Nghiên cứu sản xuất kháng nguyên cúm AH1N1, tinh chế và ứng dụng để đánh giá kháng thể ở động vật thí nghiệm

Sau đó các xét nghiệm huyết thanhhọc ở người cũng cho thấy sự hiện diện của virut cúm H1N1, các điều tra dịch tễ học trên diện rộng về sau cho thấy mức độ vụ dịch lớn hay nhỏ tùy thuộc

Từ viết tắt

ADN Axit deoxyribonucleic

ARN Axit ribonucleic

BSA Albumin huyết thanh bò

RT-PCR Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction

SDS Sodium dodecyl sulphate

SDS-PAGE Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamid gel electrophoresis

ss RNA (-) RNA mạch đơn âm

strep streptomicin

WHO Tổ chức Y tế Thế giới

MỞ ĐẦU

Bệnh cúm A/H1N1 là bệnh nhiễm trùng đường hô hấp cấp tính dochủng virus cúm A/H1N1 tái tổ hợp mới gây ra Bệnh có khả năng lây nhiễmcao từ người sang người, có thể trở thành đại dịch và biến chứng hô hấp, gây

tử vong Hiện tại chưa có văcxin phòng chống

Cúm A/H1N1 lần đầu tiên được các cơ quan y tế phát hiện vào tháng 3năm 2009 Sự bùng phát căn bệnh giống như bệnh cúm đã được phát hiện lầnđầu ở 3 khu vực thuộc Mexico Sau đó, nó tiếp tục lây lan ra rất nhiều nướctrên thế giới ở các châu lục khác nhau Tháng 6 năm 2009, Tổ chức y tế thếgiới (WHO) đã chính thức công bố đại dịch cúm toàn cầu và nâng cấp báođộng lến cấp 6 Tính từ tháng 3 đến tháng 6 năm 2009, cũng theo Tổ chức Y tếThế giới, đã có 29.669 trường hợp được xác định nhiễm cúm A/H1N1 tại 74quốc gia Bệnh cúm A/H1N1 xuất hiện ở Việt Nam lần đầu tiên vào ngày30/05/2009, có nguy cơ lây lan trong cộng đồng và bùng phát thành đạidịch[7]

Để ngăn chặn dịch cúm, chúng ta phải có những biện pháp phát hiệnbệnh, phòng chống hiệu quả và kịp thời, phương pháp hiệu quả nhất là sửdụng văcxin Hiện nay việc nghiên cứu sản xuất văcxin đã và đang được Tổchức Y tế thế giới khuyến khích và đã có bảng danh mục các loại văcxin doWHO khuyến cáo là có thể đưa vào ứng dụng Sản xuất văcxin để phòngchống bệnh cúm A/H1N1 đang bước đầu được nghiên cứu tại Việt Nam.Ngoài ra, để đáp ứng nhu cầu phòng chống dịch ở thời điểm hiện tại, chúng tacòn phải nhập khẩu các loại văcxin từ nước ngoài Vì vậy, việc kiểm tra vàđánh giá văcxin bằng các kháng nguyên và kháng thể kháng virút cúm H1N1chuẩn là hết sức quan trọng, mang tính cần thiết và cấp bách Tuy nhiên hiệnnay, các bộ sinh phẩm kháng nguyên, kháng thể chuẩn này đều phải nhậpkhẩu với giá thành rất cao

Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài "Nghiên cứu sản xuất kháng nguyên cúm A/H1N1, tinh chế và ứng dụng để đánh giá kháng thể ở động vật thí nghiệm“ để có thể tạo ra được những bộ sinh phẩm

kháng nguyên, kháng thể đạt tiêu chuẩn với giá thành rẻ để phục vụ cho việcđánh giá chất lượng vacxin và nhiều mục đích khác Đề tài được thực hiện tạiPhòng Vi sinh vật học phân tử – Viện Công nghệ sinh học – Viện Khoa học

và Công nghệ Việt Nam

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 Bệnh cúm A/H1N1

1.1 Lịch sử

Bệnh cúm A/H1N1 là bệnh nhiễm trùng đường hô hấp cấp tính do virutcúm A/H1N1 gây nên Bệnh có khả năng lây nhiễm cao và lây lan nhanhtrong cộng đồng Trong ba thế kỉ qua, cứ khoảng 30 đến 40 năm thế giới lạichứng kiến một đại dịch cúm Trước khi có vắc-xin, mỗi đợt dịch giết chếthàng triệu người Một vài chủng cúm virut H1N1 đã gây nên đại dịch ở ngườinhư năm 1918, đã có 100 triệu người chết trên toàn thế giới Người bệnh tửvong rất nhanh chỉ sau vài ngày nhiễm bệnh và hơn nửa là người trẻ tuổi Tuynhiên cho tới nay vẫn còn 1 vài chủng H1N1 ít độc tính vẫn tồn tại và chúnggây nên các đợt cúm thường trên người và gây bệnh thành đại dịch trên lợn và

1 số loài chim[7, 8, 10, 11]

Lần đầu tiên vào năm 1918, người ta nhận thấy ở lợn mắc chứng bệnh

mà triệu chứng giống như bệnh cúm ở người trong đại dịch cúm 1918 Dothương tổn thể hiện giống nhau nên bác sĩ Koen đã gọi tên bệnh mới này cholợn là cúm (flu) Nhưng mãi đến năm 1930, các nhà khoa học mới phân lậpđược loại virut này trên lợn và xác nhận là dòng H1N1 Năm 1977 – 1978 vụdịch do cúm A/ H1N1 gây ra tại Nga đã gây ảnh hưởng chủ yếu đến trẻ em vàngưởi trẻ tuổi, chủng gây bệnh tương tự chủng gây bệnh ở năm 1947-1957[7].Chủng virut này đã được dùng để sản xuất vắc-xin

Đến năm 1933, virut dòng H1N1 của người cũng được phân lập Giữa

2 dòng H1N1 trên lợn và người có phần rất giống nhau, vì vậy các nhà khoahọc đưa ra giả thuyết rằng H1N1 gây bệnh ở lợn và người có thể có cùng 1nguồn gốc Đến năm 1974, các nhà khoa học mới phân lập được virut cúmcủa lợn ở người, ca bệnh đầu tiên ở Mỹ Sau đó các xét nghiệm huyết thanhhọc ở người cũng cho thấy sự hiện diện của virut cúm H1N1, các điều tra dịch

tễ học trên diện rộng về sau cho thấy mức độ vụ dịch lớn hay nhỏ tùy thuộcvào lượng kháng thể chống virut cúm H1N1 ở người cao hay thấp; ngoài ra

người ta cũng thấy có một mối liên quan giữa quy mô nuôi lợn với tỷ lệ bệnhcúm trong vùng đó và vì thế các nhà khoa học suy luận rằng chính virut cúm

ở lợn có thể là nguồn lây bệnh dịch tiềm tàng cho con người

Từ nhóm virut H1N1 cổ đó, các đợt dịch sau này người ta còn pháthiện ra các dòng hỗn hợp và lai tạp khác của virut cúm như có thể tìm thấyH1N1 ở loài chim, H3N2 có nguồn gốc từ người và dạng tái kết hợp H1N2giữa chủng H1N1 cổ ở lợn với H3N2 ở lợn (giống với H3N2 ở người) Năm

1990 người ta phân lập được ở các con lợn bị cúm là cùng H4N6 có nguồngốc từ chim (được cách ly) Đến năm 1998 thì virut cúm lợn dạng tái hợp mới

là H3N2 (lợn -người và chim- lợn -người) đã bắt đầu xuất hiện ở Mỹ Nhưvậy đến nay các phân typ virut cúm A được biết đến là H1N1, H1N2, H3N1,H3N2 và H2N3 H1N1; H1N2 và H3N2 là 3 loại phổ biến nhất[7]

Qua đó chúng ta thấy rằng virut cúm A với sự biến đổi và truyền chéogiữa động vật và con người, cứ mỗi lần chuyển dạng kháng nguyên như vậy

có khả năng gây ra dịch cúm lớn và có nguy cơ thành đại dịch

Ngày 11/6/2009 WHO tuyên bố đại dịch H1N1 mới toàn cầu.29/11/2009 WHO công bố thế giới có 207 quốc gia và vùng lãnh thổ xác nhận

có trường hợp nhiễm cúm A/H1N1 và có ít nhất 8768 người chết Và đếntháng 1/2010 WHO đã xác nhận là 208 quốc gia và vùng lãnh thổ có trườnghợp nhiễm cúm A/ H1N1 và có ít nhất 13554 người chết Trong đại dịch cúmnăm 2009, virut được phân lập từ bệnh nhân ở Hoa Kì được xây dựng nên bởicác yếu tố di truyền từ 4 loại cúm khác nhau: cúm lợn Bắc Mỹ; cúm gia cầm

ở bắc Mỹ; cúm ở người và virut cúm lợn thưởng được tìm thấy ở Châu Âu vàChâu á Nó rất giống với sự kết hợp lại vật chất di truyền (reassortment) củacúm người và cúm lợn trong tất cả 4 chủng khác nhau của phân typ H1N1[7,8]

1.2 Tình hình dịch bệnh

1.2.1 Tình hình dịch bệnh trên thế giới

Đại dịch cúm A/H1N1 lần đầu tiên được các cơ quan y tế phát hiệnvào tháng 3 năm 2009 ở Mexico Sau đó bệnh dịch này bắt đầu lây lan rộng ratoàn thế giới Ngày 28/4/2009, những ca nhiễm virút H1N1 đầu tiên tại châu

Âu được xác nhận Hai người Anh phải nhập viện, một người đàn ông TâyBan Nha có kết quả dương tính với cúm lợn và 17 người khác bị nghi nhiễm.Ngoài Mexico, Anh và Tây Ban Nha, cũng đã có những trường hợp mắc bệnhđược ghi nhận ở Mỹ và Canada Các ca nghi nhiễm khác đang được điều tratại Brasil, Israel, Úc và Tân Tây Lan[7]

Các bộ trưởng Y tế của các nước châu Âu gặp nhau vào ngày30/4/2009 để bàn về đại dịch Các quan chức khuyên người dân không nên dulịch đến những nơi bị nhiễm bệnh, đề phòng lây lan căn bệnh Bộ trưởng Y tếAnh Alan Johnson cũng nói trong số 25 ca nghi nhiễm ở Anh, 8 người có kếtquả âm tính, 3 người nữa chờ kết quả xét nghiệm và 14 người được theo dõi

Ngày 5/5/2009, Tổ chức Y tế Thế giới tính đến khả năng nâng mứcbáo động dịch cúm A H1N1 lên mức cao nhất Tổ chức Y tế Thế giới sử dụng

6 mức báo động để đánh giá nguy cơ y tế đối với thế giới Tính đến 00:00ngày 5/5/2009, số ca mắc cúm A H1N1 đã vượt qua con số 1.000 ca tại 20nước trên 5 châu lục[8]

Theo thông báo của Cục Y tế Dự phòng và Môi trường Bộ Y tế ngày

17 tháng 3 năm 2010 về tình hình dịch cúm A/H1N1, tính đến ngày 07/3/2010trên toàn Thế giới có trên 213 quốc gia và vùng lãnh thổ ghi nhận bệnh nhândương tính cúm A/H1N1, trong đó có 16.713 trường hợp tử vong (theo thôngbáo của Tổ chức y tế Thế giới - WHO)[8]

Tại khu vực nam bán cầu, một số nước ghi nhận số ca tử vong caonhư:

 Australia (186),

 Chilê (136),

 Argentina (585),

 Brazil (1.368),

 Peru (162),

 Colombia (118)

Tại khu vực Châu Á, tình hình dịch tiếp tục diễn biến phức tạp:

 Ấn Độ đã ghi nhận 430 trường hợp tử vong do cúm A(H1N1);

 Nhật Bản (tử vong: 27);

 Hàn Quốc (tử vong: 20);

 Thái Lan (tử vong: 176)

Một số nước đã ngừng thông báo các trường hợp tử vong do cúmA(H1N1) như: Philippine (tử vong: 28); Singapore (tử vong: 18); Malaysia(tử vong: 77); Indonesia (tử vong: 10)[7]

Hình1 Sơ đồ phân bố đại dịch cúm A/H1N1 trên thế giới

1.2.2.Tình hình dịch bệnh tại Việt Nam

Đại dịch cúm A/H1N1 được ghi nhận ở Việt Nam ngày 30/5/2009.Bệnh nhân đầu tiên là một sinh viên nam từ Mỹ trở về nước ngày26/5/2009.Vào lúc 9 giờ, ngày 1 tháng 6 (giờ địa phương) đã phát hiện thêm 2trường hợp nhiễm cúm; bệnh nhân là hai mẹ con từ Hoa Kỳ về Việt Nam,nâng số ca bị nhiễm H1N1 tại Việt Nam lên con số 3[8]

Ngày 3/6/2009 ca nhiễm cúm đầu tiên của Việt Nam đã được xuấtviện Đến ngày 5/6 tại Việt Nam đã xác nhận thêm 2 ca nhiễm cúm, đây là 2bệnh nhân mang quốc tịch Mỹ nâng số ca bị nhiễm cúm lên con số 5.Số canhiễm cúm tại Việt Nam đến ngày 6/6/2009 đã tăng lên con số 10.Con số canhiễm cúm tại Việt Nam tăng nhanh từng ngày, đế ngày 7/6/2009 số ca dươngtính đã lên 13 ca và đến ngày 24/6 đã lên đến 32 ca[11].

Ngày 18/7/2009, ghi nhận 5 trường hợp đầu tiên tại 01 trường trunghọc củaTP Hồ Chí Minh, dịch bắt đầu lây lan tại cộng đồng

Tiếp đó dịch nhanh chóng lan rộng ra các tỉnh, thành phố trên phạm vi

cả nước Tính đến 17h00 ngày 03/8/2009, Việt Nam đã ghi nhận 971 trườnghợp dương tính, không có tử vong Số bệnh nhân đã ra viện là 470; 501trường hợp còn lại hiện đang được cách ly, điều trị tại các bệnh viện, cơ sởđiều trị, giám sát cộng đồng trong tình trạng sức khỏe ổn định, không có biếnchứng nặng

Đến ngày 22/10/2009, Việt Nam ghi nhận 10 349 trường hợp dươngtính với cúm A/H1N1 27 trường hợp tử vong Số khỏi ra viện: 9.941[8,11]

Các địa phương trong cả nước vận tiếp tục ghi nhận rải rác trường hợpnhiễm virus cúm A(H1N1), không ghi nhận các ổ dịch lớn trong cộng đồng.Theo Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương tính đến ngày 16/3/2010 cả nước đãghi nhận 11.202 trường hợp dương tính cúm A(H1N1), trong đó có 58 trườnghợp tử vong

1.3 Dịch tễ học

1.3.1 Con đường lây nhiễm cúm A/H1N1

Đây là loại virut có thể lây lan từ người sang người nhưng hiện nayvẫn chưa rõ mức độ của sự lây lan dễ dàng như thế nào Sự lan truyền củavirut cúm A/H1N1 mới này gần giống sự lây lan của cúm mùa Cúm lây lan

từ người sang người thông qua ho và hắt hơi, sờ, cầm vào đồ vật có chứa virut

rồi đưa tay lên mũi, miêng, mắt Cúm A/H1N1 là bệnh lây chủ yếu quađường hô hấp nên cúm A/H1N1 không lây qua thực phẩm làm từ thịt lợn Đôikhi mắc bệnh do tay bị dính chất tiết có virut sau đó đưa lên miệng, mũi Khimột người bị nhiễm virut cúm thì khoảng 7 ngày sau sẽ có triệu chứng Trẻ

em, đặc biệt là trẻ nhỏ có thời gian phát bệnh lâu hơn Một nghiên cứu mớitháng 12/2009 chi tiết về cúm H1N1 cho thấy đây là dịch bệnh nguy hiểm.Các nhà khoa học đã xác định được hình ảnh chi tiết của virut cúm H1N1cũng như độc tính của nó Khác với các virut cúm theo mùa thông thường chỉtấn công các tế bào thuộc phần trên của hệ hô hấp, H1N1 có khả năng tấncông sâu vào các tế bào phổi, nó gây ra chứng viêm phổi và nguy hiểm hơndẫn đến tử vong Để đánh giá độc tính của virut H1N1 các nhà khoa học đãthử lây nhiễm virut này cùng 1 virut cúm mùa thông thường cho đàn chuột,chồn sương và động vật linh trưởng Kết quả cho thấy virut H1N1 sao chépnhanh hơn nhiều trong hệ hô hấp so với virut cúm mùa và gây ra thương tổnnghiêm trọng cho phổi[3]

Virut cúm A/H1N1 tồn tại khá lâu ngoài môi trường, có thể sống từ24-48 giờ trên các bề mặt như bàn, ghế, tủ,…, tồn tại trong quần áo từ 8-12giờ và duy trì được 5 phút trong lòng bàn tay Loại virut này đặc biệt sống lâutrong môi trường nước; có thể sống 4 ngày trong nước ở nhiệt độ khoảng 22

độ C và đến 30 ngày ở nhiệt độ 0 độ C[9,2] Vì vậy thời điểm mùa đông làthời tiết thuận lợi cho virut phát triển Người mang virut cúm A/H1N1 có khảnăng truyền virut cho những người xung quanh trong thời gian 1 ngày trướctới 7 ngày sau, kể từ khi có triệu chứng của bệnh Bệnh lây lan càng nhanh vàcàng mạnh khi có sự tiếp xúc với người bệnh, đặc biệt ở nơi tập trung đôngngười như trường học, nơi công cộng

Hình 2: Mối quan hệ lây nhiễm virus cúm A 1.3.2 Triệu chứng bệnh

Virut xâm nhập vào cơ thể bằng đường hô hấp Khi virut cúm theonhững hạt tế bào li ti của người bệnh truyền sang người lành qua đường hôhấp, nó sẽ chui vào bên trong tế bào biểu mô hô hấp và phát triển nhanhchóng gây xưng huyết, phù nề dọc cơ quan hô hấp từ mũi họng cho đến phếquản, lúc này các triệu chứng của bệnh cúm A/H1N1 ở người gần giống vớibệnh cúm thường như cơ thể sốt nhẹ, ho, chảy nước mũi, ớn lạnh, hắt hơi.Thường sau khi nhiễm cúm khoảng 2-3 ngày người bệnh gần như bìnhthường Đến thời kì phát bệnh, đột ngột xuất hiện sốt cao, có thể kèm theo rétrun, nhức đầu, buồn nôn, đau mỏi toàn thân, người mệt mỏi Sau đó một sốbệnh nhân chuyển sang các triệu chứng nặng nề hơn như toàn thâm mệt mỏi,đau cơ, đau khớp dọc theo sống lưng, đau ngang thắt lưng, đau đầu kèm theohoa mắt, chóng mặt, ù tai Dấu hiệu nhiễm độc, nhiễm trùng rất rõ Có nhiềudấu hiệu tổn thương đường hô hấp như viêm long đường hô hấp trên, ngạt tắcmũi, ho khan, mắt đỏ…Khoảng gần 50% bệnh nhân còn có đau bụng, buồnnôn hay tiêu chảy Nhưng ở Việt nam có nhiều ca nhiễm virut cúm A/H1N1nhưng không có một triệu chứng nào, chỉ khi xét nghiệm mới thấy Vì vậy mànguy cơ gây lây lan trong cộng đồng rất lớn Khác với cúm A/H5N1 ở chỗ,

cúm A/H1N1 không có triệu chứng như sổ mũi, hắt hơi và đau nhức cơ thể

mà thay vào đó là viêm phổi cấp, ho, sốt, khó thở[11]

So với cúm gia cầm thì tỉ lệ tử vong của cúm A/H1N1 thấp hơn hơn(tỉ lệ là 50% ở cúm gia cầm và 11% ở cúm lợn)[7] Các triệu chứng hô hấpbáo động bệnh trở nên nặng là thở nhanh (người lớn trên 30 lần/phút), có cảmgiác hụt hơi Chóng mặt đột ngột, ngạt thở, tím môi và đầu chi, lơ mơ Nhữngbệnh nhân nhiễm cúm A/H1N1 có nguy cơ tử vong cao là mắc các bệnh mạntính, bệnh tim mạch, sức đề kháng yếu, phụ nữ trong thai kì…

2 Virut cúm A/H1N1

2.1 Nguồn gốc virut cúm A/H1N1

Các kết quả nghiên cứu riêng rẽ của nhiều nhóm nghiên cứu trên thếgiới cho thấy virut cúm A/H1N1 là một virut phức tạp, được hình thành trên

cơ sở 4 loại virut khác nhau gồm virut cúm gia cầm, virut cúm ở người và 2loại virut cúm lợn.Nhóm các nhà khoa học Nhật Bản đã phát hiện ra rằngtrong số 6 phân tử ARN (ribonucleic acid) của virut cúm A/H1N1, có 1 ARN

từ virut cúm ở người, 2 từ virut cúm gia cầm và 3 từ các virut cúm lợn ở Bắc

Mỹ Trong khi đó, nhóm các nhà khoa học Mỹ thuộc Trường Đại họcColumbia, đã tiến hành so sánh thông tin về gen giữa virut gây bệnh cúm mớivới virut cúm lợn đã được tìm thấy trong các nghiên cứu trước đó Kết quả sosánh cho thấy trong số 8 phân tử ARN của virut cúm mới, có 6 ARN đượcthừa kế từ các virut đã gây bệnh cúm lợn trước đó ở Bắc Mỹ và 2 ARN khácđược thừa kế từ chủng virut gây bệnh cúm lợn lai Âu-Á (Eurasian-type) cónguồn gốc ở châu Âu và châu Á[7, 8]

Lợn có thể bị nhiễm bệnh cúm ở người và cúm gia cầm Khi điều nàyxảy ra, các virut khác nhau có thể kết hợp để tạo ra nhiều loại biến thể virutkhác nhau Theo các nhà khoa học Mỹ, nhiều khả năng protein trên bề mặtcủa virut mới đã biến thể và cho phép virut này lây lan một cách dễ dàng giữangười với người

2.2 Đặc điểm của virut cúm A/H1N1

2.2.1 Đặc điểm hình thái và cấu trúc

a Hình thái

Virut cúm A/H1N1 có cấu trúc hình khối (hoặc hình khối kéo dàithành sợi) Hạt virut có đường kính 80 đến 120 nm, khối lượng khoảng 250Dalton[2.4]

Hình 3.Virut cúm A/H1N1 qua kính hiển vi

b Cấu trúc

Cấu trúc của virut cúm A/H1N1 từ ngoài vào gồm có: lớp màng lipidbao ở ngoài ( Lipid Envelop), lớp protein nền (Matrix Protein), lõi capsit(Nucleocapsid)[2]

Lớp vỏ ( Lipid Envelop): Là lớp màng phospholipit kép, ở trên bề mặt

của lớp màng này có các gai mấu nhô ra Các gai mấu là lipoprotein được tạothành do các protein trần hoặc glycosyl hóa gắn chặt vào lớp kép lipid nhờtương tác kỵ nước Có khoảng hơn 500 gai mấu, người ta chia chúng ra làm 2loại: HA (Hemagglutinin), NA(Neuraminidaza) Đồng thời trên lớp vỏ lipidcòn có các protein tạo các kênh vận chuyển (transport channel) mang nhiềucấu trúc kỵ nước và nằm xuyên qua màng tạo các kênh (ví dụ các kênh ion:ion-channels) giúp cho virut có khả năng thay đổi tính thấm của màngvirut[5]

Lớp protein nền (Matrix Protein): lớp protein nền này (ký hiệu là M1)

nằm giữa và liên kết lõi capsit với lớp vỏ Chức năng chính của lớp này là

cung cấp các protein tạo điều kiện để virut thâm nhập qua màng tế bào chủ,giúp đưa axit nuclêic của virut vào tế bào chủ[2].

Lõi virut (Capsit): mang vật liệu di truyền là các sợi đơn ARN và 3

polymeraza: PB1, PB2, PB3 đều được gắn với nucleoprotein, phức hệ này tạothành nucleocapsit[2]

Hình 4 Cấu trúc của virut cúm A/H1N1

2.2.2 Cấu trúc hệ gen và chức năng

Virut cúm A/H1N1 có hệ gen gồm có 2 sợi đơn ARN mang điện tích

âm gồm 13588 base, được chia ra làm 8 phân đoạn, mã hóa cho 10 đoạnpolypeptit: HA, NA, NP, M1, M2, NS1, NS2, PA, PB1, PB2[1]

Hình 5 Cấu trúc hệ gen của virut cúm A/H1N1

Phân đoạn 1 đến 3 mã hoá cho protein PB1, PB2 và PA: là các protein

có chức năng là enzym polymerase

Phân đoạn 4 mã hoá cho protein HA HA của virut cúm A là một loạiprotein gây ngưng kết hồng cầu, được acylat hoá ở vùng giáp ranh với vỏvirut và có đầu N liên kết glycan ở một vị trí nhất định.

Phân đoạn 5 mã hoá cho nucleprotein (NP)

Phân đoạn 6 là gen chịu trách nhiệm tổng hợp protein enzym NA NA

là một trong hai protein liên kết được tìm thấy trên bề mặt của hạt virut Nó

có chức năng phân cắt phân tử axit sialic (N-acetyl-alpha-neuraminidara 1 hayAcetylneuraminy l hydrolase)

Phân đoạn 7 mã hoá cho 2 tiểu phần protein đệm (matrix protein M1

oligopeptid này chứa một số amino axit mang tính kiềm làm khung Thànhphần của các aminoacid mang tính kiềm này thay đổi đặc hiệu theo từng loạihình phân týp H Sự biến đổi thành phần của chuỗi nối quyết định tính độccủa virut thuộc biến chủng mới[19].

Hình 7: Cấu trúc của Hemagglutinin

Chức năng: kháng nguyên HA có bản chất là glycoprotein, nằm rải

rác trên bề mặt của virut cúm[22] HA là những gai trụ giúp cho virut bámdính trên bề mặt tế bào vật chủ, có khả năng gây ngưng kết hồng cầu do kếthợp thụ thể trên bề mặt hồng cầu HA được coi là một protein vừa quyết địnhtính kháng nguyên quyết định tính độc lực của virut cúm A/H1N1 Độc lựccủa virut cúm A/H1N1 còn phụ thuộc rất lớn vào chức năng hoạt động củavùng tiếp nhận enzym proteaza để cắt rời HA khỏi thụ thể axit sialic mà chính

đó là chuỗi nối kết giữa phân đoạn HA1 và HA2[19] Virut cúm A/H1N1không có gen tổng hợp enzyme proteaza mà phải nhờ vào sự hỗ trợ của tế bào

cơ thể nhiễm virut

b Neuraminidase (NA)

NA là một protein liên kết nằm trên bề mặt của hạt virut, các gai NA

có dạng hình nấm Phần đầu nấm bao gồm 4 tiểu đơn vị có dạng gần như hìnhcầu giáp nối với nhau[19,15] Đầu này được nối với cuống chứa vùng kịnước, nhờ thế mà gai NA cắm sâu được vào vỏ ngoài virut NA có vai tròquyết định quá trình xâm nhiễm và nhân lên của virut cúm A trong tế bào chủ

NA có chức năng tách gốc sialic, giải phóng hạt virut khỏi tế bào bị xâmnhiễm Vì vậy nó còn được gọi là lysosomal sialidase (N-acetyl-alpha-neuramidase 1 hay Acetylneuraminyl hydrolase)[21] Các nghiên cứu phân tửgen NA của virut cúm A-H5N1 cho biết phần đầu của gen N1 (đầu 5’) cómức độ biến đổi cao và phức tạp giữa các chủng virut, liên quan đến các quátrình thích ứng và gây bệnh của virut cúm trên nhiều đối tượng vật chủ khácnhau

Sơ đồ dải Neuraminidase:

Hình 8 Neuraminidase

NA phân giải thụ thể tế bào ở màng nhày đường hô hấp bằng cách cắtliên kết glycosid giải phóng axit Neuraminic Quá trình này cho phép virut điqua màng nhày và thoát khỏi các chất ức chế ‘‘không đặc hiệu’’[19] NAcũng phá hủy thụ thể giành cho Hemagglutinin (HA) trên bề mặt hồng cầu,mặc dù tế bào này không phải là đối tượng gây nhiễm NA tham gia vào quátrình giải phóng virut ra khỏi tế bào[16] Nếu không có NA thì HA trên bề

mặt của các hạt virut mới tạo thành sẽ bám vào thụ thể sialic acid trên bề mặt

tế bào chủ và làm cho virut ở trạng thái không hoạt động, không được giảiphóng và do đó không còn khả năng xâm nhiễm vào tế bào khác[25]

2.2.4 Cơ chế tái tổ hợp và tạo thành biến chủng mới

Tất cả virut cúm (Orthomyxoviridae) đều có vật liệu di truyền là

ARN[5] Khi tái bản nó có xu hướng tạo ra nhiều đột biến hơn ADN Nhữngđột biến này cung cấp một lượng đột biến lớn cho chọn lọc tự nhiên Điều đó

có nghĩa những virut mang vật liệu di truyền là ARN có tỷ lệ đột biến cao nên

có khả năng tiến hoá nhanh hơn virut có vật liệu di truyền là ADN Thời gianqua đi, những đột biến này tích tụ lại và làm phát sinh loài mới[16] Quá trìnhtích lũy của các đột biến riêng biệt được gọi là sự trôi kháng nguyên Hìnhdạng của kháng nguyên (protein virut) có chiều hướng thay đổi dần dần trởthành một hình dạng mới ở các thế hệ sau của virut đó Khả năng trôi này làmcho các kháng thể sinh ra chống lại chủng virut ban đầu không thể kết hợpđược với nó nữa[20]

Đặc biệt, virut cúm A có khả năng lây nhiễm cao, hệ gen của chúngluôn luôn biến đổi để tạo các biến chủng mới, đó là quá trình trao đổi hay sắpxếp lại vật liệu di truyền Nếu một tế bào bị nhiễm đồng thời một lúc haichủng cúm type A khác nhau, các hạt virion thế hệ sau có thể sẽ là một tổ hợpgen của hai bên bố mẹ Đây là một điều khá phức tạp, nó tạo cho virut cúm Akhả năng tiến hoá nhanh chóng tạo ra các NA và HA mới Chúng ta biết rằngcúm type A có 16 loại HA (1(16) và 9 loại NA (1(9) Tất cả các loại này đềuđược tạo ra trong quá trình trôi kháng nguyên[18]

Thông thường, từ N1(N3 và H1(H3 là type gây bệnh cho người cònlại là gây bệnh cho động vật

Nếu hai virion khác nhau này cùng lây nhiễm một tế bào, chúng sẽ tạo

ra một thế hệ con cháu không những giống bản thân chúng (H1N1 và H3N7)

mà còn là một thể tổ hợp (H1N7 và H3N1) Những tổ hợp gen mới này rất

khác so với chủng bố mẹ và có thể chưa bao giờ được nhận biết trong hệ miễndịch[18, 19].

Hình thái tiến hóa nêu trên của virut được gọi là sự trượt khángnguyên (antigenic shift) để phân biệt nó với sự trôi kháng nguyên (antigenicdrift) Sự trôi kháng nguyên xảy ra chậm hơn và không có sự thay đổi về tổhợp gen Những tổ hợp mới này đã dẫn đến xuất hiện một chủng virut cúmmới mà hệ miễn dịch của chúng ta buộc phải bắt đầu lại quá trình tạo khángthể để kháng virut mới này[18]

2.2.5 Chu trình sống của virut cúm A/H1N1

Sự xâm nhập của virut vào tế bào liên quan đến chức năng của protein

HA qua hiện tượng ẩm bào nhờ cơ chế trung gian tiếp hợp thụ thể Thụ thểliên kết tế bào của virut cúm có bản chất là axit sialic cắm sâu vàoglycoprotein hay glycolipit của vỏ virut Sự hợp nhất màng tế bào và virut xảy

ra trong khoang ẩm bào khi nồng độ pH giảm xuống mức thấp Sự hợp nhấtnày chỉ có thể xảy ra phụ thuộc vào việc cắt rời HA[5]

Sau khi hợp nhất màng, nucleocapsit của virut được chuyển vào trongnhân tế bào, hệ thống enzym sao chép của virut lập tức tạo ra các ARN thôngtin (mARN) Các mARN của virut được adenyl hoá ở đầu 3’, một số đượctổng hợp từng đoạn và có thể nối lại theo lối tái tổ hợp để tạo thành sợi hoànchỉnh Sau đó được vận chuyển ra ngoài tế bào chất để tổng hợp protein củavirut Hầu hết các protein được tổng hợp ở lại nguyên sinh chất, số còn lạiđược chuyển vào trong nhân để tiếp tục thực hiện quá trình tổng hợp nguyênliệu di truyền và tham gia vào quá trình bao gói vật liệu di truyền Cùng vớiquá trình sao chép và tổng hợp protein là quá trình tổng hợp nguyên liệu ditruyền (các sợi ARN đơn âm mới) Từ sợi ARN đơn âm của virut ban đầu,dưới hoạt động của enzym phiên mã ngược mà virut mang theo sẽ tạo ra mộtsợi ARN dương hoàn chỉnh theo cơ chế bổ sung; sợi dương mới được dùnglàm khuôn để tổng hợp nên sợi ARN âm mới Các sợi ARN âm mới, một số

được dùng làm nguyên liệu để lắp ráp virion mới, một số dùng làm khuôntổng hợp theo cơ chế như với sợi ARN hệ gen của virut đầu tiên Các sợiARN hệ gen được tạo thành là một sợi hoàn chỉnh về độ dài, không được mũhoá ở đầu 5’ và không được adenyl hoá ở đầu 3’ Các sợi âm mới được cácprotein đệm (NS1, M, NP) bao bọc lại để hình thành ribonucleocapsit trongnhân tế bào nhiễm Hạt virion mới được tạo thành bằng cách “nẩy chồi” NAphân cắt axit sialic giải[5].

Hình 9 Sự xâm nhiễm và sao chép của virut cúm A/H1N1

3 Các phương pháp chẩn đoán bệnh cúm A/H1N1

Hiện có nhiều phương pháp để chẩn đoán bệnh cúm trong phòng thínghiệm, có thể sử dụng các test chẩn đoán nhanh, nuôi cấy phân lập virut, thửnghiệm PCR để tìm virut

3.1 Nuôi cấy phân lập virut

Người ta phân lập virut bằng cách tiêm truyền bệnh phẩm đã xử lý vàotúi ối của phôi gà 13-15 ngày tuổi Ủ 3 ngày ở nhiệt độ 35oC, hút nước ởkhoang ối ra để tìm virut bằng thử nghiệm ức chế ngưng kết hồng cầu Nuôicấy phân lập virut trên nuôi cấy tế bào cũng được sử dụng[9]

3.2 Phương pháp sinh học phân tử

Phương pháp sinh học phân tử để phát hiện cúm A chủ yếu là kỹ thuậtPCR phiên mã ngược (RT-PCR) Kỹ thuật này có thể được kết hợp với

phương pháp ELISA để so sánh và làm tăng khả năng phát hiện tác nhân gâybệnh [23] Sử dụng kỹ thuật RT-PCR trong chẩn đoán, giám định, phân loại,giải trình tự các phân đoạn và toàn bộ hệ gen, kết hợp với di truyền quần thể,xem xét tiến hóa và nguồn gốc các biến chủng được coi là phương pháp có lợithế trong nghiên cứu virut cúm A [23] RT-PCR có thể sử dụng khuếch đạimột phần gen của các gen “độc” HA và NA để xác định trình tự rồi đối chiếu

so sánh thành phần nucleotit của các phân týp H và N Phân tích gen cũngđược sử dụng trong chẩn đoán phân biệt các phân týp H1N1, H3N2 và H5N1của người

3.3 Phương pháp chẩn đoán thông qua huyết thanh học

Phản ứng kết hợp bổ thể (CF):

Phản ứng kết hợp bổ thể được ứng dụng rộng rãi trong chẩn đoánhuyết thanh học của cúm Phản ứng được tiến hành theo qui trình của Lief(1963) Nguyên lý của phương pháp là khi kháng nguyên (KN) phản ứngđược với kháng thể (KT) thì sẽ kết hợp với bổ thể Nếu không phản ứng đượcvới KT thì bổ thể ở dạng tự do Dù phản ứng KN-KT-Bổ thể xảy ra nhưngkhông thể nhìn thấy được bằng mắt thường, do vậy cần bổ sung thêm một hệthống thứ hai để chỉ thị Hệ thống này bao gồm hồng cầu cừu và KT khánghồng cầu cừu Nếu ở hệ thống thứ nhất KN không phản ứng với KT thì bổ thể

ở trạng thái tự do sẽ kết hợp với hệ thống thứ hai (hồng cầu cừu+ KT khánghồng cầu cừu+bổ thể) Hồng cầu cừu sẽ bị bổ thể làm tan- phản ứng âm tính,còn nếu hồng cầu cừu không bị tan- phản ứng dương tính[22]

 Phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA):

Phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA) dùng để xác định sự có mặt đồngthời xác định hiệu giá virut Nguyên tắc của phương pháp này dựa vào khảnăng liên kết với hồng cầu để gây ngưng kết của virut Bản chất của liên kếtvirut-hồng cầu chính là sự kết hợp giữa kháng nguyên HA trên bề mặt củavirut cúm với thụ thể trên bề mặt hồng cầu Vì vậy, kết quả của phản ứng

được xác định bằng cách quan sát sự có mặt hay không của ngưng kết hồngcầu[17]

 Phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu (HI):

Phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu (HI) được tiến hành theo quitrình mà Dowdle và các cộng tác viên đã mô tả năm 1979 Nguyên lý củaphương pháp là kháng thể kháng virut có khả năng ức chế quá trình ngưng kếthồng cầu Dựa vào độ pha loãng của huyết thanh có thể xác định hiệu giákháng thể HI ở động vật hay người bị nhiễm cúm hoặc được tiêm chủngvacxin[17]

Phản ứng HI có thuận lợi là tương đối đơn giản, kinh tế và nó cũngđáp ứng được hầu hết các yêu cầu của một phương pháp lý tưởng Đối vớiphần lớn các trường hợp, kháng thể kháng HA đều được phát hiện bằng phảnứng HI, vì vậy đây là phản ứng đặc hiệu phân týp đối với chẩn đoán huyếtthanh học của cúm Tuy nhiên phản ứng HI cũng có những bất lợi ở chỗ cầnphải loại bỏ các tác nhân ức chế không đặc hiệu có trong huyết thanh và độnhạy của phản ứng có thể bị giảm do ái lực của kháng thể đối với các chủngcúm trội hơn

3.4 Phương pháp miễn dịch huỳnh quang

Kỹ thuật này được tiến hành theo Mc Quillin và cộng tác viên (1985) KNhoặc KT được đánh dấu bằng thuốc nhuộm huỳnh quang Kỹ thuật này dựatrên tính chất của thuốc nhuộm khi được kích thích bởi bức xạ có bước sóng

tử ngoại sẽ phát sáng Phản ứng được xác định nhờ kính hiển vi huỳnh quang.Đây là kỹ thuật nhạy, đáng tin cậy và được dùng nhiều trong chuẩn đoánnhanh các virut gây bệnh đường hô hấp và các virut khác[20, 21]

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

1 Vật liệu nghiên cứu

1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Chủng virut virus cúm NIBRG-121 NIBSC do viện Công nghệ Sinh họctiếp nhận từ Viện Quốc gia về Tiêu chuẩn và Kiểm định sinh học (NIBSC,vương quốc Anh) là chủng được tạo bằng kỹ thuật di truyền ngược

- Trứng gà Lương Vượng do trung tâm Giống gia cầm Thụy Phương cungcấp

1.2 Các dung dịch dùng trong nghiên cứu

Nước khử ion vừa đủ 4ml

+ Dung dịch acrylamit- bisacrylamit 30%

- Các môi trường dùng để kiểm tra vô trùng:

+Môi trường thử vi khuẩn hiếu khí Luria bactari medium (môi trường

Yeast extract 1g/100ml (1%)Trypton 1g/100ml (1%)NaCl 1g/100ml (1%)Trung hòa bằng NaOH đến pH = 7,4.

- Dung dịch Sacaroza 15%, 30%, 45% và 60%.

- Dung dịch màu dùng cho định lượng protein bằng phương pháp Bradford:

Coomassi Brilian Blue G-250 40mg

và chất lượng kháng nguyên thu được sau này

Trứng được sử dụng là loại trứng gà Lương Vượng nhập từ trung tâmgiống gia cầm Thụy Phương

Tiến hành rửa trứng và khay đựng trứng bằng chloramin 0,1% Vỏtrứng được rửa sạch sẽ giúp cho quá trình hô hấp của trứng được tốt hơn vàkhông bị nhiễm bệnh trong quá trình ấp Thao tác nhẹ nhàng cẩn thận tránhtrứng bị dập vỡ Xếp trứng đều lên khay theo chiều dọc của quả trứng, đầu tocủa quả trứng hướng lên trên

Đặt các khay trứng vào tủ ấm 38,5°C trong 10 ngày Trong quá trình ấpphải đảm bảo nhiệt độ tủ ấp ổn định ở 38,5°C và luôn có khay nước vô trùngtrong tủ ấm để đảm bảo độ ẩm.

2.2.Soi trứng

Sau khi trứng đã ấp 7 ngày ta tiến hành soi trứng để kiểm tra, phân loạinhững quả trứng phát triển bình thường và những quả không phát triển thànhphôi, bị chết, hỏng Soi trứng trong phòng tối vô trùng bằng đèn soi trứng.Những quả trứng phát triển tốt là những quả có phôi, có thể nhìn thấy bằngmắt thường đầu của phôi cử động bên trong quả trứng

Sau khi soi, những quả có phôi được đưa vào ấp tiếp trong tủ ấm38,5°C, những quả hỏng sẽ bị loại

2.3 Tiêm trứng

Chủng giống: virut NIBRG-121 do Viện quốc gia và Kiểm định Sinhhọc, vương quốc Anh cung cấp Đây là chủng tái tổ hợp được tạo ra bằngphương pháp di truyền ngược từ 2 chủng virut A/California/7/2009 virutH1N1 và A/PR/8/34 (H1N1) virut, với gene HA và NA tặng từA/California/7/2009

Sau 10 ngày ấp trứng ta tiến hành soi lại trứng để đảm bảo trứng đượctiêm là hoàn toàn khỏe mạnh bình thường, loại đi những qủa có hiện tượngthối hỏng

Dùng bút chì đánh dấu túi hơi và đầu phôi trứng

Dùng khăn tẩm cồn 70% lau lại trứng một lần nữa

* Pha virut:

+ Dung dịch PBS được giữ ở 4(C