Giáo trình công nghệ tế bào

Giáo trình công nghệ tế bào Giáo trình công nghệ tế bào Giáo trình công nghệ tế bào Giáo trình công nghệ tế bào Giáo trình công nghệ tế bào Giáo trình công nghệ tế bào Giáo trình công nghệ tế bào Giáo trình công nghệ tế bào Giáo trình công nghệ tế bào Giáo trình công nghệ tế bào Giáo trình công nghệ tế bào Giáo trình công nghệ tế bào Giáo trình công nghệ tế bào Giáo trình công nghệ tế bào

Trang 1

LỜI NÓI ĐẦU

Hiện nay, Công nghệ sinh học là một trong những ngành khoa học mũi nhọn Công nghệ sinh học là các quá trình sản xuất ở quy mô công nghiệp có sự tham gia của các tác nhân sinh học dựa trên các thành tựu tổng hợp của nhiều ngành khoa học, phục

vụ cho việc tăng của cải vật chất của xã hội và bảo vệ lợi ích của con người Nuôi cấy

mô thực vật là một trong những lĩnh vực ứng dụng đạt nhiều thành công nổi bật của công nghệ sinh học thực vật

Giáo trình Công nghệ tế bào thực vật này cung cấp những kiến thức cơ bản cho sinh viên với các nội dung chính sau:

- Tính toàn thể của tế bào

- Môi trường dinh dưỡng

- Nhân giống in vitro thực vật

- Thụ phấn in vitro và nuôi cấy phôi hữu tính

- Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn

Chúng tôi xin chân thành PGS.TS Nguyễn Hoàng Lộc đã cho chúng tôi tham khảo giáo trình và sử dụng làm tài liệu chính cho phần viết giáo trình

Chúng tôi chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trường Cao đẳng Lương Thực Thực phẩm cùng phòng Quản lý Khoa học và Hợp tác quốc tế đã tạo điều kiện để chúng tôi hoàn thành giáo trình này

Các tác gi ả

Trang 2

Chương 1 GIỚI THIỆU VỀ TÍNH TOÀN THỂ CỦA TẾ BÀO

tế bào Có thể nói Schleiden và Schwann là hai ông tổ của học thuyết tế bào Tuy nhiên, cả hai ông không phải là các tác giả đầu tiên phát biểu một nguyên tắc nào đó ,

mà chỉ là diễn đạt nguyên tắc ấy rõ ràng và hiển nhiên tới mức nó được phổ biến rộng rãi và cuối cùng đã được đa số các nhà sinh học thời ấy thừa nhận

Ngày nay, các nhà sinh học quan niệm rằng, tế bào là đơn vị tổ chức cơ bản của

sự sống cả về cấu trúc, chức năng và di truyền, có nghĩa là sự sống chỉ thể hiện trong

tổ chức tế bào và trong các cấp độ có cấu tạo tế bào

Những cơ thể đơn bào như vi khuẩn, amip hay trùng lông Paramecium thì cơ

thể chúng chỉ gồm một tế bào nhưng chúng có đầy đủ đặc tính của cơ thể sống giống như chuột gồm hàng tỷ tế bào Có thể nói tất cả các hoạt động sống của cơ thể như trao đổi chất, trao đổi năng lượng, dinh dưỡng, tiêu hóa, bài tiết, phản ứng thích nghi với

môi trường sinh trưởng, sinh sản, di truyền,… đều có sơ sở tế bào

2 TÍNH TOÀN THỂ CỦA TẾ BÀO

2.1 Tính toàn thể của tế bào

Haberlandt (1902) là người đầu tiên đề xướng ra phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật để chứng minh cho tính toàn thể của tế bào Theo ông mỗi một tế bào bất kỳ của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh Điều đó theo kiến thức sinh học hiện đại có nghĩa là : Mỗi tế bào riêng

rẽ của một cơ thể đa bào đều chứa đầy đủ toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết của cả sinh vật đó và nếu gặp điều kiện thích hợp thì mỗi tế bào có thể phát triển thành một cơ thể sinh vật hoàn chỉnh

Từ năm 1898, Haberlandt đã bắt đầu những thí nghiệm nuôi cấy tế bào đơn tách

từ nhu mô lá , tượng tầng của tầng biểu bì và lông hút của nhiều loài thực vật nhưng

không thu được kết quả nào cả Ông viết : "Trong các thí nghiệm nuôi cấy của tôi chẳng bao giờ quan sát được tế bào phân chia Vấn đề đặt ra cho các thí nghiệm nuôi cấy trong tương lai là phải xác đị nh cho được các điều kiện thích hợp mà ở đó tế bào riêng rẽ sẽ phải phân chia " Hơn 50 năm sau các nhà thực nghiệm về nuôi cấy mô và

tế bào thực vật mới chứng minh khả năng tồn tại và phát triển độc lập của tế bào

Tính toàn thể của tế bào thực vật đã được từng bước chứng minh Nổi bật là các công trình theo thứ tự thời gian sau : Miller và Skoog (1953) tạo được rễ từ mảnh mô cắt từ thân cây thuốc lá, Reinert và Steward (1958) đã tạo được phôi và cây cà rốt hoàn chỉnh từ tế bào đơn nuôi cấy trong dung dịch, Cocking (1960) tách được tế bào trần và Takebe (1971) tái sinh được cây hoàn chỉnh từ nuôi cấy tế bào trần của lá cây thuốc lá

Trang 3

Kỹ thuật tạo dòng (cloning) các tế bào đơn được phân lập trong điều kiện in vitro đã chứng minh một các tế bào soma , dưới các điều kiện thích hợp , có thể phân hóa để phát triển thành một cơ thể thực vật hoàn chỉnh Sự phát triển của một cơ th ể trưởng thành từ tế bào đơn (hợp tử) là kết quả của sự hợp nhất sự phân chia và phân hóa tế bào Để biểu hiện tính toàn thể, các tế bào phân hóa đầu tiên trải qua giai đoạn phản phân hóa (dedifferentiation) và sau đó l à giai đoạn tái phân hóa (redifferentiation)

Hiện tượng tế bào trưởng thành trở lại trạng thái phân sinh và tạo ra mô callus không phân hóa (undifferentiation) được gọi là phản phân hóa , trong khi khả năng để các tế bào phản p hân hóa tạo thành cây hoàn chỉnh (whole plant) hoặc các cơ quan thực vật được gọi là tái phân hóa ở động vật , sự phân hóa (cytodifferentiation) là không thể đảo ngược trở lại Như vậy, sự phân hóa tế bào là kết quả cơ bản của sự phát triển ở những cơ thể bậc cao

Sự tạo phôi dinh dưỡng cho thấy tính toàn thể của tế bào thực vật, đơn bội hoặc lưỡng bội Sự khởi tạo phôi sinh dưỡng bao gồm sự tác động vết thương, kim loại nặng, sự thay pH, nguồn carbon, nồng độ carbon và nhiệt độ cao Các công trình

nghiên cứu trên đối tượng Cichorium và cà rốt chỉ ra rằng việc đạt được tính toàn

năng và khả năng tạo phôi của các tế bào nuôi cấy phụ thuộc vào sự thay đổi về phía thể đơn bội, là kết quả sự phản ứng của cơ thể với chất điều hòa sinh trưởng

2.2 Sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào

Cơ thể thực vật trưởng thành là một chỉnh thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, được hình thành từ nhiều loại tế bào khác nhau Tuy nhiên, tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên (tế bào hợp tử) Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử tiếp tục phân chia thành nhiều tế bào phôi sinh chưa mang chức năng riêng biệt (chuyên hóa) Sau đó từ các tế bào phôi sinh này chúng tiếp tục được biến đổi thành các tế bào chuyên hóa đặc biệt cho các mô, cơ quan có chức năng khác nhau

Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào mô chuyên hóa, đảm nhận các chức năng khác nhau Ví dụ: Mô dậu làm nhiệm vụ quang hợp, mô bì làm nhiệm vụ bảo vệ, nhu mô làm nhiệm vụ dự trữ, mô dẫn có chức năng dẫn nước và dẫn dinh dưỡng

Quá trình phân hóa có thể biểu thị như sau:

Tế bào phôi sinh →Tế bào dãn →Tế bào phân hóa có chức năng riêng biệt Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng chuyên, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi mình Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ Quá trình đó gọi là phản phân hóa tế bào, ngược lại với sự phân hóa tế bào

Ví dụ: khi nuôi cấy mô thuốc lá, các tế bào đã phân hóa của lá gặp điều kiện thích hợp của môi trường sẽ phản phân hóa và phân chia liên tục tạo nên các mô sẹo (callus) Các tế bào mô sẹo không còn là tế bào có chức năng như tế bào lá nữa Nếu chuyển các callus này sang môi trường khác, tùy theo thành phần môi trường mà callus lại phân hóa theo hướng hình thành chồi, rễ và có thể hình thành nên cây hoàn

chỉnh

Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạt hóa, ức chế các gen Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen được hoạt hóa (mà vốn trước đây bị ức chế) để cho tính trạng mới, còn một số gen

Trang 4

khác lại bị đình chỉ hoạt động Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc của phân tử DNA của mỗi tế bào khiến quá trình sinh trưởng phát triển

của cơ thể thực vật được hài hòa

Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thường bị ức chế bởi các tế bào xung quanh Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thước của khối mô

sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sự hoạt hóa các gen của tế bào

Hầu hết các tế bào thực vật đã biệt hóa có thể phát triển thành callus hoặc huyền phù tế bào không biệt hóa dưới sự cảm ứng của một chế độ hormone nhất định, dẫn đến sự bất tử của tế bào thực vật Các tế bào thực vật có khả năng phát triển đến một

cấu trúc có biệt hóa bằng cách thay đổi chương trình phát sinh hình thái của nó Tế bào

mầm (tế bào có khả năng tự sinh sản và biệt hóa thành những loại mô khác nhau) có

thể tồn tại trong trạng thái không biệt hóa và tùy theo sự phân chia có thể biệt hóa thành một hay nhiều loại tế bào phụ thuộc vào những tế bào cơ bản, từ đó các cơ quan bên sẽ được hình thành

Tế bào mầm được tìm thấy với lượng nhỏ trong mô phân sinh đỉnh chồi và mô phân sinh đỉnh rễ, tại đó những tế bào mầm này vẫn tồn tại trong trạng thái không biệt hóa trước khi trải qua quá trình biệt hóa tạo nên nhiều loại mô khác nhau Những tế bào khối u hoặc những tế bào mô sẹo phát triển một con đường khác sự biệt hóa bình thường và có khả năng tăng sinh không giới hạn, mặc dù việc trở về trạng thái biệt hóa bình thường có thể được thực hiện bằng cách điều khiển các điều kiện của môi trường nuôi cấy

Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật thực chất là kết

quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào cho đến cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật một cách định hướng dựa vào sự phân hóa và sự phản phân hóa của tế bào trên cơ sở tính toàn năng của tế bào thực vật

Để điều khiển sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy, người ta thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy hai nhóm chất điều hòa sinh trưởng là auxin và cytokinin Tỷ

lệ hai nhóm này sẽ tạo ra sự phát sinh hình thái khác nhau Khi môi trường nuôi cấy có

tỷ lệ nồng độ auxin thấp thì sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy theo hướng tạo

chồi, khi tỷ lệ này cao mô nuôi cấy sẽ phát sinh hình thái theo hướng tạo rễ, còn ở tỷ lệ cân đối sẽ phát sinh theo hướng tạo mô sẹo

2.3 Tế bào thực vật và sự phân bào

Cơ thể sống cấu tạo từ một tế bào đơn độc hoặc một phức hợp các tế bào Tế bào rất đa dạng, khác nhau về hình thái, kích thước, cấu trúc và chức năng Tế bào động vật và tế bào thực vật là những biến đổi của cùng một kiểu cơ sở của đơn vị cấu trúc

Mỗi tế bào là một hệ thống mở, tự duy trì và tự sản xuất: tế bào có thể thu nhận

chất dinh dưỡng, chuyển hóa các chất này thành năng lượng, tiến hành các chức năng chuyên biệt và sản sinh thế hệ tế bào mới nếu cần thiết

Mọi tế bào đều có một số khả năng sau:

- Sinh sản thông qua phân bào;

- Trao đổi chất tế bào bao gồm thu nhận các vật liệu thô, chế biến thành các thành phần cần thiết cho tế bào, sản xuất các phân tử sinh năng lượng và sản xuất các

sản phẩm phụ Để thực hiện được các chức năng của mình, tế bào cần phải hấp thu và

Trang 5

sử dụng được nguồn năng lượng hóa học dự trữ trong các phân tử hữu cơ Năng lượng này được giải phóng qua các con đường trao đổi chất;

Hình 1.1 C ấu tạo tế bào thực vật

Tế bào thực vật được bọc chung quanh bởi thành tế bào Lớp ngoài của thành tế bào có chứa pectin để giúp nó liên kết với tế bào bên cạnh Lớp trong của thành tế bào

là màng tế bào Màng tế bào khác hoàn toàn với thành tế bào về hình dạng, thành phần

và chức năng Trong khi thành tế bào cứng rắn, có cấu trúc tương đối dày thì màng tế bào lại mỏng (khoảng 750

A) và mềm dẻo Màng tế bào bao gồm protein và lipid trong khi thành tế bào là carbonhydrate tự nhiên Thành tế bào có chức năng nâng đỡ cho cây trong khi màng tế bào điều hòa sự vận chuyển các chất đi vào và ra khỏi tế bào

Không bào (vacuole) có vai trò tiếp nhận các chất thải của sự trao đổi chất hoặc các chất thứ cấp của thực vật Ở các tế bào non không bào nhỏ và nhiều Khi tế bào lớn

dần và già đi thì không bào mở rộng thêm và kết nối thành một khối Ở các tế bào thực

vật trưởng thành không bào có thể chiếm đến 90% thể tích tế bào Không bào được

bọc chung quanh bởi màng nguyên sinh chất (plasma) Thành phần chính của các

Trang 6

không bào lớn là nước chứa các chất hòa tan như các ion vô cơ, các amino acid, các acid hữu cơ, các sắc tố hòa tan trong nước và các chất không hòa tan ở dạng tinh thể

và hình kim Ngoài ra, không bào cũng chứa các protein như các hydrolyse, catalase, photphotase

Lục lạp (chloroplast) là bào quan thực hiện quang hợp trong tế bào thực vật, nó

chứa sắc tố lục (chlorophyll) phản ứng với ánh sáng để sản xuất các carbonhydrate Nhân (nuclear) là trung tâm điều khiển các tế bào chứa DNA để phiên mã và dịch mã thành protein Các protein tổng hợp được sắp xếp đóng gói trong các túi của bộ máy golgi Nội sinh chất (endoplasmic reticulum) là mạng lưới của các ống nhỏ nối liền các

phần khác nhau của tế bào Ribosom được tập trung trên bề mặt của mạng lưới nội sinh chất và tham gia vào hoạt động sinh tổng hợp protein Ty thể (mitochondria) chứa

vật liệu di truyền và nhiều enzyme quan trọng trong sự trao đổi chất của tế bào

Cơ thể thực vật được cấu tạo từ những tế bào, mỗi tế bào được liên kết với

những tế bào khác bởi chất kết dính gian bào bao quanh Trong khối liên kết đó có

những nhóm tế bào khác biệt về hình thái hoặc chức năng hoặc cả hai với những nhóm khác Những nhóm như vậy gọi là mô Một số mô có cấu tạo đơn giản, chỉ gồm một

loại tế bào, những mô khác phức tạp hơn nhiều hơn một kiểu tế bào

Các mô tế bào trong cơ thể thực vật đều có nguồn gốc từ hợp tử (từ tế bào trứng

đã thụ tinh qua các giai đoạn phát triển của phôi và sau đó phát triển thành cơ thể trưởng thành) Cơ thể thực vật sinh trưởng nhờ có mô phân sinh Mô phân sinh ngọn phân chia và phân hóa thành các phần mới của chồi và rễ Đó là sự sinh trưởng sơ cấp

Sự sinh trưởng thứ cấp ở thực vật hai lá mầm và hạt trần là do hoạt động của mô phân sinh thứ cấp được gọi là tầng phát sinh Trong sinh trưởng thứ cấp còn có tầng phân sinh bần là mô phân sinh thứ cấp hình thành nên chu bì Tầng phát sinh và tầng sinh

bần được gọi là mô phân sinh bên vì nó ở vị trí bên của thân và rễ để phân biệt với mô phân sinh sơ cấp là mô phân sinh ngọn Cơ thể thực vật có phôi phát triển từ khi hạt

nẩy mầm gồm rễ phát triển xuống đất và chồi gồm thân mang lá phát triển trong khí quyển Sự phát triển của chồi và rễ là từ các tế bào của mô phân sinh ngọn Thân, lá, rễ được gọi là cơ quan dinh dưỡng Khi trưởng thành thì hoa được hình thành Sau khi

thụ phấn là sự thụ tinh và sự hình thành phôi, hạt và quả Những cơ quan đó gọi là cơ quan sinh sản Chu trình phát triển của cơ thể thực vật có thể kể từ khi hợp tử hình thành và kết thúc trước khi xảy ra sự thụ tinh của các giao tử để tạo nên thế hệ sau

2.3.2 S ự phân bào

Thực vật có thể sinh trưởng, phát triển được nhờ ở sự phân bào Có hai kiểu phân bào: gián phân (mitose) còn gọi là phân bào nguyên phân và giảm phân (meiose) còn gọi là phân bào giảm nhiễm

Trong nguyên phân các cơ quan tử (lục lạp, ty thể…) của tế bào được chia ra hai phần khá đều ở hai tế bào mới được hình thành Riêng đối với nhân thì sự phân chia làm đôi được thực hiện rất chính xác nhờ sự phân đôi chính xác ở mức độ phân tử của các thể nhiễm sắc (NST)

Ở thực vật, sự nguyên phân (hình 1.2) xảy ra ở các mô phân sinh Quá trình nguyên nhiễm là quá trình phức tạp, gồm nhiều thời kỳ nối tiếp nhau: Kỳ trung gian, kỳ đầu, kỳ giữa, kỳ sau và kỳ cuối Mỗi kỳ có đặc trưng về cấu trúc và tập tính về NST, bộ máy phân bào

Trang 7

Hình 1.2 Sự nguyên phân

- Kỳ trung gian (interphage): Trong kỳ này, DNA của tế bào được nhân đôi nhờ enzyme DNA polymerase Kỳ trung gian chia ra ba giai đoạn: G1, S, G2 Sinh tổng hợp DNA xảy ra trong giai đoạn S

- Kỳ đầu (Prophase): Kỳ đầu được tiếp theo sau pha G2 của kỳ trung gian, thường kéo dài từ 10 đến 15 phút Các hiện tượng đặc trưng cho kỳ đầu là:

+ Hình thành NST: NST xuất hiện ở dạng các sợi xoắn dọc, mảnh, sắp xếp trong nhân Về sau, NST thấy rõ hơn, nó gồm 2 sợi xoắn kép có tên là nhiễm sắc tử (chromatide) Hai nhiễm sắc tử trong 1 NST được đính lại với nhau bởi tâm động chung Số nhiễm sắc tử trong một NST là gấp đôi số 2n (2n x 2) Đây là kết quả của sự nhân đôi NST qua giai đoạn S Dần dần các NST xoắn lại và co ngắn lại, dày lên

+ Màng nhân và hạch nhân có nhiều thay đổi: Hạch nhân giảm thể tích phân rã

và biến mất Màng nhân đứt ra thành nhiều đoạn và biến thành các bóng không bào bé phân tán trong tế bào chất, tạo điều kiện cho NST di chuyển ra ngoại vi tế bào

+ Hình thành bộ máy phân bào: Các vi ống xếp phóng xạ quanh trung tử mới tạo thành sao phân bào Hai sao di chuyển về 2 cực của tế bào Giữa hai sao các vi ống

phát triển sắp xếp thành hệ thống sợi có dạng hình thoi được gọi là thoi phân bào

- Kỳ giữa (Metaphase): Các NST tập trung vào giữa tế bào, các tâm động cùng nằm trên một mặt phẳng xích đạo Thoi vô sắc được hình thành đầy đủ và có thể thấy

2 dạng sợi của nó Một dạng sợi kéo dài qua suốt tế bào, nối với 2 cực của tế bào Dạng sợi thứ 2 dính một đầu mút vào cực của tế bào và đầu mút kia vào tâm động của thể nhiễm sắc Ở cuối trung kỳ, các nhiễm sắc tử phân tách nhau ra ở vùng giữa của

nó Kỳ giữa thường kéo dài từ từ 25 đến 30 phút

- Kỳ sau (Anaphase): Hậu kỳ bắt đầu từ lúc các NST phân tách nhau ra và di chuyển về các cực khác nhau Bắt đầu tâm động phân đôi, các tâm động con tách nhau

Trang 8

ra mang theo các nhiễm sắc tử Như vậy 2 nhiễm sắc tử trong 1 NST tách nhau ra và nhờ tâm động sẽ di chuyển về hai cực của tế bào theo sợi của thoi phân bào Các nhiễm sắc thể đã trở thành NST con Ở thời kỳ này bắt đầu hình thành nhân con, các màng nhân xuất hiện màng ngăn cách các tế bào chị em, các bào quan tử phân phối đều giữa các tế bào mới Thời gian diễn ra kỳ sau là ngắn nhất, chỉ kéo dài từ 5 đến 8 phút

- Kỳ cuối (Telophase): Ở giai đoạn này, các NST con đã chuyển đến 2 cực, chúng dần mở xoắn và ẩn vào dịch tế bào giống như lúc bắt đầu tiền kỳ Màng nhân được tái tạo hoàn toàn, hạch nhân xuất hiện Đồng thời xảy ra quá trình phân chia tế bào chất Quá trình phân chia tế bào chất xảy ra ở động vật và thực vật khác nhau

Sự giảm phân (Hình 1.3) là đặc trưng cho sự phân chia của các tế bào sinh dục

Do phân bào giảm nhiễm mà các giao tử có bộ NST đơn bội 1n và qua quá trình thụ tinh hợp tử lại có bộ NST lưỡng bội 2n Giảm phân gồm có hai giai đoạn: Giảm phân I

và giảm phân II

Hình1.3 Sự giảm phân

Giảm phân I có thời gian kéo dài và rất phức tạp, đặc biệt là kỳ đầu I có thể kéo dài tới hàng ngày, hàng tháng thậm chí hàng năm

- Kỳ đầu I : Được phân thành 5 giai đoạn tuỳ theo tập tính của NST

+ Giai đoạn Leptonema (giai đoạn bó hoa): Xuất hiện các sợi NST xoắn đôi, co ngắn, có mang tâm động, rất khó nhận biết các NST trong giai đoạn này

Trang 9

+ Giai đoạn Zygonema (giai đoạn tiếp hợp): Giai đoạn này bắt đầu khi các NST tương đồng liên kết với nhau từng đôi một Một chiếc trong cặp NST tương đồng có nguồn gốc từ bố, chiếc kia có nguồn gốc từ mẹ (từ giao tử đực và giao tử cái) Sự tiếp hợp của các NST tương đồng xảy ra một cách chính xác Có thể đính với nhau từ đầu mút, sau đó, kéo dài dọc NST, cũng có thể đính với nhau ở nhiều đoạn cùng một lúc Nhờ sự tiếp hợp mà các hạt nhiễm sắc, các điểm của sợi nhiễm sắc tương đồng này có thể tiếp cận với các hạt, các điểm của sợi tương đồng kia Trong suốt quá trình tiếp hợp, NST vẫn giữ nguyên là một thể toàn vẹn Điểm đặc trưng để nhận biết giai đoạn zigonem là sự tiếp hợp của các cặp NST tương đồng

+ Giai đoạn Pachinema (giai đoạn trao đổi chéo): giai đoạn này tương đối dài,

có thể kéo dài hằng ngày Trong giai đoạn này sự tiếp hợp của các NST tương đồng kết thúc Các NST tương đồng vẫn nằm tiếp cận nhau, chúng dày lên và co ngắn lại Các NST ở đây đều là sợi đôi do 2 NST tương đồng dính sát vào nhau theo chiều dọc

và được gọi là thể lưỡng trị (bivalent) gồm 2 đơn trị (mỗi NST tương đồng) Chúng có cặp tâm động riêng Mỗi lưỡng trị có hai tâm động và gồm 4 sợi NST (chromatid) Trong giai đoạn này xảy ra hiện tượng trao đổi chéo giữa các cặp NST tương đồng Sự trao đổi chéo biểu hiện 2 NST tương đồng trao đổi các cấu thành có chứa gen cho nhau Hiện tượng trao đổi chéo có ý nghĩa hết sức quan trọng về mặt di truyền, vì nó dẫn đến sự tái tổ hợp của gen

+ Giai đoạn Diplonema: Đặc trưng của diplonem là xuất hiện các lực đẩy giữa

các thành viên tiếp hợp mà bắt đầu là từ tâm động, kết quả là các NST tương đồng tách nhau ra (các đơn vị tách ra) Nhưng sự tách ra không xảy ra toàn bộ chiều dọc, mà chúng vẫn dính với nhau ở một vài điểm, điểm đó gọi là hình chéo Thường người ta xem hình chéo là dẫn chứng tế bào của hiện tượng trao đổi chéo đã xảy ra ở diplonem

+ Giai đoạn Diakinese (giai đoạn sợi xoắn): Ở giai đoạn này, NST càng co ngắn lại Các đơn trị tách nhau ra và thường nằm ở ngoại vi của nhân Quá trình mút hóa của hình chéo tiếp tục, số hình chéo giữa NST mất dần vào đầu trung kỳ I, các NST chỉ dính với nhau ở chéo tận cùng Màng nhân và hạch nhân biến mất, xuất hiện sao và thoi phân bào

Khi kỳ đầu kết thúc, tế bào chuyển vào kỳ giữa I, kỳ sau I, kỳ cuối I để hoàn thành phân chia tạo ra 2 tế bào đơn bội

- Kỳ giữa I: Các lưỡng trị xếp ở xích đạo theo kiểu cả 2 nhiễm sắc tử của mỗi cặp tương đồng đều hướng tâm động của mình về các cực đối diện Các tâm động càng đẩy nhau mạnh hơn và các nhiễm sắc tử chuẩn bị để phân ly về 2 cực

- Kỳ sau I: Trong bộ 4 (lưỡng trị), mỗi đôi nhiễm sắc tử (đơn trị) vẫn dính nhau tâm động tách khỏi đôi kia và lập thành 2 bộ 2 và mỗi bộ 2 đi về một cực của tế bào

- Kỳ cuối I: Các bộ 2 gồm 2 nhiễm sắc tử đã đến các cực Màng nhân và hạch

nhân được tái tạo Cuối kỳ sau thì tế bào chất phân chia để hình thành nên 2 tế bào con: Trong đó mỗi tế bào con chứa thành viên hoặc chỉ là của bố, hoặc chỉ là của mẹ (mang bộ NST đơn bội) nhưng mỗi thành viên vẫn có 2 nhiễm sắc tử (đơn bội kép),

do đó cần có lần phân chia II để phân chia nhiễm sắc tử kép về 2 tế bào cháu mang số nhiễm sắc thể đơn bội

- Kỳ chuyển tiếp (interkinez): Kì trung gian là kì nằm giữa lần phân chia I và II của giảm phân Kỳ chuyển tiếp không xảy ra hiện tượng nhân đôi nhiễm sắc thể cũng như không có nhân đôi ADN như ở kỳ trung gian , kì chuyển tiếp nói chung rất ngắn

Giảm phân II: Lần phân chia II của giảm phân xảy ra giống như nguyên phân:

Trang 10

- Kỳ trước II: Nói chung rất ngắn, có khi không có, các bộ hai vẫn còn dính với nhau ở tâm động, nhưng các vai đã bắt đầu đẩy nhau ra

- Kỳ giữa II: Các NST xếp ở mặt xích đạo

- Kỳ sau II: Tâm động của mỗi bộ 2 chia đôi, các NST con (nhiễm sắc tử) trượt trên thoi, phân ly về hai cực và mỗi nhiễm sắc tử = 1 NST

- Kỳ cuối II: Ở kỳ cuối II xảy ra sự phân chia tế bào chất

Ở lần phân chia hai, yếu tố phân chia về hai cực là các NST con (nhiễm sắc tử) nên được gọi là phân chia cân bằng Kết quả ta có các tế bào con với bộ NST đơn bội

Trường hợp này ta có các cá thể dị hợp về tính trạng màu hoa Nếu cả hai allel đều mang thông tin di truyền cho màu đỏ (hoặc màu trắng) ta có các cá thể đồng hợp

về tính trạng màu hoa Đối với trường hợp dị hợp, một trong hai allele có thể là alen trội (dominant), alen còn lại là allele lặn (recessive) Màu hoa của cây do allel trội quyết định

Trong ví dụ trên, nếu trên thực tế ta thu được các hoa hồng thì đó là trường hợp các allele trội không hoàn toàn (incomplete dominance) Các tế bào, mô, hay cá thể đơn bội (haploids) gọi là bán hợp (hemizygous), vì với mỗi tính trạng chỉ có một allele Ở các cá thể đơn bội kép các gen đều là đồng hợp hoàn toàn

Thể bội là danh từ dùng để chỉ số bộ nhiễm sắc thể có trong tế bào, mô, cá thể thực vật với quy định chung là ở các tế bào sinh sản có một bộ nhiễm sắc thể (với số nhiễm sắc thể n được gọi là thể đơn bội) Hợp tử, sản phẩm dung hợp của hai giao tử đơn bội, có thể bội là nhị bội với số nhiễm sắc thể là 2n Tất cả các tế bào soma hình thành do sự phân chia hợp tử đều là nhị bội Trên thực tế cùng một lúc có thể tìm thấy nhiều mức bội thể khác nhau ở các mô khác nhau của cơ thể thực vật (4n, 8n…) Đó là hiện tượng đa bội hóa do nội gián phân

Trong cùng một loài có thể gặp nhiều mức bội thể Các thể bội lớn hơn nhị bội được gọi là đa bội Khoảng một nửa thực vật bậc cao ở mức đa bội Để dễ dàng hơn cho sự tìm hiểu tế bào học của các loài ở mức đa bội này, người ta sử dùng khái niệm

số nhiễm sắc thể cơ bản của các loài x (là số đơn bội nhỏ nhất trong dãy đa bội) Các

cá thể có x nhiễm sắc thể được gọi là thể nhất bội (monoploids) để phân biệt với thể đơn bội (haploids)

Ví dụ cây lúa mì có hợp tử 2n=42 Trên thực tế lúa mì là một thể lục bội (hexaploids) 6x trong đó có số nhiễm sắc thể cơ bản của loài là x=7 Thể đơn bội của

cây lúa mì lục bội có n=3x=21 thể nhiễm sắc Cây thuốc lá trồng (Nicotiana tabacum)

là một thể tứ bội 4x có 48 nhiễm sắc thể, số nhiễm sắc thể cơ bản x bằng 12 Thể đơn bội của loài thuốc lá này vì vậy có n =2x=24 thể nhiễm sắc Một loài thuốc lá khác

Nicotiana sylvestris có cùng số x=12, nhưng vì là một cây nhị bội trong tự nhiên nên tế bào hợp tử chứa 2n=2x=24 nhiễm sắc thể và các tế bào sinh sản chứa n=x=12 nhiễm sắc thể trường hợp này thuật ngữ đơn bội đồng nghĩa với nhất bội

Trang 11

2.5 Thể bào tử và thể giao tử ở thực vật bậc cao

Thể bào tử (sporophyte) gồm có hợp tử và tất cả các tế bào sản sinh từ hợp tử

kể cả hạt phấn trong túi phấn và noãn

Thể giao tử (gametophyte) gồm có hạt phấn đã nảy mầm và tất cả các tế bào do

nó sinh ra, bao gồm các giao tử Khi hai giao tử khác giới dung hợp, thể bào tử 2n được tái lập ở thực vật bậc cao thể giao tử thường có không quá 3 tế bào, trong đó 2 tế bào là các giao tử Ở tất cả các loài thực vật mức thể bội dao động theo chu trình được trình bày tại hình 1.4

Hình 1.4 Chu trình d ao động của thể bội ở thực vật

Ở thực vật bậc cao, thể giao tử (trong các trường hợp đặc biệt, có thể phát triển thành thể bào tử đơn bội (haploid sporophyte) chứa n nhiễm sắc thể Thể bào tử đơn bội bề ngoài giống như thể bào tử 2n, tuy kích thước nhỏ hơn và cũng có thể ra hoa, nhưng các bào tử hình thành không có sức sống

Tạo thể bào tử đơn bội và những cây đơn bội kép là mục đích của nuôi cấy túi phấn và hạt phấn

của tế bào là nhờ vào sự phân bào

Trang 12

CÂU H ỎI

Câu 1: Vì sao từ một bộ phận bất kỳ của thực vật khi đưa vào môi trường dinh dưỡng thích hợp thì có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh?

Câu 2: Hãy so sánh quá trình phân hóa và phản phân hóa?

Câu 3: Vì sao nói sự phân bào là một quá trình không thể thiếu được trong đời

sống của thực vật?

Trang 13

Chương 2 MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG

Nuôi cấy mô - tế bào thực vật là nuôi cấy các tế bào, mô hoặc cơ quan tách rời khỏi cơ thể Để chúng có thể tồn tại, phản phân hóa và phát sinh hình thái theo định hướng, chúng nhất thiết phải được đặt trong điều kiện đảm bảo về dinh dưỡng, nước, các chất cảm ứng quá trình phản phân hóa và phân hóa định hướng Vì vậy, cần có các môi trường nuôi cấy đảm bảo được các điều kiện nêu trên

Sở dĩ Haberlandt, người đầu tiên đề xướng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật (1902), không thành công trong các thí nghiệm của mình vì lúc bấy giờ những hiểu biết về nhu cầu dinh dưỡng khoáng của tế bào thực vật còn hạn chế và đặc biệt là vai trò của các chất điều khiển sinh trưởng đối với quá trình phân chia và phân hóa của

tế bào còn chưa được biết nhiều

Bên cạnh đó, các mẫu nuôi cấy cần đặt trong các điều kiện ngoại cảnh nhân tạo thích hợp (ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm…) Các loại thực vật, tế bào, mô và các cơ quan khác nhau, các giai đoạn nuôi cấy khác nhau đòi hỏi các môi trường phù hợp khác nhau Mặt dù có sự khác biệt về thành phần , nồng độ các chất trong môi trường nhưng hiện nay, hầu hết các môi trường dinh dưỡng nhân tạo được sử dụng để nuôi cấy mô

và tế bào thực vật đều bao gồm những thành phần sau:

1 NGUỒN DINH DƯỠNG KHOÁNG VÀ CARBON

Có nhiều loại nguyên tố muối khoáng khác nhau cần thiết cho đời sống thực vật được cung cấp dưới dạng đa lượng và vi lượng Theo thống nhất của Hội sinh lý học thực vật quốc tế, các nguyên tố đa lượng là các nguyên tố khoáng mà thực vật cần với nồng độ lớn hơn 0,5 mM, các nguyên tố vi lượng là các nguyên tố khoáng mà thực vật cần với nồng độ nhỏ hơn 0,05 mM Khi các muối khoáng được hòa ta n trong nước , chúng trải qua quá trình phân ly (dissociation) và ion hóa (ionisation)

Trong môi trường dinh dưỡng , một loại ion có thể được kết hợp bởi một hoặc nhiều loại muối khác nhau Ví dụ: trong môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962), ion ΝΟ−3 được kết hợp bởi KNO3 và NH4NO3, ion K+ bởi KNO3 và KH2PO4 Do đó, đây là điều quan trọng để so sánh các môi trường khác nhau bằng cách đánh giá nồng

độ tổng số của các ion hiện diện t rong chúng nhằm có được một ý tưởng về sự thích hợp của môi trường cho các mô hoặc các hệ thống nuôi cấy đặc biệt

Trong tự nhiên, cây trồng muốn sinh trưởng phát triển khỏe mạnh thì cần phải lấy từ đất các nguyên tố sau:

- Các nguyên tố đa lượng : bao gồm sáu nguyên tố : nitrogen (N), phosphorus (P), potassium (K), calcium (Ca), magnesium (Mg) và sulphur (S) tồn tại dưới dạng muối khoáng

- Các nguyên tố vi lượng: bao gồm iron (Fe), manganese (Mn), zinc (Zn), boron (B), copper (Cu), molybdenum (Mo) và nickel (Ni)

Mười bốn nguyên tố trên cùng với carbon (C), oxygen (O), hydrogen (H) được xem là 17 nguyên tố thiết yếu của thực vật Các nguyên tố khác như cobalt (Co), aluminum (Al), sodium (Na), silica (Si) và iodine (I) cũng cần thiết hay có lợi cho một

số loài nhưng vai trò của chúng vẫn đang được nghiên cứu

Theo Epstein (1971), một nguyên tố được xem là thiết yếu cho sự phát triển của thực vật nếu:

- Cây trồng không thể hoàn thành chu kỳ sống của nó nếu thiếu nguyên tố này

Trang 14

- Hoạt động của nguyên tố này là chuyên biệt và không thể thay thế hoàn toàn bằng bất kỳ nguyên tố nào khác

- Có tác động trực tiếp đến hoạt động sinh lý của cây

- Là thành phần của một hợp chất được biết là cần thiết

1.1 Các nguyên tố đa lượng

Bảng 2.1 trình bày các nguyên tố đa lượng và nồng độ sử dụng

Bảng 2.1 Các nguyên tố đa lượng và nồng độ sử dụng

tt Nguyên tố đa lượng Nồng độ (mM)

1.1.1 Nitrogen (N)

Nitrogen ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng của thực vật, là nguyên tố thiết yếu cấu tạo nên các nucleic acid, protein, chlorophyll, acid amin, alkaloid và một vài hormon thực vật Vì vậy nên N là nguyên tố dinh dưỡng quan trọng hàng đầu trong môi trường nuôi cấy

Mô và tế bào thực vật trong nuôi cấy có thể sử dụng N khoáng dưới dạng nitrate (ΝΟ3−) và ammonium (NH4

+), đồng thời cũng sử dụng các dạng N hữu cơ như acid amin N dạng ammonium là N trạng thái khử, N dạng nitrate là N trạng thái oxy hóa Ion nitrat là là một nguồn N quan trọng đối với hầu hết cây trồng Tuy nhiên, trong tế bào, nitrate lại bị khử thành ammonium trước khi tham gia vào quá trình sinh tổng hợp acid amin

Phần lớn cơ thể thực vật hoàn chỉnh , mô, cơ quan hấp thu N tốt hơn trên môi trường chứa cả hai ion nitrate và ammonium , trong trường hợp chỉ dùng ammonium , thì cần phải bổ sung thêm một acid dạng mạch vòng (cycle acids), tricarboxylic acid hoặc một số acid khác nữa (dạng muối), như: citrate, succinate, hoặc malate sao cho mọi ảnh hưởng độc do nồng độ của ammonium vượt quá 8 mM trong môi trường được giảm bớt

Khi các ion nitrate và ammonium cùng hiện diện trong môi trường nuôi cấy, thì ion sau được sử dụng nhanh hơn , và mặc dù trong môi trường không có chất đệm, nhưng nhờ sự hấp thu hài hòa giữa ammonium và nitrate giúp điều chỉnh pH của môi trường nuôi cấy

Để xây dựng công thức môi trường thích hợp cho các đối tượng nghiên cứu khác nhau và mục đích nghiên cứu khác nhau, cần phải quan tâm đến:

- Hàm lượng N tổng số trong môi trường

- Tỷ lệ ion nitrate/ammonium

Nitrate được cung cấp dưới dạng muối Ca(NO3)2.4H2O, KNO3, NaNO3 hoặc

NH4NO3

Trang 15

Ammonium được cung cấp dưới dạng (NH4)2SO4, NH4NO3 hoặc NH4Cl Trong một số ít trường hợp có thể cung cấp dưới dạng urea

1.1.2 Phosphorus (P)

Phosphorus là nguyên tố quan trọng trong đời sống thực vật, có tác dụng rất quan trọng đối với việc phân chia tế bào, tích lũy và chuyển hóa năng lượng trong quá trình quang hợp, hô hấp, đồng thời là thành phần cấu tạo nên nucleic acid, protein, diệp lục, tham gia vào cấu trúc màng và nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học khác

Trong môi trường nuôi cấy, P được cung cấp dưới dạng mono hay di hydrogenphosphate như: NaH2PO4.H2O, KH2PO4, NH4H2PO4 , ion phosphate hóa trị

I và II có thể chuyển đổi lẫn nhau tùy thuộc vào độ pH Nồng độ ion phosphate được cho vào môi trường nuôi cấy cao nhất là 18,9 mM, trung bình là 1,7 mM

Nồng độ phosphate cao có thể gây kết tủa các nguyên tố vi lượng khác, giảm sự

hấp thu nguyên tố khoáng, ức chế sinh trưởng của mẫu nuôi cấy

1.1.3 Potassium (K)

Trong quá trình hoạt động sống, K rất cần thiết cho sự phân chia bình thường của tế bào và thúc đẩy sự phát triển của mô phân sinh, tham gia vào việc tổng hợp protein, diệp lục và oxy hóa khử nitrate

Ion K+ là một cation chủ yếu trong cây, giúp cho cây cân bằng các anion vô cơ

và hữu cơ Ion K+ được chuyển qua màng tế bào dễ dàng và có hai tác dụng sinh lý chủ yếu là điều hòa pH và áp suất thẩm thấu của môi trường nội bào, qua đó gây đóng

mở khí khổng, vận động của cây và sinh trưởng tế bào Thiếu K trong môi trường nuôi cấy mô thực vật sẽ dẫn đến tình trạng thừa nước, tế bào không dãn được, tính đề kháng giảm và giảm tốc độ hấp thu phosphate K được bổ sung vào môi trường nuôi cấy dưới dạng KNO3, KH2PO4, KCl, K2SO4

1.1.4 Calcium (Ca)

Trong nuôi cấy tế bào, ion Ca2+có vai trò trong sự phát sinh hình thái đồng thời với sự cảm ứng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật, đặc biệt là cytokinin và auxin Calcium còn có khả năng liên kết các phân tử sinh học lại với nhau (dưới dạng calcium pectate) do đó nó góp phần vào trong cấu trúc và hoạt động sinh lý của màng

tế bào và ở phiến giữa của thành tế bào, sự tạo thành vách cellulose trong nuôi cấy tế bào chỉ xảy ra khi trong môi trường có ít nhất vài µM Ca2+ Sự hoạt động của nhiều loại enzyme khác của thực vật cũng phụ thuộc vào ion Ca2+ vì calcium là đồng yếu tố với những enzyme phân giải ATP

Trong môi trường nuôi cấy thường dùng CaCl2.2H2O, Ca(NO3)2.4H2O, đôi khi còn sử dụng Ca10(PO4)6(OH)2, nồng độ trung bình khi sử dụng Ca2+

là 2,57 mM/L

1.1.5 Magnesium (Mg)

Magnesium là nguyên tố cần thiết cho sự sinh tổng hợp diệp lục và tham gia vào cấu trúc của một số enzyme như enzyme vận chuyển phosphate Mg còn hoạt hóa cho nhiều enzyme trong các phản ứng trao đổi glucid liên quan đến quá trình quang hợp, hô hấp và trao đổi nucleic acid, các phản ứng đó có liên quan đến ATP Ngoài ra

Mg tham gia vào quá trình hình thành thành tế bào, quá trình tổng hợp protein, điều chỉnh sự hút của các cation, trung hòa các anion và các acid hữu cơ…

Môi trường nuôi cấy mô thực vật thường chứa Mg với nồng độ trung bình từ 5,3-6,8 mM, MgSO4.7H2O là nguồn bổ sung ion Mg2+ cho mô nuôi cấy, ngoài ra MgCl2.6H2O đôi khi cũng được sử dụng Độ pH thấp sẽ ức chế sự hấp thu ion Mg2+

Trang 16

1.1.6 Sulphur (S)

Sulphur là thành phần của ba acid amin quan trọng trong cây là cystine, cysteine và methionine, các acid amin này là thành phần bắt buộc của các protein Trong các phân tử protein, S tạo nên các cầu nối disulfit (-S-S-) bảo đảm tính ổn định

về cấu trúc của phân tử protein

Sulphur tham gia vào hợp chất quan trọng có ý nghĩa trong trao đổi chất và năng lượng trong tế bào là cofecment A (CoA-SH), nhóm –SH của nó khi kết hợp với gốc acetyl tạo nên hợp chất actyl-CoA (CH3-CO~S.CoA) Actyl-CoA đóng vai trò quan trọng trong hô hấp và trao đổi lipid trong cây S còn có mặt trong một số vitamin quan trọng trong quá trình trao đổi chất là biotine, thiamine

Sulphur được thực vật hấp thu dưới dạng ion sulfate (SO4

2-), và đây cũng là nguồn cung cấp S trong nuôi cấy mô thực vật Các muối cung cấp gốc (SO4

2-) phổ biến là: MgSO4.7H2O4, (NH4)2SO4, K2SO4 và NaSO4… Nồng độ (SO42-) trong môi trường nuôi cấy tương đối thấp, trung bình 2,33 mM

1.2 Các nguyên tố vi lượng

Các nguyên tố vô cơ cần một lượng nhỏ nhưng không thể thiếu cho sinh trưởng của mô và tế bào thực vật được gọi là các nguyên tố vi lượng Vai trò quyết định nhất của các nguyên tố vi lượng đối với cây là hoạt hóa hệ thống enzyme Có những trường hợp, một số khoáng vi lượng có thể là không cần thiết, do đó, để an toàn, các tác giả đã cung cấp hầu hết các nguyên tố vi lượng đối với cây cho mô trong môi trường nuôi cấy Đó là các ion : iron (Fe), manganese (Mn), zinc (Zn), boron (B), copper (Cu), và molybdenum (Mo) Các nguyên tố này đóng vai trò quan trọng trong các hoạt động của enzyme và có thể có ảnh hưởng đến sự phân hóa tế bào khi kết hợp với các chất điều hòa sinh trưởng thực vật (Beasley và cộng sự, 1974)

Trước đây, khi kỹ thuật nuôi cấy mô mới ra đời, các nhà khoa học chưa nghĩ đến việc bổ sung khoáng vi lượng vào trong môi trường nuôi cấy Các thí nghiệm lúc

đó thành công là do agar và các hóa chất dùng để pha chế môi trường không tinh khiết, trong đó có lẫn một số nguyên tố vi lượng nên đã cung cấp phần nào cho môi trường nuôi cấy

Bảng 2.2 trình bày các nguyên tố vi lượng và nồng độ sử dụng

Bảng 2.2 Các nguyên tố vi lượng và nồng độ sử dụng

1

1.2.1 Iron (Fe)

Vai trò quan trọng nhất của Fe là hoạt hóa các enzyme Nó có mặt trong nhóm hoạt động của một số enzyme oxi hóa khử như catalase, peroxydase Nó có mặt trong các cytocrom, feredoxin trong chuổi chuyển vận điện tử của quang hợp và hô hấp

Trang 17

Fe không tham gia vào thành phần của diệp lục nhưng lại có ảnh hưởng quyết định đến sự tổng hợp diệp lục trong cây Hàm lượng Fe trong lá cây có quan hệ mật thiết đến hàm lượng diệp lục trong chúng…

Những môi trường cổ điển thường dùng sắt dưới dạng FeCl2, FeCl3.6H2O, FeSO4.7H2O, Fe2(SO4)3, Fe (C4H4O6), nhưng Fe thường tạo phức với các thành phần khác nên , hiện nay, hầu hết các phòng thí nghiệm Fe dường n hư thích hợp hơn khi được cung cấp dưới dạng chelate : Fe-NaEDTA (Na2-Ethylene Diamine Tetra Acetate ) đặc biệt đối với quá trình tạo phôi Ở dạng này, Fe không bị kết tủa và giải phóng từ từ

ra môi trường theo nhu cầu của mô thực vật ở một phạm vi pH rộng Tuy nhiên, các dạng chelate EDTA không hoàn toàn ổn định trong môi trường nuôi cấy dạng lỏng

1.2.2 Manganese (Mn)

Manganese là một trong những nguyên tố vi lượng quan trọng nhất, gần như luôn luôn có mặt trong môi trường nuôi cấy Mn có tác động hóa học tương tự Mg2+nên có thể thay thế cho Mg2+ trong một số hệ thống enzyme (Hewitt, 1948) Một số nhà khoa học cho rằng khi có sự hiện diện của Mn trong môi trường nuôi cấy thì hàm lượng IAA tự nhiên trong mô sẽ giảm xuống do hoạt động của IAA oxydase tăng lên Điều này có thể là do Mn hay Mn2+ có mặt trong những enzyme làm bất hoạt các yếu

tố cản trở sự hoạt động của IAA oxydase hoặc Mn2+là đồng yếu tố của IAA oxydase trong tế bào thực vật (Galston và Hillman, 1961) Mn phối hợp với EDTA làm tăng sự oxid hóa IAA tự nhiên nhưng không ảnh hưởng gì đến auxin tổng hợp như NAA hay 2,4-D (MacLachlan và Waygood, 1956) Tuy nhiên, Chée (1986) lại cho rằng: dưới ánh sáng xanh thì Mn2+ làm gia tăng lượng IAA tự nhiên trong mô do nó bất hoạt một đồng yếu tố của IAA oxydase

1.2.3 Zinc (Zn)

Thiếu Zn thì sự tổng hợp protein, nucleic acid và diệp lục sẽ bị giảm đi, thực vật có đốt thân ngắn và lá nhỏ, đồng thời tế bào trần cũng kém phát triển Giữa Zn và nồng độ IAA có mối liên hệ rất gần gũi (Skoog, 1940), người ta cho rằng Zn là một thành phần trong enzyme có liên quan đến sự tổng hợp tiền chất của IAA đó là tryptophan (Tsui, 1948)

1.2.4 Boron (B)

Vai trò của nguyên tố B trong sinh hóa học và sinh lý học thực vật chưa được biết nhiều B cần thiết cho sự hoạt động của đỉnh sinh trưởng vì nó có mặt trong sự sinh tổng hợp các base chứa nitrogen đặc biệt là uracil, cũng như cần thiết cho sự sinh tổng hợp lignin và phenolic acid

Trong đất, nguồn cung cấp B cho cây là boric acid vì vậy hợp chất này cũng được sử dụng để bổ sung vào môi trường nuôi cấy mô Sự hấp thu boric acid (H3BO3)

ở dạng không phân ly khi pH môi trường có tính acid (Oertli và Gregurevic, 1974) hoặc dạng H2BO3- (Devlin, 1975) B ở nồng độ cao có vai trò như chất điều hòa sinh trưởng kích thích sự nảy mầm của hạt phấn, thiếu B sẽ làm giảm sự sinh tổng hợp cytokinin Tuy nhiên, ở một số đối tượng, nồng độ B cao trong môi trường nuôi cấy sẽ cản sự tăng trưởng của rễ bất định và giảm số lượng rễ được tạo thành (Javis, 1986)

1.2.5 Copper (Cu)

Cu hiện diện trong hệ thống enzyme cytochrome oxydase của chuỗi vận chuyển điện tử hô hấp Trong thực vật, Cu tồn tại dưới dạng ion hóa trị I và II Nồng độ Cu cao sẽ gây độc cho mô Các ion Cu2+được bổ sung vào môi trường dưới dạng sulfate,

và đôi khi người ta cũng bổ sung Cu dưới dạng CuCl2 hoặc CuNO3

Trang 18

1.2.6 Molypdenum (Mo)

Thực vật hấp thu Mo dưới dạng MoO4

2- Molypdate thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy với nồng độ đến 1 µM Cũng có những thí nghiệm người ta sử dụng Mo với nồng độ cao hơn nhiều như trong môi trường của Abou-Mandour (1977) hoặc Asahira và Kano (1977) mà không có ảnh hưởng có hại đến mô cấy Nhưng Teasdale (1987) ghi nhận rằng huyền phù tế bào cây thông bị ảnh hưởng bất lợi khi nồng độ Mo6+trong môi trường ở mức 50 µM

1.2.7 Cobalt (Co)

Cobalt là thành phần kim loại trong vitamin B12 có liên quan đến sự sinh tổng hợp nucleic acid nhưng chưa có bằng chứng nào về tác động của nó đến sự tăng trưởng và phát sinh hình thái của mô trên môi trường nuôi cấy Bổ sung Co vào môi trường nuôi cấy nhằm đáp ứng nhu cầu cho các loại thực vật bậc thấp và trong sự phát sinh hình thái ở thực vật bậc cao, đồng thời cũng có tác dụng kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo ở một số cây một lá mầm Ngoài ra, một mục đích khác của việc bổ sung

Co vào môi trường nuôi cấy là chống lại sự gây độc của các chelat kim loại và nó có thể ngăn cản phản ứng oxid hóa gây ra bởi Cu và Fe Ngưỡng gây độc cho mô của Co

là 160 µM

1.2.8 Iodine (I)

Ion I- không được cho là nguyên tố cần thiết cho sự dinh dưỡng của thực vật bậc cao (Rains, 1976), mặc dù nó là thành phần của một vài acid amin và có rất nhiều trong các loại rong tảo

Hannay (1956) đã nhận thấy rằng sự tăng trưởng của rễ sẽ giảm đi khi trong môi trường không có mặt của ion I-

và ion I- không chỉ được cung cấp bởi KI mà nó còn được cung cấp bởi idoacetate hoặc methylene iodide Các hợp chất này sẽ cung cấp I-rất chậm nhờ sự thủy phân

1.2.9 Một số nguyên tố vi lượng khác

Ion chlorine (Cl-) cần thiết cho sự tăng trưởng của thực vật nhưng dường như

nó ít có mặt trong các phản ứng sinh học và có vai trò với một lượng rất nhỏ Một số thực vật nhạy cảm với ion Cl-, nồng độ Cl-cao sẽ làm cho các loại cây thân gỗ bị vàng

lá và thân yếu, đôi khi mô bị nhũn ra và chết

Một số tác giả có bổ sung aluminium (Al) và nickel (Ni) vào môi trường nuôi cấy Tuy nhiên lợi ích của các kim loại này chưa được chứng minh một cách rõ ràng

Ở hầu hết thực vật, Ni+ không nhất thiết cần cho sự tăng trưởng và phát triển của thực vật, nhưng ion này cũng là một thành phần của một số enzyme urease Sự tăng trưởng của tế bào trên môi trường chỉ có urea diễn ra chậm khi không bổ sung Ni với nồng độ thích hợp, và sự tăng trưởng này có lẽ nhờ vào các nguyên tố vi lượng dạng vết còn lại trong tế bào (Polacco, 1977) Ni cũng nên được cân nhắc khi sử dụng trong môi trường nuôi cấy vì urea thoát ra từ mẫu cấy sẽ khuyếch tán vào trong môi trường nên không gây độc cho mô (Teasdale, 1987)

1.3 Carbon và nguồn năng lượng

Mô và tế bào thực vật nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phươ ng thức dị dưỡng, mặc dù ở nhiều trường hợp chúng có thể sống bán dị dưỡng nhờ điều kiện ánh sáng nhân tạo và lục lạp có khả năng quang hợp Mặt khác, quá trình quang hợp cũng

bị hạn chế ở nồng độ CO2 trong bình cấy Trên thực tế, việc bổ sung CO2 là rất khó khăn và tốn kém Vì vậy, việc đưa vào môi trường nuôi cấy nguồn carbon hữu cơ là điều bắt buộc Nguồn carbon thông dụng nhất đã được kiểm chứng là saccharose, nồng

Trang 19

độ thích hợp phổ biến là 2-3%, song cũng còn phụ thuộc vào mục đích nuôi cấy mà thay đổi có khi giảm xuống tới 0,2% (chọn dòng tế bào) và tăng lên đến 12% (cảm ứng stress nước- gây hạn sinh lý)

Tiếp đến là glucose cũng thường được đưa vào môi trường nuôi cấy và cho hiệu quả tương đương saccharose (glucose thường dùng cho nuôi cấy protoplast ), còn fructose cho hiệu quả kém hơn saccharose, trong khi khử trùng môi trường , bị biến đổi thành glucose và fructose Trong tiến trình này , đầu tiên glucose sẽ được sử dụng

và sau đó là fructose Các carbohydrate khác , như: lactose, galactose, rafinose, maltose, cellobiose, melibiose và trehalose cũng đã được thí nghiệm , nhưng tỏ ra kém hiệu quả và chỉ được dùng trong những trường hợp đặc biệt

Các dạng polysaccharide như tinh bột , pectine, dextrine cũng có thể dùng cho nuôi cấy, tuy nhiên những loại tế bào được nuôi trên môi trường có chứa một trong các polysaccharide trên nhất định phải thể hiện khả năng thủy phân thông qua các enzyme chẳng hạn như amylase Có những chủng tế bào nuôi cấy giải phóng ra môi trường chứa tinh bột khá nhiều amylase Chuyển chúng lên môi trường chỉ chứa saccharose lượng amylase thải ra sẽ giảm ngay

Glycerin cũng có thể được tế bào sử dụng Mannitol hoặc sorbitol hoàn toàn trung tính vì không thâm nhập vào bên trong tế bào , nhưng chúng được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy huyền phù và nuôi cấy protoplast với chức năn g là chất ổn định áp suất thẩm thấu , hoặc tương tự saccharose chúng cũng được dùng để cảm ứng stress nước Các loại rượu như ethanol, methanol ít hiệu quả, còn propanol và butanol thì rất độc

Acid hữu cơ thường không phải là nguồn carbon thích hợp cho tế bào nuôi cấy Thí nghiệm với các acid : folic, succinic, pyruvic và keto -glutaric chỉ đạt 15% sinh trưởng so với saccharose

Các mô và tế bào thực vật trong môi trường nuôi cấy ít có khả năng tự dưỡ ng

và vì thế cần thiết phải bổ sung nguồn carbon bên ngoài để cung cấp năng lượng Thậm chí các mô bắt đầu lục hóa hoặc hình thành diệp lục tố dưới các điều kiện đặc biệt trong suốt quá trình nuôi cấy đã không tự dưỡn g carbon Việc bổ sung nguồn carbon bên ngoài vào môi trường làm tăng phân chia tế bào và tái sinh các chồi xanh

Sự thủy phân từng phần saccharose xuất hiện khi môi trường được khử trùng Các tế bào và mô nuôi cấy đã sinh trưở ng trên môi trường có saccharose được khử trùng bằng nồi khử trùng (autoclave) tốt hơn trên môi trường có saccharose được khử trùng bằng màng lọc (filter) Điều này cho thấy các tế bào thích hợp với nguồn dự trữ

có sẳn của glucose và fructose do thủy phân saccharose khi khử trùng bằng autoclave

Sử dụng fructose được khử trùng bằng autoclave không được đề cập đến vì nó có thể gây bất lợi cho sinh trưởng của mô

Tuy nhiên, một số tác giả đã thành công trong việc nuôi cấy tế bào đơn chứa diệp lục tố nên có khả năng quang hợp Nhờ vậy, nồng độ đường trong môi trường giảm xuống rất thấp và đôi khi được bỏ hẳn Nuôi cấy tế bào thực vật tự dưỡng là một hướng quan trọng trong nuôi cấy tế bào đơn

2 CÁC PHỤ GIA HỮU CƠ

Trang 20

nhưng thường không đủ về lượng , do đó phải bổ sung thêm từ bên ngoài vào , đặc biệt

là các vitamin thuộc nhóm B Nhiều nghiên cứu cho rằng, chỉ cần vitamin B1 và inositol là có thể duy trì được sự sinh trưởng của mô nuôi cấy mà không cần đến các loại vitamin khác Các loại vitamin đều hòa tan trong nước, chỉ có folic acid tan trong môi trường kiềm

Riboflavine (Vit B2) Biotin

Acid folic

100 0,05-0,5 10-50 0,5-10 1-5 0,001-0,01 0,1-10

2.1.1 Vitamin B1 (Thiamine.HCl, Aneurin)

Căn cứ vào tần suất suất hiện trong các loại môi trường nuôi cấy có thể nói B1

là vitamin quan trọng nhất trong nuôi cấy mô thực vật Là một chất bổ sung rất cần cho môi trường nuôi cấy , vitamin B1 cùng với các chất điều hòa sinh trưởng có tác dụng tương hỗ, duy trì sự sinh trưởng và phát sinh hình thái mẫu nuôi cấy Khi khử trùng bằng cách hấp ở nhiệt độ cao vitamin B 1 bị nhiệt phân thành pyrimidin e và thiazol là hai cấu tử của vitamin B 1, nhưng tế bào nuôi cấy có khả năng tổng hợp lại chúng thành phân tử vitamin B 1 Vì vậy không nhất thiết phải khử trùng bằng phương thức khác như lọc chẳng hạn

2.1.2 Vitamin B2 (Riboflavin, Lactoflavin)

Có thể khử trùng bằng nhiệt , nhưng lại dễ bị ánh sáng phân huỷ Đối với nuôi

cấy sáng chỉ dùng nồng độ 0,01 ppm, nhưng đối với nuôi cấy trong tối có thể tăng lên 10-50 ppm

2.1.3 Vitamin B6 (Pyridoxine, Adermin)

Là tiền chất của pyridoxal -phosphate-cofactor của các nhóm enzyme như carboxylase và transaminase Khi khử trùng ở nhiệt độ cao phản ứng xảy ra như sau:

Pyridoxin + Phosphat → Pyridoxalphosphate

2.1.4 Myo-Inositol (Bios I)

Trong môi trường nuôi cấy mô thực vật myo-inositol được xếp vào nhóm vitamin, nhưng cũng có tác giả cho rằng đây là một carbonhydrate chứ không phải vitamin Người ta cho rằng myo-inositol được phân tách ra thành ascobic acid và peptine, sau đó được đồng hóa thành phosphoinositide và phosphatidylinositol có vai trò quan trọng trong sự phân chia tế bào và thúc đẩy sự sinh trưởng và phân hóa tế bào Myo-inositol tham gia vào nhiều quá trình trao đổi chất , đặc biệt trong sinh tổng hợp thành tế bào , cụ thể là sinh tổng hợp acid polygalacturonic , hemicellulose và pectine

Nó còn có thể là một trong những chất nhận tín hiệu thứ cấp trong điều hòa sự tổng hợp auxin , nuôi cấy callus và môi trường phân hóa callus nhất thiết phải có myo -inositol Myo-inositol là chất bền vững khi khử trùng Thường được sử dụng ở nồng

Trang 21

độ cao 100 ppm Khi phân tích thành phần của nướ c dừa người ta thu được myo inositol trong một phân đoạn trung tính

-2.1.5 Biotin (Bios II)

Cần thiết cho sự phân bào của một số loại mô Chỉ sử dụng ở nồng độ rất thấp

từ 0,001-0,01 ppm

2.1.6 Acid pantothenic (Bios III, Vit B5)

Được sử dụng để làm thành phần của coenzyme A

2.1.7 Nicotinic acid và pyridoxine

Thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhưng có thể thay thế bằng các vitamin khác cho sự sinh trưởng của tế bào ở nhiều loài Các vitamin khác như folic acid, ascorbic acid , vitamin E (tocophenol), và ρ-aminobenzoic acid cũng được sử

dụng trong nuôi cấy mô và tế bào, đặc biệt khi tế bào sinh trưởng ở mật độ quần thể rất thấp Nói chung, các vitamin này được bổ sung trong khoảng 0,1-10,0 ppm

2.2 Các acid amin

Các mô được nuôi cấy vẫn có khả năng tổng hợp các acid amin cần thiết cho các quá trình trao đổi chất khác nhau Mặc dù thế, việc bổ sung các acid amin vào môi trường vẫn cần thiế t để kích thích sinh trưởng tế bào trong nuôi cấy protoplast và để hình thành các dòng tế bào

Không giống như các N vô cơ , các acid amin được các tế bào thực vật hấp thụ nhanh hơn Casein hydrolysate, L-glutamine, L-asparagine, L-glycine, L-arginine và L-cystein là nguồn N hữu cơ thích hợp được dùng trong các môi trường nuôi cấy Tyrosine chỉ được dùng khi có bổ sung agar vào môi trường Các acid amin được bổ sung riêng lẻ thường hạn chế sự sinh trưởng của tế bào trong khi hỗn hợp của chúng lại có hiệu quả hơn Bổ sung vào môi trường adenine sulphate có thể kích thích sinh trưởng của tế bào hoặc làm tăng khả năng tạo c hồi Bảng 2.4 thể hiện nồng độ sử dụng của các acis amin

Bảng 2.4 Các acid amin và nồng độ sử dụng

2.3 Các phụ gia hữu cơ khác

Trước đây, các nhà khoa học sáng lập ra các kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật thường sử dụng môi trường dinh dưỡng rất đơn giản gồm muối khoáng và đường

Ngày na y, người ta khẳng định rằng loại môi trường đơn giản như vậy không

đủ để cho tế bào sinh trưởng bình thường

Vì vậy, thành phần môi trường ngày càng phong phú và phức tạp hơn , một số hỗn hợp dinh dưỡng tự nhiên đã được sử dụng như:

Trang 22

2.3.1 Nước dừa

Từ năm 1941, nước dừa đã được sử dụng để nuôi phôi Datura và sau đó năm

1949, nuôi mô Daucus Phân tích thành phần của nước dừa từ non đến già cho thấy trong nước dừa có:

- Acid amin tự do từ 190,5-685,0 ppm trong nước dừa từ non đến già Khi khử trùng ở nhiệt độ cao còn lại khoảng 70 ppm

- Acid amin trong protein

- Acid hữu cơ

2.3.2 Dịch chiết nấm men (yeast extract-YE)

Với dịch nấm men, White (1934) lần đầu tiên nuôi thành công rễ cà chua trong ống nghiệm kéo dài vô thời hạn Thành phần hóa học của dịch nấm men ít được chú ý phân tích Chủ yếu chứa: đường, nucleic acid, acid amin, vitamin, auxin, muối khoáng Tác dụng của YE với rễ rất tốt nhưng với callus thì không rõ ràng

2.3.3 Dịch thủy phân casein (casein hydrolysate-CH)

Được sử dụng rộng rãi trong kỹ thuật vi sinh vật , ở nuôi cấy mô và tế bào thực vật chủ yếu được sử dụng làm nguồn bổ sung acid amin Casein thủy phân chứa Ca và

P tương đối phong phú, trong 1g casein có chứa 13 mmol muối phosphat và 15%

NH4+

2.3.4 Hỗn hợp acid amin nhân tạo

Dựa vào những kết quả phân tích các hỗn hợp chấ t tự nhiên nói trên nhiều tác giả đã đề ra những công thức pha chế hỗn hợp acid amin nhân tạo để bổ sung vào môi trường dinh dưỡng Kết quả sử dụng các hỗn hợp này còn rất khác nhau , có thể do yêu cầu acid amin của từng lo ại tế bào là không giống nhau Trong môi trường lỏng để nuôi callus lúa và môi trường tái sinh cây lúa từ callus thì proline là một thành phần quan trọng

2.4 Than hoạt tính (activated charcoal-AC)

Bổ sung than hoạt tính vào môi tr ường nuôi cấy đã kích thích sinh trưởng và phân hóa ở các loài hoa lan , cà rốt, dây thường xuân và cà chua Ngược lại, nó gây ức

chế ở thuốc lá, đậu tương và các loài thuộc chi Camellia

Nói chung than hoạt tính có ảnh hưởng trên 3 mặt: giúp làm giảm độc tố bằng cách đào thải các hợp chất độc (ví dụ: phenol) được tạo ra trong quá trình nuôi cấy và cho phép tế bào sinh trưởng mà không bị trở ngại gì , hấp phụ các chất điều hòa sinh trưởng hoặc làm đen môi trường than hoạt tính được rửa acid và trung hòa trước khi

bổ sung nó ở nồng độ 0,5-3% vào môi trường nuôi cấy

Trang 23

2.5 Các kháng sinh (antibiotics)

Bổ sung các kháng sinh vào môi trường nuôi cấy nói chung thường được tránh

do sự hiện diện của chúng trong môi trường làm chậm sinh trưởng của mô và tế bào Tuy nhiên, một số tế bào thực vật bị nhiễm một cách hệ thống các vi sinh vật Để ngăn chặn sinh trưởng của bọn vi sinh vật này , điều không thể t hay thế là làm giàu môi trường bằng kháng sinh streptomycin hoặc kanamycin ở nồng độ thấp kiểm soát hiệu quả hiện tượng nhiễm có tính hệ thống và môi trường được bổ sung các kháng sinh này không gây bất lợi cho sự sinh trưởng của tế bào nuôi cấy

Kháng sinh được bổ sung vào môi trường nuôi cấy có vai trò:

- Ngăn chặn sự lây nhiễm của các vi khuẩn vào môi trường nuôi cấy

- Ngăn chặn nấm mốc và nấm men lây nhiễm vào mô, tế bào nuôi cấy

- Loại trừ các chủng vi khuẩn Agrobacterium dùng trong chuyển gen ra khỏi

môi trường và mô nuôi cấy

3 CÁC CHẤT ĐIỀU KHIỂN SINH TRƯỞNG THỰC VẬT

Trong môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật thành phần phụ gia quan trọng nhất quyết định kết quả nuôi cấy là các chất điều khiển sinh trưởng Có bốn nhóm chất điều khiển sinh trưởng chung đó là auxin , cytokinin, gibberellin và abscisic acid, những chất này có vai trò quan trọng trong nuôi cấy mô Sự sinh trưởng , phân hóa và phát sinh cơ quan của mô nuôi cấy trở nên thuận lợi chỉ khi bổ sung một hoặc một số chất thuộc bốn nhóm trên vào môi trường nuôi cấy Tỷ lệ của các loại hormone cần cho sự tạo rễ và chồi rất khác nhau , và mô là nơi liên quan trực tiếp với lượn g hormone được tổng hợp nội sinh ở các tế bào của mẫu vật nuôi cấy

Bảng 2.5 trình bày các chất điều khiển sinh trưởng thường dùng và nồng độ sử dụng

Bảng 2.5 Các chất điều khiển sinh trưởng thường dùng và nồng độ sử dụng

Stt Tên chất sinh trưởng Nồng độ (mg/l)

GA3

0,2-5,0 0,1-5,0 5,0-20,0 1,0-5,0 0,1-2,0 0,1-2,0 0,1-2,0

3.1 Auxin (hormone sinh trưởng)

Môi trường nuôi cấy được bổ sung các auxin khác nhau như : 1H- acetic acid (IAA), 1-naphthaleneacetic acid (NAA), 1H-indole-3-butyric acid (IBA), 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) và naphthoxyacetic acid (NOA) IAA là auxin

indole-3-tự nhiên có trong mô thực vật ; còn lại NAA , IBA, 2,4-D và NOA là các auxin nhân tạo, thường thì các auxin nhân tạo có hoạt tính mạnh hơn vì do đặc điểm phân tử của chúng nên các enzyme oxy hóa auxin (auxin-oxydase) không có tác dụng Những auxin có hiệu lực riêng biệt trong nuôi cấy tế bào thực vật là 4-chlorophenoxyacetic acid (4-CPA) hoặc p-chlorophenoxyacetic acid (PCPA), 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid (2,4,5-T), 2-methyl-4-chlorophenoxyacetic acid (MCPA), 4-amino-3,5,6-trichloropicolinic acid (picloram), và 3,6-dichloro-2-methoxybenzoic acid (dicamba)

Trang 24

Đặc tính c ủa các auxin là khởi đầu sự phân chia tế bào Các hormone thuộc nhóm này có các hoạt tính như : tăng trưởng chiều dài thân , lóng (gióng), tính hướng (sáng, đất), tính ưu thế ngọn, tạo rễ, và phân hóa mạch dẫn Nói chung, các auxin được hòa tan hoặc trong ethanol hoặc trong NaOH loãng

Mặc dù, những chi tiết ở mức độ phân tử về hoạt động của auxin vẫn chưa được biết nhiều, nhưng một số nghiên cứu về di truyền và phân tử đã cung cấp những kết

quả mới thú vị Trong những năm qua , một số gen mã hóa cho các protein liên kết auxin (auxin binding proteins ) đã được tạo dòng (cloning) và khảo sát các đặc điểm của chúng, và thông tin mới về gen cảm ứng auxin (auxin-induced gene) cũng đã thu được Auxin có tác dụng hoạt hóa các ion H+trực tiếp hoặc gián tiếp (thông qua sự ảnh hưởng lên các enzyme) làm tăng tính đàn hồi của thành tế bào, tăng tính giản nỡ của tế bào trong phản ứng với áp suất t rương Auxin cũng có ảnh hưởng ở mức độ biểu hiện gen và kích thích quá trình tạo rễ

Sự áp dụng loại và nồng độ auxin trong môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào:

- Kiểu tăng trưởng hoặc phát triển cần nghiên cứu

- Hàm lượng auxin nội sinh của mẫu cấy

- Khả năng tổng hợp auxin tự nhiên của mẫu cấy

- Sự tác động qua lại giữa auxin ngoại sinh và auxin nội sinh

3.2 Cytokinin (hormone phân bào)

Các cytokinin là dẫn xuất của adenine, đây là những hormone liên quan chủ yếu đến sự phân chia tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi trong nuôi cấy mô Các cytokinin được sử dụng thường xuyên nhất là 6-benzylaminopurine (BAP) hoặc 6-benzyladenin (BA), 6-γ-γ-dimethyl-aminopurine (2-iP), N-(2-furfurylamino)-1-H-purine-6-amine (kinetin), và 6-(4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butanylamino)purine (zeatin) Zeatin và 2-iP là các cytokinin tự nhiên , còn BA và kinetin là các cytokinin nhân tạo Nói chung, chúng được hòa tan trong NaOH hoặc HCl loãng

Một số hợp chất được phát hiện trong thời gian gần đây có hoạt tính giống cytokinin là N ,N’-diphenylurea (DPU), thidiaziron, N-2-chloro-4-puridyl-N-phenyl urea (CPPU) và một số dẫn xuất khác của diphenyl urea Hiệu quả đặc biệt của các hợp chất gốc urea lên sự sinh trưởng của mô thực vật cần phải được nghiên cứu thêm

Tỷ lệ auxin /cytokinin rất quan trọng đối với sự phát sinh hình thái

(morphogenesis) trong các hệ thống nuôi cấy Đối với sự phát sinh phôi

(embryogenesis), để tạo callus và rễ cần có tỷ lệ auxin /cytokinin cao , trong khi ở trường hợp ngược lại sẽ dẫn đến sự sinh sản chồi và chồi nách Vấn đề quan trọng không kém là nồng độ của hai nhóm chất điều khiển sinh trưởng này Chẳng hạn 2,4-D

cùng với BA ở nồng độ 5,0 ppm kích thích sự tạo thành callus ở Agrostis nhưng nếu

dùng ở nồng độ 0,1 ppm chúng sẽ kích thích tạo chồi mặc dù trong cả 2 trường hợp tỷ

lệ auxin/cytokinin là bằng 1 Cơ chế hoạt động của cytokinin là chưa được biết rõ ràng mặc dù có một số kết quả về sự có mặt của các hợp chất mang hoạt tính cytokinin trong RNA vận chuyển (transfer RNA ) Các cytokinin cũng có hoạt tính tổng hợp RNA, tăng hoạt tính enzyme và protein trong các mô nhất định

- Kinetin được phân lập từ chế phẩm DNA cũ hoặc nucleic acid mới sau khi khử trùng ở nhiệt độ cao hay đun sôi Trong cơ thể sống không có kinetin tồn tại , sản phẩm này kích thích sự phát sinh chồi của cây thuốc lá nuôi cấy , nhưng nếu phối hợp

xử lý cùng auxin ở tỷ lệ nồng độ thích hợp thì sẽ kích thích quá trình phân chia tế bào (do đó có tên là kinetin) ở các mô không phân hóa

Trang 25

Trong tự nhiên cũng tồn tại một hormone phân bào khác , Letham là người đầu tiên đã phân lập, tinh chế và cho kết tinh thành công hormone phân bào tự nhiên đó từ nội nhũ đang ở dạng sữa của hạt ngô Hợp chất cytokinin tự nhiên đó được gọi là zeatin (zea: ngô)

- Tương tự các cytokinin khác , zeatin cũng là một dẫn xuất của adenin Trong thực tiễn nuôi cấy mô người ta chỉ dùng zeatin trong những trường hợp đặc biệt vì giá thành rất đắt , thường thay thế zeatin bằng kinet in hoặc một sản phẩm tổng hợp nhân tạo khác, đó là:

- 6-Benzylaminopurine (BAP): Hoạt lực của BAP cao hơn nhiều so với kinetin

và bản thân BAP bền vững hơn zeatin dưới tác động của nhiệt độ cao BAP có khả năng làm tăng hình th ành các sản phẩm thứ cấp và tăng kích thước của tế bào ở các lá mầm, kích thích sự nảy mầm của hạt và quá trình trao đổi chất

3.3 Gibberellin

Gibberellin được phát hiện vào những năm 1930 Lịch sử phát hiện nhóm hormone này bắt đầu từ 1895 khi người Nhật nói về bệnh lúa von Năm 1926, xác định

được bệnh đó là do loài nấm Gibberella fujikuroi gây ra Đến những năm 30, mới phân

lập và tinh chế được hoạt chất , được gọi là gibberellin Sau chiến tranh thế giới thứ II năm 1950, người Anh và người Mỹ mới biết đến công trình này của người Nhật Tới nay, người ta đã phát hiện được khoảng 126 loại thuộc nhóm gibberellic acid Loại gibberellic acid thông dụng nhất trong nuôi cấy mô thực vật là GA3

Trong đời sống thực vật gibberellin đóng vai trò quan trọng đối với nhiều quá trình sinh lý như: sinh lý ngủ nghỉ của hạt và chồi , sinh lý phát triển của hoa, làm tăng sinh trưởng chiều dài của thực vật

Nhưng trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật tác dụng của gibberellic acid chưa thật rõ ràng Nhiều tác giả có sử dụng và coi đó là thành phần không thể thiếu của một loại môi trường chuyên dụng nào đó

Khi bổ sung GA3 vào môi trường nuôi cấy thường chúng có vai trò như các auxin tự nhiên GA3 nồng độ cao (1-8 mg/l) có thể cảm ứng sự tăng trưởng của những

tế bào callus không phân hóa và có thể kích thích sự tăng trưởng của callus khi phối hợp với auxin và cytokinin nồng độ thấp, nhưng nó lại làm giảm bớt hoặc ngăn cản sự tạo chồi, rễ bất định và sự phát sinh phôi soma…

3.4 Abscisic acid (ABA)

ABA thuộc nhóm các chất ức chế sinh trưởng tự nhiên , được tạo ra trực tiếp từ mevalonic acid hoặc do sự phân giải carotenoid Vai trò của ABA là gây ra sự ngủ nghỉ của chồi, làm chậm sự nảy mầm của hạt và sự ra hoa , đóng khí khổng, sự lão suy

và rụng lá ABA còn có tác dụng tăng cường khả năng chống chịu của tế bào thực vật đối với điều kiện ngoại cảnh bất lợi, vì vậy ABA được đưa vào môi trường nuôi cấy và mang lại hiệu quả nhất định

4 CÁC NHÂN TỐ KHÁC

4.1 Các nhân tố làm rắn môi trường

Các tác nhân làm rắn hoặc tạo gel được sử dụng phổ biến để chuẩn bị cá c môi trường nuôi cấy mô dạng rắn (solid) hoặc dạng sệt (semi-solid) Trong nuôi cấy dịch lỏng mô hoặc tế bào bị ngập trong môi trường và chết do thiếu oxy, môi trường ở trạng thái lỏng này thích hợp cho việc nuôi cấy protoplas, huyền phù tế bào, nuôi cấy thể phôi Khi sử dụng môi trường lỏng để nuôi cấy thì dung dịch phải được lắc hoặc khuấy

Trang 26

Môi trường ở trạng thái gel tạo một giá đỡ cho mô sinh trưởng trong điều kiện tĩnh (static conditions), với các mục đích phát sinh callus, phân hóa và phát sinh cơ quan hình thái Những thuận lợi trong việc sử dụng môi trường dạng gel là:

- Dễ quan sát các mô nuôi cấy

- Tính định hướng của các mô nuôi cấy được lưu giữ

- Mô nuôi cấy được đặt trên bề mặt môi trường nên không cần các biện pháp thông khí

- Chồi và rễ phát triển ổn định So với mô nuôi cấy trong môi trường lỏng chồi

và rễ có thể bị mất phương hướng

- Trong môi trường lỏng lắc callus có thể bị vỡ hoặc tạo thành các tế bào đơn Tuy nhiên, môi trường dạng gel có nhiều bất lợi: các chất độc tiết ra từ mô nuôi cấy không được khuếch tán nhanh, tình trạng thông khí kém sẽ tác động đến sự phát triển và chức năng của rễ

Agar là một loại polysaccharide thu được từ một số loài tảo (ngành tảo đỏ Rhodophyta), chúng có ưu điểm hơn các tác nhân tạo gel khác Trước tiên, gel của agar không phản ứng với các thành phần của môi trường Thứ hai, chúng không bị thủy phân bởi các enzyme thực vật và duy trì sự ổn định ở tất cả các nhiệt độ nuôi cấy được tiến hành Bình thường, từ 0,5-1% agar được dùng trong môi trường để tạo gel rắn chắc ở pH đặc trưng cho môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật Trong những nghiên cứu về dinh dưỡng , việc sử dụng agar được tránh bởi vì ag ar thương phẩm không sạch do có chứa một số ion Ca , Mg, K, Na và một số nguyên tố khác ở dạng vết Tuy nhiên, các chất bẩn nói trên cũng có thể được loại bỏ bằng cách rửa agar với nước cất hai lần ít nhất là 24 giờ, tráng trong cồn và làm khô ở 60o

-C trong 24 giờ Nói chung, ở 80oC agar ngậm nước chuyển sang trạng thái sol và ở 40oC trở về trạng thái gel Khả năng ngậm nước của agar cao từ 6-12 g/L nước

Gelatin ở nồng độ cao (10%) cũng có hiệu quả tạo gel nhưng bị hạn chế sử dụng bởi vì nó nóng chảy ở nhiệt độ thấp (25oC) Các hợp chất khác đã được thử nghiệm thành công bao gồm methacel , alginate, phytagel và gel -rite Công ty FMC Corp gần đây đã phát triển một l oại agarose được tinh sạch cao gọi là Sea Plaque (k),

loại này có thể được dùng để phục hồi các protoplast đơn (single protoplast) trong nuôi cấy Cellophane đục lỗ (perforated cellophane), cầu giấy lọc (filter paper bridge ), bấc giấy lọc (filter paper wick ), bọt polyurethane (polyurethane foam ) và xốp polyester (polyester fleece ) là các phương thức thay đổi giá thể được dùng trong môi trường nuôi cấy mô hoặc tế bào

Điều thuận lợi khi làm việc với các hợp chấ t tạo gel nhân tạo là chúng tạo ra các gel sạch ở các nồng độ tương đối thấp (1,25-2,5 g/L) và nó có thể giúp phát hiện

sự nhiễm bẩn được phát triển trong suốt thời gian nuôi cấy Các mẫu vật sinh trưởng tốt hơn trên agar hoặc các tác nhân tạo giá thể khác phụ thuộc vào loại mô và từng loài khác nhau

4.2 pH môi trường

Tế bào và mô thực vật đòi hỏi pH tối ưu cho sinh trưởng và phát triển trong nuôi cấy Trong khi chuẩn bị môi trường , pH có t hể được điều chỉnh đến giá trị cần thiết của thí nghiệm Độ pH ảnh hưởng đến sự di chuyển của các ion và đối với hầu hết các môi trường nuôi cấy pH 5,0-6,0 trước khi khử trùng được xem là tối ưu Độ pH cao hơn sẽ làm ch o môi trường rất rắn trong khi pH thấp lại giảm khả năng đông đặc của agar Hầu hết các môi trường nuôi cấy nghèo đệm , vì thế chúng làm dao động giá

Trang 27

trị pH, sự giao động này có thể gây bất lợi cho thí nghiệm nuôi cấy dài ngày và sự sinh trưởng của các tế bào đơn hoặc các quần thể tế bào ở mật độ thấp

Độ pH của môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng trực tiếp tới quá trình thu nhận các chất dinh dưỡng từ môi trường vào tế bào Vì vậy, đối với từng môi trường nhất định và từng trường hợp cụ thể của các loài cây phải chỉnh độ pH của môi trường về mức ổn định ban đầu Nuôi cấy callus của nhiều loài cây , pH ban đầu thường là 5,5-6,0 sau 4 tuần nuôi cấy pH đạt đ ược giá trị từ 6,0-6,5 Đặc biệt khi sử dụng các loại phụ gia có tính kiềm hoặc tính acid cao như acid amin, vitamin thì nhất định phải phải dùng NaOH hoặc HCl loãng để chỉnh pH môi trường về từ 5,5-6,5

Những thí nghiệm nu ôi cấy tế bào đơn hay tế bào trần thì việc chỉnh độ pH là bắt buộc

5 MỘT SỐ LOẠI MÔI TRƯỜNG CƠ BẢN

Ngay từ những giai đoạn đầu của sự phát triển kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật, Gau theret (1939) và White (1943) đã đề xuất các môi trường nuôi cấy callus và nuôi cấy rễ Do đối tượng nghiên cứu, mục đích nghiên cứu rất khác biệt đòi hỏi phải

có những môi trường dinh dưỡng thích hợp khác nhau, vì vậy hiện nay đã có khoảng

685 loại môi trường nuôi cấy mô thực vật đã được công bố (Georgen và cộng sự , 1987) Thành phần cơ bản của một số loại môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật được trình bày trong bảng 2.6

Dựa vào thành phần và hàm lượng chất dinh dưỡng vô cơ có thể phân các môi trường nuôi cấy thành bốn nhóm:

- Nhóm môi trường giàu dinh dưỡng : Đại diện là môi trường Murashige -Skoog (MS, 1962), Erksson (ER, 1965) Nhóm môi trường này có hàm lượng muối khoáng cao, nhất là muối nitrate , ammonium, potassium, các nguyên tố vi lượng đầy đủ Môi trường (MS) là một trong nhữ ng loại môi trường được sử dụng rộng rãi nhất trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật Môi trường MS thích hợp cho cả thực vật hai lá mầm

và một lá mầm Vì vậy, những người mới bắt đầu làm quen với nuôi cấy mô thường bắt đầu với môi trường này trước khi tìm ra môi trường của riêng mình Tới nay, có rất nhiều công thức cải tiến môi trường MS trên cơ sở công thức gốc do Murashige và Skoog công bố năm 1962

- Nhóm môi trường đủ dinh dưỡng: Đại diện là môi trường Chu (N6), B5, SH Nhóm này có hàm lượng dinh dưỡng đa lượng và vi lượng thấp hơn môi trường MS, nhưng đặc biệt có hàm lượng muối nitrate potassium cao Nhóm môi trường này thích hợp cho các mục đích nuôi cấy tăng cường cảm ứng hình thành callus và phân hóa chồi Môi trường B5 được thiết kế đầu tiên cho nuôi cấy callus hoặc nuôi cấy dịch huyền phù tế bào, sau đó được cải tiến và trở thành môi trường thích hợp cho nuôi cấy protoplast Môi trường này cũng được sử dụng để tái sinh cây từ p rotoplast Môi trường Chu (N6) là loại môi trường rất hiệu quả trong nuôi cấy bao phấn của lúa , được phát triển đặc biệt cho nuôi cấy bao phấn các loài hòa thảo , mặc dù trong các thí nghiệm nuôi cấy bao phấn môi trường được p hát minh bởi Nitsch (1969) vẫn được dùng phổ biến hơn

- Nhóm môi trường nghèo dinh dưỡng: Đại diện cho nhóm này là môi trường Nitsch và Nitsch Môi trường này có hàm lượng muối đa lượng chỉ bằng ½ môi trường

MS, nhưng hàm lượng các muối vi lượng và vitamin thì phong phú hơn so với MS Môi trường Nitsch ngày càng thích hợp và phổ biến trong nuôi cấy cây đậu tương , cỏ

ba lá đỏ (red clover) và các loài legume khác Thành phần dinh dưỡng của môi trường

Trang 28

này đã giúp tăng sinh trư ởng của tế bào trong quá trình phát sinh phôi và nuôi cấy protoplast

- Nhóm thứ tư là nhóm môi trường thích hợp để nuôi cấy các cây thân gỗ: Môi trường WPM (Woody Plant Medium-Lloyd G, Mc Cown B, 1980), DKW (Driver-Kuniyuki Walnut, 1984)

Bảng 2.6 Thà̀nh phần dinh dưỡng của một số môi trường nuôi cấy mô và

tế bào thực vật (a)

- 0,75

- 8,6 0,25 0,025 0,025 0,83 27,8 37,3

- 27,8 37,3

-

- 0,8 27,8 37,3

-

43

25

Trang 29

5

100

2 0,5 0,05

5,8

1 0,5 0,5

(a) Các chất điều khiển sinh trưởng và các hỗn hợp dinh dưỡng phức tạp được

sử dụng bởi các tác giả khác nhau không trình bày ở bảng này Hàm lượng và thành phần của các hỗn hợp này cũng rất khác nhau tùy thuộc vào các mô và cơ quan đặc trưng được sử dụng để nuôi cấy

+ Các nguyên tố vi lượng (nồng độ > 0,5mM): được sử dụng dưới dạng muối

hoặc acid; sáu nguyên tố đa lượng cần thiết là Fe, Mn, Zn, B, Cu, Mo

+ Nguồn carbon được sử dụng dưới dạng các loại đường như: saccharose, glucose; các loại đường khác sử dụng kém hiệu quả hơn

+ Các phụ gia hữu cơ: các vitamin (B), các acid amin (dạng L); các phụ gia khác (nước dừa, các dịch chiết nấm men,…); than hoạt tính; các kháng sinh

+ Các chất điều hòa sinh trưởng (auxin, cytokinin,gibberellins, abcisic acid): tùy theo nhu cầu tạo cơ quan từ mô hay tế bào mà sử dụng thành phần và nồng độ các

chất điều hòa sinh trưởng thích hợp

+ Các nhân tố khác: Các nhân tố làm rắn môi trường (agar); pH môi trường (5-6) phù hợp cho sự sinh trưởng của thực vật

Trang 30

Một số loại môi tường cơ bản: tùy theo nhu cầu dinh dưỡng của mỗi loại thực

vật mà chọn lựa môi trường nuôi cấy cho thích hợp Dựa vào thành phần và hàm lượng

chất dinh dưỡng vô cơ có thể phân các môi trường nuôi cấy thành bốn nhóm như sau:

+ Nhóm môi trường giàu dinh dưỡng: Đại diện là môi trường MS (1962), ER (1965); môi trường MS được sử dụng rộng rãi thích hợp cho cả thực vật hai lá mầm và

một lá mầm

+ Nhóm môi trường đủ dinh dưỡng: Đại diện là môi trường Chu (N6), B5, SH; B5 là môi trường thích hợp để nuôi cấy protoplast; N6 là môi trường thích hợp nuôi

cấy bao phấn của lúa, nuôi cấy bao phấn các loài hòa thảo

+ Nhóm môi trường nghèo dinh dưỡng: Đại diện là môi trường Nitsch; môi trường này thích hợp nuôi cấy đậu tương, cỏ ba lá đỏ và các loài legume khác

+ Nhóm môi trường thích hợp nuôi cấy các cây thân gỗ: WPM, DKW

CÂU HỎI

Câu 1: Hãy trình bày vai trò của môi trường trong kỹ thuật nuôi cấy mô?

Câu 2: Hãy nhận xét sự khác nhau giữa các môi trường cơ bản: MS, B5, Nitsh, N6, E1?

Câu 3: Hãy phân tích vai trò của các thành phần trong môi trường nuôi cấy mô? Câu 4: Trong kỹ thuật nuôi cấy mô, pH của môi trường nuôi cấy là một yếu tố ảnh hưởng đến kết quả nuôi cấy Vì sao?

Trang 31

Chương 3 NHÂN GIỐNG IN VITRO THỰC VẬT

VẬT

Nuôi cấy mô (tissue culture) là thuật ngữ dùng để chỉ quá trình nuôi cấy vô

trùng in vitro các bộ phận tách rời khác nhau của thực vật

Kỹ thuật nuôi cấy mô dùng cho cả hai mục đích nhân giống và cải thiện di truyền (ví dụ: giống cây trồng), sản xuất sinh khối các sản phẩm hóa sinh, bệnh học thực vật, duy trì và bảo quản các nguồn gen quý… Các hoạt động này được bao hàm trong thuật ngữ công nghệ sinh học (biotechnology)

Thuật ngữ nhân giống in vitro (in vitro propagation) hay còn gọi là vi nhân

giống (micropropagation) được sử dụng đặc biệt cho việc ứng dụng các kỹ thuật nuôi

cấy mô để nhân giống thực vật, bắt đầu bằng nhiều bộ phận khác nhau của thực vật có kích thước nhỏ, sinh trưởng ở điều kiện vô trùng trong các ống nghiệm hoặc trong các loại bình nuôi cấy khác

Trong thực tế, các nhà vi nhân giống (micropropagators) dùng thuật ngữ nhân

giống in vitro và nuôi cấy mô thay đổi cho nhau để chỉ mọi phương thức nhân giống thực vật trong điều kiện vô trùng Thuật ngữ đồng nghĩa (synonymous) là nuôi cấy in vitro (in vitro culture)

Nhân giống in vitro và nuôi cấy mô bắt đầu bằng các mảnh cắt nhỏ của thực

vật, sạch vi sinh vật, và được nuôi cấy vô trùng

Thuật ngữ đầu tiên dùng trong quá trình nhân giống là explant (mẫu vật) tương đương với các phương thức nhân giống khác là cành giâm (cutting), cành chiết (layer), cành ghép (scion) hoặc hạt (seed)

Năm thuật ngữ khác được dùng để chỉ các loại tái sinh sinh dưỡng (vegetative

or somatic regeneration) cơ bản trong nhân giống in vitro và nuôi cấy mô:

1.1 Nuôi cấy đỉnh phân sinh (meristem-tip culture)

Phương thức nhân giống bằng cách dùng các phận rất nhỏ của đỉnh chồi tip) bao gồm mô phân sinh đỉnh riêng rẽ (single apical meristem) và mầm lá non (young leaf primordia) để kéo dài chồi (shoot elongation) ngay sau đó

(shoot-Kiểu nuôi cấy này được dùng lần đầu tiên để làm sạch virus (virus-free) ở thực vật Nếu dùng đỉnh phân sinh không thể sống sót và tạo rễ một cách độc lập, thì có thể thay thế bằng phương thức vi ghép (micrografting)

1.2 Sinh sản chồi nách (axillary shoot proliferation)

Kiểu nuôi cấy này sử dụng chồi của các điểm sinh trưởng bên và ngọn nơi mà

sự kéo dài của chồi ngọn (elongation of terminal shoot) bị kìm hãm và sự sinh sản chồi nách được đẩy mạnh

Sự điều khiển này cho phép nhân nhanh được các chồi in vitro (microshoots), là các chồi có thể tách ra và tạo rễ in vitro để hình thành cây trong ống nghiệm (microplants), hoặc nó có thể được cắt ra riêng biệt tạo thành các cành giâm in vitro (microcuttings) để tạo rễ bên ngoài in vitro

1.3 Tạo chồi bất định (adventitious shoot induction)

Loại nuôi cấy này cho phép hình thành các chồi bất định hoặc trực tiếp trên mẫu vật hoặc gián tiếp từ mô callus, mà mô callus này hình thành trên bề mặt vết cắt của mẫu vật

Trang 32

1.4 Phát sinh cơ quan (organogenesis)

Thuật ngữ này dùng để mô tả quá trình phát triển các chồi hoặc rễ bất định (cả chồi và rễ bất định) từ các khối tế bào callus

Quá trình này xảy ra sau thời điểm mà mẫu vật được đặt vào môi trường nuôi cấy và sự bắt đầu cảm ứng tạo callus

1.5 Phát sinh phôi vô tính (somatic embryogenesis)

Thuật ngữ này dùng cho sự phát triển của các phôi hoàn chỉnh từ các tế bào sinh dưỡng được sản xuất từ các nguồn mẫu vật khác nhau sinh trưởng trong nuôi cấy

in vitro Thuật ngữ tương đương đối với sự phát triển phôi ở thực vật sinh trưởng trong điều kiện tự nhiên là phát sinh phôi hữu tính (zygotic embryogenesis) và phát sinh phôi vô tính (apomitic embryogenesis)

thư, chiếu xạ, virus, vi khuẩn gây biến đổi di truyền

Biến nạp bằng điện (electroporation): Kỹ thuật dùng dòng điện tạo những lỗ thủng trên màng tế bào để chuyển nạp những vật lạ, đặc biệt là DNA từ ngoài vào trong tế bào

Cảm ứng (inducion): Hormon gây tạo một loại cấu trúc, bộ phận hay một quá

trình nào đó trong điều kiện in vitro

Cấy chuyền (passage hoặc subculture): Chuyển tế bào, mô hay mẫu vật nuôi

cấy sang bình nuôi có chứa môi trường mới pha với tách nhỏ hoặc làm loãng mật độ

Con lai tế bào soma (somatic cell hybrid): Tế bào hoặc cây hoàn chỉnh tạo được

do lai tế bào trần với đặc tính di truyền khác nhau

Dị bội (heteroploid): Tình trạng các tế bào trong phòng thí nghiệm nuôi cấy có

bộ nhiễm sắc thể ở nhiều mức bội thể khác nhau Khái niệm này dùng như một cơ thể

đa bào hay nuôi cấy gồm nhiều tế bào

Dị nhân (heterkaryon): Một tế bào có hai hay nhiều nhân khác nhau ở trong một

tế bào chung, thông thường là do dung hợp tế bào tạo thành

Đỉnh sinh trưởng chồi ngọn (shoot apical meristem): Mô chưa phân hóa hình chóp nằm trong các mầm lá của chồi ngọn, khi tách không lớn quá 1mm

Độ xốp lỏng (friability): Tình trạng không liên kết của các tế bào thực vật trong khối mô sẹo Mô sẹo xốp lỏng rất khó tái sinh cây hoàn chỉnh

Dòng (clone): Tập hợp các thể nhân được bằng phương thức nhân giống vô tính

từ một cá thể duy nhất

Trang 33

Dòng tế bào (cell line): Khái niệm để chỉ sự nuôi cấy của những tế bào có nguồn gốc chung từ lần cấy chuyển đầu tiên

Già hóa (senesemce): Biểu hiện mất khả năng phân chia của tế bào và mô trong nuôi cấy

Hiệu suất tạo dòng (cloning efficiency): Phần trăm số tế bào đã tạo được dòng khi nuôi trải trên bề mặt môi trường

Kỹ thuật vô trùng (aseptic technique): Quy trình ngăn ngừa sự nhiễm nấm, vi khuẩn, siêu vi khuẩn, hoặc các loại vi sinh vật khác đối với nuôi cấy mô và tế bào

Lai tế bào (cell hybridization): Sự dung hợp hai hay nhiều tế bào không giống nhau để tạo một thể tế bào hỗn hợp

Lai tế bào soma (somatic cell hybridization): Quá trình dung hợp protoplast của

tế bào soma động vật hay thực vật đặc tính di truyền khác nhau

Lần cấy chuyển (passage number): Số lần tế bào, mô hay mẫu vật nuôi cấy được cấy chuyển, qua đó có thể tính tuổi và hệ số đẳng trương của chúng

Mật độ quần thể (population density): Số lượng tế bào trên đơn vị diện tích nuôi cấy hay trên đơn vị thể tích nuôi cấy

Mẫu vật (expant): Mô được tách từ nguyên liệu ban đầu dùng để duy trì hoặc nuôi cấy

Môi trường nhân tạo (chemically difined medium): Dung dịch dinh dưỡng dùng

để nuôi cấy chỉ chứa những thành phần mà cấu trúc hóa học đã được biết

Mô sẹo (callus): Khối mô thực vật gồm những tế bào không phân hóa, có khả năng phân chia, được phát sinh từ các tế bào đã phân hóa ít nhiều Khi thực vật bị tổn thương tạo loại mô này trên vết sẹo, vì thế có tên gọi là mô sẹo

Nhân dòng (clonal propagation): Nhân giống vô tính những dòng thực vật có nguồn gốc từ một cá thể hay một mảnh cắt duy nhất, đảm bảo hoàn toàn đồng nhất về mặt di truyền

Nhân giống vô tính (vegatative propagation): Nhân giống không thông qua quá trình sinh sản hữu tính, bao gồm các kỹ thuật như: nhân giống in vitro, giâm các bộ phận cành, mảnh lá, đoạn rễ,

Nuôi cấy đỉnh ngọn (shoot tip culture): Sử dụng đỉnh sinh trưởng chồi ngọn cùng với hai mầm lá với tổng kích thước từ 0,1 – 1mm

Nuôi cấy cơ quan (organ culture): Duy trì và phát triển toàn bộ hay một phần cơ

quan động vật hay thực vật trong điều kiện in vitro

Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (meristem culture): Nuôi cấy mẫu mô hình chóp không lớn hơn 0,1mm Thường được tách từ rễ ngọn dưới kính hiển vi

Nuôi cấy huyền phù (suspension culture): Phương thức nuôi tế bào đơn hay cụm tế bào ở trạng thái lơ lửng trong môi trường lỏng

Nuôi cấy khởi đầu, nuôi cấy sơ cấp (primary culture): Nuôi cấy đầu tiên khi tách tế bào, mô hoặc mẫu vật từ cơ thể ban đầu tính đến khi cấy chuyển hữu hiệu lần đầu, từ đó sẽ thu dòng tế bào

Nuôi cấy phôi (embryo culture): Duy trì và phát triển phôi non hoặc đã trưởng thành được phân lập từ hạt

Nuôi cấy tế bào (cell culture): Khái niệm chỉ những nuôi cấy trong ống nghiệm

(in vitro) của những tế bào kể cả tế bào đơn không phân hóa thành mô

Trang 34

Phân hóa (differentiation): Quá trình chuyên môn hóa các tế bào về chức năng

và hình thái, để tạo ra các loại mô, cơ quan và cơ thể hoàn chỉnh

Phân hóa hình thái (morphogenetic differentiation): Phân hóa riêng về mặt hình thái, chủ yếu nói đến sự hình thành chồi và rễ từ mô sẹo Đồng nghĩa với phát sinh hình thái

Phát sinh hình thái (morphogenensis): Hiện tượng phát sinh và phát triển các cấu trúc giống hay không giống các cơ quan như chồi, lá, rễ từ tế bào, mô sẹo hay mẫu vật nuôi cấy

Sạch bệnh (pathogen free): Được kiểm định là không mang mầm bệnh

Sạch virus (virus free): Được kiểm tra bằng phép thử đặc hiệu chứng tỏ không mang virus đặc trưng cần phát hiện

Tái sinh (regeneration): Hiện tượng tế bào hoặc mô nuôi cấy chịu tác động kích thích phân hóa thành mô, cơ quan hoặc cây hoàn chỉnh

Tế bào trần (protoplast): Tế bào bị làm mất toàn bộ thành tế bào Khái niệm dùng cho cả thực vật, vi khuẩn, nấm

Vô trùng (asepsis): Không bị tạp nhiễm các loại vi khuẩn khác

Nếu đứng trên quan điểm ứng dụng mà nhìn nhận thì nuôi cấy mô và tế bào thực vật có bốn lĩnh vực ứng dụng lớn:

- Sản xuất và chuyển hóa sinh học các dược liệu tự nhiên

- Cải thiện về mặt di truyền các giống cây trồng nông-lâm nghiệp và dược liệu

- Nhân giống in vitro các cây trồng quý

- Làm sạch bệnh virus

Lần lượt các chương sau sẽ đề cập đến các khía cạnh ứng dụng đó Chương này

chủ yếu nói về lĩnh vực thứ 3 là nhân giống in vitro các cây trồng quý đã được chọn

lọc Đây là một lĩnh vực mà nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã mang lại hiệu quả kinh

tế thực sự Trong đó, kỹ thuật nhân giống in vitro được ứng dụng nhằm phục vụ các

mục đích sau:

- Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen hiếm làm vật liệu cho công tác tạo giống

- Nhân nhanh với hiệu quả kinh tế cao các loài hoa và cây cảnh không trồng bằng hạt

- Nhân nhanh và duy trì các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp hạt giống các loài rau, cây cảnh và các cây trồng khác

- Nhân nhanh và kinh tế các kiểu gen quý của giống cây lấy gỗ trong lâm nghiệp và gốc ghép trong nghề trồng cây ăn quả, cây cảnh

- Nhân nhanh ở điều kiện vô trùng, cách ly tái nhiễm kết hợp với làm sạch bệnh virus

- Bảo quản các tập đoàn giống nhân giống vô tính và các loài cây giao phấn trong ngân hàng gen

Phương pháp nhân giống in vitro thực chất là một bước tiến bộ vượt bậc của

các phương pháp nhân giống vô tính cổ điển như giâm cành, giâm chồi, chiết, ghép, tách dòng…

Trang 35

Ở đây giá trị thực tiễn của các tiến bộ khoa học kỹ thuật là đã biến những phương thức cổ điển đó thành những phương thức hoàn toàn mới về chất cho phép giải quyết những khó khăn mà phương pháp cổ điển không thể vượt qua Ví dụ: kỹ thuật giâm cành chỉ có thể ứng dụng thành công ở một số cây trồng nhất định, vì rằng với kích thước 5-20 cm khả năng tạo rễ phụ của vùng mô thượng tầng gần vết cắt hoặc khả năng đánh thức chồi phụ vẫn bị các vùng tế bào lân cận và toàn bộ phần còn lại của đoạn giâm khống chế Nếu tiến hành nuôi cấy mẫu mô với kích thước 5-10 mm, tức là làm giảm thể tích khối mô xuống 103 lần thì rõ ràng mối tương tác giữa các tế bào và các loại mô sẽ đơn giản đi rất nhiều, hiệu quả tác động của các biện pháp nuôi cấy sẽ

phải cao hơn Sau đây là một số phương thức nhân giống in vitro:

3.1 Tái sinh cây mới từ các cấu trúc sinh dưỡng

Sự tái sinh cơ quan không xảy ra ngay khi vừa cô lập mẫu cấy mà phải trải qua một quá trình phức tạp vì:

- Có những mối tương quan cần phải phá vỡ để lập lại những mối tương quan khác có thể đưa đến việc tái sinh cơ quan:

+ Sự phát triển cơ quan

- Có một số hạn chế về mặt số lượng lẫn chất lượng do nhiều yếu tố:

+ Các yếu tố nội sinh trong mẫu cấy

+ Điều kiện tăng trưởng của cây mẹ trong nhà kính hoặc ngoài thiên nhiên + Vị trí của mẫu cấy trên cây

+ Thời gian nuôi mẫu trong năm

+ Hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng thực vật nội sinh

+ Kích thước của mẫu cấy, phương pháp nuôi cấy, thành phần dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy, các chất điều hòa sinh trưởng, các yếu tố vật lý trong quá trình nuôi cấy như nhiệt độ, ánh sáng,

3.1.1 Nuôi cấy mô phân sinh đỉnh hay đỉnh phân sinh

Phương thức này sử dụng các bộ phận nhỏ nhất của đỉnh chồi (shoot-tip) hay đỉnh sinh trưởng (apex) làm mẫu vật nuôi cấy Nó bao gồm mô phân sinh đỉnh (apical meristem) và các mầm lá non (young leaf primordia) Khái niệm mô phân sinh đỉnh (ngọn) chỉ đúng khi mẫu vật được tách từ đỉnh sinh trưởng có kích thước trong vòng 0,1-0,15 mm tính từ chóp sinh trưởng Trong thực tế mẫu vật được tách với kích thước như vậy chỉ khi nào người ta tiến hành nuôi cấy với mục đích làm sạch virus cho cây trồng Thường sẽ gặp khó khăn lớn trong việc nuôi thành công các mô phân sinh đỉnh

riêng rẽ có kích thước nhỏ như vậy Do đó, trong khuôn khổ nhân giống in vitro người

ta thường nuôi cấy cả đỉnh chồi hoặc đỉnh sinh trưởng Phổ biến nhất ở các đối tượng như phong lan, dứa, mía, chuối… đỉnh sinh trưởng được tách với kích thước từ 5-10

mm, nghĩa là toàn bộ mô phân sinh đỉnh và một phần mô xung quanh

Tương quan giữa độ lớn của chồi nuôi cấy, tỷ lệ sống và mức độ ổn định về mặt

di truyền của chồi được biểu hiện như sau: Nếu độ lớn tăng thì tỷ lệ sống và tính ổn

Trang 36

định tăng, nếu độ lớn giảm thì tỷ lệ sống và tính ổn định giảm Nhưng xét về hiệu quả kinh tế nuôi cấy (thể tích bình nuôi, lượng dung dịch môi trường dinh dưỡng): Nếu độ lớn tăng thì hiệu quả kinh tế giảm, nếu độ lớn giảm thì hiệu quả kinh tế tăng Do đó, phải kết hợp hài hòa được các yếu tố trên để tìm ra phương thức lấy mẫu tối ưu

Một đỉnh sinh trưởng nuôi cấy ở điều kiện thích hợp sẽ tạo một hay nhiều chồi

và mỗi chồi sẽ phát triển thành một cây hoàn chỉnh Xét về nguồn gốc của các cây đó

có ba khả năng:

- Cây phát triển từ chồi đỉnh (chồi ngọn)

- Cây phát triển từ chồi nách phá ngủ

- Cây phát triển từ chồi mới phát sinh, ví dụ: nuôi cấy đoạn trụ dưới mầm

(hypocotyl) của cây mãng cầu (Annona squamosa) sẽ cho xuất hiện rất nhiều mầm

(buds) trên mô nuôi cấy, một số mầm sau đó sẽ phát triển thành chồi (shoots) và trở

thành cây in vitro hoàn chỉnh (plantlet)

Tuy nhiên, thông thường khó phân biệt được chồi phá ngủ và chồi phát sinh mới Các phương thức phát triển cây hoàn chỉnh từ đỉnh sinh trưởng nuôi cấy như sau:

- Phát triển cây trực tiếp

Chủ yếu ở các đối tượng hai lá mầm (dicotyledon) như khoai tây, thuốc lá, cam

chanh, hoa cúc… Ví dụ: Khoai tây (Solanum tuberosum):

Mầm (đỉnh sinh trưởng) → Chồi nách → Cây

- Phát triển cây thông qua giai đoạn protocorm

Chủ yếu gặp ở các dối tượng một lá mầm (monocotyledon) như phong lan, dứa, huệ… Cùng một lúc đỉnh sinh trưởng tạo hàng loạt protocorm (proembryo-tiền chồi)

và các protocorm này có thể tiếp tục phân chia thành các protocorm mới hoặc phát triển thành cây hoàn chỉnh Bằng phương thức này trong một thời gian ngắn người ta

có thể thu được hàng triệu cá thể, ví dụ: Hoa lan (Orchidaceae):

Đỉnh sinh trưởng → Protocorm → Cây Các đối tượng hoa lan đã mang lại hiệu quả kinh tế đặc biệt cao Sau những kết

quả đầu tiên ở chi Cymbidium của Morel (1966) người ta đã thu được kết quả rất tốt ở

22 chi khác nhau của họ này Sở dĩ nhân giống vô tính hoa lan đạt được thành công lớn và được ứng dụng rộng rãi như vậy là vì hoa lan có phương thức sinh sản qua protocorm (Hình 3.1)

Hình 3.1 Protocom hoa lan

Nhờ có phương thức nhân giống nhanh và rẻ tiền mà hoa lan vốn đắt trở nên có giả phải chăng và được nhiều người ưa chuộng Những thành công ở họ lan không

Trang 37

những chỉ là bằng chứng mà còn mở đường cho việc ứng dụng kỹ thuật này đối với các loài cây khác

Lĩnh vực ứng dụng mới đây nhất cũng đã bắt đầu có kết quả là các cây ăn quả

và cây lâm nghiệp, trong đó có các cây quý như cà phê, táo, lê, thông, bồ đề… Tổng số

có trên 30 chi khác nhau đã được nuôi cấy thành công

Vì rằng, các cây trồng rừng và các cây ăn quả là những cây trồng lâu năm nên

mọi chi phí ban đầu trong nhân giống in vitro đều có thể chấp nhận được

- Ghép đỉnh chồi (shoot apex grafting) hay vi ghép

Về nguyên tắc, vi ghép là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, nhưng thông qua dinh dưỡng tự nhiên của gốc ghép Đỉnh sinh trưởng dùng làm mắc ghép có kích thước khoảng từ 0,2-0,5 mm, được tách từ búp non đang sinh trưởng mạnh của cây mẹ trưởng thành, gốc ghép là mầm giá mới nảy mầm từ hạt của giống hoang dại, toàn bộ cây ghép được nuôi dưỡng trong điều kiện ống nghiệm vô trùng Phương thức này thường dùng để tạo ra các giống cây ăn quả sạch bệnh virus nhằm cung cấp mắt ghép

và cành chiết đầu dòng làm nguyên liệu nhân giống cho sản xuất đại trà Phương thức này cho phép thu được cây hoàn toàn sạch bệnh và mang đặc điểm di truyền của cây

mẹ cho mắt ghép

Có nhiều cách ghép khác nhau, chẳng hạn: (1) Ghép lên mặt cắt: đặt mắt ghép trực tiếp lên bề mặt lát cắt, trên vùng tượng tầng (2) Ghép chữ T-ngược: dùng đầu nhọn của lưỡi dao cắt lỗ ghép hình chữ T-ngược, chân chữ T là mặt cắt để dễ bộc lộ vùng tượng tầng (3) Ghép hàm ếch: khoét trên thân mầm cách mặt cắt 5 mm một vết lõm hình hàm ếch, chiều sâu vết lõm bằng chiều dày lớp vỏ Đặt mặt ghép vào đáy hàm ếch (Hình 3.2)

Hình 3.2 Vị trí mắt ghép trong ba kiểu vi ghép khác nhau

3.1.2 Nuôi cấy chồi bất định (adventitious shoot culture)

Hệ thống nuôi cấy này có những yêu cầu tương tự với nuôi cấy mô phân sinh đỉnh, nó chỉ khác về nguồn mẫu vật và nguồn gốc bất định của các chồi mới Đỉnh chồi bất định mới có thể phát triển hoặc trực tiếp trên mẫu vật hoặc gián tiếp từ mô callus, mà mô callus này hình thành trên bề mặt vết cắt của mẫu vật Một số loại mẫu vật được dùng như sau:

- Đoạn thân: thuốc lá, cam, chanh, cà chua, bắp cải…

- Mảnh lá: thuốc lá, cà chua, bắp cải, cà phê, ca cao…

- Cuống lá: thủy tiên…

Trang 38

- Các bộ phận của hoa: súp lơ, lúa mỳ, thuốc lá…

- Nhánh củ: họ hành, họ lay ơn, họ thủy tiên…

- Đoạn mầm: măng tây

Sự phát sinh chồi bất định trực tiếp bắt đầu bằng các tế bào nhu mô (parenchyma cells) nằm ở trong biểu bì hoặc ngay phía dưới bề mặt của thân; một số

tế bào này trở thành mô phân sinh và các túi nhỏ gọi là thể phân sinh (meristemoids) phát triển Các thể phân sinh này rõ ràng có nguồn gốc từ các tế bào đơn Tuy nhiên, chiều hướng phản ứng của thực vật cũng tùy thuộc vào nồng độ phytohormone Nghiên cứu sự tạo chồi ở mô nuôi cấy của cây linh sam Douglas cho thấy cytokinin (BAP 5 µM) cần thiết cho sự phát sinh chồi bất định, nhưng có ba kiểu phản ứng khác nhau có kết quả tùy thuộc vào nồng độ của auxin được cung cấp Nồng độ auxin thấp (NAA < 5 µM) chỉ có chồi phát triển Khi nồng độ auxin cao hơn (NAA > 5 µM) lá mầm tạo ra cả callus và nhiều chồi Khi cung cấp chỉ riêng auxin (NAA = 5 µM) thì chỉ có callus được tạo thành

Sự phát triển các chồi bất định gián tiếp đầu tiên qua giai đoạn hình thành callus

cơ sở (basal callus) từ các chồi được tách trong nuôi cấy Các chồi sau đó phát triển từ ngoại vi mô callus và không có quan hệ ban đầu với các mô có mạch dẫn (vascular tissue) của mẫu vật

3.2 Nhân giống thông qua giai đoạn callus

Trong khuôn khổ của mục đích nhân giống in vitro nếu tái sinh được cây hoàn

chỉnh trực tiếp từ mẫu vật nuôi cấy ban đầu thì không những nhanh chóng thu được cây mà các cây cũng khá đồng nhất về mặt di truyền Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp mô nuôi cấy không tái sinh cây ngay mà phát triển thành khối callus Tế bào callus khi cấy chuyển nhiều lần sẽ không ổn định về mặt di truyền Để tránh tình trạng

đó nhất thiết phải sử dụng loại callus vừa phát sinh, tức là callus sơ cấp để tái sinh cây thì hy vọng sẽ thu được cây tái sinh đồng nhất Thông qua giai đoạn callus còn có thể thu được những cá thể sạch virus như trường hợp của Kehr và Sehaffer (1976) thu được ở tỏi

Sự phát sinh cơ quan từ callus tương tự như sự phát sinh cơ quan trực tiếp từ mẫu cấy Tế bào của mẫu cấy sẽ phản phân hóa dưới tác động của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật để phân chia hỗn loạn tạo thành callus Khi thay đổi thành phần

và nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng thì tế bào callus được cảm ứng để phân hóa tạo cơ quan

Vị trí của vùng mô phân sinh trong callus có liên quan đến tổ chức của cơ quan vừa mới hình thành trong callus, sau đó chồi và rễ phát sinh từ bên trong callus và phát

triển ra ngoài Ở một vài loài thực vật (Convolvulus), hai loại cơ quan khác nhau hình

thành từ những phần khác nhau của callus, rễ thường hình thành từ những tế bào ở trên callus, còn chồi thì xuất phát từ những tế bào tiếp xúc với môi trường nuôi cấy

3.3 Nhân giống thông qua phát sinh phôi vô tính-công nghệ phôi vô tính

3.3.1 Phôi vô tính

Một phương thức nhân giống vô tính nữa là tạo phôi vô tính từ tế bào callus Năm 1958, Street và Reinert là hai tác giả đầu tiên mô tả sự hình thành phôi vô tính từ

các tế bào đơn của cà rốt (Daucus carota) Đến năm 1977, Murashige cho rằng phôi

vô tính có thể trở thành một biện pháp nhân giống in vitro Ở một số loài, sự phát sinh

phôi vô tính hình thành trực tiếp từ những phôi bất định (adventitious embryos) nằm

Trang 39

trong phôi tâm (nucellar embryos) Đến nay, công nghệ phôi vô tính được coi là công nghệ rất có triển vọng cho nông nghiệp trong thế kỷ 21

Phôi vô tính là các cá thể nhân giống (propagules) có cực tính bắt nguồn từ các

tế bào soma Chúng rất giống phôi hữu tính (zygotic embryo) ở hình thái, quá trình phát triển và sinh lý, nhưng do không phải là sản phẩm của sự thụ tinh giữa giao tử đực và giao tử cái, và vì vậy không có quá trình tái tổ hợp di truyền (genetic recombination), các phôi vô tính có nội dung di truyền giống hệt với các tế bào soma

đã sinh ra chúng

Ở trường hợp phôi hữu tính, sự kết hợp giao tử đực và cái cho ra hợp tử (zygote) Hợp tử phân chia nhiều lần tạo nên phôi hữu tính có cấu trúc hai cực: rễ và ngọn Khi hợp tử phát triển, miền sinh trưởng rễ và miền sinh trưởng ngọn cùng phát triển và cuối cùng tạo thành cây hoàn chỉnh, qua các giai đoạn phôi học như sau:

- Trường hợp cây hai lá mầm:

Dạng cầu → dạng thủy lôi → dạng có lá mầm

- Trường hợp cây một lá mầm:

Dạng cầu → dạng scutellar → dạng diệp tiêu

Ở rất nhiều cây, người ta nhận thấy các tế bào đang phân chia vô tổ chức đã tạo nên callus khi nuôi cấy Có thể thay đổi hướng phát triển của chúng để tạo ra các phôi

vô tính với các bước phát sinh hình thái rất giống với trường hợp phôi hữu tính Điểm khác nhau cơ bản giữa phôi hữu tính và phôi vô tính là phôi hữu tính luôn luôn đi kèm với nội nhũ là cơ quan dự trữ năng lượng và chất dinh dưỡng phục vụ cho quá trình nảy mầm, còn ở phôi vô tính hoàn toàn không có nội nhũ Sự khác nhau này không chỉ đáng chú ý về mặt khoa học mà còn là một yếu tố rất quan trọng trong công nghệ phôi

vô tính

Tính toàn năng của các tế bào thực vật là một trong các chức năng đặc trưng nhất của tế bào và sự sinh phôi từ tế bào soma được xem là một kiểu của tính toàn năng Sự sinh phôi từ tế bào soma giúp cho việc nghiên cứu toàn bộ quá trình phân hóa của thực vật cũng như những cơ chế biểu hiện của tính toàn năng tế bào thực vật Có nhiều công trình nghiên cứu thành công đã thừa nhận rằng phần lớn các tế bào thực vật

dù ở mức độ chuyên hóa nào đều có khả năng phản phân hóa để trở về trạng thái phôi

Ở trạng thái này một tế bào được gọi là có khả năng sinh phôi hay tế bào sinh phôi, có thể nuôi cấy trong điều kiện thích hợp để cho một phôi theo một quá trình gọi là sự phát sinh phôi vô tính.Tế bào có khả năng sinh phôi là những tế bào đẳng kính, nhân

to, nguyên sinh chất đậm đặc, và có nhiều hạt tinh bột Những tế bào này có hàm lượng protein và RNA cao Sự hình thành phôi gồm các bước:

- Sự biệt hóa các tế bào có khả năng sinh phôi thành tế bào phôi

- Sự phát triển của các tế bào phôi mới hình thành thông qua giai đoạn sau: phôi hình cầu, phôi hình trái tim và phôi hình cá đuối

Khả năng tạo phôi vô tính trong nuôi cấy mô thực vật, ngoài các điều kiện vật

lý, hóa học thuận lợi cho sự tạo phôi, còn phụ thuộc rất lớn vào loài, vào các giống (cultivars), dòng (strains) trong cùng một loài Khả năng này được chứng minh là do một hoặc một vài gen phụ trách Vì vậy, bằng biện pháp lai tạo có thể chuyển khả năng tạo phôi vô tính cao từ cây này qua cây khác

Trải qua quá trình nghiên cứu lâu dài về sự hình thành và phát triển phôi soma, các nhà nghiên cứu nhận thấy rằng tế bào phôi phát triển tốt trong huyền phù tế bào, đồng thời thu nhận được một lượng lớn phôi từ huyền phù tế bào nói trên Việc thu

Trang 40

nhận phôi cà rốt từ huyền phù tế bào đã được Fujimura và Komamine (1975) thực hiện bằng cách lọc để thu nhận những cụm tế bào có cùng kích thước Năm 1979, hai ông

đã sử dụng phương pháp ly tâm trong dung dịch ficoll để tách các cụm tế bào phôi dinh dưỡng thành những tế bào đơn Các giai đoạn phát triển phôi cũng có thể phân biệt nhờ phương pháp lọc Từ đó các nhà khoa phát triển hệ thống nuôi cấy phôi và phôi soma trong môi trường lỏng

3.3.2 Công nghệ hạt nhân tạo

Hầu hết các loài thực vật được nhân giống bằng hạt, chẳng hạn như : Hạt lúa, hạt bắp, hạt hoa, hạt rau… Nhưng đó chỉ là hạt giống hữu tính, được tạo ra từ quá trình thụ phấn ở cây trồng Như một thể nhân giống, hạt giống có thể được trồng trọt nhanh với những thiết bị cơ giới Tuy nhiên, phương pháp nhân giống từ hạt không hiệu quả do tỷ lệ hạt nảy mầm thấp, không đảm bảo độ đồng đều và không đảm bảo về mặt di truyền Vì vậy, nhân giống vô tính hiện được xem là một phương pháp hiệu quả

để tạo ra một số lượng lớn cây giống đạt chất lượng Phương pháp này đã tạo ra hạt

nhân tạo

Hạt nhân tạo (artificial seeds or synthetic seeds) về cơ bản giống như hạt giống

tự nhiên, có cấu tạo là phôi được bao bọc bởi lớp áo bên ngoài Có sự khác biệt so với hạt giống tự nhiên là hạt giống nhân tạo không có nội nhũ Hạt nhân tạo là phôi vô tính bọc trong một hạt polymer như: agar, agarose, alginate… Trong cấu trúc lưới của các hạt đó, nước, chất dinh dưỡng và chất sinh trưởng được cung cấp thay cho nội nhũ, giúp cho phôi vô tính có thể nảy mầm trở thành cây hoàn chỉnh Ý nghĩa khoa học của hạt vô tính là nó tạo nên những cá thể đồng nhất về mặt di truyền, tính ổn định cũng như chất lượng cây giống Các công trình thành công trên đối tượng hạt nhân tạo mà

có thể chuyển hạt đó ra bên ngoài trong những điều kiện đặc biệt có thể nảy mầm như những hạt tự nhiên, như là hạt nhân tạo của cây mía, cây dâu, địa lan…

Trong việc sản xuất các hạt nhân tạo thông qua phôi vô tính từ nuôi cấy dịch lỏng, thì nồi phản ứng sinh học (bioreactor) là thiết bị không thể thay thế được

Do phôi vô tính cũng có thể nảy mầm và phát triển thành cây hoàn chỉnh, nên kỹ thuật hạt nhân tạo đã được nghiên cứu và ứng dụng thành công ở nhiều nước Hạt nhân tạo gồm có 3 phần:

- Phôi vô tính

- Vỏ bọc polymer (alginate)

- Màng ngoài (calcium alginate)

Gel bọc phôi vô tính phải có đặc điểm là có thể cung cấp chất dinh dưỡng khoáng, chất điều hòa sinh trưởng thực vật và carbohydrate thức đẩy sự tăng trưởng của phôi trong quá trình nảy mầm và giúp phôi có tỷ lệ sống cao Có nhiều loại polymer tự nhiên đã được thử nghiệm dùng cho công nghệ phôi vô tính, trong đó alginate được coi là tốt nhất Alginate là một polymer sinh học, được chiết từ rong

biển mà chủ yếu là các loài thuộc chi Sargassum Aliginate do các phân tử manuronic

acid gắn với nhau tạo thành, giống như các phân tử glucose tạo nên cellulose Đặc điểm quan trọng nhất của alginate là chúng ở dạng hòa tan trong nước khi kết hợp với các ion hóa trị một (monovalent) như: Na+

, K+, NH+4… và lập tức chuyển sang dạng không tan trong nước khi kết hợp với các ion hóa trị hai (divalent) hoặc đa hóa trị (polyvalent) như: Ca2+

, Mg2+, Al3+,… Nếu nhỏ một giọt dung dịch sodium alginate vào dung dịch CaCl2 thì sodium alginate ở phần diện tích ngoài của giọt sẽ chuyển hóa

Định dạng
Số trang	191
Dung lượng	2,44 MB

Giáo trình công nghệ tế bào

PHƯƠNG PHÁP LÀM SẠCH VIRUS

DUY TRÌ TÍNH SẠCH BỆNH VIRUS