotuberculosis: gây bệnh giả lao Yersinia enterocolitica: gây viêm ruột đại tràng

1.2.2 Hình thể và tính chất bắt màu [ 2, 19 ]

Yersin (1894) là người đầu tiên mô tả hình thái vi khuẩn dịch hạch, tiếp theo

là Gabritrevsky (1897), Allerecht và Ghon (1900) cũng mô tả tương tự

đám Vi khuẩn bắt màu lưỡng cực, Gram ( - ) rất rõ khi nhuộm bằng phương pháp Wayson Trên các tiêu bản khác nhau, hình thể và cách sắp xếp của vi khuẩn dịch hạch có thể khác nhau

Hình 1.1: Hình thể Yersinia pestis nằm riêng lẻ

1.2.3 Tính chất nuôi cấy [ 2 ]

Yersinia pestis là vi khuẩn hiếu khí Sokkey (1938), Habbu (1943), Turnansky

(1958) và những người khác cho rằng vi khuẩn dịch hạch có thể sinh trưởng và phát triển ở nhiệt độ -20C - 450C , nhiệt độ thích hợp hơn là 270C - 280C; pH tối thích là 6,9 – 7,1 Vi khuẩn có thể sinh trưởng trên các môi trường nuôi cấy thông thường

Trên môi trường canh thang:

Sau 24- 48 giờ vi khuẩn tạo thành những bông tuyết lơ lửng trong canh thang bám vào thành ống nghiệm, dưới đáy có lắng cặn nhưng canh thang vẫn trong Trên

bề mặt có thể tạo thành một váng mỏng khi thời gian nuôi cấy kéo dài, đây là cách mọc theo lối ngưng kết

Trên môi trường thạch đặc:

Sau 48 giờ nuôi cấy vi khuẩn dịch hạch tạo thành khuẩn lạc dạng R điển hình

có kích thước 2-3mm, màu trắng trong, bờ dẹt Nếu nhìn dưới kính hiển vi thấy ở giữa có các hạt màu nâu xám, bề mặt xù xì lồi cao, trong có hình răng cưa Nếu để

khuẩn lạc tiếp tục phát triển ở giữa tối dần và lồi cao hơn, vùng răng cưa xung quanh giảm dần rồi mất hẳn

Dù là môi trường nào đi nữa, theo Girard: “ Tất cả các giống vi khuẩn nào làm đục môi trường thì không phải là trực khuẩn dịch hạch” Tính chất sinh trưởng của

Y.pestis trên môi trường nuôi cấy sẽ thay đổi tùy thuộc vào thành phần môi trường và

nhiệt độ Nhiều tác giả đã nghiên cứu về nguyên nhân cũng như ý nghĩa thực tiễn của các yếu tố này

1.2.4 Tính chất sinh hóa:[ 2, 27, 33 ]

Thành phần sinh hóa của Yersinia pestis:

Nước chiếm tỉ lệ từ 75-85% trọng lượng tế bào vi khuẩn Tỉ lệ này có thể thay

đổi phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy Thành phần khô của Yersinia pestis được tạo

thành từ các chất vô cơ và hữu cơ, gồm:

+ Các chất khoáng (chiếm 3,5 - 4%): gồm phospho, kali, natri, magie, lưu huỳnh, canxi,clo và sắt

+ Các chất hữu cơ gồm: protein chiếm khoảng 62-77%, acid nucleic 8-14,8% và glucid chiếm 2,5 - 20% phần khô của tế bào

Tính chất sinh vật hóa học:

Yersinia pestis có khả năng tổng hợp các loại enzym cần cho quá trình trao đổi

chất Một số phản ứng sinh hóa trong quá trình trao đổi chất đã được dùng để chẩn đoán và phân chia giữa các loài VKDH từ các ổ dịch thiên nhiên khác nhau

Y pestis có khả năng phân giải không sinh hơi các loại đường: glucose

mannitol, levulose, galactose, mantose, không len men đường rhamnose, lactose và

melibiose Sản phẩm của sự phân giải này được Y pestis sử dụng làm nguồn nguyên

liệu và năng lượng để xây dựng tế bào Ngoài ra, một số sản phẩm trung gian của quá trình trao đổi glucid còn tham gia tích cực vào các phản ứng quan trọng khác của sự

phân giải urê Kết quả phản ứng khử nitrat và lên men glycerol khác nhau được sử dụng để phân chia các nhóm trực khuẩn dịch hạch

1.2.5 Cấu trúc kháng nguyên [ 21, 26, 30, 32, 37, 38, 48, 50 ]

Schiitre là người đầu tiên nghiên cứu cấu trúc kháng nguyên của Y pestis

Bằng phương pháp hấp phụ và kết tủa ông đã thu được kháng nguyên vỏ và kháng

nguyên thân Các nghiên cứu đầy đủ về cấu trúc kháng nguyên của Y pestis được mở

ra khi các nhà khoa học sử dụng phương pháp kết tủa trong thạch Allan và cs,

Crumpton và Davies đã xác định thành phần của Y pestis gồm:

- Kháng nguyên vỏ

- Kháng nguyên độc tố

- Kháng nguyên do các thành phần polysaccarit không đóng vai trò bảo vệ

Số lượng kháng nguyên của VKDH được phát hiện nhiều nhưng chỉ có một số được nghiên cứu kĩ là KN F1, KN VW, KN độc tố, các chất và các men có hoạt tính kháng nguyên ( pesticine, congulase, fibrinolizine )

Kháng nguyên F1:

KN F1 có tính đặc hiệu loài cao, chỉ có Y pestis mới có KN F1 Các vi khuẩn nhóm khác không có KN này William và cs đã nghiên cứu trên 300 chủng Y pestis

độc và không độc ( EV76) cho thấy tất cả các chủng đều có KN F1, bởi vậy KNF1

được dùng cho chẩn đoán dịch hạch Khi nuôi cấy Y pestis ở 370C, F1 được hình

rất ít và nằm dưới dạng kết hợp với các thành phần khác KN F1 có trọng lượng phân

tử là 2.032.229 Da

Phân tử protein KN F1 có cấu trúc bậc 4 với kiểu tác dụng tương hỗ không

hóa trị và kị nước KNF1 dạng keo có cấu trúc bên trong theo kiểu hàng rào không gian 3 nhịp với các lỗ thấm và kênh nhỏ xác định nó như một màng sinh học phụ thêm của thành phần tế bào

KN F1 có thành phần hóa học và cấu trúc đặc biệt đã tạo cho nó có tính đề

phút mới làm biến đổi các hapten của nó và chỉ bị phân hủy hoàn toàn khi nung nóng

1000C/1 giờ

KN F1 là yếu tố độc lực chủ yếu có khả năng chống lại thực bào của các bạch cầu trung tính và bạch cầu đơn nhân KN F1 có tính sinh miễn dịch KN F1 có khả năng kích thích tạo ra kháng thể chống lại nhiễm trùng ở động vật Một tính chất

quan trọng khác nữa đã được Janssen và Sunrgalla nhấn mạnh KN F1 trợ giúp cho Y pestis trốn được thực bào

KN F1 có tính đa năng là một KN quan trọng nhất của Y pestis, một nhân tố miễn dịch tích cực hàng đầu và có tính đặc hiệu cao duy nhất chỉ có ở Y pestis Do

đó KN F1 đã được sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán huyết thanh bệnh dịch hạch

Kháng nguyên V và W:

Burrows và Bacon đã xác định tính kháng thực bào của Y pestis nhờ kháng

nguyên gọi là V và W có thể hoạt động liên kết hay độc lập với KN F1 Những chủng không độc thiếu KN F1 có thể kháng thực bào nhờ các kháng nguyên này

Y pestis sản sinh kháng nguyên V và W đồng thời chứ không tách biệt Kháng

nguyên W được tiết tự do vào môi trường xung quanh, kháng nguyên V liên kết chặt chẽ với tế bào vi khuẩn Lawton và cs lần đầu tiên đã tách được kháng nguyên này dưới dạng tinh khiết và chỉ ra rằng KN V là protein có trọng lượng phân tử 90.000 Da

và KN W là lipoprotein với trọng lượng phân tử 145.000 Da

phenol và nước từ Y pestis LPS có tất cả các đặc tính gây bệnh và tất cả những tính

chất sinh học như gây sốt lưỡng pha ở thỏ, choáng, gây chết ở động vật do sự hủy hoại mao mạch, hoại huyết ở thận, gan và các tổ chức khác

Ảnh hưởng sinh học khác của độc tố vi khuẩn dịch hạch có thể gây nhiễm cho con người đã được Walker chứng minh trên động vật thí nghiệm Chúng ảnh hưởng đến sự trao đổi chất như làm giảm glycogen ở gan và máu, đồng thời tăng urê máu hoặc suy yếu chức năng của thận và trao đổi chất cacbon

+ Ngoại độc tố:

Ngoại độc tố dịch hạch là các enzym ngoại tiết của vi khuẩn Ngoại độc tố là một dạng protein hòa tan gọi là độc tố murin rất độc đối với chuột nhắt nhưng ít gây chết đối với những động vật khác Độc tố murin chỉ có ở màng tế bào vi khuẩn Ngoại độc tố murin ức chế chức năng hô hấp của ti thể ở tế bào chuột nhưng không

ức chế ti thể ở tế bào thỏ, khỉ và tinh tinh Độc tố murin còn làm ti thể phồng lên và mất đi khả năng nhận dạng ion canxi và photpho vô cơ Montie và cs đã phát hiện thêm murin có tác động đối kháng với AMP vòng Việc tổng hợp munrin do plasmid Fral/Tox điều khiển

1.3 CÁC CON ĐƯỜNG LÂY TRUYỀN BỆNH DỊCH HẠCH

Dịch hạch là bệnh chủ yếu của động vật hoang dại và chuột, người chỉ là vật chủ thứ yếu Trong tự nhiên, bệnh lan truyền qua 4 con đường: ( trong đó chủ yếu lây qua đường máu )

+ Đường máu: lây qua vết đốt côn trùng, chủ yếu là do bọ chét Bọ chét hút máu làm lan truyền bệnh trong các giống chuột và từ chuột sang người

+ Đường tiêu hóa: thực phẩm, nước bị ô nhiễm do chuột trực tiếp gieo rắc mầm bệnh vào, đường lây này trên thực tế ít nguy hiểm vì trực khuẩn dịch hạch dễ bị chết khi đun sôi nấu chín

+ Đường hô hấp: từ bệnh nhân dịch hạch thể phổi có thể lây trực tiếp cho người xung quanh qua các giọt đờm, nước bọt bắn ra khi bệnh nhân ho, hắt hơi, nói chuyện (lây qua đường này rất nhanh)

+ Đường da, niêm mạc: qua tiếp xúc trực tiếp với vùng da tổn thương (hiếm gặp)

1.4 MIỄN DỊCH HỌC DỊCH HẠCH [ 47, 50 ]

Sau khi xâm nhập qua da nơi vết đốt của bọ chét, Y pestis bị sự tấn công bởi

các globulin miễn dịch Nhưng vi khuẩn được mang bởi bọ chét đã có sẵn một số kháng nguyên F1 có khả năng kháng thực bào, giúp vi khuẩn thích ứng với tình trạng

ký sinh và phát triển nội bào

Cơ chế hoạt động kháng thực bào của KN F1 được làm rõ bởi R.C Williams: hai yếu tố cần cho sự opsonins để tăng tính thực bào có hiệu quả là bổ thể C2và C4

kháng nguyên

hóa bổ thể bị gián đoạn Do hoạt động kháng bổ thể cực mạnh của KN F1 nên ở giai đoạn ủ bệnh thế hệ sau trở nên đề kháng với sự thực bào và chúng được tung ra từ các

hạch, lan rộng khắp cơ thể, điều này đã giải thích khả năng của Y pestis giết được

Phân tử globulin miễn dịch là một phân tử protein gồm 4 chuỗi polypeptide giống nhau từng đôi một: hai chuỗi nhẹ và hai chuỗi nặng nối với nhau bằng cầu disulfide và có độ đàn hồi nhất định

Hình 1.2: Cấu trúc của một phân tử kháng thể Chuỗi nhẹ, kí hiệu L ( light chain )

Chuỗi nhẹ có trọng lượng phân tử khoảng 23.000Da Có 2 loại chuỗi nhẹ

lambda (kí hiệu )

Tính kháng nguyên của hai loại chuỗi nhẹ này hoàn toàn khác nhau Tỷ lệ

cả hai loại Hai chuỗi nhẹ của phân tử globulin miễn dịch không những cùng loại mà còn hoàn toàn giống nhau về cấu trúc Cho đến nay người ta thấy rằng chỉ có một chuỗi nhẹ K, nhưng có ít nhất 4 chuỗi nhẹ Về cấu tạo chung, mỗi chuỗi nhẹ gồm 211- 221 axit amin và chia thành hai phần dài bằng nhau:

+ Phần hằng định, kí hiệu C (constant) tận cùng –COOH với trình tự axit amin tương đối hằng định và được kí hiệu là CK (cho typ Kappa ) và C ( cho typ lambda )

+ Phần thay đổi, kí hiệu V ( variable ) tận cùng là - NH2 Trật tự axit amin trong phần này thay đổi theo từng nhóm một do đó nó khác nhau ngay cả trong một

cá thể, phần này được kí hiệu là VK ( cho typ Kappa ) và V ( cho typ lambda ) Trong phần này có những vị trí sắp xếp axit amin rất thay đổi

Chuỗi nặng, kí hiệu H ( Heavy chain )

Chuỗi nặng có trọng lượng phân tử từ 50.000 đến 70.000 Da Chúng được chia thành 5 lớp: , , , , Các chuỗi nặng có tính đặc hiệu riêng và quyết định globulin miễn dịch thuộc lớp này Tương ứng với mỗi lớp chuỗi nặng là một loại globulin miễn dịch, còn chuỗi nhẹ có thể là K hoặc Chuỗi nặng có khoảng 440 axit amin và cũng chia thành 2 phần :

+ Phần hằng định ( C ) tận cùng bằng – COOH, có số axit amin nhiều gấp 3 lần số axit amin của phần hằng định chuỗi nhẹ, tức khoảng 330 axit amin Do sự khác biệt về tính chất kháng nguyên ở vùng hằng định này mà một số lớp globulin miễn dịch còn được chia thành các lớp dưới như 1, 2, 3, 4 hoặc 1, 2

+ Phần thay đổi: cũng giống như phần thay đổi của chuỗi nhẹ, vùng thay đổi chuỗi nặng ở phía tận cùng –NH2 Trong trật tự axit amin có một số đoạn cực kì thay đổi xen giữa những đoạn tương đối ổn định Ở cả hai chuỗi nhẹ và chuỗi nặng, vùng cực kì thay đổi được xác định ở gần các axit amin 30, 50, 95 Những vùng cực kì thay đổi như thế tham gia trực tiếp vào việc hình thành vị trí kết hợp kháng nguyên

Các vùng hằng định không có vai trò nhận diện KN, chúng làm nhiệm vụ cầu nối với các tế bào miễn dịch cũng như các bổ thể Do đó phần “ chân của chữ Y” còn được gọi là Fc ( tức phần hoạt động sinh học của kháng thể )

Mỗi immunoglobulin có 4 vùng thay đổi ở đầu “ hai cánh tay của chữ Y” Sự

nhẹ (VL ) tạo nên vị trí nhận diện KN ( còn gọi là paratope ) Như vậy mỗi immunoglobulin có hai vị trí gắn KN Hai vị trí này giống nhau như đúc, qua đó một

KT có thể gắn được với 2 KN giống nhau Hai “ cánh tay của chữ Y” còn gọi là Fab ( tức là phần nhận biết KN ) Nơi kháng nguyên gắn vào kháng thể gọi là epitope

Hình 1.3: Sơ đồ các chuỗi của một kháng thể

Bạch cầu ái kiềm, tế bào mast

VK, virus

Ngưng tụ, trung hòa

VK, virus

Ngưng tụ theo con đường cổ điển của bổ thể

Dị ứng, trung hòa các ký sinh trùng

Hoạt hóa các tế bào lympho B

Bảng 1.1: Tóm tắt tính chất của các lớp globulin miễn dịch khác nhau

Hình 1.4: Cấu trúc một số lớp kháng thể 1.6 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN DỊCH HẠCH

1.6.1 Chẩn đoán lâm sàng

Là bước đầu tiên chính yếu trong công tác chẩn đoán dịch hạch đối với bất cứ người nào bị sốt, hạch rất đau, số lượng hạch nhiều, kích thước hạch lớn hơn hoặc bằng 0,1 cm, nghi ngờ mắc bệnh dịch hạch, sống trong vùng có dịch hạch lưu hành hoặc từ những vùng có dịch trở về

1.6.2 Chẩn đoán vi sinh vật

1.6.2.1 Nhuộm soi

Từ các bệnh phẩm và mẫu nghiệm làm tiêu bản và nhuộm bằng phương pháp nhuộm Gram và Wayson Quan sát dưới kính hiển vi xác định hình thể và tính chất

bắt màu của Y pestis

1.6.2.2 Nuôi cấy trực tiếp

Trên môi trường thạch:

Có thể sử dụng nhiều loại môi trường để nuôi cấy vi khuẩn dịch hạch: thạch máu, Hottinger, Brain heart infusion ( BHI) Cấy bệnh phẩm lên các môi trường này,

ủ 280

C, sau 24- 48 giờ, vi khuẩn dịch hạch phát triển tạo thành khuẩn lạc dạng R

Trên môi trường lỏng:

C, sau 24 - 48 giờ, VKDH mọc theo lối ngưng kết, không làm đục môi trường

1.6.2.3 Tiêm truyền cho súc vật thí nghiệm

Thường sử dụng chuột bạch hay chuột lang là súc vật nhạy cảm với vi khuẩn dịch hạch Có thể tiêm dưới da, màng bụng hoặc xát da tùy theo mức độ tạp nhiễm của bệnh phẩm

Sau khi tiêm, chuột thường chết trong vòng 3- 10 ngày với các tổn thương xuất hiện ở gan, lách, hạch, phổi Cấy các phủ tạng vào môi trường thạch, cấy máu tim vào canh thang và làm tiêu bản nhuộm soi Tiếp tục quy trình như nuôi cấy trực tiếp

1.6.3 Phương pháp huyết thanh học [ 2, 3, 18, 26, 33, 35, 36, 40, 42, 45, 58 ]

Trong thực tế điều tra giám sát dịch hạch, dùng phương pháp chẩn đoán vi sinh vật vẫn còn nhiều trường hợp không phát hiện được Đặc biệt với các bệnh nhân

đã được điều trị sớm với kháng sinh, những người sống trong các ổ dịch đã bị nhiễm khuẩn nhưng không phát bệnh, không có triệu chứng lâm sàng nhưng huyết thanh của

họ có kháng thể kháng F1 hoặc trong trường hợp cần hồi cứu thì phương pháp huyết thanh học rất cần thiết Một số kỹ thuật sau thường được sử dụng trong chẩn đoán huyết thanh dịch hạch

1.6.3.1 Ngưng kết hồng cầu thụ động phát hiện kháng thể kháng F1 của Y pestis

Người đầu tiên mở ra triển vọng dùng hồng cầu làm yếu tố tạo ngưng kết chính là Salk ( 1944 ) Ông phát hiện thấy khi hồng cầu ở nồng độ thấp ( 2,5% ) nếu

có chất làm chúng ngưng kết thì hồng cầu sẽ bao phủ đáy ống nghiệm màu hồng mờ hình cái dù Nếu không có chất làm ngưng kết thì hồng cầu lắng xuống đáy hình tròn

bờ đều rõ rệt

Tiếp theo, Boyden ( 1951 ) nhận thấy có thể gắn protein lên bề mặt các hồng cầu đã được xử lý bằng axit tannic, hồng cầu này bị ngưng kết bởi KHT đặc hiệu chống protein đó Do kháng thể trong KHT kết hợp với KN là protein nên phản ứng

này được gọi là phản ứng ngưng kết hồng cầu thụ động Ở đây hồng cầu đóng vai trò như chất chỉ thị vì vậy có thể đọc kết quả bằng mắt thường

Chen và Meyer ( 1966 ) đã hoàn thiện kĩ thuật và tiêu chuẩn thử nghiệm ngưng kết hồng cầu thụ động được các chuyên gia của tổ chức WHO chấp thuận ở hội nghị dịch hạch 1970 và được xem như là một quy trình để chẩn đoán huyết thanh dịch hạch

Cơ chế của phản ứng ngưng kết hồng cầu thụ động

Kháng nguyên F1 là KN hòa tan được gắn với HCC Khi cho KN chẩn đoán gắn hồng cầu vào mẫu huyết thanh:

- Nếu trong mẫu huyết thanh có kháng thể sẽ xảy ra phản ứng ngưng kết, hồng cầu dàn đều đáy ống hình tán dù: phản ứng dương tính (+)

- Ngược lại, hồng cầu tụ thành chấm ở đáy ống nghiệm: phản ứng âm tính ( - )

1.6.3.2 Ngưng kết hạt

Suzuki và cs ( 1967 ) đã cải tiến kỹ thuật gắn KN lên hạt polystyren để sử dụng cho phản ứng ngưng kết ở trên phiến hay chuẩn độ theo lối vi mô Tác giả chứng minh thử nghiệm này có thể so sánh được với phản ứng ngưng kết hồng cầu thụ động Thử nghiệm ngưng kết hạt có thể ưu việt hơn phản ứng ngưng kết hồng cầu thụ động nhờ tính bền vững của hạt polystyren

1.6.3.3 Kỹ thuật ELISA phát hiện kháng thể kháng F1

Nguyên lí của ELISA chính là dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể

Kĩ thuật này có độ nhạy và độ đặc hiệu cao được dùng để phát hiện kháng thể kháng F1 ở tất cả các mẫu huyết thanh có nguồn gốc khác nhau ( người, động vật ) mà không cần chất cộng hợp đặc trưng cho loài, đặc biệt phương pháp này có thể đo lường được các lớp KT đặc hiệu IgG, IgM và IgA

1.6.3.4 Kháng thể kháng F1 gắn HCC đông khô phát hiện kháng nguyên F1

- Trên thế giới, nhiều tác giả đã nghiên cứu và sản xuất chế phẩm chẩn đoán

KT kháng F1 gắn HCC đông khô đã sử dụng trong phản ứng ngưng kết hồng cầu thụ

động, đáng chú ý là một số công trình của:

Smuter, Baxôva, Kanatôf, Mensôf và một số tác giả khác đã bước đầu xây dựng quy trình sản xuất KT kháng F1 gắn HCC đông khô phát hiện KN F1 được đăng trên tài liệu Hội nghị Khoa học lần thứ VI chống dịch hạch vùng Trung Á – Kazắcttăng, Alma – Ata vào năm 1969

Mensôf đã hoàn thiện quy trình sản xuất hồng cầu chẩn đoán cho nghiên cứu huyết thanh học dịch hạch năm 1970

Viện nghiên cứu khoa học chống dịch hạch Trung Á Alma – Ata đã sản xuất nhiều lô KT chẩn đoán phát hiện KN F1 với nồng độ rất nhỏ chỉ cần 0,000625 mcg

và nếu trực khuẩn dịch hạch thì chỉ cần 15.625 tế bào

- Tại Việt Nam, chế phẩm chẩn đoán KT kháng F1 gắn HCC đông khô cũng được sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán và điều tra giám sát huyết thanh Chế phẩm sử dụng chủ yếu là nhận từ các nước Liên Xô cũ

Gần đây tại Viện Vắc xin cơ sở II Đà Lạt bước đầu đã nghiên cứu và sản xuất thử chế phẩm KT kháng F1 gắn HCC đông khô Chế phẩm này đạt các tiêu chuẩn về vật lí, vô trùng, tính đặc hiệu và độ nhạy Kháng thể kháng F1 dịch hạch gắn HCC đông khô có thể nhận dạng được KN F1 của huyền dịch vi khuẩn chuẩn tới đậm độ

VKDH khảo sát

1.6.3.5 Kháng thể gắn huỳnh quang phát hiện kháng nguyên F1

Phương pháp này chủ yếu dựa trên kỹ thuật hiển vi huỳnh quang Hiển vi huỳnh quang là một phương pháp tiên tiến để nghiên cứu vật chất có thể làm cho phát huỳnh quang, hoặc dưới dạng tự nhiên ( gọi là sự tự phát huỳnh quang sơ cấp), hoặc sau khi xử lí với các hóa chất có khả năng huỳnh quang ( gọi là huỳnh quang thứ phát cấp) Hiển vi huỳnh quang là sáng chế vào đầu thế kỷ 19 của August Kor, Carl Reichert, Heinrich Lehmann và nhiều người khác Tuy nhiên, tiềm năng của thiết bị này không được nhận ra trong nhiều thập kỉ Kính hiển vi huỳnh quang hiện nay là một công cụ quan trọng trong ngành sinh học tế bào

Cộng hợp kháng thể gắn huỳnh quang dùng để phát hiện kháng nguyên và vị trí khu trú của kháng nguyên đó Kháng thể đặc hiệu được gắn với chất huỳnh quang ( Fluorescein Isothiocyanate: FITC ) Cộng hợp kháng thể huỳnh quang sẽ gắn chặt vào kháng nguyên tạo nên một phức hợp bền vững, không một kháng thể nào bị mất trong quá trình rửa, và kết quả được quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang Khi quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang phải quan sát dưới nền tối, kháng nguyên gắn đặc hiệu với cộng hợp kháng thể huỳnh quang sẽ được phát hiện bởi ánh sáng

màu xanh lá mạ Đây là phương pháp kiểm tra có tính đặc hiệu cao để phát hiện Y pestis, cho kết quả nhanh chỉ sau vài giờ và chính xác tới 98 – 99,4%

Cộng hợp kháng thể huỳnh quang được sử dụng để phát hiện rất nhiều loại vi khuẩn, virus như vi khuẩn dịch hạch, virus HIV, virus Dengue, virus dại

Hình 1.5: Mẫu nhuộm huỳnh quang Yersinia pestis, 2000x

Trên thế giới kít chẩn đoán kháng thể gắn huỳnh quang phát hiện KN F1 đã được sản xuất và sử dụng ở một số nước như Mỹ, Pháp, Đức, Anh

Ở Việt Nam, hiện vẫn chưa có nơi nào sản xuất bộ kít chẩn đoán này để phát hiện KN F1

1.6.4 Phương pháp sinh học phân tử - PCR (Polymerase Chain Reaction ) [8, 35]

Đây cũng là kỹ thuật rất đặc hiệu và có độ chính xác cao Để thực hiện thử nghiệm này trước hết phải tổng hợp nên những primer tức là những đoạn ADN nhỏ bắt đầu và kết thúc của đoạn ADN đặc hiệu Nhờ đoạn ADN mồi này thực hiện phản ứng tổng hợp chuỗi để tổng hợp những đoạn ADN đặc hiệu ít ỏi của vi khuẩn gây bệnh nằm trong bệnh phẩm lên nhiều ngàn lần Các cặp primer được sử dụng trong PCR để phát hiện ADN của vi khuẩn dịch hạch là F1- 1/2, Pst 3/5 là Rep 1/2

Phương pháp PCR đã được áp dụng trong nghiên cứu chẩn đoán dịch hạch, tuy nhiên đây là kĩ thuật đòi hỏi máy móc và sinh phẩm đắt tiền phức tạp nên chưa được sử dụng rộng rãi ở các tuyến cơ sở

1.7 SẢN XUẤT KHÁNG THỂ

1.7.1 Sản xuất kháng thể đa dòng [ 13 ]

Các KT đa dòng là một tập hợp các KT đặc hiệu với các epitope khác nhau trên một KN cho trước Trong đáp ứng miễn dịch, mỗi tế bào sinh KT tổng hợp và tiết một KT đơn nhận biết có ái lực cao với vùng riêng biệt trên KN miễn dịch ( epitope, quyết định KN ) Vì mỗi KN thường có vài epitope khác nhau nên có vài loại tế bào trong hệ miễn dịch mà mỗi loại sinh ra một KT khác nhau chống lại một trong nhiều epitope của KN Các KT như vậy, đều phản ứng với cùng một KN, cấu thành một KT

đa dòng

Hình 1.6: Các KT đa dòng, mỗi KT liên kết với một epitope khác nhau

Đối với các xét nghiệm chẩn đoán cụ thể, việc dùng KT đa dòng có hai hạn chế: + Số lượng KT khác nhau trong chế phẩm đa dòng có thể khác nhau giữa các lô sản xuất

+ KT đa dòng không thể dùng để phân biệt hai đích tương tự nhau, tức là khi sự khác nhau giữa dạng gây bệnh ( đích ) và dạng không gây bệnh ( không phải đích ) là một quyết định KN

Tuy có hạn chế nhưng KT đa dòng được sử dụng cho mục đích chẩn đoán nhằm để xác định các tác nhân gây bệnh trên diện rộng

1.7.2 Sản xuất kháng thể đơn dòng [ 11 ]

Kỹ thuật sản xuất KT đơn dòng đã được Kohler và Milstein miêu tả và sản xuất thành công từ năm 1975 Trong mấy chục năm qua kỹ thuật này đã có ảnh hưởng lớn tới nhiều lĩnh vực nghiên cứu khác nhau của miễn dịch học, vi sinh vật

học, sinh hóa, sinh lí và sinh học tế bào

Cơ sở của kỹ thuật sản xuất kháng thể đơn dòng là phải thu được thể lai vừa có các đặc tính của tế bào lympho: sản xuất kháng thể và vừa có đặc tính của tế bào u tủy: nhân lên khi nuôi cấy dài ngày invitro

Phương pháp này đã tạo ra được KT đơn dòng từ một dòng tế bào của tế bào u lai nên KT rất tinh khiết chỉ phản ứng với một quyết định KN mà thôi Các KT đơn dòng chỉ nhận biết một epitope trên một KN cho sẵn

Hình 1.7: Các kháng thể đơn dòng liên kết với một epitope đặc hiệu

1.7.3 Tình hình sản xuất kháng thể trên thế giới và Việt Nam [ 9, 13, 26, 53, 54,

56 ]

Tình hình sản xuất kháng thể trên thế giới

Hiện nay trên thế giới việc sản xuất KT tinh sạch được tiến hành ở nhiều nước, đặc biệt là những nước có nền khoa học kỹ thuật phát triển như Mỹ, Hà Lan, Nhật, Pháp….chủ yếu là dựa trên công nghệ sản xuất KT đơn dòng và đa dòng, tạo nên các

hệ thuốc mới chữa trị các bệnh nguy hiểm cho con người và các bộ kít chẩn đoán của nhiều loại bệnh Với sự phát minh phương pháp lai tế bào, KT được xem là tác nhân điều trị tiềm năng Sau đây là một số KT đơn dòng đã được phép dùng cho người ở Hoa Kỳ và Liên minh Châu Âu

Năm phê

duyệt

Dạng kháng thể

Ortho Biotech Centocor Protein Design Labs, Hoffmann- LaRoche Centocor, Schering- Plough

Novartis Genentech Medimmune

American Home Products, Celltech Millennium, Schering Pharmaceuticals, Genentech, Novartis, Tanox

Chống thải thận ghép cấp Chống cục máu đông Chống thải thận ghép cấp Bệnh Crohn và viêm khớp Chống thải thận ghép cấp Ung thư vú dương tính HER2 Nhiễm virut hợp bào đường hô hấp ở trẻ em

Ung thư bạch cầu đơn nhân tủy tái phát cấp

Ung thư bạch cầu đơn nhân mạn

Bệnh hen

Bảng 1.2: Một số KT đơn dòng đã đƣợc phép dùng ở Hoa Kỳ và Châu Âu

Theo Rechard Van den Broek, một chuyên gia phân tích của hãng dược phẩm Hambrecht & Quist của Mỹ thì tổng doanh thu của thị trường sử dụng KT chữa bệnh năm 1999 đạt 1,3 tỉ USD tăng 30% so với năm 1997 và 63,1% so với năm 1998 Đến năm 2002 đạt 3,1 tỉ USD với 19 loại sản phẩm khác nhau

- Năm 2004, các nhà khoa học Mỹ đã tạo ra được một kháng thể người có thể ngăn chặn sự lây lan của virus SARS trong phòng thí nghiệm

- Năm 2005 các nhà nghiên cứu Châu Âu đã tạo ra được kháng thể CD3 có thể điều trị bệnh tiểu đường type I

- Năm 2007 các nhà nghiên cứu trường đại học Ghent Bỉ đã sản xuất thành công kháng thể chống virus viêm gan A

- Hiện nay rất nhiều bộ kít chẩn đoán dùng kháng thể để phát hiện các loại virus như virus dại, virus Dengue, virus HIV… đã được sản xuất và sử dụng ở các nước Mỹ, Anh, Pháp

Công nghệ sản xuất kháng thể ngày càng được phát triển mạnh vì tính hiệu quả, an toàn và kinh tế của nó

Tình hình sản xuất kháng thể ở Việt Nam

Do khả năng ứng dụng của việc sản xuất kháng thể mang lại nhiều hiệu quả trong điều trị bệnh và sản xuất các kít chẩn đoán nên các nhà khoa học Việt Nam cũng đã và đang tiến hành nghiên cứu và sản xuất nhiều loại KT để phục vụ cho đời sống Vì vậy việc sản xuất KT ở Việt Nam cũng đạt một số thành tựu nhất định

- Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương Hà Nội từ những năm 1990 đã nghiên cứu và sản xuất thử KT đơn dòng kháng tả và bước đầu cho thấy có kết quả khả quan

- Năm 1994 Nguyễn Thị Kê chủ nhiệm đề tài cấp nhà nước đã xây dựng công nghệ sản xuất KHT kháng dại tinh chế tại Nha Trang

- Năm 2001 đề tài nghiên cứu sản xuất KT đa giá phòng, trị bệnh Newcastle và Gumboro ở gà của tập thể tác giả thuộc phân viện Thú Y Nha Trang đã được hội đồng khoa học Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn đánh giá đạt loại xuất sắc

- Năm 2008 đề tài nghiên cứu tạo KT đơn dòng virus gây bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và dưới vỏ ( IHHNV ) ở tôm PENAEID của Bùi Thị Bích Hằng và Timothy W Fleg, Đại học Cần Thơ đã thành công và được công bố

- Tại viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh đã sản xuất được rất nhiều loại kháng

OMA (Nhóm : A, B, D, E, L), Kháng huyết thanh Vi, Kháng huyết thanh H đa giá (a+b+c+d+i+g,m ), KHT Shigella, KHT Dysenteriae, KHT Flexneri, …

- Tại phân viện Vắc xin Đà Lạt cũng đã sản xuất được một số loại kháng huyết thanh như: KHT lỵ trực khuẩn, KHT ho gà, KHT não mô cầu, KHT thương hàn, phó thương hàn

Tóm lại tại Việt Nam việc nghiên cứu và sản xuất các loại KHT, KT đã được tiến hành tại một số viện Pasteur Tuy nhiên việc nghiên cứu và sản xuất KT đơn dòng ở nước ta chưa được phổ biến mà mới chỉ bước đầu đi vào nghiên cứu Sản xuất kháng thể gắn huỳnh quang để phát hiện KN F1 dịch hạch ở Việt Nam chưa có nơi nào sản xuất, do đó đặt vấn đề nghiên cứu sản xuất, tinh chế IgG là cần thiết

1.7.4 Tinh chế kháng thể [ 9, 13, 7 ]

Mục đích của việc tinh chế kháng thể IgG là loại bỏ các albumin, protein và những kháng thể khác đồng thời cô đặc globulin miễn dịch đặc hiệu Vì vậy trong sản xuất chúng ta phải chọn những phương pháp đơn giản mà cho một sản phẩm tinh khiết, có tỷ lệ cô đặc cao, có hiệu suất chấp nhận được và không làm thay đổi tính chất của kháng thể Để tinh chế kháng thể người ta có thể dùng nhiều phương pháp vật lí, hóa học khác nhau Mỗi phương pháp đều có những ưu nhược điểm riêng Trong điều kiện tiến hành luận văn hạn chế, chúng tôi tiến hành tinh chế IgG hằng hai phương pháp sau:

ở các nước Mỹ, Liên Xô, Đức Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào sự thay đổi điều kiện của sự trầm hiện của những phân tử có trong huyết tương như nồng độ dung môi, pH, lực ion, nhiệt độ và nồng độ protein

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 VẬT LIỆU

2.1.1 Chủng giống

Yersinia pestis EV 76 do viện Tarasevich ( Liên Xô ) cung cấp ở dạng đông

khô Y pestis EV 76 bắt màu gram lưỡng cực, là chủng vi khuẩn được gây đột biến giảm độc lực, phát triển thích hợp ở 280C

2.1.2 Môi trường

2.1.2.1 Môi trường canh thang BHI ( Brain heart infusion) và thạch BHI

Canh thang BHI

Thành phần giống canh thang BHI bổ sung thêm agar 2,5%

2.1.2.2 Môi trường Thioglycolate

- Acid thioglycolic 0,5g

2.1.3 Hóa chất và nguyên liệu khác

- Kháng nguyên F1 do công ty Vắc xin Pasteur Đà Lạt sản xuất

- n – butanol bão hòa nước

- Dung dịch nhuộm protein

- Dung dịch rửa màu

- Dung dịch cố định màu nhanh

- Các loại ống nghiệm có đường kính 12mm, 18mm và 22mm

- Pipette Pasteur và pipette 1ml, 5ml, 10ml

- Lam kính, que cấy, đèn cồn, kẹp và kéo

- Giá đựng ống nghiệm

- Kim tiêm, bơm tiêm

- Hộp Roux và phao thủy tinh

- Máy li tâm Hermile 6000 vòng/ phút – Đức

- Bộ so độ đục chuẩn viện Tarasevich – Liên Xô (cũ )

- Máy đo pH – Đức

- Cân điện prolabo – Pháp

- Buồng cấy vô trùng Class Nuarie – Mỹ

2.2.1 Phương pháp pha chế môi trường

2.2.1.1 Môi trường canh thang BHI và thạch BHI ( theo hướng dẫn của nhà sản

xuất)

Môi trường canh thang BHI:

Hòa tan 37g bột môi trường BHI vào 1000ml nước cất, sau đó đun sôi phân vào trong các ống nghiệm 22mm, mỗi ống nghiệm 20ml môi trường Hấp khử trùng ở

1100C/30 phút, pH= 7,4± 0,2

Môi trường thạch BHI:

Hòa tan 47g bột thạch BHI vào 1000ml nước cất, đun nhẹ để làm tan thạch

C/30 phút, sau đó để ngửa hộp Roux cho

trong vòng 15 ngày

2.2.1.2 Môi trường Thioglycolate

Đun nóng cho tan hết các chất ( trừ glucose, acid thioglycolic, Resazurin) Riêng L.Cystin hòa ít nước cất có pha 5ml NaOH 10% rồi đổ vào hỗn hợp trên Đun sôi 10 phút khuấy tan thạch, bù nước cho đủ thể tích ban đầu, sau đó thêm glucose và acid thioglycolic Điều chỉnh pH đến 7,2 – 7,3, lọc 2 lần rồi thêm Resazurin Phân vào ống nghiệm hấp 1100C/30 phút làm nguội nhanh ở 250C Môi trường có màu hồng nhạt ở phía trên không quá 1,5cm là đạt ( nếu quá bị oxi hóa, phải đun và làm lại), dùng được 2 tuần

2.2.2 Phương pháp sản xuất kháng nguyên EV sống

Sản xuất kháng nguyên EV sống theo phương pháp nuôi cấy bề mặt trên môi trường rắn ở chai Roux

- Lấy 2ml canh thang BHI hòa tan vào ống chủng EV đông khô sau đó cấy vào 4 ống

trong ống nghiệm có môi trường Thioglycolate

- Sau 24 giờ nhuộm Gram xem hình thể EV điển hình, cấy vào chai Roux Mỗi chai Roux được cấy vào 2,0ml huyền dịch vi khuẩn từ canh thang BHI láng đều khắp mặt

C

- Sau 48 giờ lấy ra kiểm tra tạp khuẩn, cho vào mỗi chai 15ml nước muối sinh lý và 2 phao thủy tinh để lắc làm bong hết những khuẩn lạc mọc trên bề mặt thạch Thu huyền dịch vi khuẩn vào bình cầu và tiến hành đo đậm độ bằng bộ so độ đục chuẩn

để xác định số tế bào vi khuẩn Từ huyền dịch thu được điều chế thành kháng nguyên

để gây miễn dịch Tiến trình sản xuất kháng nguyên được trình bày tóm tắt qua sơ đồ sau:

280C/24 giờ Kiểm tra: vô trùng, thuần khiết

280C/48 giờ Kiểm tra: vô trùng, thuần khiết

Kiểm tra: vô trùng, thuần khiết

Độ đục

Hình 2.1 : Sơ đồ nuôi cấy sản xuất kháng nguyên

Canh thang BHI

Thạch BHI ( Trong bình Roux )

Gặt với nước muối sinh lí

Kháng nguyên EV sống

miễn dịch

Chủng Y pestis EV 76

đông khô

2.2.3 Phương pháp gây miễn dịch thỏ thu kháng thể và lấy máu

Phương pháp pha kháng nguyên dựa vào bộ đo độ đục chuẩn

- Từ huyền dịch vi khuẩn nuối cấy pha thành KN miễn dịch

- Lắc đều ống đo độ đục mẫu của bộ so độ đục viện Tarasevich –Liên Xô

- Hút 0,1ml KN từ huyền dịch vi khuẩn cho vào ống đo, thêm nước muối sinh lí vào

từ từ cho đến lúc đạt cùng màu so với ống chuẩn ( ống đo chuẩn và ống thử có màu sắc tương đương nhau)

- Từ đó tính được đậm độ kháng nguyên ban đầu và dựa trên kết quả độ đục này pha liều kháng nguyên cần để gây miễn dịch

Đậm độ huyền dịch vi khuẩn = Đơn vị đo độ đục x Số lần pha loãng

- Pha kháng nguyên có đậm độ vi khuẩn là 100.106; 200.106; 400.106; 800.106; 109 tbvk/1ml

- Tiến trình pha loãng phải được thực hiện với nước muối sinh lí được làm lạnh

Phương pháp gây miễn dịch thỏ

- Chuẩn bị sẵn kim tiêm với liều tiêm thích hợp, gòn tẩm cồn iod

- Cho thỏ vào hộp gỗ, cố dịnh phần đầu thỏ ( tránh cử động làm sai lệch kim tiêm )

- Người phụ kỹ thuật dùng tay giữ chặt gốc tai, ngón trái và ngón trỏ giữ tĩnh mạch tai thỏ, búng mạnh vào tai để tĩnh mạch nổi rõ

- Trước khi bơm kháng nguyên, người tiêm sát trùng nơi tiêm bằng cồn iod, sau đó đưa kim tiêm chích xác vào đường tĩnh mạch bơm kháng nguyên từ từ chảy vào tĩnh mạch tai, người giữ thả lỏng tay để kháng nguyên chảy vào dễ dàng

- Sau khi bơm kháng nguyên hết, rút kim tiêm khỏi tĩnh mạch, đặt bông sát cồn lên vết tiêm giữ chặt cho máu và KN không chảy ngược ra

- Thời gian từ khi pha loãng KN EV sống miễn dịch đến khi kết thúc gây miễn dịch cho thỏ không quá 2 giờ 30 phút

Miễn dịch EV được tiến hành cụ thể như sau:

 Khoảng cách tiêm: 1 tuần

tbvk/1ml + Mũi tiêm thứ 2: 200.106 tbvk/1ml

+ Mũi tiêm thứ 3: 400.106

tbvk/1ml + Mũi tiêm thứ 4: 800.106

tbvk/1ml + Mũi tiêm thứ 5: 109 tbvk/1ml

Cho thỏ nghỉ 2 tuần nhắc lại mũi tiêm thứ 6 và mũi tiêm thứ 7

+ Mũi tiêm thứ 6: 800.106

tbvk/ml + Mũi tiêm thứ 7: 109 tbvk/ml

Sau mũi tiêm thứ 7 cho thỏ nghỉ 7 ngày rồi lấy hết máu

Phương pháp lấy máu thỏ:

Thỏ sau khi được gây miễn dịch cho ăn uống đầy đủ, chăm sóc cẩn thận Đến ngày thứ 7 sau mũi tiêm cuối cùng lấy toàn bộ máu bằng cách lấy máu ở động mạch

cổ

- Chuẩn bị hộp Roux vô trùng có gắn kim tiêm , kéo inox vô trùng

- Đặt thỏ nằm ngửa và cột bốn chân thỏ vào 4 góc khay inox Dùng cồn iod sát trùng vùng cổ, lấy kéo rạch lớp da bên ngoài để tìm động mạch cảnh Buộc chặt động mạch cảnh để máu không lưu thông về phía đầu thỏ, buộc hờ phía còn lại hướng về phía ngực bằng dây nhợ trắng có tẩm cồn iod

- Dùng ngón tay trỏ nâng động mạch cảnh lên, còn tay kia đưa kim gắn với dây silicon của hộp Roux vào động mạch cảnh Giữ chặt và rút hết máu ở tim từ động mạch cảnh vào hộp Roux đặt nằm ngang phía bên dưới cho đến lúc máu ngừng chảy rồi đậy kín nắp hộp Roux

- Sau khi máu đã đông hoàn toàn, đặt vào tủ lạnh 4 – 80C cho huyết thanh tách ra Sau khi để bình Roux 48 giờ trong lạnh, hút tách lấy kháng huyết thanh ( trong phòng

vô trùng ) và đem kháng huyết thanh ly tâm để loại bỏ hồng cầu bị vỡ