Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm chế phẩm vi sinh từ các dòng vi khuẩn có đặc tính đối kháng vibrio spp nhằm nâng cao tỉ lệ sống ấu trùng cá biển và tôm sú

1 Qui trình công nghệ phân lập và sản xuất sinh khối chế phẩm vi sinh Qui trình dễ áp dụng, tạo ra chế phẩm vi sinh ở qui mô 1kg / 3 giờ Qui trình tạo ra chế phẩm vi sinh với công suất 2

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN CHƯƠNG TRÌNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC NÔNG NGHIỆP, THỦY SẢN

Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II

Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh

8938

TP Hồ Chí Minh, tháng 6/2011

VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI

I THÔNG TIN CHUNG

1 Tên đề tài: Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm chế phẩm vi sinh từ các dòng vi khuẩn

có đặc tính đối kháng Vibrio spp nhằm nâng cao tỉ lệ sống ấu trùng cá biển và tôm sú

Địa chỉ tổ chức: 116 Nguyễn Đình Chiểu, Quận 1, thành phố Hồ Chí Minh Địa chỉ nhà riêng: 18/7/5 Phan Văn Trị, Phường 2, Quận 5, thành phố Hồ Chí

Minh

3 Tổ chức chủ trì đề tài:

Tên tổ chức chủ trì đề tài: Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II

Điện thoại: (08)38299592 Fax: (08)38226807

E-mail: vienncntts2@vnn.vn

Website: http://www.vienthuysan2.com/

Địa chỉ: 116 Nguyễn Đình Chiểu, Quận 1, thành phố Hồ Chí Minh

Họ và tên thủ trưởng tổ chức: Nguyễn Văn Hảo

Số tài khoản: 060.19.00.00047

Ngân hàng: Kho bạc Nhà nước Quận 1, thành phố Hồ Chí Minh

Tên cơ quan chủ quản đề tài: Bộ Nông nghiệp và phát triển Nông thôn

II TÌNH HÌNH THỰC HIỆN

1 Thời gian thực hiện đề tài:

- Theo Hợp đồng đã ký kết: từ tháng 01/ năm 2008 đến tháng 12/ năm 2010

- Thực tế thực hiện: từ tháng 01/năm 2008 đến tháng 12/năm 2010

- Được gia hạn (nếu có):

c) Kết quả sử dụng kinh phí theo các khoản chi:

3 Các văn bản hành chính trong quá trình thực hiện đề tài:

(Liệt kê các quyết định, văn bản của cơ quan quản lý từ công đoạn xác định nhiệm vụ, xét

chọn, phê duyệt kinh phí, hợp đồng, điều chỉnh (thời gian, nội dung, kinh phí thực hiện nếu

có); văn bản của tổ chức chủ trì đề tài, dự án (đơn, kiến nghị điều chỉnh nếu có)

Số

1 209/KHCN, 20/5/2008 Hợp đồng nghiên cứu khoa học

đề tài

Đồng ý cho chủ nhiệm đề tài thực hiện thí nghiệm trên tôm sú của ND4 tại Trại Thực nghiệm thủy sản Bạc Liêu

4 Tổ chức phối hợp thực hiện đề tài: Không có

5 Cá nhân tham gia thực hiện đề tài:

(Người tham gia thực hiện đề tài thuộc tổ chức chủ trì và cơ quan phối hợp, không quá 10 người kể cả chủ nhiệm)

Sản phẩm chủ yếu đạt được

Ghi chú*

1 Nguyễn Thị Ngọc

Tĩnh

Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh

Chủ nhiệm đề tài

2 GSTS Nguyễn Văn

Thanh

GSTS Nguyễn Văn Thanh

Cố vấn khoa học

3 Trần Nguyễn Ái

Hằng

Trần Nguyễn Ái Hằng

Phân lập các chủng probiotic, đánh giá in vitro

(Nội dung, thời gian, kinh phí,

địa điểm, tên tổ chức hợp tác,

số đoàn, số lượng người tham

1 Tên người và tổ chức hợp tác:

GSTS Peter Bossier,

Laboratory of Aquaculture &

Artemia Reference Center,

Ghent University, Belgium

Nội dung hợp tác: Trao đổi và

7 Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị:

(Nội dung, thời gian,

kinh phí, địa điểm ) Ghi chú*

1

2

- Lý do thay đổi (nếu có):

8 Tóm tắt các nội dung, công việc chủ yếu:

(Nêu tại mục 16 của thuyết minh, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo sát trong nước và nước ngoài)

1 Khảo sát phân lập tác nhân gây

bệnh Vibrio spp trên ấu trùng tôm

Ái Hằng

2 Phân lập các dòng vi khuẩn có khả

năng phân hủy phân tử quorum

sensing của vi khuẩn Gram âm

(AHL)

2.1 Thu mẫu ấu trùng tôm sú và cá

chẽm, nghiền mẫu, ly tâm và bảo

quản ở -800C

4/2008 – 6/2008

4/2008 – 6/2008;

1/2010 – 3/2010

Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh, Trần Nguyễn

Ái Hằng

2.2 Phân lập các dòng vi khuẩn có khả

năng phân hủy phân tử AHL 6/2008 – 9/2008 6/2008 – 9/2008;

4/2010 – 6/2010

Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh, Trần Nguyễn

Ái Hằng

3 Khảo sát các đặc tính probiotic

của các chủng vi khuẩn đã phân

lập ở điều kiện in vitro

10/2008 – 3/2009 10/2008 – 3/2009;

4/2010 – 6/2010

Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh, Trần Nguyễn

Ái Hằng

4 Khảo sát các đặc tính probiotic

của các chủng vi khuẩn đã phân

lập ở điều kiện in vivo (trên ấu

4/2009 – 6/2009;

4/2010 – 6/2010

Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh, Trần Nguyễn

Ái Hằng

4.2 Khảo sát các đặc tính probiotic

của các chủng vi khuẩn riêng lẻ và

hỗn hợp vi khuẩn ở qui mô pilot

4/2009 – 3/2010

4/2009 – 8/2010

Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh, Đặng Tố Vân Cầm, Vũ Hồng Như Yến

5/2009 – 9/2009

Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh, Trần Nguyễn

Ái Hằng

6 Nghiên cứu nhân sinh khối và

phối chế tạo chế phẩm vi sinh từ

các dòng vi khuẩn đã tuyển chọn,

khảo sát thời gian bảo quản

1/2010 – 9/2010 7/2010 – 12/2010 Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh, GSTS

Nguyễn Văn Thanh

- Lý do thay đổi (nếu có):

III SẢN PHẨM KH&CN CỦA ĐỀ TÀI

1 Qui trình công nghệ phân

lập và sản xuất sinh khối

chế phẩm vi sinh

Qui trình dễ áp dụng, tạo ra chế phẩm vi sinh ở qui mô 1kg / 3 giờ

Qui trình tạo ra chế phẩm vi sinh với công suất 2,5kg / 24 giờ

Số lượng, nơi công bố

(Tạp chí, nhà xuất bản)

1 Bài báo “Phân lập các

chủng vi khuẩn phân hủy

2 Báo cáo thuyết trình “Kết

quả phân lập các chủng vi

khuẩn probiotic đối kháng

Vibrio spp và bước đầu

ứng dụng trong ương nuôi

ấu trùng cá chẽm và tôm

sú”

Kỷ yếu Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc khu vực phía Nam năm

2009

- Lý do thay đổi (nếu có):

d) Kết quả đào tạo:

Số lượng

Số

TT

Cấp đào tạo, Chuyên

được

Ghi chú

(Thời gian kết thúc)

2 Tiến sỹ

- Lý do thay đổi (nếu có):

đ) Tình hình đăng ký bảo hộ quyền sở hữu công nghiệp, quyền đối với giống cây trồng:

- Lý do thay đổi (nếu có):

e) Thống kê danh mục sản phẩm KHCN đã được ứng dụng vào thực tế

Kết quả

sơ bộ

1

2

2 Đánh giá về hiệu quả do đề tài mang lại

a) Hiệu quả về khoa học và công nghệ:

(Nêu rõ danh mục công nghệ và mức độ nắm vững, làm chủ, so sánh với trình độ công

nghệ so với khu vực và thế giới…)

Với các kết quả nghiên cứu đạt được, đề tài sẽ đóng góp vào lĩnh vực KH&CN

có liên quan đến việc nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học trong việc phân lập và

tạo chế phẩm vi sinh có đặc tính ức chế quorum sensing và đối kháng nhóm vi khuẩn

gây bệnh và ứng dụng trong sản xuất giống tôm sú và cá biển, đồng thời xây dựng qui trình cho các đối tượng thủy sản khác

b) Hiệu quả về kinh tế xã hội:

(Nêu rõ hiệu quả làm lợi tính bằng tiền dự kiến do đề tài, dự án tạo ra so với các sản phẩm cùng loại trên thị trường…)

Các sản phẩm của đề tài có hiệu quả cao trong việc nâng cao tỉ lệ sống của ấu trùng tôm sú và cá biển Nếu có thể hạ giá thành so với các sản phẩm khác cùng loại sản xuất trong nước thì sẽ có sức cạnh tranh cao, đồng thời tạo ra giá trị thặng dư thông qua việc ứng dụng sản phẩm vào sản xuất và đời sống

3 Tình hình thực hiện chế độ báo cáo, kiểm tra của đề tài

Lần 1 6/2008 Đề tài đã hoàn thành những nội dung công

việc của 6 tháng đầu năm 2008

Lần 2 12/2008 Đề tài thực hiện đúng tiến độ, đã hoàn thành

nội dung 1 và 2 và đang thực hiện nội dung 3Lần 3 6/2009 Đã hoàn thành nội dung 3 và đang thực hiện

thử nghiệm quy mô pilot

Lần 4 12/2009 Đã xác định 2 hỗn hợp vi khuẩn có thể sử

dụng làm chế phẩm vi sinh cho ấu trùng cá biển và 1 hỗn hợp có thể sử dụng làm chế phẩm vi sinh cho ấu trùng tôm sú

Lần 5 6/2010 Đã hoàn thành nội dung 4 nhưng chậm 3

tháng so với tiến độ Đang thực hiện nội dung 5 và 6

Lần 6 10/2010 Đang tiếp tục định danh và thử nghiệm ở

điều kiện trại giống Đề tài thực hiện đúng tiến độ so với thuyết minh và hợp đồng

Lần 3 8/2010 Đề nghị CNĐT khẩn trương hoàn thiện và

làm báo cáo tổng kết Chuẩn bị đầy đủ hồ sơ

để nghiệm thu đề tài đúng thời hạn

III Nghiệm thu cơ

sở 12/2010 Đề tài được xếp loại “Đạt”, đủ điều kiện đánh giá kết quả đề tài ở cấp Nhà nước

MỤC LỤC

Chương 1 - MỞ ĐẦU 1

1.1 Giới thiệu về sự hình thành đề tài 1

1.2 Mục tiêu và phạm vi nghiên cứu 1

1.3 Tính cấp thiết 1

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2

1.5 Tổng quan về tình hình nghiên cứu 2

1.5.1 Tình hình nghiên cứu bệnh do Vibrio gây ra trên động vật thủy sản 2

1.5.2 Probiotic – giải pháp thay thế kháng sinh 5

1.5.3 Bẻ gãy hệ thống quorum sensing ở vi khuẩn gây bệnh – phương pháp tiếp cận mới trong việc kiểm soát bệnh 7

1.5.4 Tình hình nghiên cứu và sản xuất chế phẩm vi sinh trong nuôi trồng thủy sản trong và ngoài nước 13

Chương 2 – KHẢO SÁT PHÂN LẬP TÁC NHÂN GÂY BỆNH Vibrio spp TRÊN ẤU TRÙNG TÔM SÚ VÀ CÁ CHẼM 17

2.1 Vật liệu nghiên cứu 17

2.1.1 Tôm, cá thí nghiệm 17

2.1.2 Chủng vi khuẩn 17

2.2 Phương pháp nghiên cứu 17

2.3 Kết quả nghiên cứu 19

2.3.1 Thí nghiệm gây nhiễm trên ấu trùng tôm sú 19

2.3.1.1 Thí nghiệm 1 20

2.3.1.2 Thí nghiệm 2 20

2.3.1.3 Thí nghiệm 3 20

2.3.1.4 Thí nghiệm 4 21

2.3.1.5 Thí nghiệm 5 21

2.3.1.6 Thí nghiệm 6 22

2.3.2 Thí nghiệm gây nhiễm trên cá chẽm hương 23

2.3.2.1 Thí nghiệm 1 23

2.3.2.2 Thí nghiệm 2 23

2.3.2.3 Thí nghiệm 3 23

2.3.2.4 Thí nghiệm 4 24

2.3.2.5 Thí nghiệm 5 24

2.3.2.6 Thí nghiệm 6 25

Chương 3 – PHÂN LẬP CÁC CHỦNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY PHÂN TỬ QUORUM SENSING CỦA VI KHUẨN GRAM ÂM 26

3.1 Vật liệu nghiên cứu 26

3.2 Phương pháp nghiên cứu 26

3.2.1 Thu nhận hệ vi sinh vật đường ruột 26

3.2.2 Phân lập vi khuẩn có đặc tính phân hủy phân tử AHL 27

3.2.3 Định danh bằng phương pháp sinh hóa 27

a) Nhuộm Gram 27

b) Định danh 27

3.3 Kết quả nghiên cứu 28

3.3.1 Biến động giá trị pH của môi trường phân lập 28

3.3.2 Mật độ vi sinh vật qua các đợt phân lập 30

3.3.3 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn phân hủy AHL qua các chu kỳ phân lập 31

3.3.4 Kết quả định danh bằng phương pháp sinh hóa 31

Chương 4 – KHẢO SÁT CÁC ĐẶC TÍNH PROBIOTIC CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN PHÂN HỦY QUORUM SENSING Ở ĐIỀU KIỆN IN VITRO 33

4.1 Vật liệu nghiên cứu 33

4.2 Phương pháp nghiên cứu 33

4.2.1 Khảo sát khả năng phân hủy phân tử HHL 33

4.2.2 Khảo sát khả năng đối kháng Vibrio gây bệnh 35

4.3 Kết quả nghiên cứu 36

4.3.1 Khảo sát khả năng phân hủy phân tử HHL 36

4.3.1.1 Khả năng phân hủy HHL của nhóm vi khuẩn phân lập từ cá chẽm hương 36

4.3.1.2 Khả năng phân hủy HHL của nhóm vi khuẩn phân lập từ tôm sú thương phẩm 37

4.3.1.3 Khả năng phân hủy HHL của nhóm vi khuẩn phân lập từ tôm sú post 38

4.3.2 Khảo sát khả năng đối kháng Vibrio gây bệnh 39

Chương 5 – KHẢO SÁT CÁC ĐẶC TÍNH PROBIOTIC CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN PHÂN HỦY QUORUM SENSING Ở ĐIỀU KIỆN IN VIVO 42

5.1 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 42

5.1.1 Đánh giá tính an toàn đối với vật chủ (tôm sú post và cá chẽm hương) 42

5.1.2 Đánh giá khả năng bảo vệ vật chủ gây nhiễm với Vibrio spp 42

5.1.3 Khảo sát đặc tính tương thích 43

5.1.4 Khảo sát các đặc tính probiotic ở quy mô pilot 44

5.1.4.1 Thí nghiệm trên cá chẽm hương 44

5.1.4.2 Thí nghiệm trên ấu trùng tôm sú 46

5.1.5 Phương pháp xử l ý số liệu 49

5.2 Kết quả nghiên cứu 49

5.2.1 Đánh giá tính an toàn đối với vật chủ 49

5.2.1.1 Đánh giá tính an tòan đối với ấu trùng cá chẽm 49

a Nhóm vi khuẩn phân lập từ cá chẽm 49

b Nhóm vi khuẩn phân lập từ tôm sú 50

5.2.1.2 Đánh giá tính an tòan đối với ấu trùng tôm sú 51

a Nhóm vi khuẩn phân lập từ cá chẽm 51

b Nhóm vi khuẩn phân lập từ tôm sú 52

5.2.2 Đánh giá khả năng bảo vệ vật chủ gây nhiễm với Vibrio spp 53

5.2.2.1 Khả năng bảo vệ ấu trùng cá chẽm gây nhiễm với Vibrio parahaemolyticus 53

a Nhóm vi khuẩn phân lập từ cá chẽm 53

b Nhóm vi khuẩn phân lập từ tôm sú 54

5.2.2.2 Khả năng bảo vệ ấu trùng tôm sú gây nhiễm với Vibrio alginolyticus 54

a Nhóm vi khuẩn phân lập từ cá chẽm 54

b Nhóm vi khuẩn phân lập từ tôm sú 55

5.2.3 Khảo sát đặc tính tương thích giữa các chủng vi khuẩn 56

5.2.4 Khảo sát các đặc tính probiotic ở quy mô pilot 57

5.2.4.1 Thí nghiệm trên cá chẽm hương 57

a Thí nghiệm 1 57

b Thí nghiệm 2 60

c Thí nghiệm 3 63

d Thí nghiệm 4 66

5.2.4.2 Thí nghiệm trên ấu trùng tôm sú 71

a Thí nghiệm 1 71

b Thí nghiệm 2 72

c Thí nghiệm 3 75

d Thí nghiệm 4 78

Chương 6 – ĐỊNH DANH VÀ KHẢO SÁT CÁC ĐẶC TÍNH PROBIOTIC KHÁC CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN ĐÃ ĐƯỢC TUYỂN CHỌN 83

6.1 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 83

6.1.1 Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử 83

6.1.2 Khảo sát các đặc tính probiotic khác 83

6.1.2.1 Khả năng sinh bacteriocin 83

6.1.2.2 Khả năng sinh enzyme ngoại bào 85

a) Gelatinase 85

b) Caseinase 85

c) Amylase 85

d) Cellulase 86

e) Lipase 86

6.1.2.3 Khả năng tương tác với vi tảo 86

6.1.3 Khảo sát khả năng sinh hemolysin 87

6.2 Kết quả nghiên cứu 87

6.2.1 Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử 87

6.2.2 Khảo sát các đặc tính probiotic khác 89

6.2.2.1 Xác định bản chất của hợp chất đối kháng 89

a Khảo sát khả năng đối kháng với các chủng vi khuẩn kiểm định theo thời gian nuôi cấy 89

b Khảo sát sự thay đổi pH của môi trường 92

6.2.2.2 Khả năng sinh enzyme ngoại bào 93

6.2.2.3 Khảo sát sự tương tác với vi tảo 93

a Thí nghiệm 1 93

b Thí nghiệm 2 94

6.2.3 Khả năng sinh hemolysin 95

Chương 7 – NGHIÊN CỨU NHÂN SINH KHỐI VÀ PHỐI CHẾ TẠO CHẾ PHẨM VI SINH 96

7.1 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 96

7.1.1 Khảo sát sự tăng trưởng của các chủng vi khuẩn tuyển chọn ở các điều kiện nuôi cấy khác nhau 96

7.1.2 Tạo chế phẩm vi sinh từ các hỗn hợp vi khuẩn đã tuyển chọn, khảo sát thời gian bảo quản 96

7.1.2.1 Thiết bị và chất mang sử dụng 96

7.1.2.2 Thí nghiệm khảo sát tỉ lệ phối trộn và nhiệt độ bảo quản tối ưu 97

7.1.3 Thử nghiệm sản phẩm ở điều kiện trại giống 98

7.2 Kết quả nghiên cứu 98

7.2.1 Khảo sát sự tăng trưởng của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 98

a Khảo sát sự tăng trưởng trong các môi trường khác nhau 98

b Khảo sát sự tăng trưởng ở các giá trị pH khác nhau 99

c Khảo sát sự tăng trưởng ở các giá trị nhiệt độ khác nhau 99

d Khảo sát đường cong tăng trưởng theo thời gian 100

7.2.2 Xác định chất mang, tỉ lệ phối trộn và nhiệt độ bảo quản tối ưu 101

a Xác định chất mang thích hợp 101

b Xác định tỉ lệ phối trộn và nhiệt độ bảo quản tối ưu 101

7.2.3 Kết quả thử nghiệm sản phẩm ở điều kiện sản xuất 103

a Kết quả thử nghiệm ở trại giống cá chẽm 103

b Kết quả thử nghiệm ở trại giống tôm sú 104

Chương 8 – CÁC KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC VÀ THẢO LUẬN 105

8.1 Các kết quả khoa học công nghệ 105

8.1.1 Khảo sát tác nhân gây bệnh Vibrio spp trên ấu trùng tôm sú và cá chẽm 105

8.1.2 Phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy phân tử quorum sensing (phân tử AHL) của vi khuẩn Gram âm 105

8.1.3 Khảo sát các đặc tính probiotic của các chủng vi khuẩn đã sàng lọc ở điều kiện in vitro 106

8.1.3.1 Khảo sát khả năng phân hủy phân tử HHL 106

8.1.3.2 Khảo sát khả năng đối kháng Vibrio spp 106

8.1.4 Khảo sát các đặc tính probiotic của các chủng vi khuẩn đã sàng lọc ở điều kiện in vivo 106

8.1.4.1 Khảo sát khả năng bảo vệ vật chủ gây nhiễm với Vibrio spp ở điều kiện phòng thí nghiệm 106

8.1.4.2 Khảo sát các đặc tính probiotic ở quy mô pilot 108 8.1.5 Xác định thành phần loài và định danh các hỗn hợp vi khuẩn đã tuyển chọn 109

8.1.6 Nghiên cứu nhân sinh khối và phối chế tạo chế phẩm vi sinh từ các hỗn hợp

vi khuẩn đã tuyển chọn, thử nghiệm lại ở điều kiện trại giống 109

8.2 Các sản phẩm khoa học và công nghệ 111

8.3 Tác động đối với kinh tế, xã hội và môi trường 112

8.3.1 Hiệu quả kinh tế trực tiếp 112

8.3.2 Mức độ tác động đối với kinh tế, xã hội và môi trường 112

8.3.3 Mức độ sẵn sàng thương mại hóa kết quả nghiên cứu 112

Chương 9 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 113

9.1 Kết luận 113

9.2 Kiến nghị 114

TÀI LIỆU THAM KHẢO 116

thủy sản 8 Bảng 2.1 Tỉ lệ sống của ấu trùng tôm sú (%) sau 24 giờ gây nhiễm (thí nghiệm 2) 20 Bảng 2.2 Tỉ lệ sống của ấu trùng tôm sú (%) sau 24 giờ gây cảm nhiễm

(thí nghiệm 3) 21 Bảng 2.3 Tỉ lệ sống của ấu trùng tôm sú (%) sau 24 giờ gây cảm nhiễm

(thí nghiệm 4) 21 Bảng 2.4 Tỉ lệ sống của ấu trùng tôm sú (%) sau 24 giờ gây cảm nhiễm

(thí nghiệm 5) 22 Bảng 2.5 Tỉ lệ sống của ấu trùng tôm sú (%) sau 24 giờ gây cảm nhiễm

(thí nghiệm 6) 22 Bảng 2.6 Tỉ lệ sống của cá chẽm hương (%) sau 48 giờ gây cảm nhiễm

(thí nghiệm 2) 23 Bảng 2.7 Tỉ lệ sống của cá chẽm hương (%) sau 48 giờ gây cảm nhiễm

(thí nghiệm 3) 24 Bảng 2.8 Tỉ lệ sống của cá chẽm hương (%) sau 48 giờ gây cảm nhiễm

(thí nghiệm 4) 24 Bảng 2.9 Tỉ lệ sống của cá chẽm hương (%) sau 48 giờ gây cảm nhiễm

(thí nghiệm 5) 25 Bảng 2.10 Tỉ lệ sống của cá chẽm hương (%) sau 48 giờ gây cảm nhiễm

(thí nghiệm 6) 25

Bảng 3.1 Khoảng biến thiên giá trị pH ở các nghiệm thức qua các đợt phân lập 28

Bảng 4.1 Kết quả tổng hợp các đặc tính probiotic in vitro của các chủng vi khuẩn khảo sát 40

Bảng 5.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm trên cá chẽm hương (quy mô pilot) 46

Bảng 5.2 Chế độ thay nước và cho ăn đối với ấu trùng tôm sú thí nghiệm 47

Bảng 5.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm trên ấu trùng tôm sú (quy mô pilot) 48

Bảng 5.4 Tỉ lệ RPS (%) trên ấu trùng cá chẽm 48 giờ sau khi bổ sung các chủng vi khuẩn phân lập từ cá chẽm và gây nhiễm với Vibrio parahaemolyticus 53

Bảng 5.5 Tỉ lệ RPS (%) trên ấu trùng cá chẽm 48 giờ sau khi bổ sung các chủng vi khuẩn phân lập từ tôm sú và gây nhiễm với Vibrio parahaemolyticus 54

Bảng 5.6 Tỉ lệ RPS (%) trên ấu trùng tôm sú 24 giờ sau khi bổ sung các chủng vi khuẩn phân lập từ cá chẽm và gây nhiễm với Vibrio alginolyticus 55

Bảng 5.7 Tỉ lệ RPS (%) trên ấu trùng tôm sú 24 giờ sau khi bổ sung các chủng vi khuẩn phân lập từ tôm sú và gây nhiễm với Vibrio alginolyticus 55

Bảng 5.8 Đặc tính tương thích của 13 chủng vi khuẩn tuyển chọn 56

Bảng 6.1 Đặc điểm hình thái và kết quả định danh của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 88

Bảng 6.2 Hoạt tính đối kháng của các chủng vi khuẩn tuyển chọn theo thời gian nuôi cấy 90

Bảng 6.3 Giá trị pH của môi trường sau thời gian nuôi cấy 92

Bảng 6.4 Hoạt tính các enzyme ngoại bào của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 93

Bảng 7.1 Bố trí thí nghiệm khảo sát tăng trưởng của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 96

Bảng 7.2 Bố trí thí nghiệm khảo sát tỉ lệ phối trộn và nhiệt độ bảo quản đối với các chế phẩm vi sinh 97

Bảng 7.3 Mật độ vi khuẩn (log CFU/ml) sau 48 giờ nuôi cấy trong các môi trường khác nhau 98 Bảng 7.4 Mật độ vi khuẩn (log CFU/ml) sau 48 giờ nuôi cấy ở các giá trị pH

khác nhau 99 Bảng 7.5 Mật độ vi khuẩn (log CFU/ml) sau 48 giờ nuôi cấy ở các giá trị nhiệt độ khác nhau 100 Bảng 7.6 Độ ẩm của sản phẩm ở các tỉ lệ phối trộn khác nhau 102 Bảng 7.7 Mật độ vi khuẩn tổng số trong sản phẩm ở các nhiệt độ bảo quản và ở các thời điểm khác nhau 103 Bảng 7.8 Kết quả thử nghiệm sản phẩm BioFish-RIA2 104 Bảng 7.9 Kết quả thử nghiệm sản phẩm BioShrimp-RIA2 104 Bảng 8.1 Các chủng vi khuẩn đạt giá trị RPS cao nhất ở các thí nghiệm gây nhiễm trên

ấu trùng tôm sú và cá chẽm 107 Bảng 8.2 Kết quả định danh của bốn chủng được tuyển chọn 109 Bảng 8.3 Các sản phẩm khoa học và công nghệ của đề tài 111

DANH SÁCH HÌNH VÀ ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Hệ thống quorum sensing ở Vibrio harveyi 10

Hình 1.2 Sơ đồ các phương pháp bẻ gãy quá trình quorum sensing ở vi khuẩn 11 Hình 1.3 Quá trình phân hủy phân tử AHL bằng enzyme 12

Hình 2.1 Toàn cảnh bố trí thí nghiệm gây nhiễm để khảo sát tác nhân gây bệnh

Vibrio spp 19

Hình 3.1 Sơ đồ qui trình phân lập vi khuẩn phân hủy phân tử AHL 29 Hình 3.2 Mật độ vi sinh vật trung bình (log CFU/ml) qua các chu kỳ và qua các đợt phân lập 30 Hình 4.1 Mức độ phân hủy khác nhau đối với phân tử HHL bởi các chủng vi khuẩn khảo sát 34

Hình 4.2 Thí nghiệm khảo sát đặc tính đối kháng Vibrio spp ở điều kiện in vitro 36

Hình 4.3 Biến động nồng độ HHL theo thời gian ở các nghiệm thức có bổ sung các chủng vi khuẩn phân lập từ cá chẽm hương 36 Hình 4.4 Biến động nồng độ HHL theo thời gian ở các nghiệm thức có bổ sung các chủng vi khuẩn phân lập từ tôm sú thương phẩm 38

Hình 4.5 Biến động nồng độ HHL theo thời gian ở các nghiệm thức có bổ sung các chủng vi khuẩn phân lập từ tôm sú post 39

Hình 5.1 Bố trí thí nghiệm khảo sát đặc tính probiotic ở điều kiện in vivo (phòng thí

nghiệm) 43 Hình 5.2 Toàn cảnh bố trí thí nghiệm trên cá chẽm hương tại Trung tâm quốc gia giống hải sản Nam Bộ 45 Hình 5.3 Toàn cảnh bố trí thí nghiệm trên ấu trùng tôm sú tại Trại Thực nghiệm Thủy sản Bạc Liêu 47 Hình 5.4 Tỉ lệ sống của ấu trùng cá chẽm 48 giờ sau khi bổ sung các chủng vi khuẩn phân lập từ cá chẽm 50

Hình 5.5 Tỉ lệ sống của ấu trùng cá chẽm 48 giờ sau khi bổ sung các chủng vi khuẩn phân lập từ tôm sú thương phẩm và tôm sú post 50 Hình 5.6 Tỉ lệ sống của ấu trùng tôm sú 24 giờ sau khi bổ sung các chủng vi khuẩn phân lập từ cá chẽm 51 Hình 5.7 Tỉ lệ sống của ấu trùng tôm sú 24 giờ sau khi bổ sung các chủng vi khuẩn phân lập từ tôm sú thương phẩm và tôm sú post 52

Hình 5.8 Mật độ Vibrio tổng số trung bình trong nước bể ương cá chẽm (Thí

nghiệm 1) 58 Hình 5.9 Tỉ lệ sống của ấu trùng cá chẽm tại thời điểm 14 ngày (Thí nghiệm 1) 59

Hình 5.10 Mật độ Vibrio tổng số trung bình trong nước bể ương cá chẽm

(Thí nghiệm 2) 60 Hình 5.11 Tỉ lệ sống cá chẽm hương vào ngày tuổi thứ 30 (Thí nghiệm 2) 62 Hình 5.12 Chiều dài trung bình cá chẽm hương 30 ngày tuổi (Thí nghiệm 2) 63

Hình 5.13 Mật độ Vibrio tổng số trung bình trong nước bể ương cá chẽm (Thí

nghiệm 3) 64 Hình 5.14 Tỉ lệ sống cá chẽm hương vào ngày tuổi thứ 30 (Thí nghiệm 3) 65 Hình 5.15 Chiều dài cá chẽm hương vào ngày tuổi thứ 30 (Thí nghiệm 3) 66

Hình 5.16 Mật độ Vibrio tổng số trung bình trong nước bể ương cá chẽm

(Thí nghiệm 4) 68 Hình 5.17 Tỉ lệ sống cá chẽm hương vào ngày tuổi thứ 30 (Thí nghiệm 4) 69 Hình 5.18 Trọng lượng khô cá thể cá chẽm hương vào ngày tuổi thứ 30 (Thí

Hình 5.22 Mật độ Vibrio tổng số trung bình trong nước bể ương tôm sú (Thí

nghiệm 3) 76 Hình 5.23 Tỉ lệ sống ấu trùng tôm sú ở giai đọan PL13 (Thí nghiệm 3) 77 Hình 5.24 Chiều dài thân ấu trùng tôm sú ở giai đọan PL13 (Thí nghiệm 3) 78

Hình 5.25 Mật độ Vibrio tổng số trung bình trong nước bể ương tôm sú (Thí

nghiệm 4) 80 Hình 5.26 Tỉ lệ sống ấu trùng tôm sú ở giai đọan PL13 (Thí nghiệm 4) 81 Hình 5.27 Chiều dài thân ấu trùng tôm sú ở giai đọan PL13 (Thí nghiệm 4) 82 Hình 6.1 Kết quả nhộm Gram các chủng vi khuẩn tuyển chọn 89

Hình 6.2 Diễn biến mật độ tảo Chlorella sp trong bình nuôi cấy không có và có bổ

sung các chủng vi khuẩn phân lập từ cá chẽm 94

Hình 6.3 Diễn biến mật độ tảo Chlorella sp trong bình nuôi cấy không có và có bổ

sung các chủng vi khuẩn phân lập từ tôm sú thương phẩm 95 Hình 7.1 Đường cong tăng trưởng của các chủng vi khuẩn tuyển chọn theo

thời gian 100

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AHL Acyl homoserine lactone

ANOVA Analysis of variance

BHL Butyryl homoserine lactone

CAI-1 Cholerae autoinducer 1

HAI-1 Harveyi autoinducer 1

HHL Hexanoyl homoserine lactone

TCBS Thiosulphate citrate bile salt

VEM Vietnamese effective microorganisms

WSSV White spot syndrome virus

Chương 1 - MỞ ĐẦU

1.1 Giới thiệu về sự hình thành đề tài

Đề tài “Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm chế phẩm vi sinh từ các dòng vi khuẩn

có đặc tính đối kháng Vibrio spp nhằm nâng cao tỉ lệ sống ấu trùng cá biển và tôm sú”

là đề tài thuộc chương trình công nghệ sinh học nông nghiệp, thủy sản, thực hiện trong

3 năm 2008 – 2010 và do Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II là cơ quan chủ trì

1.2 Mục tiêu và phạm vi nghiên cứu

Nghiên cứu xây dựng quy trình phân lập và tạo chế phẩm vi sinh từ các dòng vi khuẩn có đặc tính ức chế phân tử tín hiệu quorum sensing và đối kháng với nhóm

Vibrio gây bệnh, nhằm nâng cao chất lượng sản xuất giống (sinh trưởng, tỉ lệ sống) của

một số đối tượng nuôi thủy sản (tôm sú và cá biển), giảm thiểu tỉ lệ nhiễm bệnh do

nhóm Vibrio gây ra trên ấu trùng tôm sú và cá biển

Nội dung nghiên cứu của đề tài: Bao gồm 6 nội dung sau đây:

1 Khảo sát phân lập tác nhân gây bệnh Vibrio spp trên ấu trùng tôm sú và cá chẽm

2 Phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy phân tử quorum sensing của vi khuẩn Gram âm

3 Khảo sát các đặc tính probiotic của các chủng vi khuẩn phân hủy quorum sensing ở

điều kiện in vitro

4 Khảo sát các đặc tính probiotic của các chủng vi khuẩn phân hủy quorum sensing ở

điều kiện in vivo

5 Xác định thành phần loài và định danh các hỗn hợp vi khuẩn đã tuyển chọn

6 Nghiên cứu nhân sinh khối và phối chế tạo chế phẩm vi sinh từ các hỗn hợp vi khuẩn đã tuyển chọn

1.3 Tính cấp thiết

Trước tình hình sử dụng kháng sinh bừa bãi trong các trại sản xuất giống thủy sản và gây nên hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh, việc sử dụng chế phẩm

vi sinh (probiotic) đã trở thành một trong những cách tiếp cận mới thay thế cho việc sử dụng kháng sinh Tuy nhiên phần lớn các chế phẩm vi sinh sử dụng trong nước hiện nay đều có nguồn gốc ngoại nhập hoặc không rõ thành phần, chủng loại Ảnh hưởng của các chế phẩm này đến hệ vi sinh vật bản địa cũng không được kiểm tra Các chế phẩm vi sinh phân lập và sản xuất trong nước vẫn còn khá hạn chế Vì vậy việc phân lập các chế phẩm vi sinh có nguồn gốc bản địa nhằm sử dụng trong các trại sản xuất giống là rất cấp thiết

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Tôm sú (Penaeus monodon) và cá chẽm (Lates calcarifer) là những đối tượng

thủy sản có giá trị kinh tế cao ở Việt Nam Tuy nhiên tỉ lệ sống của ấu trùng (đặc biệt

là sau giai đoạn biến thái) của các đối tượng này thường không ổn định, việc nhiễm

bệnh do vi khuẩn (chủ yếu là nhóm Vibrio) chưa thể kiểm soát được, đặc biệt việc

nhiễm vi khuẩn phát sáng đang là vấn đề nan giải của các trại sản xuất giống tôm Bên cạnh đó, việc sử dụng kháng sinh không có kiểm soát đã gây nên hiện tượng kháng thuốc

Đa số các chế phẩm vi sinh được phân lập theo phương pháp truyền thống là dựa vào đặc tính ức chế sinh trưởng (đối kháng) với vi khuẩn gây bệnh Một trong những cách tiếp cận mới của thế giới hiện nay là phân lập những vi khuẩn probiotic có khả năng phân hủy phân tử tín hiệu quorum sensing liên quan đến độc lực của vi khuẩn gây bệnh Đề tài này kết hợp cả hai phương pháp tiếp cận, đó là phân lập các dòng vi khuẩn vừa có khả năng phân hủy quorum sensing vừa có khả năng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh Đây là cách tiếp cận khả thi và bền vững, vì chế phẩm vi sinh tạo ra không những ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn gây bệnh mà còn có khả năng ức chế độc lực của chúng, từ đó góp phần làm giảm thiểu tỉ lệ nhiễm bệnh của ấu trùng và tăng năng suất của các trại sản xuất giống

1.5 Tổng quan về tình hình nghiên cứu

1.5.1 Tình hình nghiên cứu bệnh do Vibrio gây ra trên động vật thủy sản

Cùng với việc thâm canh hóa nghề nuôi tôm trong những năm gần đây, tôm

nuôi trên toàn thế giới đang chịu ảnh hưởng của dịch bệnh, bao gồm cả bệnh do vi khuẩn và bệnh do virus Trong đa số trường hợp, dịch bệnh xảy ra là kết quả của sự thoái hóa môi trường và tôm bị stress [64] Đa số các bệnh nhiễm khuẩn xảy ra là do

tác nhân gây bệnh Vibrio spp (bệnh vibriosis), bao gồm các loài như Vibrio harveyi, V

alginolyticus, V parahaemolyticus, V penaeicida, và một số loài khác [62] Những

biểu hiện của bệnh vibriosis bao gồm bơi lờ đờ, họai tử mô và phụ bộ, tăng trưởng chậm, biến thái chậm, dị hình, phát sáng sinh học, đục cơ hoặc đốm đen trên thân [8]

Sự gia tăng về dịch bệnh vibriosis đã được chứng minh là có liên quan đến sự gia tăng

của mật độ quần thể Vibrio trong nước nuôi tôm [62]

Trong nhiều trường hợp, Vibrio spp là những vi khuẩn cơ hội, chỉ gây bệnh khi

vật chủ bị ức chế miễn dịch hoặc bị stress về mặt sinh lý [56] Mặc dù hầu hết các lòai nuôi thủy sản có thể bị ảnh hưởng bởi nhóm vi khuẩn này, những tổn thất nghiêm trọng

nhất được ghi nhận đối với nghề nuôi tôm he, và bệnh phát sáng do Vibrio đã trở thành

một trở ngại lớn đối với sản lượng tôm nuôi ở Nam Mỹ và châu Á [11] Những tổn thất gây ra bởi bệnh phát sáng ở các trại giống ở Indonesia vào năm 1991, đã lên đến 100 triệu USD Đa số các báo cáo về bệnh nhiễm khuẩn trên tôm đều gây ra bởi các lòai vi khuẩn cơ hội chứ không phải bởi các lòai gây bệnh bắt buộc, với tần số nhiễm bệnh tỉ

lệ thuận với mức độ nuôi thâm canh và điều kiện môi trường bất lợi [9]

Hiện nay người ta đã phân lập và định danh được 172 chủng vi khuẩn từ tôm

bệnh và tìm thấy khỏang 90% các chủng vi khuẩn thuộc nhóm Vibrio Trong đó V

harveyi và V campbellii có thể gây bệnh cho tôm sú giai đọan ấu niên, giai đọan giống

và cả giai đọan trưởng thành Theo Đỗ Thị Hòa (1996), bệnh do vi khuẩn có thể gây ra 45,3% hiện tượng chết ở tôm nuôi, trong đó hai nhóm gây tác hại lớn nhất là nhóm vi

khuẩn dạng sợi và nhóm Vibrio spp Các lòai Vibrio sau đây được xem là tác nhân gây bệnh nguy hiểm cho tôm nuôi ở Việt Nam: V alginolyticus, V parahaemolyticus, V

anguillarum, V harveyi, V vulnificus, V damsela, V penaeicida Trong đó, V harveyi

là lòai quan trọng nhất gây ra bệnh phát sáng trong các trại giống và trong ao nuôi tôm

sú Bệnh này xảy ra chủ yếu ở tôm giai đọan post-larvae Thông thường trong ao nuôi

tôm sú, bệnh thường xuất hiện vào khỏang 45 ngày đầu của vụ nuôi Tôm bị bệnh thường có dấu hiệu yếu, bơi lờ đờ, kém bắt mồi hoặc thậm chí bỏ ăn, trong bóng tối phát ra ánh sáng màu xanh liên tục

Azard và ctv (2005) cho biết bệnh do nhóm Vibrio spp hiện nay cũng đang là

vấn đề đáng lo ngại trong các hệ thống nuôi cá biển Hiện nay nhiều lòai cá biển có giá

trị kinh tế đang được nuôi phổ biến ở nhiều quốc gia châu Á như cá mú (Epinephelus spp.) và cá chẽm (Lates calcarifer) thường bị bệnh xuất huyết và lở lóet Ở Việt Nam,

từ mẫu cá bệnh xuất huyết lở lóet đã phân lập được một số lòai vi khuẩn như Vibrio

parahaemolyticus, V anguillarum và V alginolyticus [2]

Vibrio harveyi được biết đến như là loài vi khuẩn gây bệnh trên tôm nuôi trên

toàn thế giới [47] Các yếu tố độc lực khác nhau đã được xác định ở loài vi khuẩn này (Bảng 1.1)

Bảng 1.1 Các yếu tố độc lực liên quan đến quá trình phát sinh bệnh của Vibrio harveyi

[26]

Yếu tố độc lực Bacteriocin

Thể thực khuẩn làm tăng họat tính haemolysin

Chitinase Cysteine protease Haemolysin Lipase Lipopolysaccharide trọng lượng phân tử thấp

Luciferase Metalloprotease Proteases, phospholipases và siderophores Exotoxins nguồn gốc protein

Siderophores

Phương pháp phổ biến nhất để kiểm soát bệnh vibriosis là sử dụng kháng sinh hoặc các chất diệt khuẩn Tuy nhiên, việc lạm dụng kháng sinh đã dẫn đến sự gia tăng các dòng vi khuẩn kháng thuốc và nguy cơ tồn dư kháng sinh trong cơ thể tôm [22; 36]

Theo báo cáo của Karunasagar và ctv (1994), các chủng Vibrio harveyi kháng kháng

sinh đã được phân lập từ tất cả ấu trùng tôm sú nhiễm bệnh thu từ các trại giống ở Ấn

Độ Các chủng V harveyi này đã được chứng minh là đề kháng với bốn loại kháng sinh

mạnh như co-trimoxazole, erythromycin, streptomycin và chloramphenicol Nhằm ngăn ngừa những tổn thất do bệnh vibriosis gây ra trên tôm cả về mặt môi trường và kinh tế xã hội, cần phải có những giải pháp nhằm tăng sức đề kháng đối với mầm bệnh đồng thời giảm thiểu việc sử dụng kháng sinh và hóa chất [14]

1.5.2 Probiotic – giải pháp thay thế kháng sinh

Quá trình nuôi thâm canh được đặc trưng bởi sự tiếp xúc thường xuyên của tôm,

cá đối với các yếu tố stress về hóa học, vật lý và sinh học Số lượng lớn các chất hữu

cơ và vi khuẩn được đưa vào cùng với thức ăn và mật độ cao của tôm, cá sẽ dẫn đến sự tích lũy chất hữu cơ và vi khuẩn trong hệ thống nuôi [67] Theo các nguyên lý về sinh thái học, việc cung cấp chất hữu cơ không thường xuyên có khuynh hướng làm mất cân bằng hệ vi sinh theo hướng tăng tỉ lệ vi khuẩn cơ hội [10] Những điều kiện này lại là điều kiện bất lợi đối với tôm, cá nuôi [68]

Vì vậy, quản lý hệ vi sinh là rất quan trọng trong nuôi trồng thủy sản nhất là trong các hệ thống nuôi thâm canh Vadstein (1997) đưa ra ba yếu tố tương tác lẫn nhau cần thiết cho sự phát triển các điều kịên để đảm bảo tỉ lệ sống cao của tôm, cá Những yếu tố này bao gồm vật chủ, môi trường vi sinh và môi trường lý-hóa học

Vadstein và ctv (1993) đề nghị một sơ đồ chiến lược chung cho việc kiểm sóat

hệ vi sinh trong trại giống cá biển

Bảng 1.2 Các yếu tố cấu thành trong chiến lược kiểm sóat hệ vi sinh trong ương nuôi

ấu trùng thủy sản (phát triển từ sơ đồ của Vadstein và ctv, 1993)

Yếu tố Phương pháp

1 Giảm thiểu không chọn lọc hệ vi

sinh - Khử trùng bề mặt của trứng - Khử trùng thức ăn tự nhiên

2 Tăng cường có chọn lọc hệ vi khuẩn

có lợi / ức chế hệ vi khuẩn gây bệnh

- Nước nuôi chín muồi về hệ vi sinh

- Bổ sung các chủng vi khuẩn có lợi được chọn lọc (probiotic)

- Liệu pháp thể thực khuẩn

- Bẻ gãy hệ thống quorum sensing

3 Nâng cao sức đề kháng của ấu trùng - Kích thích cơ chế miễn dịch tự nhiên

Trong số các phương pháp nói trên, việc sử dụng probiotic như là cách tiếp cận thay thế cho việc sử dụng kháng sinh đã trở nên đầy hứa hẹn đối với nghề nuôi trồng thủy sản trong ba thập kỷ gần đây

Những nghiên cứu đầu tiên về vi khuẩn probiotic phân lập từ môi trường nuôi trồng thủy sản đã được báo cáo vào những năm 1980 [31; 40] Trong các hệ thống nuôi trồng thủy sản, mối tương tác giữa vi sinh vật và vật chủ không chỉ giới hạn trong đường ruột của vật chủ Vi khuẩn probiotic cũng có thể hoạt động trong mang, da và cả trong môi trường sống xung quanh của vật chủ Liên quan đến điều này, Verschuere và ctv (2000) đề nghị một định nghĩa cho phép mở rộng ứng dụng của thuật ngữ

“probiotic” trong nuôi trồng thủy sản Probiotic được định nghĩa như là một vi sinh vật sống được bổ sung vào để mang lại những ảnh hưởng có lợi cho vật chủ bởi khả năng tăng cường mối quan hệ đối với vật chủ hoặc là mối quan hệ giữa vật chủ với cộng đồng vi sinh vật xung quanh, làm tăng cường giá trị của dinh dưỡng, tăng cường khả năng phản ứng của vật chủ đối với bệnh tật, hoặc là cải thiện môi trường sống xung quanh Trong thời gian gần đây, hầu hết các nghiên cứu về probiotic được thực hiện trên nhóm cá, nhóm giáp xác, nhuyễn thể và thức ăn tự nhiên [49; 50; 71] Sự hình thành cộng đồng vi sinh vật trên cá và nhóm giáp xác, nhuyễn thể ở giai đoạn ấu trùng

là một giai đoạn chuyển tiếp và phản ánh hệ vi sinh vật tồn tại trên trứng, môi trường

nước nuôi và hệ vi sinh vật trong thức ăn tự nhiên trong suốt giai đoạn đầu của quá trình ương nuôi [55] Do đó, việc hình thành khu hệ vi sinh vật của ấu trùng thông qua việc bổ sung probiotic đang được xem như là một chiến lược để ưu tiên hình thành hệ

vi sinh vật có lợi cho ấu trùng trong quá trình ương nuôi [69]

1.5.3 Bẻ gãy hệ thống quorum sensing ở vi khuẩn gây bệnh – phương pháp tiếp cận mới trong việc kiểm soát bệnh

Vi khuẩn có thể giao tiếp với nhau sử dụng các phân tử tín hiệu hóa học Chúng sản xuất ra, tiếp nhận và điều hòa biểu hiện gen phụ thuộc vào những phân tử tín hiệu này Việc tiếp nhận các phân tử tín hiệu trong môi trường cho phép các tế bào vi khuẩn nhận biết được về mật độ quần thể của chính nó và của các quần thể lân cận, đồng thời kiểm sóat việc biểu hiện một số gen tùy thuộc vào sự thay đổi về mật độ tế bào Quá trình này được gọi là “quorum sensing”, có thể được hiểu là quá trình giao tiếp giữa các tế bào vi khuẩn Nhiều kiểu hình ở vi khuẩn được điều khiển bởi quá trình quorum sensing, bao gồm độc lực ở vi khuẩn gây bệnh, quá trình cộng sinh, sự sản xuất kháng sinh, sự tạo thành màng sinh học … [61]

Trong thế giới vi khuẩn tồn tại cả hai lọai ngôn ngữ quorum sensing, ngôn ngữ phổ biến và ngôn ngữ đặc hiệu, cho phép các tế bào vi khuẩn giao tiếp trong cùng một lòai và giữa các lòai khác nhau Quá trình quorum sensing ở vi khuẩn Gram âm được điều khiển bởi các phân tử N-acyl homoserine lactone (AHL), các phân tử này đều có cùng cấu trúc vòng homoserine lactone, nhưng có chiều dài và cấu trúc mạch acyl khác nhau tùy thuộc vào số phân tử cacbon (từ 4 đến 14 phân tử cacbon) [34] Ở vi khuẩn Gram dương, quá trình quorum sensing được điều khiển bởi các phân tử oligopeptide

có chiều dài 5 đến 17 amino acid [51]

Quá trình giao tiếp thông qua hệ thống tín hiệu LuxI/LuxR được xem như là cơ chế chuẩn được các vi khuẩn Gram âm sử dụng để thông tin liên lạc với nhau Hệ thống quorum sensing kiểu này được sử dụng để kiểm soát việc biểu hiện gen ở trên 25 loài vi khuẩn Gram âm [17; 52] Trong mọi trường hợp, AHL là một loại phân tử tín hiệu mà việc tổng hợp nó phụ thuộc vào protein kiểu LuxI Một protein khác (protein

kiểu LuxR) chịu trách nhiệm việc nhận biết phân tử tín hiệu AHL và sau đó là quá trình hoạt hóa việc phiên mã của một số gen đích Phân tử tín hiệu AHL đã được chứng minh là có liên quan đến quá trình quorum sensing ở nhiều tác nhân gây bệnh ở người

và thực vật, như Pseudomonas aeruginosa [59], Erwinia carotovora, Agrobacterium

tumefaciens [73], cũng như ở Vibrio harveyi [48] và những loài vi khuẩn gây bệnh

khác trong nuôi trồng thủy sản [23] Một số loại phân tử tín hiệu quorum sensing ở một

số vi khuẩn gây bệnh trên động vật thủy sản được tổng hợp trong bảng 1.3

Bảng 1.3 Một số phân tử tín hiệu của các loài vi khuẩn gây bệnh trên động vật thủy

sản [26]

Loài vi khuẩn Phân tử tín hiệu Độc lực liên quan đến quorum

sensing

Aeromonas hydrophila BHL, HHL Hình thành màng sinh học,

sản xuất protease ngoại bào

Aeromonas salmonicida BHL, HHL Sản xuất serine protease

Vibrio anguillarum ODHL Chưa biết

Vibrio harveyi BHL, AI-2 Sản xuất siderophore,

sản xuất các thành phần của hệ thống chất tiết loại III,

sản xuất các độc tố ngoại bào

Vibrio parahaemolyticus BHL, AI-2 Tạo nên sự mờ đục

BHL: N-Butyryl homoserine lactone; HHL: N-Hexanoyl homoserine lactone;

ODHL: N-oxo-decanoyl homoserine lactone; AI-2: autoinducer 2

Hành vi kiểm soát mật độ quần thể thông qua hệ thống quorum sensing có ý nghĩa sinh học lớn đối với các loài vi khuẩn gây bệnh, giúp cho chúng duy trì sự biểu hiện gen ở mức thấp khi mật độ quần thể thấp, đợi đến khi mật độ quần thể đạt đến ngưỡng cần thiết để vượt qua được hệ miễn dịch thì lúc đó chúng mới bắt đầu tấn công vào vật chủ Quorum sensing cũng có ý nghĩa khi vi khuẩn chuyển từ dạng sống tự do trong môi trường sang dạng tạo thành khuẩn lạc hay màng sinh học [20]

Hệ thống quorum sensing đã được phát hiện ở loài vi khuẩn gây bệnh Vibrio

harveyi từ khá lâu Đây là một hệ thống gồm ba đường dẫn vận hành song song, với ba

loại phân tử tín hiệu: HAI-1 (harveyi autoinducer 1), AI-2 (autoinducer 2), CAI-1 (cholerae autoinducer 1) Hệ thống này điều khiển một số yếu tố độc lực như quá trình phát sáng sinh học [18; 19; 35], metalloprotease [53], siderophore, và sự tiết ra exopolysaccharide [46], phụ thuộc vào mật độ quần thể tế bào

Cơ chế hoạt động của hệ thống quorum sensing ở V harveyi được mô tả ở hình

1 HAI-1 là một phân tử AHL (N-Butyryl homoserine lactone), quá trình sinh tổng hợp của nó được xúc tác bởi enzyme LuxM AI-2 là một phân tử furanosyl borate diester, quá trình sinh tổng hợp của nó được xúc tác bởi enzyme LuxS [26; 65] Trong khi đó, cấu trúc phân tử của CAI-1 chưa được xác định, quá trình sinh tổng hợp của nó được xúc tác bởi enzyme CqsA [65] Gần đây, Defoirdt và ctv (2006) phát hiện hệ thống

quorum sensing tương tự cũng hiện diện ở V campbellii và V parahaemolyticus

Có hai chiến lược chủ yếu trong việc kiểm soát bệnh nhiễm khuẩn, hoặc giết chết vi khuẩn gây bệnh, hoặc làm suy giảm độc lực của nó để sau đó mầm bệnh không thể thích nghi với môi trường bên trong vật chủ hoặc dễ dàng bị đào thải bởi hệ miễn dịch tự nhiên của vật chủ Việc phát hiện ra hệ thống quorum sensing ở vi khuẩn, có chức năng gắn liền với việc sản xuất ra các hợp chất trao đổi chất thứ cấp hoặc những yếu tố liên quan đến độc lực ở vi khuẩn gây bệnh, là tiền đề cho cách tiếp cận thứ hai [32]

Việc bẻ gãy hệ thống quorum sensing ở vi khuẩn gây bệnh đã được đề nghị như

là cách tiếp cận mới trong việc kiểm soát bệnh nhiễm khuẩn trong nuôi trồng thủy sản [26] Một số phương pháp bẻ gãy hệ thống quorum sensing đã được nghiên cứu, bao gồm (Hình 1.2):

(A) Ức chế quá trình sinh tổng hợp phân tử tín hiệu quorum sensing;

Hình 1.1 Hệ thống quorum sensing ở Vibrio harveyi [65]

(B) Ứng dụng các hợp chất đối kháng quorum sensing;

(C) Phân hủy sinh học bằng các enzyme của vi khuẩn;

(D) Sử dụng các hợp chất đồng dạng để kích thích vượt mức hiện tượng quorum sensing

Phương pháp tiếp cận (D) khai thác khả năng phân hủy phân tử AHL, phân bố rộng rãi trong thế giới vi khuẩn Những enzyme có thể phân hủy phân tử AHL đã được phát hiện ở nhiều lòai vi khuẩn thuộc nhóm β-Proteobacteria [75], α- Proteobacteria và γ- Proteobacteria [66], cũng như ở một số lòai thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương [28] Những lòai vi khuẩn thuộc các nhóm này có khả năng khóa hệ thống quorum sensing của những lòai vi khuẩn cạnh tranh để đạt được ưu thế chọn lọc Quá trình bẻ gãy các phân tử tín hiệu AHL có thể được xúc tác bởi hai lọai enzyme: AHL-acylase và AHL-lactonase (Hình 1.3)

Enzyme AHL-acylase có khả năng bẻ gãy mạch cacbon, phân hủy AHL thành acid béo và homoserine lactone [29; 45; 72], tuy nhiên không làm thay đổi nhiều đến cấu trúc của phân tử AHL Trong khi đó enzyme AHL-lactonase, điều khiển bởi gen

Hình 1.2 Sơ đồ các phương pháp bẻ gãy quá trình quorum sensing ở vi khuẩn [26]

aiiA, có khả năng phân hủy phân tử AHL bằng cách xúc tác phản ứng mở vòng lactone

Điều này dẫn đến sự thay đổi về cấu trúc hình thể tương đối của phân tử AHL, gây trở ngại cho việc gắn kết của phân tử AHL với protein điều tiết việc phiên mã LuxR, vì vậy một số kiểu hình (trong đó có yếu tố độc lực ở vi khuẩn gây bệnh) không thể được biểu hiện

Hình 1.3 Quá trình phân hủy phân tử AHL bằng enzyme

Có khá nhiều báo cáo về các chủng vi khuẩn phân lập từ đất hoặc từ thực vật có khả năng phân hủy phân tử AHL tiết ra bởi các vi khuẩn gây bệnh, vì vậy có tiềm năng được sử dụng như là tác nhân kiểm soát sinh học trong việc phòng bệnh Vi khuẩn tổng hợp AHL và vi khuẩn phân hủy AHL luôn luôn cùng tồn tại trong mỗi hệ sinh thái, chúng phát triển những chiến lược khác nhau để đạt được ưu thế cạnh tranh Từ quần

xã vi sinh vật phân lập từ màng sinh học tạo thành trong hệ thống xử l ý nước, người ta phân lập được hai nhóm vi khuẩn sản xuất ra phân tử AHL, và ba chủng thuộc các loài

Agrobacterium tumefaciens, Bacillus cereus và Ralstonia biểu hiện các enzyme phân

hủy AHL [37] Theo báo cáo của Dong và ctv (2004), vi khuẩn Bacillus thuringiensis

có khả năng ức chế độc lực của vi khuẩn gây bệnh trên thực vật Erwinia carotovora bằng cách can thiệp vào quá trình sinh tổng hợp AHL Tương tự, chủng Acinetobacter

C1010 phân lập từ rễ cây dưa chuột có khả năng phân hủy phân tử AHL tiết ra bởi vi

khuẩn gây bệnh Burkholderia glumae [41], và chủng vi khuẩn phân lập từ đất

Variovorax paradoxus có khả năng tăng trưởng trong môi trường chứa phân tử AHL

như là nguồn cacbon và nitơ duy nhất [44] Uroz và ctv (2003) thu thập hỗn hợp vi

sinh vật từ rễ cây thuốc lá và nuôi cấy trong môi trường tối thiểu chứa ammonium sulfate như là nguồn nitơ và N-hexanoyl homoserine lactone như là nguồn cacbon, kết quả đã phân lập và định danh được một số chủng vi khuẩn phân hủy AHL thuộc 4 chi

Pseudomonas, Comamonas, Variovorax và Rhodococcus Trong những năm gần đây

đã có một số nghiên cứu về phân lập các dòng vi khuẩn phân hủy AHL và ứng dụng trong ương nuôi ấu trùng động vật thủy sản như ấu trùng cá bơn [63] và ấu trùng tôm càng xanh [24] Trong cả hai nghiên cứu này, việc bổ sung hỗn hợp các phân tử AHL vào nước bể ương đã làm giảm đáng kể tỉ lệ sống của ấu trùng, gián tiếp thông qua việc kích thích sự gia tăng độc lực của các lòai vi khuẩn có hại tồn tại trong môi trường nước nuôi (khi bổ sung 1ppm AHL, tỉ lệ sống giảm xuống chỉ còn 2,1% đối với ấu trùng cá bơn và 37,3% đối với ấu trùng tôm càng xanh) Ngược lại, việc bổ sung các hỗn hợp vi khuẩn phân hủy AHL vào bể ương (bổ sung trực tiếp vào nước và làm giàu thông qua thức ăn tự nhiên) đã giúp cải thiện đáng kể tỉ lệ sống của ấu trùng (tỉ lệ sống đạt 94,3% đối với ấu trùng cá bơn và 77,7% đối với ấu trùng tôm càng xanh)

1.5.4 Tình hình nghiên cứu và sản xuất chế phẩm vi sinh trong nuôi trồng thủy sản trong và ngoài nước

Ngoài nước: Trong ba thập kỷ qua, việc sử dụng chế phẩm vi sinh (probiotics)

để thay thế cho việc sử dụng thuốc kháng sinh đã trở thành một bước tiếp cận đầy hứa hẹn trong nuôi trồng thủy sản, đặc biệt là trong việc ương nuôi ấu trùng cá và giáp xác Những nghiên cứu đầu tiên trong việc phân lập probiotic từ môi trường nuôi thủy sản

đã được báo cáo vào cuối thập kỷ 1980 [31; 40] Trong các hệ thống nuôi thủy sản, sự tương tác giữa vi sinh vật và vật chủ không chỉ giới hạn trong hệ tiêu hoá Probiotic cũng có thể hoạt động trên mang hoặc da cá hoặc trong môi trường nuôi Vì vậy, Verschuere và ctv (2000) đã đề nghị một định nghĩa mới cho probiotic, cho phép ứng dụng thuật ngữ “probiotic” trong nuôi trồng thủy sản Probiotic là tế bào vi sinh vật sống có ảnh hưởng có lợi đối với vật chủ, bằng cách làm thay đổi hệ vi sinh vật trong môi trường nuôi, bằng cách làm gia tăng hiệu quả sử dụng thức ăn hoặc giá trị dinh dưỡng của thức ăn, làm gia tăng sức đề kháng của vật chủ đối với bệnh, hoặc cải thiện

chất lượng của môi trường nuôi Trong những năm gần đây có khá nhiều công trình tổng quan về tình hình sử dụng probiotic trong nuôi trồng thủy sản [39; 16; 71] Những nghiên cứu probiotic trong thời gian gần đây đã chú ý nhiều hơn đến ứng dụng cho ấu trùng cá và giáp xác và cho thức ăn tự nhiên [49; 50; 71] Việc điều chỉnh hệ vi sinh của ấu trùng tôm cá thông qua việc bổ sung probiotic đã được đề nghị như một phương pháp để đưa những vi sinh vật có lợi vào trong hệ tiêu hoá của ấu trùng [69]

Trong nước: Trong những năm gần đây, để giảm thiểu những bất lợi do sử dụng hóa chất trong nuôi trồng thủy sản, việc nghiên cứu và sử dụng các chế phẩm sinh học

để phòng bệnh và cải thiện môi trường trong quá trình nuôi tôm ở nước ta đang phát triển mạnh Theo Cục Bảo vệ nguồn lợi thủy sản, hiện có khoảng trên 200 thương hiệu chế phẩm sinh học và vitamin đang bán trên thị trường nước ta Đa số các chế phẩm sinh học có nguồn gốc nhập ngoại, giá bán của các loại chế phẩm này khá cao, nên đã gây khó khăn cho người nuôi trồng thủy sản trong việc lựa chọn một sản phẩm vừa đạt chất lượng vừa có giá thành rẻ Với lý do đó, các Viện nghiên cứu, các nhà khoa học trong nước với sự hỗ trợ kinh phí từ Nhà nước đã nghiên cứu thành công một số các chế phẩm sinh học có giá thành tương đối rẻ nhưng chất lượng thì không thua các sản phẩm của nước ngòai

Các nhà khoa học tại Viện hóa học các hợp chất thiên nhiên đã nghiên cứu và sản xuất thành công chế phẩm EBS2 để bổ sung vào thức ăn trong nuôi trồng thủy sản EBS2 có vai trò quan trọng như những vitamin kích thích trong quá trình sinh trưởng của các đối tượng nuôi trồng thủy sản Kết quả thử nghiệm với cua biển cho thấy trong

22 ngày đầu lô cua dùng thức ăn tổng hợp có bổ sung EBS2 đạt tốc độ tăng trưởng 3,5% Trong khi đó lô không bổ sung EBS2 có tốc độ tăng trưởng là 0,9% và lô dùng thức ăn tự nhiên có tốc độ tăng trưởng là 0,5%

Tiến sĩ Nguyễn Hữu Phúc, Viện Sinh học Nhiệt đới Tp.HCM đã nghiên cứu chế tạo thành công hai chế phẩm sinh học để nuôi tôm Hai chế phẩm này có tên là Probact dùng để trộn vào thức ăn của tôm, và Ecobact dùng để xử lý môi trường nước trong ao nuôi tôm Hai chế phẩm sinh học này có tác dụng giảm thiểu vi sinh vật gây bệnh cho

tôm, cải thiện chất lượng nước và bùn trong các ao nuôi tôm (góp phần tăng tính miễn dịch cho tôm trong quá trình nuôi) Bước đầu hai chế phẩm này đã được sử dụng thử nghiểm tại một số hộ nông dân ở huyện Cần Giờ, Nhà Bè, các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long, cho kết quả khá tốt Tôm ít bị bệnh, tăng trưởng tốt, năng suất thu hoạch tăng từ 30-45%

Ngoài ra, chế phẩm sinh học Biochie bao gồm một số chủng thuộc chi Bacillus (Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Bacillus licheniformis) và Lactobacillus (Lactobacillus acidophilus) Chúng có chức năng phân hủy hợp chất hữu cơ bằng cách

tiết ra các enzyme như protease, amylase Chúng còn có khả năng tổng hợp chất kháng

khuẩn làm giảm số lượng vi sinh vật gây bệnh phát triển quá mức như Vibrio,

Aeromonas… Sử dụng chế phẩm sinh học Biochie để xử lý nước nuôi tôm cá có tác

dụng làm giảm lượng bùn hữu cơ, giảm chu kỳ thay nước và cải thiện môi trường (tăng oxi hòa tan, giảm COD, BOD) Ngòai ra, còn có tác dụng giảm đáng kể tỷ lệ chết, tỷ lệ còi cọc, tăng sản lượng và giảm mùi hôi của ngư trường [6]

Thêm vào đó, chế phẩm sinh học BioF có chứa chủng Lactobacillus

acidophillus được sử dụng trong nuôi trồng thủy sản có tác dụng tăng khả năng hấp thụ

thức ăn và hạn chế bệnh do Aeromonas, Vibrio… gây ra Những nghiên cứu gần đây đã

cho thấy khi bổ sung BioF vào thức ăn tôm làm tăng tỷ lệ sống và đặc biệt tăng đáng

kể sản lượng tôm trong ao Trung tâm Khuyến nông Hà Nội đã thử nghiệm nuôi tôm giống tại Sơn Thủy, Hà Nội Tôm giống được nuôi trong các tráng kích thước 3x2x1,5m Chỉ sau 5 ngày thử nghiệm đã thấy sự khác biệt về chiều dài và trọng lượng của tôm ở tráng có sử dụng chế phẩm so với đối chứng Tiếp tục theo dõi sau 24 ngày thấy chiều dài trung bình của tôm ở bể thử nghiệm là 1,97 cm, ở lô đối chứng là 1,71

cm Kết quả bước đầu cho thấy sử dụng BioF để nuôi tôm giống rất hiệu quả, tôm tăng trưởng nhanh, khoẻ, đồng đều [7]

Vừa qua Viện Sinh học Nhiệt đới được sự hỗ trợ kinh phí của Sở Khoa học và Công nghệ TP.Hồ Chí Minh đã thành công trong việc nghiên cứu và sản xuất chế phẩm