Nhân giống vô tính dừa sáp

Nhân giống vô tính dừa sáp

I MỤC ĐÍCH ĐỀ TÀI

Hình ảnh cây dừa đã đi vào đời sống con người Việt Nam từ xa xưa, rất dân dã, mộc mạc Đó

là hình ảnh những buổi trưa hè mắc võng dưới tán lá mát rượi, nghe tiếng lá dừa xào xạc như lời

ru ngọt ngào của mẹ thuở còn thơ, các trò chơi kéo tàu dừa, lấy lá dừa làm kèn, làm thành nhữngcon châu chấu, cào cào rất dễ thương Lớn lên vườn dừa trở thành chốn hẹn hò của các đôi namthanh nữ tú Hay những buổi trưa ba mẹ đi làm đồng về, uống từng ngụm nước dừa ngọt lịm máttận đáy lòng

Trong nền văn hóa, trong tiềm thức con người Việt Nam, cây dừa đã trở nên quen thuộc và

có giá trị bền vững thể hiện qua cuộc sống hằng ngày Vùng Tây Nam Bộ và duyên hải miềnTrung nước ta những vùng có truyền thống trồng dừa, sản phẩm từ dừa được sử dụng nhiều trongchế biến thực phẩm, mỹ phẩm, trong công nghiệp, rất gần gũi trong bữa ăn hằng ngày và nướcdừa là loại nước giải khát bổ dưỡng và ngon miệng

Bên cạnh những giống dừa truyền thống, nước ta còn có một số giống dừa nhập ngoại vớiphẩm chất tốt và giá trị kinh tế cao như 2 giống dừa dứa và dừa sáp, được trồng nhiều ở TâyNam Bộ, chủ yếu tập trung ở hai tỉnh Trà Vinh và Bến Tre Trong đó, dừa sáp là loại dừa có cơmdày, ít nước, dẻo quánh, thơm ngon rất được ưa chuộng, cho giá trị kinh tế cao nhưng lại cho sảnlượng ít do trong số quả dừa sáp tạo thành trong một buồng ít, mặt khác dừa sáp rất khó nảymầm ngoài tự nhiên do nhiều lý do

Trước tình hình đó, Ở Việt Nam cũng như một số nước trồng nhiều dừa khác như Philippin,Thái Lan,… đã có nhiều nghiên cứu để nhân giống và lai tạo các giống dừa và đã có nhiều thànhcông

Trong phạm vi bài tiểu luận này, nhóm em xin trình bày về đặc điểm của dừa sáp, nhữngcông trình nghiên cứu về dừa, và phương pháp nuôi phôi dừa trong điều kiện in vitro Bài làmcòn rất nhiều thiếu sót , mong thầy đóng góp ý kiến để bài tiểu luận hoàn chỉnh hơn Nhóm emxin chân thành cảm ơn!

II TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Tài liệu gồm tổng cộng 54 trang, 7 phần Phần đầu đưa ra mục đích đề tài của bài tiểu luận vềmức độ cần thiết của phương pháp nhân giống đối với cây dừa sáp vì nó mang lại giá trị caonhưng sản lượng lại ít Phần sau giới thiệu về cây dừa sáp còn gọi là dừa đặc ruột, dừa kem, vìcơm dày, mềm, dẻo như sáp Bọng dừa thường ít hoặc không có nước Cơm do nước dừa từ từđặc lại rồi phình ra tạo thành một khối xôm xốp, vị béo và ngọt Dừa sáp là đặc sản của quêhương Trà Vinh, nổi tiếng nhất là tại huyện Cầu Kè Sở dĩ dừa sáp quý hiếm là vì rất kén đất vàkhó trồng Cùng là loại dừa sáp nhưng có trái cho sáp, có quả không Hơn nữa, cùng một buồng(quầy dừa) nhưng không phải trái nào cũng có sáp mà tỷ lệ cho sáp chỉ chiếm khoảng 20-40%.Phần sau giới thiệu về các phương pháp nhân giống cho dừa sáp,cách thụ phấn cho dừa sáp cũngnhư kĩ thuật trồng dừa Phần cuối nói về các loại bệnh trên cây dừa và giá trị mà nó mang lại

III PHÂN BỐ ĐỊA LÝ

Ở Việt Nam, dừa sáp được tìm thấy chủ yếu ở huyện Cầu Kè, tỉnh Trà Vinh, với diện tíchgần 200 ha, trong đó có khoảng 50 ha dừa đang cho trái

IV GIỚI THIỆU – PHÂN LOẠI

IV.1 Phân loại:

Kingdom: Plantae Division: Magnoliophyta Class: Liliopsida

Order: Arecales Family: Arecaceae Subfamily: Arecoideae

Tribe: Cocoeae

Genus: Coconuts Species: Coconuts Makapuno

IV.2 Giới thiệu:

Dừa Sáp theo tiếng Tagalog của Philippines là “Makapuno” “Maka” có nghĩa là “hầu như” và “puno” có nghĩa là “đầy”, do đó “Makapuno” có nghĩa là “hầu như đầy”, chỉ hiện

tượng có rất ít nước hoặc hầu như không có nước của giống dừa này Giống dừa đặc ruột nàyđược phát hiện lần đầu tiên ở tỉnh Laguna và Tayabas (Quezon - Philippines ngày nay) và cũngđược đề cập trên tạp chí khoa học lần đầu tiên vào năm 1914 Đến năm 1937 những nghiên cứu

về dừa sáp đã cho kết quả ban đầu về di truyền tính trạng cơm dừa đặc ruột của dừa Sáp Người

ta quan tâm đến giống dừa đặc ruột chủ yếu là vì tầm quan trọng kinh tế của nó và vì nó có 3 đặcđiểm thu hút các nhà nghiên cứu dừa đó là:

(1) Cơm dừa mềm, sốp, nước dừa sền sệt như keo

(2) Cây dừa mang quả dừa đặc ruột có ngoại hình như cây dừa bình thường

(3) Trái dừa đặc ruột không có khả năng nảy mầm và đặc điểm đặc ruột của cơm dừa sápđược kiểm soát bởi một gen đơn lặn

IV.2.1 Một số đặc điểm cơ bản về hình thái học của dừa Sáp:

2

Cây dừa sáp có trái đặc ruột trông giống với cây dừa bình thường về tất cả các phần, từ lá,thân, hình dáng, màu sắc và kích thước trái

• Rễ:

Dừa có rễ bất định sinh ra liên tục ở phần đáy gốc

thân, không có rễ cọc Lúc mới mọc có màu trắng sau

chuyển sang màu đỏ nâu Rễ không có rễ lông hút mà

chỉ có những rễ nhỏ là rễ dinh dưỡng Những rễ nầy

hình thành trên rễ chính và có hoạt động như rễ hô

hấp, giúp cho cây trao đổi khí Trong điều kiện ngập

nước liên tục sẽ ảnh hưởng đến khả năng hô hấp của

bộ rễ, làm cho cây dừa giảm sức tăng trưởng do cây

dừa là cây chịu nước nhưng không chịu ngập Rễ già

sẽ chết và rễ mới phát triển liên tục

Tuần đầu tiên sau khi nảy mầm, cây dừa con sẽ mọc ra một rễ cấp 1 có chiều dài trung bình5cm, mười ngày sau sẽ mọc ra rễ thứ hai, sau sáu tuần sẽ có trung bình 3 rễ cấp 1, với chiều dài

Thân dừa mọc thẳng, không phân nhánh, chiều cao trung

bình từ 15-20m Trong giai đoạn đầu sau khi trồng thân dừa

ngắn, phát triển chậm, cho đến khi chiều ngang phát triển đầy

đủ thì thân mới bắt đầu cao lên Giai đoạn này kéo dài khoảng 4

năm tùy theo giống Do đặc điểm này mà thân dừa cao chỉ phát

triển mạnh sau 4-5 năm Gốc dừa là một trong những đặc điểm

để phân biệt nhóm giống dừa cao và dừa lùn Ở nhóm giống

dừa lùn thường có gốc nhỏ, ngược lại ở nhóm giống dừa cao và

dừa lai giữa giống lùn và giống cao thường có gốc phình to đến

rất to Số sẹo lá trên thân trên 1m chiều cao thân là một trong

những đặc điểm để đánh giá điều kiện sinh trưởng và phát triển

của cây, dựa trên đặc điểm này làm tiêu chuẩn để chọn giống

theo phương pháp truyền thống Do cấu tạo của thân không có

tầng sinh mô thứ cấp nên những tổn thương trên thân dừa không

thể phục hồi được và đường kính thân cũng không phát triển

theo thời gian nên quan sát một đoạn thân ta có thể đánh giá tình hình sinh trưởng của cây trongthời gian đó Đồng thời thân phát triển từ đỉnh sinh trưởng (củ hủ) nên khi bị đuông tấn công cây

sẽ bị chết

Tóm lại, thân dừa là đặc điểm dùng để đánh giá sự sinh trưởng của cây Thân dừa to, không

bị tổn thương, sẹo to, khít là cây dừa sinh trưởng mạnh, cho năng suất cao.

• Lá:

Một cây dừa có khoảng 30-35 tàu lá Mỗi tàu lá dài

5-6m vào thời kỳ trưởng thành Ở cây trưởng thành, 1

tàu lá dừa gồm 2 phần Phần cuống lá không mang lá

chét, lồi ở mặt dưới, phẳng hay hơi lõm ở mặt trên,

đáy phồng to, bám chặt vào thân và khi rụng sẽ để lại

một vết sẹo trên thân Phần mang lá chét mang trung

bình 90-120 lá chét mỗi bên, không đối xứng hẳn qua

sống lá mà một bên này sẽ có nhiều hơn bên kia

khoảng 5-10 lá chét

Đỉnh sinh trưởng sản xuất lá liên tục, cứ một lá xuất hiện trên tán thì có thêm một chồi láxuất hiện và một lá già rụng đi Một cây dừa tốt, mỗi năm ra ít nhất 14-16 lá (24-26 ngày/lá) đốivới nhóm dừa cao và 16-18 lá (20-22 ngày/lá) đối với nhóm dừa lùn Mùa khô dừa ra lá nhanhhơn so với mùa mưa Một tàu lá dừa luôn luôn có đời sống 5 năm, từ khi tượng đến khi xuất hiện2,5 năm và từ khi xuất hiện đến khi khô, rụng là 2,5 năm Nếu điều kiện tự nhiên bất lợi lá sẽ rachậm hơn, số lá ít đi chứ không rút ngắn đời sống của lá Điều kiện dinh dưỡng và nước đầy đủcây ra nhiều lá sẽ làm cho số lá trên tán cây nhiều hơn (35-40 tàu) Nếu gặp điều kiện bất lợi thờigian ra lá kéo dài, số lá trên tán cây sẽ ít Ở vùng khô hạn, trên tán lá có một số lá khô nhưngkhông rụng, đó là điều kiện rất đặc trưng chứng tỏ cây bị thiếu nước

4

Tóm lại, quan sát tán lá của cây dừa ta có thể đánh giá được khả năng sinh trưởng và cho năng suất của cây Đây là một trong những chỉ tiêu dùng để tuyển chọn cây làm giống Tán lá phân phối đều chứng tỏ cây mạnh và có khả năng cho nhiều trái.

• Hoa:

Thời gian từ khi tượng đến khi nở trung bình từ 30-40

tháng Thông thường mỗi nách lá mang một phát hoa, do đó

có bao nhiêu lá mới là có khả năng có bấy nhiêu phát hoa

được sinh ra mỗi năm Tuy nhiên, giai đoạn 15-16 tháng

trước khi hoa nở (giai đoạn phân hóa nhánh gié) phát hoa

dừa có thể bị thui do cây dừa bị thiếu dinh dưỡng, khô hạn

hay ngập úng Đây là một trong những nguyên nhân góp

phần gây ra hiện tượng “mùa treo” ở dừa

Hoa dừa thuộc loại đơn tính, đồng chu nghĩa là hoa đực

và hoa cái riêng rẻ nhưng ở trên cùng một gié hoa Số lượng hoa cái trung bình biến động từ

20-40 cái trên mỗi phát hoa tùy theo giống Số hoa cái trên buồng ít có thể do thiếu chất đạm Nhómdừa lùn có số lượng hoa cái nhiều hơn nhóm dừa cao

Mỗi phát hoa có thể mang trung bình từ 5-10g phấn hoa Mỗi hoa đực chứa khoảng 272 triệuhạt phấn có kích thước rất nhỏ Chỉ khoảng 40% hạt phấn có khả năng thụ phấn trong mỗi pháthoa Thời gian để hoa cái đầu tiên nở đến hoa cái cuối cùng thụ phấn xong trên cùng phát hoa gọi

là pha cái, kéo dài từ 5-7 ngày ở giống dừa cao và từ 10-14 ngày đối với giống dừa lùn

Thời gian để hoa đực đầu tiên mở đến hoa đực cuối cùng mở gọi là pha đực, kéo dài khoảng18-22 ngày Thời gian xuất hiện của pha đực và pha cái hình thành nên kiểu thụ phấn khác nhau

và là một trong những đặc tính quan trọng để phân biệt giữa các giống Trên giống dừa cao phađực thuờng xuất hiện trước rồi mới đến pha cái nên có sự lệch pha và sự thụ phấn chéo là phổbiến.Trên giống dừa lùn, pha cái thường trùng với pha đực nên dừa lùn thường tự thụ phấn Đốivới nhóm dừa lai, giữa pha đực và pha cái có sự trùng pha một phần nên có thể xảy ra hiện tượng

tự thụ trên cùng một phát hoa Do nhóm dừa cao có đặc tính thụ phấn chéo nên khi nhân giốngbằng phương pháp hữu tính cần có kỹ thuật riêng biệt và nghiêm ngặt hơn so với giống dừa lùn.Hoa dừa được thụ phấn chủ yếu nhờ gió và côn trùng, trong đó ong mật có vai trò quan trọngnhất Việc nuôi ong trong vườn dừa làm tăng năng suất dừa đáng kể

• Trái:

Trái dừa thuộc loại quả hạch, nhân cứng

Trái gồm có ba phần:

o Ngoại quả bì (phần vỏ bên ngoài được phủ cutin)

o Trung quả bì (xơ dừa) và nội quả bì bao gồm gáo

o Nước và cơm dừa

Vỏ dừa dày từ 1-5cm tùy theo giống, phần cuống có thể dày đến 10cm Vỏ dừa bao gồm 30% là

xơ dừa và 70% là bụi xơ dừa Bụi xơ dừa có đặc tính hút và giữ ẩm cao từ 400-600% so với thểtích của chính nó

Gáo dừa có hình dạng rất khác biệt tùy theo giống, độ dày của gáo từ 3-6mm Bốn tháng tuổi saukhi thụ phấn gáo dừa bắt đầu hình thành và chuyển sang màu nâu và cứng hơn khi trái được 8tháng tuổi

Nước dừa xuất hiện từ tháng thứ ba sau khi thụ phấn và đạt được thể tích lớn nhất ở tám thángtuổi Thể tích sẽ giảm dần khi trái khô Thành phần hóa học chủ yếu của nước dừa là đường vàmuối khoáng

Cơm dừa bắt đầu hình thành 5 tháng sau khi thụ phấn, có thể thu hoạch để

uống nước vào tháng thứ 7-8 Thời gian để hoa cái thụ phấn, phát triển

thành trái và đến khi trái khô kéo dài 12 tháng Thu hoạch trái ở giai đoạn

10 tháng sau khi đậu trái có thể giảm năng suất do trái chưa phát triển đầy

đủ nhưng ở giai đoạn từ 11 tháng trở đi thì trái có thể dùng làm giống

Trọng lượng cơm dừa khô của một trái dừa dao động từ 100-350 g/trái và

chứa khoảng 65-74% dầu dừa tùy theo giống Kích thước, hình dạng trái rất

đa dạng, tùy theo giống

IV.2.2 Nhu cầu sinh thái:

• Khí hậu:

Sự tăng trưởng phát triển của cây dừa tùy thuộc vào 2 yếu tố khí hậu và đất đai Sự hiểu biết

về môi trường và những ảnh hưởng của chúng trên đời sống cây dừa giúp chọn đúng nơi có thểphát triển trồng dừa Sự xác định những yếu tố giới hạn trên năng suất dừa giúp ta có biện pháp

kỹ thuật để cải thiện tăng năng suất, nâng cao hiệu quả sử dụng đất đai, gia tăng thu nhập

Cây dừa được trồng trong hầu hết các vùng nhiệt đới ẩm, hơn 90% vườn dừa trên thế giớiđược tìm thấy giữa Bắc và Nam vĩ tuyến thứ 20, với độ cao trung bình dưới 500m so với mặtnước biển Nhiệt độ thích hợp cho cây dừa là 27oC và dao động từ 20-34oC Nhiệt độ thấp dưới

15oC gây ra hiện tượng rối loạn sinh lý của cây Do tác động của nhiệt độ nên khi trồng dừa ởnhững vùng có độ cao trên 500m thường cho năng suất không cao Cây dừa có thể trồng trên cácvùng có lượng mưa trung bình hàng năm từ 1.000-4.000mm Lượng mưa lý tưởng từ 1.500-2.300mm và phân bố tương đối đều trong năm Ẩm độ thích hợp là 80-90%, ẩm độ dưới 60% cóthể gây ra hiện tượng rụng trái non Dừa là cây ưa sáng, cần tối thiểu 2.000 giờ chiếu sáng mỗinăm, 120 giờ chiếu sáng mỗi tháng thích hợp cho cây dừa (4 giờ/ngày) Gió nhẹ giúp tăng khảnăng thụ phấn và đậu trái, đồng thời tăng khả năng thoát hơi nước dẫn đến tăng khả năng hútnước và dinh dưỡng của cây

• Đất đai:

6

Cây dừa có thể trồng trên nhiều loại đất khác nhau từ đất cát nghèo dinh dưỡng Tuy nhiên,thích hợp nhất là đất thịt pha cát, thoát thủy tốt Cây dừa có thể chịu được đất với độ pH từ 5 đến

8 Tuy nhiên pH đất thích hợp nhất từ 5,5 - 7 Vùng bị khô hạn hay ngập úng không thích hợpcho cây dừa Vùng mặn dừa có trái nhỏ

Ở ĐBSCL, để đạt được năng suất cao, khi chọn đất phát triển cây dừa cần chú ý một số đặc điểmsau:

- Bề dày tầng đất mặt trên 1 m

- Không bị ngập úng

- Không bị nhiễm mặn liên tục

- pH từ 6-7

- Thành phần cơ giới là cát pha hay thịt pha cát

IV.2.3 Một số đặc điểm cơ bản của cơm dừa đặc ruột trên cây dừa sáp:

Chúng ta có thể được phân biệt dừa thường và

dừa sáp bằng cách kiểm tra trái dừa Chắc chắn những

cây dừa sáp sẽ cho trái dừa đặc ruột ở một tỷ lệ nào đó

Trái dừa đặc ruột được phân biệt với trái dừa bình

thường bằng cách lắc hoặc bổ đôi những trái dừa khô

(từ 10 tháng tuổi trở lên) Nếu đặc ruột, khi lắc những

trái dừa này không nghe được tiếng óc ách bên trong do

phần nước dừa trở nên sền sệt Thông thường một quày

dừa sáp có 12 trái, chỉ có khoảng 4-5 trái có sáp, thậm

chí không có trái nào, tùy theo nhiều yếu tố

Khác với dừa thường, dừa sáp có độ dầu cao

hơn, mùi hương đặc trưng hơn Đó là đặc điểm quý cần nghiên cứu ứng dụng trong việc sản xuấtbánh kẹo và các sản phẩm khác đem lại nguồn lợi kinh tế cao

Adriano và Manahan (1931) phân loại dừa đặc ruột theo 3 kiểu phổ biến:

o Kiểu 1 (kiểu A): phần nước chỉ hơi sền sệt, phần cơm dừa giống như cơm nhão và

có độ dày cơm dừa giống trái dừa bình thường

o Kiểu 2 (kiểu B: phần nước sệt hơn, trắng đục, phần cơm dừa dày hơn cơm dừa

bình thường, lớp cơm dừa gần gáo dừa trông giống như cơm nhão, lớp kế mềmhơn và bông lên vào bên trong

o Kiểu 3 (kiểu C): nước dừa hầu như không còn mà được thay thế bởi phần cơm

dừa rất nhão và béo Giống như hai kiểu kia, lớp cơm dừa cận gáo dừa của tráidừa đặc ruột kiểu 3 giống cơm nhão, lớp bên trong sốp, mềm hầu như chiếm đầykhông gian bên trong trái

Thành phần cơm dừa sáp tương tự như cơm dừa của trái dừa bình thường, bao gồm 60%nước, 53% chất béo, 7,5% chất đạm, và 25% chất hữu cơ, 5% chất xơ thô và 2,5% tro (ngoại trừ

ẩm độ, các thông số được tính toán dựa trên trọng lượng khô) Cơm dừa đặc của trái dừa sáp cóhàm lượng chất hữu cơ cao hơn ở tất cả các giai đoạn phát triển của trái Đường tổng số khônggiảm và đường hòa tan của hai loại trái cũng khác biệt có ý nghĩa ở tất cả các giai đoạn phát triểncủa trái Những sự khác biệt này là đặc điểm chỉ thị quá trình trao đổi chất khác thường của dừasáp

Đặc tính tế bào học của cơm dừa đặc tương tự như các khối u bướu của thực vật và độngvật (Abraham et al, 1965; dela Cruz và Ramirez, 1968) Quá trình này là do một kiểu thay đổi tếbào có khả năng di truyền có liên quan đến cơ chế điều tiết Ngoại trừ dừa sáp, chưa có trườnghợp nào được ghi nhận xuất hiện khối u di truyền trong thực vật Số liệu từ kết quả phân tíchthành phần hóa học của cơm dừa đặc chỉ ra hệ thống trao đổi chất rất khác biệt so với cơm dừabình thường Có hai kiểu chu kỳ tổng hợp sinh học hoạt động liên tục trong các tế bào khối u: (1)chu kỳ thứ nhất liên quan đến các chất điều hòa tăng trưởng, những chất này thiết lập nên cácquy trình trao đổi chất trong sự phân chia và tăng trưởng của tế bào; (2) chu kỳ thứ hai liên quanđến những sản phẩm cần thiết cho điều kiện phát triển khối u (Braun, 1981)

Del Rosario và de Guzman (1981) tìm thấy hoạt động kích thích tăng trưởng cao hơn vàcác chất kích thích tăng trưởng giống như cytokinin nhiều hơn trong cơm dừa đặc so với cơmdừa bình thường

Hai loại kích thích tố α-D-galactosidase và –mannosidase trong trái dừa đặc ruột có thểgây ra việc không thể tổng hợp hoặc tổng hợp được rất ít chất kích thích tố galactomannan dẫnđến sự thiếu dinh dưỡng và năng lượng cho phôi Vì vậy đó có thể là nguyên nhân chủ yếu dẫnđến hiện tượng không thể nảy mầm của phôi dừa đặc ruột

IV.2.4 Đặc điểm di truyền của cơm dừa đặc ruột trên cây dừa sáp:

Bằng phương pháp thụ phấn nhân tạo trên cùng cây và thụ phấn chéo giữa hai cây dừasáp với nhau đều ghi nhận kết quả như sau: tỷ lệ giữa trái bình thường/trái đặc ruột là 3:1 chophép kết luận cơm dừa đặc của trái dừa sáp được kiểm soát bởi một gen lặn Khi thụ phấn chéoqua lại giữa cây dừa sáp và cây bình thường cho kết quả tất cả trái đều bình thường Kết quả nàykhẳng định một cách chắc chắn cơm dừa của trái dừa sáp không đặc ruột được quy định bởi gentrội Vì vậy những trái dừa thu được từ những cây dừa sáp tự thụ phấn sẽ có 3 kiểu gen: (1) MM:trái dừa sáp với cơm dừa bình thường (MMM); (2) Mm: trái dừa sáp có kiểu hình của cơm dừabình thường (MMm và Mmm) và (3) cây dừa sáp được trồng sẽ mang trái đặc ruột và sẽ khôngthể nảy mầm là mang gen lặn mm (mmm)

Kết quả khảo sát và đánh giá các đặc điểm hình thái của dừa sáp ở Việt Nam cho thấydừa sáp của Việt Nam có thể phân thành 3 nhóm dựa vào các chỉ tiêu số lượng của thân, lá, hoa,trái và các chỉ tiêu chất lượng của cơm dừa để mô tả và phân loại như sau:

8

Bảng 1 Phân nhóm dừa Sáp Việt Nam

Hình dạng trái Tròn Từ thon dài đến hìnhquả lê Tròn

Màu sắc vỏ trái còn

Kiểu đặc ruột của

Ghi chú:

Kiểu A: cơm dừa mềm như cơm nhão, nước dừa có độ nhớt nhẹ, độ dày cơm dừa chỉ dày hơn

cơm dừa bình thường một chút

Kiểu B: nước dừa sền sệt, có màu trắng trong, cơm dừa sốp, mềm, dày hơn gấp đôi cơm dừa

thường, lớp cơm dừa gần gáo dừa mềm như cơm nhão, lớp cơm dừa bên trong sốp và bong lênkhông đều

Bảng 2 Đặc điểm sinh học của hoa dừa Sáp

Đặc điểm Dừa Sáp nhóm I Dừa Sáp nhóm II Dừa Sáp nhóm III

Trung bình số hoa cái/

Số ngày pha cái của bông mo

thứ nhất (n) trùng với pha

đực của bông mo số 2 (n+1)

Nuôi cấy phôi soma từ chồi mầm được xem là giải pháp tốt nhất hiện nay để nhân nhanh vàđồng bộ về kiểu di truyền giống dừa sáp đặc ruột Theo công nghệ này thì 2 phương pháp đượcđưa vào ứng dụng là phôi soma thứ cấp và phương pháp nhân callus phôi Qui trình của phươngpháp này được thực hiện trình tự với bước khởi đầu từ phôi soma sơ cấp được nuôi cấy trongmôi trường nhân tạo để hình thành phôi thứ cấp và callus phôi Sau 3 chu kỳ nhân phôi thứ cấp

và callus phôi, giai đoạn sau cùng hình thành nhiều phôi soma rồi chuyển thành cây con hoànchỉnh

Như vậy, theo phương pháp này, từ 1 chồi mầm ban đầu của 1 trái dừa sáp thu thập đượcchúng ta có thể tạo ra được 98.000 phôi vô tính để từ đó sản xuất ra được 98.000 cây giống dừasáp đảm bảo độ đồng đều về mặt di truyền, cung cấp cho các cơ sở sản xuất và bà con nông dâncác địa phương mở rộng diện tích giống dừa đặc sản quí hiếm này trong những năm tới

VI.1 Trồng dừa sáp theo phương pháp truyền thống:

10

Dùng trái không đặc của cây

dừa sáp để ươm làm giống sẽ cho tỷ lệ

nảy mầm khoảng 60-70% Tuy nhiên

những cây giống này sẽ cho tỷ lệ trái

đặc ruột thấp giống như cây bố mẹ

(khoảng 25%)

Trước khi thụ phấn, phải lấy

phấn đực trên cây sáp mo bung 2-3

ngày Đây là lúc phấn đực già, đủ

mạnh, bông cái sẽ thụ phấn mạnh

hơn Phấn đực (tuyệt đối không có

phấn lạ) lấy về được nghiền vỡ, cho

vào thùng kín, phơi ngoài trời trong

Kinh nghiệm nhân giống dừa sáp của người dân:

Chọn giống: Nhân giống dừa sáp chủ yếu bằng trái, dừa làm giống được tuyển chọn từ

những cây đầu dòng trên 10 năm tuổi, cây dừa có sáp, khoẻ mạnh, không bị bệnh Chọn buồngnhiều trái, trái to, màu sắc đẹp (lưu ý chọn trái dừa nước) nếu chọn trái sáp thì trái không nảymầm

Trái dừa hái xuống, treo lên dây phơi khô, sau đó vạt mặt, xếp xuống đất hoặc cho vàobịch nylon có chứa xơ dừa + phân chuồng, đưa vào vườn ươm

Làm giàn lưới để che bớt ánh sáng, ngày tưới 1 lần, mùa mưa không cần tưới Sau khiđưa vào vườn ươm khoảng 35 ngày, trái nảy mầm Khi nảy mầm, dùng phân bón lá phun kíchthích cho lá và rễợ phát triển Tiếp tục chăm sóc thêm 25 ngày, khi cây dừa cao 50cm và rễ đâm

ra khỏi vỏ dừa là xuất bán được

Cách trồng: Dừa sáp rất thích hợp với đất cát pha nhẹ, có thể trồng xung quanh bờ ao, bờ

kênh, nếu trồng diện tích lớn, nên trồng tập trung Đào hố rộng 80 x80cm, hoặc lên mô, cây cáchcây 8 x 8m rồi trộn phân chuồng + tro trấu + phân hữu cơ, lấp một lớp đất mỏng Hạ cây dừaxuống, lấp đất chặt, kín ngang mặt bầu

Chăm sóc: Trồng xong tưới nước ngày 1 lần, dừa trồng được 30 ngày tiến hành bón urê,

lượng phân không đáng kể, mỗi gốc 1 nắm Khi cây trổ bông, bón 1kg phân NPK 16 - 16 - 8 +10kg phân hữu cơ Humix Bón bằng cách đào rãnh xung quanh gốc dừa, cách gốc 1, 5m bỏ phânxuống rồi lấp đất lại Muốn cây dừa sáp đạt tỷ lệ sáp cao (cơm dày), khi cây trổ bông cần thụphấn nhân tạo

VI.2 Nuôi cấy phôi dừa sáp: Phương pháp nuôi cấy phôi in vitro

Những trái sáp đặc ruột không thể tự nảy mầm do nội nhũ phát triển bất thường (cơm dừa

mềm và xốp) và phôi của trái sáp đặc ruột này chỉ nẩy mầm bằng phương pháp nuôi cấy phôi in vitro, lấy phôi từ trái đặc ruột đem cấy vào môi trường dinh dưỡng thay thế cho nội nhũ của dừa

sáp, phôi dừa sáp nảy mầm và phát triển thành cây dừa giống có tỷ lệ trái đặc ruột cao (≥70%,theo Rillo)

Bằng phương pháp nuôi cấy phôi hữu tính, cây dừa sáp nuôi cấy phôi có thể cho tỷ lệ tráisáp đặc ruột ≥70% Qui trình nuôi cấy phôi dừa sáp gồm nhiều giai đoạn, tuy nhiên, với qui trìnhnuôi cấy phôi dừa trước đây chỉ đạt tỉ lệ thành công 19-20%, thời gian nuôi trồng khoảng 20tháng Nguyên nhân là do tỷ lệ phôi phát triển thành cây trong ống nghiệm và sự thích nghi củacây con ở vườn ươm còn thấp Đề tài tập trung nghiên cứu các giải pháp kỹ thuật trong phòng thínghiệm và vườn ươm như thay đổi thành phần môi trường nuôi cấy, điều kiện chiếu sáng, hàmlượng đường, chế độ bón phân để làm tăng tỷ lệ nảy mầm, giúp phôi tăng trưởng tốt trong ốngnghiệm thông qua việc cải thiện chồi, rễ và làm tăng tỷ lệ sống của cây con ở vườn ươm

VI.2.1 Tình hình nuôi cấy phôi dừa ở nước ngoài:

Việc nuôi cấy in vitro phôi dừa hợp tử (zygotic) đã được nhiều tác giả nghiên cứu thành

công từ những năm trước đây như De Guzman và Del Rosario (1974), Assy Bar (1986), Rillo vàPaloma (1992), Samosir và cộng sự (1999) Các nghiên cứu này nhằm mục đích cứu lấy nhữngphôi hữu tính phát triển bình thường từ những quả dừa đột biến nhưng có giá trị cao như dừa Sáp(makapuno) trong khi nội nhũ (cơm dừa) lại mềm, xốp và không có chức năng (Rillo và Paloma,1992) để từ đó tạo ra những cây giống cho tỷ lệ trái sáp cao Ngoài ra phương pháp này còn được

áp dụng trong việc chọn lựa in vitro các tính trạng cây trồng khác nhau và bảo quan gen dừa ở

nhiệt độ thấp

Từ nhiều năm nay, Mạng luới gen dừa quốc tế - Viện Quỹ gen thực vật Quốc tế(COGENT-IPGRI) đã tài trợ vốn và thiết lập ngân hàng bảo tồn nguồn gen dừa quốc ở nhiều nơi(ICG) Mạng lưới các điểm bảo tồn này, trong đó có nhiều nơi đã đi vào hoạt động nằm trong 5

12

khu vực của COGENT là Đông Nam Á, Nam Á, Nam Thái Bình Dương, Châu Phi, Ấn ĐộDương, Châu Mỹ La Tinh và vùng Caribe Mạng lưới ngân hàng gen dừa này sẽ là nơi lưu giữphần lớn nguồn gen dừa của thế giới và bảo vệ chúng cho việc sử dụng trong tương lai của ngànhcông nghiệp dừa Để hỗ trợ cho việc thành lập các ngân hàng bảo tồn gen dừa, việc thu thậpnguồn gen bằng phôi mầm riêng biệt hoặc những miếng nội nhũ nhỏ có chứa phôi và di chuyển

chúng như trong trường hợp nuôi cấy phôi trong ống nghiệm (in vitro) đã trở thành một biện

pháp mang tính thực tế hơn nhiều trong công đoạn vận chuyển gen dừa vừa gọn nhẹ, dễ dàng,vừa an toàn về mặt kiểm dịch thực vật

Cho đến nay, kỹ thuật nuôi cấy phôi dừa tiêu chuẩn quốc tế đã được sử dụng để lập ra bộsưu tập nguồn gen dừa và sản xuất các cây giống chất lượng cao từ những giống dừa đột biếnnhư dừa Sáp (makapuno) Phương pháp này được gọi là “Kỹ thuật nuôi cấy phôi mầm lai”(Batugal, 2002), được sử dụng để sản xuất cây giống dừa ở những nơi phôi mầm được gửi đếnsau các vụ trao đổi quốc tế

Nhiều khía cạnh về mặt sinh lý của cây con phát triển trong quá trình nuôi cấy in vitro là

chưa tối ưu và chính điều này được cho là nguyên nhân làm giảm tỷ lệ thích nghi với điều kiệnkhí hậu bên ngoài và sự phát triển của cây con sau khi đưa ra khỏi môi trường nuôi cấy Các đặcđiểm sinh lý của cây con có khả năng chịu ảnh hưởng bởi kỹ thuât, là sự phát triển của bộ rễ, khảnăng quang hợp và tính mẫn cảm với bệnh

Những nghiên cứu gần đây của Trung tâm nghiên cứu nông nghiệp Quốc tế Úc (2008)với sự tham gia của một nhóm các nhà khoa học đến từ nhiều quốc gia khác nhau (Úc, Indonesia,Papue Newguinea, Philippines và Việt Nam trong một thời gian hơn 3 năm Một số cải tiến đáng

kể của quy trình được sử dụng cho việc vận chuyển gen dừa, tái thiết lập và sản xuất cây giốngđột biến chất lượng cao như dừa Sáp Makapuno

VI.2.2 Tình hình nghiên cứu nuôi cấy phôi dừa ở trong nước:

Ở Việt Nam, về nuôi cấy phôi dừa đã có các công trình từ 1993 ( Nguyễn Hữu Hổ vàcộng sự, 1993; Nguyễn Thị Hiền, 1996) nhưng chỉ thực hiện với các giống dừa địa phương có tỷ

lệ nảy mầm trong tự nhiên rất cao, chưa có nghiên cứu nào thực hiện cho các giống dừa quýhiếm

Viện nghiên cứu Dầu và cây có dầu đã nghiên cứu nuôi cấy phôi dừa từ năm 1996 và đãnhận được trợ giúp tài chính từ Chính phủ Việt Nam, IPGRICOGENT, và gần đây thông qua Đạihọc Queensland (Australia) bởi một dự án ACIAR Nhóm tác giả Vũ Thị Mỹ Liên, Trần ThịNgọc Thảo và cộng sự (Viện nghiên cứu Dầu và cây có dầu) đã nghiên cứu nuôi cấy phôi dừa

trong điều kiện in vitro từ năm 1999 trên 2 giống dừa là Ta xanh và Lùn vàng Mã Lai Từ năm

2000 đến 2001, được sự tài trợ của IPGRI-COGENT, Nhóm tác giả trên đã nghiên cứu nuôi cấy

phôi dừa Sáp (Makapuno), dừa Ẻo trong điều kiện in vitro.

Đến năm 2003-2004, nhóm tác giả trên tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện, nâng cao qui trìnhnuôi cấy phôi trong phòng thí nghiệm thông qua việc tìm môi trường thích hợp cho nuôi cấy phôidừa Sáp và dừa Dứa, nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian trữ lạnh đến khả năng nảy mầm củaphôi dừa Sáp Bên cạnh đó, nhóm tác giả còn nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể trồng, chế độtưới, chế độ ánh sáng, độ ẩm đến tỷ lệ sống của cây dừa nuôi cấy phôi ở vườn ươm Từ đó chothấy, việc tìm ra điều kiện nuôi trồng của vườn ươm giúp cây dừa cấy phôi thích nghi với điều

kiện ex-vitro là một vấn đề khó khăn nhưng lại rất thiết thực.

Song song đó, với sự tài trợ của Trường Đại học Queensland (Australia) thông qua dự ánACIAR thực hiện từ năm 2003-2005, nhóm tác giả này đã nghiên cứu sự ảnh hưởng của IBA vàNAA đến sự tạo rễ của phôi dừa Dứa và Xiêm, nghiên cứu ảnh hưởng của việc cắt dây treo

(haustorium) của phôi trong quá trình nuôi cấy để hạn chế tỷ lệ chết của cây dừa nuôi cấy phôikhi chuyển ra vườn ươm.

Và thông qua dự án Phát triển sản xuất giống Dừa (giai đoạn 2001-2005) của Bộ CôngNghiệp, nhóm tác giả Vũ Thị Mỹ Liên, Trần Thị Ngọc Thảo và cộng sự đã nghiên cứu nuôitrồng 2 giống dừa quý là Sáp và Dứa, hiện nay đã trồng ra đồng được khoảng 5ha

Tuy nhiên, cho đến nay tỷ lệ thành công vẫn chưa cao Từ phôi mới đưa vào nuôi cấy cho đếnkhi cây trưởng thành để trồng ra đồng là 19-20%

VI.2.3 Qui trình nuôi cấy phôi dừa:

Từ năm 2001-2005 viện Nghiên Cứu Dầu và Cây Có Dầu đã bước đầu thực hiện thành

công việc nhân giống dừa sáp bằng cách nuôi cấy phôi dừa trong điều kiện in vitro Dưới đây là

quy trình được mô tả lại :

Giai đoạn 1: Chọn trái giống

Dừa sáp được lấy ở Cầu Kè Trà Vinh, chọn trái giống không bị hư, khoảng 9 tháng tuổi.

Ở giai đoạn này tỷ lệ trái được sử dụng để lấy phôi bị hao hụt chỉ còn khoảng 80%.

Giai đoạn 2 : Tách phôi và khử trùng Cấy phôi và nuôi phôi

Phôi dừa sau khi được lấy ra cùng với lớp cơm dừa được khử trùng với javen 100% trong10-15 phút Rửa phôi bằng nước vô trùng khoảng 4-5 lần Tách phôi

Cấy phôi đã được vô trùng vào các ống nghiệm có chứa 50 ml môi trường chuẩn Y3

14

Các ống nghiệm chứa phôi được mang đi nuôi cấy ở phòng sáng ở nhiệt độ 280C ± 20C,ánh sáng là 4.000 lux, thời gian chiếu sáng 9h/ngày

Cấy chuyền phôi hàng tháng (10 lần/10tháng)

Phôi dừa bắt đầu nảy mầm sau khoảng 3-4 tuần, khoảng 10-11 tháng hình thành đầy đủcác bộ phận thân, lá, rễ Trong khoảng thời gian này cần định kỳ cấy chuyền mỗi tháng một lầnnhằm thay thế môi trường cũ đã cạn kiệt dinh dưỡng bằng môi trường mới giàu dinh dưỡng hơn,tạo điều kiện cho cây phát triển khỏe mạnh và cân đối

Cây trưởng thành trong ống nghiệm chuẩn bị chuyển ra vườn ươm là cây phải đạt kíchthước về chiều cao cây ≥ 15cm, đã có 3 lá mở hoàn toàn và đã có rễ thứ cấp.

Kết thúc giai đoạn nuôi cấy phôi trong phòng thí nghiệm, tỷ lệ phôi sống sót và phát triểnthành cây là khoảng 40%

Giai đoạn 3: Giai đoạn thích nghi trong phòng thí nghiệm.

Cây trưởng thành trong ống nghiệm chuẩn bị chuyển ra vườn ươm nên cần có một giaiđoạn thích nghi trong phòng thí nghiệm Các cây dừa con được cấy vào môi trường Y3 có nồng

độ đường 4,5% và được đặt vào điều kiện phòng thí nghiệm có nhiệt độ 30oC, độ ẩm 60% vàcường độ chiếu sáng 5.000 lux Giai đoạn thích nghi trong phòng thí nghiệm được thực hiệnkhoảng 1-2 tháng

Giai đoạn 4 : làm cây thích nghi ở vườn ươm

Cây dừa trong phòng thí nghiệm được đem ra trồng trong các túi PE 15 có pha cát, xơdừa, phân chuồng theo tỷ lệ (1:1:1) Nuôi trồng cây dừa trong bịch PE khoảng 4 tháng Cây sốngsót từ giai đoạn này đạt 60-70%

16

Giai đoạn 5: Trồng ở vườn ươm

Sau khi trồng thích nghi ở vườn ươm, các cây con được chuyển sang giá thể trồng khác làđất và được trồng trong túi PE 25

Cây sống sót ở giai đoạn này đạt 80-90%

Cây con đạt tiêu chuẩn đưa ra vườn trồng là cây có chiều cao ≥ 40cm, cây có ít nhất 5 láxanh, chu vi gốc ≥ 10cm

Giai đoạn 6: Trồng ra đồng

Sau khi được trồng ở giai đoạn thích nghi cây dừa đã cứng cáp có khả năng chống chịucao, được đem trồng ra đồng, tăng lượng phân bón lên 1/3 so với khuyến cáo trồng dừa Tỷ lệsống giai đoạn này là khoảng 95% -100%

=>Như vậy, sau quá trình nuôi cấy phôi khoảng 12-13 tháng, tỷ lệ phôi phát triển thành cây xanh tốt ở vườn ươm đạt tiêu chuẩn trồng ra đồng là 19-20%.

Nguyên nhân dẫn đến tỷ lệ thành công thấp là do:

o Tỷ lệ phôi bị chìm hoàn toàn trong môi trường khi mới đưa vào nuôi cấy chiếm10-15%, các phôi này hầu hết không phát triển được và chết

o Tỷ lệ phôi phát triển bất thường cao chiếm khoảng 10-30% (các phôi phát triểnbất thường là các phôi phát triển không có lá hay rễ, hay cây không có lá mở)

o Tỉ lệ phôi phát triển thành cây hoàn chỉnh trong ống nghiệm đủ tiêu chuẩn đưa ravườn ươm thấp (khoảng 40%)

o Hệ thống lá và rễ nghèo nàn (lá nhỏ, phát triển chậm, bộ rễ không có hoặc có ít rễthứ cấp)

o Khả năng thích nghi ở vườn ươm thấp (Tỷ lệ cây con sống sót ở vườn ươm làkhoảng 60-70%)

=>Như vậy vấn đề chính cần giải quyết trong đề tài này là phải định hướng cho phôi phát triển ngay khi mới đưa vào nuôi cấy và cải tạo được hệ thống chồi và rễ để năng cao tỷ lệ nảy mầm và phát triển thành cây hoàn chỉnh có đầy đủ lá rễ trong ống nghiệm Ngoài ra, đề tài cải thiện tỷ lệ sống của cây dừa nuôi cấy phôi ở giai đoạn vườn ươm.

Cây dừa nuôi cấy phôi phát triển tốt trong phòng thí nghiệm có đủ điều kiện để đưa ravườn ươm là:

• Cây phát triển xanh tốt

• Cây lá và rễ phát triển cân đối

• Cây đã có 3 lá mở và có rễ phụ

Cây dừa nuôi cấy phôi phát triển tốt trong vườn ươm đủ tiêu chuẩn để đưa ra vườn trồngkhi:

• Cây phát triển xanh tốt, không sâu bệnh

• Cây đạt chiều cao ≥ 40cm

18

già, không bị thối nhũn Trái giống đều đặn, không dị dạng và sâu bệnh Trái đủ độ chín, khoảng10-11 tháng tuổi.

2. Sự hóa nâu:

Dừa là loài thực vật giàu các hợp chất polyphenol (tanin hay các hydroxyphenol) Sau khiphôi bị tổn thương trong quá trình cắt và khử trùng, các hợp chất này bị oxid hóa bởi cácoxydase chứa gốc đồng (Cu) như polyphenoloxydase Các hoạt động oxid hóa được tạo thành sẽcản hoạt động của các enzyme trong mô làm mô và môi trường nuôi cấy bị hóa nâu hay đentrong vòng vài ngày sau đó, mô không thể tăng trưởng và sẽ chết Các polyphenol oxydase có thểtổng hợp mới hay hiện diện sẵn và phóng thích do sự tác động của vết thương

Có thể hạn chế sự hóa nâu bằng cách:

o Loại bỏ các hợp chế phenol (phenolic) sinh ra

o Thay đổi thế oxid khử

o Bất hoạt hóa các enzyme phenolase

o Giảm hoạt tính phenolase

o Loại đài chất của phenolase

Trong thực tế, phương pháp dễ nhất để cản sự hóa nâu của mô thực vật là loại các hợpchất phenol sinh ra, có thể thực hiện bằng nhiều cách:

Mô cấy được chuyển thường xuyên trong 2-4 tuần lễ đầu Sự cấy chuyền sẽ dễ thực hiệnhơn nếu mô cấy được đặt vào môi trường lỏng (nuôi cấy lắc)

Các phenolic có thể liên kết với các hợp chất được cho vào trong môi trường nuôi cấy nhưthan hoạt tính (0.5-5mg/l) Khi bị liên kết các phenolic sẽ không cản sự tăng trưởng của mô thựcvật

3. Vai trò của các chất dinh dưỡng

Các nguyên tố đa lượng cũng như vi lượng đều có vai trò đối với thực vật (hoạt hóa enzym).Thực vật chỉ cần một lượng nhỏ chất khoáng cho nhu cầu sinh trưởng, phát triển của chúng Tuynhiên, sự thừa hay thiếu các nguyên tố này cũng đều gây ra những rối loạn biến dưỡng, dẫn tớinhững triệu chứng bất thường đặc trưng và có thể dễ dàng nhận ra khi theo dõi sự phát triển củachúng

• Các khoáng đa lượng:

a. Nitơ ( N):

Nitơ là nguyên tố cần thiết tạo acid min, các loại protein, acid nucleic, diệp lục tố,vitamin và enzym Là thành phần bắt buộc của protein-chất đặc trưng cho sự sống Các hợp chấtnitơ cung cấp năng lượng cho cơ thể, tham gia cấu tạo ADP và ATP Nitơ còn là thành phần củanhiều vitamin như : B1, B2, B6, PP,… đóng vai trò là nhóm hoạt động của nhiều hệ enzym oxyhóa khử, trong đó có sự tạo thành của Adenin

Mô tế bào thực vật trong nuôi cấy có thể sử dụng nitơ ở hai dạng amonium và nitrat,đồng thời có thể sử dụng các dạng nitrogen hữu cơ như acid amin Tỷ lệ nitơ dạng amonium vànitrat thích hợp tùy theo loại cây, bộ phận và trạng thái phát triển của mô Nồng độ NH4+, NO3-

thay đổi từ 3-6 mM

Nitơ còn có tác động nhiều mặt đến sự đồng hóa CO2 Khi thiếu Nitơ cường độ đồng hóaCO2 giảm, làm giảm cường độ quang hợp Khi cung cấp nitơ làm cây tổng hợp Auxin tăng lên.Nếu mô cấy hấp thu nitơ vượt quá nhu cầu thì sẽ mềm mỏng Tuy nhiên nếu không cung cấp đủlượng cấn thiết thì mô cấy sẽ bị cứng do thừa cenllulose và ligin ở thành tế bào

Khi thiếu nitơ thì thân mô cấy kém phát triển, mô có màu xanh nhạt, lá có màu vàng, phiến lámỏng, ảnh hưởng đến quang hợp

b. Phospho (P):

Phospho có vai trò quan trọng trong sự sinh trưởng, cần thiết cho sự phân chia tế bào, sự pháttriển của rễ Phospho có liên quan đến sự tổng hợp đường, tinh bột vì phospho là thành phần củacác hợp chất cao năng tham gia vào các quá trình phân giải hay tổng hợp các chất hữu cơ trong tếbào

Khi thiếu phospho lá cây có màu xanh đậm do sự thay đổi tỷ lệ diệp lục tố a và b Ở môitrường có pH thấp, nhiều sắt thì dễ bị thiếu phospho vì làm phospho ít linh hoạt Sự thiếuphospho thường đi theo sự thiếu nitơ và có triệu chứng gần tương tự nhau vì phospho liên quanđến sự biến dưỡng nitơ

Hai dạng muối phospho thường dùng nhất là NaH3PO4.7H2O và KH2PO4 Nồng độ phosphotrong môi trường biến thiên từ 0.15 - 4mM, thường dùng 1 mM

c. Kali (K):

Kali làm tăng quá trình quang hợp và thúc đẩy sự vận chuyển glucid từ phiến lá vào các cơquan Kali còn tác động rõ rệt đến trao đổi protid, lipid, đến quá trình hình thành các vitamin.Kali rất dễ xâm nhập vào tế bào, làm tăng tính thẩm thấu của thành tế bào đối với các chấtkhác, tăng quá trình thủy hóa, giảm độ nhớt, tăng hàm lượng nước liên kết Kali ảnh hưởng đếncác quá trình sinh tổng hợp các sắc tố trong lá, ảnh hưởng tích cực quá trình đẻ nhánh, hìnhthành bông và chất lượng hạt của các hạt ngũ cốc

Người ta cung cấp Kali cho mô nuôi cấy dưới dạng KNO3, KCl, KH2PO4

Nồng độ Kali trong môi trường biến thiên từ 2 - 25 mM, trung bình khoảng 10 mM

d. Canxi (Ca):

Canxi là thành phần muối pectate của tế bào (pectate calcium) có ảnh hưởng trên tính thấmcủa màng Canxi cần cho sự thâm nhập của NH4+ và NO3- vào rễ Canxi là ion kém linh động nênmàng tế bào thực vật hấp thu dễ dàng

Canxi được cung cấp dưới dạng muối Ca(NO3)2.4H2O, CaCl2.6H2O hoặc

CaCl2.2H2O Nồng độ Ca2+ trong môi trường nuôi cấy từ 1- 3.5 mM, trung bình là 2mM

e. Magie (Mg):

Magie là thành phần cấu trúc của diệp lục tố, có tác dụng sâu sắc và nhiều mặt đến quá trìnhquang hợp, phụ trợ cho nhiều enzym, đặc biệt là ATPase liên quan trong biến dưỡngcarbohydrat, sự tổng hợp acid nucleic, sự bắt cặp của ATP với các chất phản ứng

Khi thiếu magie lá bị vàng, quang hợp kém dẫn đến năng suất giảm Sử dụng magie dưới dạngMgSO4.7H2O, MgO, nồng độ 0.5-3 mM

20

Khi thiếu kẽm thì cường độ tổng hợp tryptophan từ indol và serine bị kiềm hãm nên rễ không tạođược hoặc kém phát triển, lá bị bạc màu, sắc tố bị hủy hoại, lá kém phát triển, hình dạng lákhông bình thường, lóng ngắn,…Thường sử dụng kẽm ở dạng ZnSO4.7H2O.

b. Sắt (Fe):

Những môi trường cổ điển thường dùng sắt dưới dạng clorua sắt FeCl2, FeCl3.6H2O,FeSO4.7H2O, Fe(SO4)3… Hiện nay hầu hết các phòng thí nghiệm đều dùng sắt dưới dạng chelatkết hợp với Disodium Ethylen diamin tetra-acetat (Na2-EDTA) Ở dạng này sắt hầu như không bịtủa và giải phóng dần dần ra ngoài môi trường theo nhu cầu của mô thực vật

Ảnh hưởng của Mn đối với cây trồng khá giống sắt, ngoại trừ bệnh vàng lá không xuất hiện ở

lá non như trong trường hợp của sắt Có một vài dấu hiệu chothấy có sự ảnh hưởng lẫn nhau giữacác lượng khác nhau sắt và mangan và cần phải phòng ngừa trước để để chắc chắn rằng sự cânđối giữa mangan và sắt là không đổi trong giới hạn phát triển tốt nhất của cây trồng

Trong nuôi cấy in vitro, nguồn carbon để mô, tế bào thực vật tổng hợp nên các chất hữu cơ

giúp tế bào phân chia, tăng sinh khối không phải do quá trình quang hợp cung cấp mà do đườngtrong môi trường Đường được sử dụng như nguồn carbon cung cấp năng lượng chủ yếu trongnuôi cấy phôi

Hai dạng đường thường được sử dụng nhất là saccharose và glucose nhưng hiện naysaccharose được dùng phổ biến hơn vì 2 nguyên nhân chính:

o Sử dụng đường saccharose kinh tế hơn đặc biệt là khi ứng dụng vào sản xuất vì giá thànhđường saccharose thấp hơn

o Đường saccharose là một disaccharit được cấu tạo từ 2 đường đơn là α- D-glucose và D-fructose Trong quá trình hấp vô trùng môi trường với autoclave ở 121oC, 1atm,saccharose bị tách thành 2 loại đường đơn như trên và mô thực vật có thể hấp thu được cảhai loại đường đơn này, đối với một số mô đặc biệt thì sự hấp thu đường fructose hiệuquả hơn glucose, ngay cả đường saccharose mô thực vật vẫn có thể hấp thu được nhờ cácenzyme và các chất chuyên chở đặc biệt qua màng

β-Trong thí nghiệm nuôi cấy phôi dừa, không sử dụng đường vàng vì trong đường vàng cónhiều tạp chất, có thể là những yếu tố không kiểm soát được trong quá trình làm thí nghiệm.Ngoài ra, đường còn tác động như chất tạo ra áp suất thẩm thấu Tùy từng giai đoạn phát triểnphôi khác nhau, nhu cầu về đường và áp suất thẩm thấu khác nhau (từ 0.1 đến 12%)

• Các Vitamin:

Các vitamin thường được pha hỗn hợp trong dung dịch mẹ có nồng độ cao gấp 500 hoặc

1000 lần dung dịch làm việc Các dung dịch vitamin rất dễ hỏng do nấm khuẩn nhiễm tạp, vì vậycần giữ trong điều kiện lạnh dưới 0oC

Vai trò từng loại vitamin:

o Thyamin hydrocloric (B1): dạng tinh bột kết tinh trắng, hút ẩm, rất không bền vững.Chứa lưu huỳnh, được tổng hợp trong lá hay chồi non Các mô nuôi cấy không tổng hợpđược vitamin B1 do vậy cần bổ sung vào môi trường nuôi cấy Vitamin B1 thiết yếutrong sự biến dưỡng tế bào

o Vitamin PP được tìm thấy trong NAD hay NADP, các coenzym thiết yếu trong sự vậnchuyển điện tử

o Prydoxine HCl (B6) :dưới dạng phosphoryl hóa, là nhóm hoạt động của transaminase

o Myo-inositol : là một đồng phân của inositol, chất liên quan trong sự truyền dấu hiệuhormon và liên kết với auxin Nó thường được dùng với nồng độ khá cao nên thường đặtngoài nhóm vitamin

o Ca-D pantothenate: chất bột trắng, tan trong nước, là dạng phổ biến nhất của vitamin B3

o Biotin cần trong vài sự carboxyl hóa

• Chất điều hoà tăng trưởng thực vật.

Chất điều hoà sinh trưởng thực vật (hormone thực vật) là những hợp chất hữu cơ do t ế bàotạo ra tại một nơi nào đó trong cơ thể thực vật và được chuyển tới một nơi khác Ở đó, với nồng

độ rất thấp gây ra một phản ứng sinh lý

Ở nồng độ thấp làm biến đổi các hoạt động sinh lý (kích thích, điều hoà hay cản) các quátrình sinh lý của thực vật

Ở nồng độ cao chúng trở thành chất độc cho thực vật (đặc biệt là với con người)

Chất điều hoà sinh trưởng nội sinh ít bền và dễ kiểm soát hơn so với các chất điều hoà ngoạisinh Do vậy trong thực tế các chất điều hoà tổng hợp được sử dụng rất phổ biến

Chất điều hoà sinh trưởng thực vật được phân làm 5 nhóm chính là: Auxin, Cytokinin,Gibberilin, Acid Abscisic và Ethylen Mỗi chất có những tác dụng sinh lý khác nhau trên quá

trình sinh trưởng của thực vật tự nhiên và thực vật trong nhân giống in-vitro.

VI.2.5 Tác động của các đi ề u kiện môi trường:

• Ánh sáng:

Ánh sáng đóng vai trò quan trọng trong việc tạo hình cây in vitro, nó tác động đến các quá

trình quang hợp và hô hấp của cây Ánh sáng còn góp phần vào việc tạo rễ và chồi bất định củacác phôi Khi thiếu ánh sáng cây sẽ bị hoàng hoá do lá thiếu diệp lục tố vì quang hợp không xảy

ra dẫn đến hậu quả là cây sẽ giảm trọng lượng, việc phân hoá mô và tạo rễ sẽ giảm

Mặt khác, khi cường độ ánh sáng yếu thì cường độ quang hợp cũng kém hơn cường độ hôhấp làm tăng hàm lượng CO2 gây độc cho cây Khi ánh sáng quá nhiều, cường độ ánh sáng tăngcao sẽ làm tăng sự thoát hơi nước, làm cho môi trường nuôi cấy khô do thiếu nước ảnh hưởng tới

sự phát triển của mô cấy

Ánh sáng trong phòng cấy mô có cường độ thay đổi trong khoảng 3000 - 5.000lux thời gianchiếu sáng từ 8-10 giờ /ngày Khi chuẩn bị đưa cây ra vườn ươm thì cường độ ánh sáng tăng lênkhoảng từ 3.000- 5.000 lux

Phản ứng của cây đối với quang hợp và phát sinh hình thái khi ánh sáng có bước sóng 400 và680nm do diệp lục tố a và b có hai cực đại hấp thu, một ở vùng xanh lam (400-460nm), một ởvùng đỏ (620-680nm) và hầu như không hấp thu ánh sáng ở giữa hai cực đại này (tức trong vùng

lục và vàng) Chất lượng ánh sáng quyết định đến khả năng phát sinh hình thái của cây in

vitro Chất liệu bình nuôi cấy cho phép sự vận chuyển ánh sáng qua bình Ví dụ: chất liệu là thủy

tinh, nhựa, polycarbonate, cho phép cản ánh sáng có bước sóng 390, 300, 290nm Như vậy, ánh

sáng mà cây in vitro thu nhận được phụ thuộc vào bước sóng ánh sáng và chất liệu bình nuôi cấy.

• Nhiệt độ:

22

Nhiệt độ có tác động trên sự tăng trưởng do tác động trên sự quang hợp, các phản ứng biếndưỡng, sự hấp vận chuyển nước và các chất khoáng.

Ánh sáng là nguồn gốc tạo nên năng lượng và chuyển thành nhiệt năng, 25% năng lượng được sửdụng trong quang hợp Ánh sáng làm cho bình nuôi cấy tăng nhiệt độ, và chênh lệch cao nhiệt độngoài bình từ 0,5 đến 1oC trong suốt quá trình quang hợp

• Độ ẩm:

Độ ẩm trong nuôi cấy in vitro cần độ ẩm tương đối khoảng 95% do độ ẩm ảnh hưởng tới

hình thái, cấu trúc và sinh lý của mô cấy Độ ẩm giúp tạo áp suất thuỷ tĩnh, giảm bớt nhiệt độ daođộng trong bình cấy, giúp vận chuyển các chất trong cơ thể thực vât…

Khi độ ẩm trong bình cấy mô quá cao sẽ gây ra sự bão hoà hơi nước trong bình cấy mô làmcho lớp cutin mỏng, hiện tượng thuỷ tinh thể xảy ra dẫn đến sự giảm năng suất khi đưa cây ramôi trường ngoài

• Độ pH:

Độ pH phù hợp trong nuôi cấy phôi dừa sáp trong khoảng từ 5,8 - 6 Trong môi trường nuôicấy nếu pH chưa phù hợp thì nó có xu hướng dịch chuyển về pH phù hợp để mô có thể phát triểnđược

VI.2.6 Giai đoạn thích nghi:

Để thích nghi cây dừa nuôi cấy phôi, cây con cần có tỷ lệ thích hợp giữa chồi và rễ Nếu

cây con đã được tạo rễ in vitro, khi trồng vào hỗn hợp đất (chứa trong túi PE) cần được duy trì

trong các điều kiện che sáng một phần và độ ẩm tương đối cao trong vài ngày Cây thích nghinhờ sự giảm dần độ ẩm tương đốitrong khí quyển Điều này được thực hiện đơn giản bằng cáchtrùm cây con với với túi PE trong suốt trong vài ngày sau đó mở dần túi PE ra

Cây con ra rễ in vitro có thể làm cho cứng cáp hơn bằng cách để cây con trong ống nghệm thêm

1-2 tuần trước khi cho ra hỗn hợp đất Xử lý cây con mới được chuyển ra đất với các chất chốngnấm giúp làm tăng đáng kể sự sống còn của các cây con

• Sự tự dưỡng của cây con:

Quang hợp và sự tạo lớp sáp cutin trên lá có ảnh hưởng trên sự sống còn của cây con từ sự

nuôi cấy in vitro Cây con tăng tưởng in vitro trên môi trường giàu carbihydrate nói chung chỉ

sản xuất một phần rất ít nhu cầu carbohydrate từ sự cố định CO2 trong quang hợp

Khi các cây con này được chuyển vào điều kiện in vivo, chúng phải trở nên hoàn toàn tự dưỡng,

quang hợp gia tăng Tuy nhiên trong thời gian đầu (trong vòng khoảng 1-2 tuần) chúng vẫn cònphóng thích nhiều CO2 hơn là hấp thu cho quang hợp Hô hấp tối của các cây này cũng cao hơn

hô hấp tối của các cây con cùng tuổi, cho thấy rằng các cây con mới được chuyển dùng nhiềunăng lượng để thích ứng với môi trường mới Do đó sự sống còn của các cây con mới được

chuyển ra vườn ươm lệ thuộc mạnh vào nguồn tinh bột được tích lũy trong sự nuôi cây in

vitro.

• Sự cân bằng nước của cây con:

Các cây con từ sự nuôi cây in vitro có lớp sáp cutin trên bề mặt lá mỏng hơn nhiều so với các

cây tương tự được trồng trong nhà kính hay ngoài đồng Sự giảm lớp sáp cutin này làm cây con

in vitro mất nước nhanh hơn cây bình thường và do đó gây bất lợi cho cây in vitro khi mới

chuyển ra vườn ươm Độ ẩm cao trong các bình nuôi cây được xem là nguyên nhân chính làmgiảm lớp sáp cutin Ánh sáng thấp cũng góp phần trong sự giảm này Một lý do khác của sự mấtnước là hoạt động không hiệu quả của các khí khẩu

VII KỸ THUẬT TRỒNG:

VII.1 Mùa vụ:

Ở Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) nên trồng vào tháng 6 - 7 dương lịch (đã vàomùa mưa) để giảm chi phí tưới trong giai đoạn cây con Tuy nhiên, nếu chủ động được nguồnnước tưới thì có thể trồng vào bất kỳ thời gian nào trong năm.

VII.2 Đào mương lên liếp:

Ở ĐBSCL ngoài đất giồng cát, thì tất cả các loại đất từ đất phù sa ven sông hay đất phènđều phải lên liếp khi trồng cây lâu năm như cây dừa Tuy nhiên, kiểu lên liếp tùy thuộc vào từngloại đất và mô hình canh tác Đối với vùng đất phù sa không phèn có thể lên liếp theo kiểu cuốnchiếu, tức là lớp đất mặt bị đưa xuống dưới và tầng đất ở dưới sâu được đưa lên mặt, dần dần liếpđược hình thành Đối với vùng đất có phèn, tùy thuộc vào độ sâu xuất hiện tầng phèn mà xácđịnh độ sâu của mương, tránh đưa tầng đất phèn tiềm tàng lên tầng mặt, đất oxid hóa sinh raphèn hoạt động sẽ làm chết cây dừa Ngoài ra, nên áp dụng biện pháp kê liếp để không làm đảolộn tầng đất, không đưa đất phèn lên tầng mặt

VII.3 Kích thước liếp:

Tùy thuộc vào loại đất và mô hình canh tác mà liếp được lên theo kiểu liếp đơn với chiềurộng mặt từ 4-6 m hay liếp đôi với chiều rộng mặt từ 6-8 m, thậm chí từ 10-12 m Đối với vùngđất phù sa, không phèn, có thể lên liếp đôi để tiện việc trồng xen hoa màu trong giai đọan kiếnthiết cơ bản, đồng thời cũng dễ áp dụng các mô hình đa canh khi cây trưởng thành Đối với vùngđất có phèn, mặn nên lên liếp đơn để liếp mau rửa phèn và thường áp dụng mô hình độc canhhay xen canh với một số cây có khả năng chịu phèn như chuối, khóm

o Đất cát pha địa hình bằng phẳng, dễ thoát nước: Không cần lên liếp Dọn sạch đất,cày tơi xốp Định hướng trồng, đóng cọc định vị hố trồng

o Đất thịt khó thoát nước: Phải đào mương lên liếp Kích thước và kiểu liếp thayđổi tùy theo điều kiện thực tế, nhưng điều kiện quan trọng là phải có tầng đất mặtdày 1m để bảo đảm cho bộ rễ dừa phát triển Có 2 loại liếp: liếp đơn và liếp đôi

o Liếp đôi: Bề rộng liếp đôi thường là 10 m Trồng hai hàng dừa ở 2 bên, cách bờmương 1-1,5 m

o Liếp đơn: Bề rộng mặt liếp khoảng 5 m Trồng một hàng dừa ở giữa liếp

24