Sản xuất protein trong y học

Mô hình này thể hiện trong hình 1.7, nó có các tính năng chủ yếu dưới đây và một trong số đó đã được cập nhật một ít từ môhình ban đầu trong ánh sáng của độ phân giải cao trong dữ liệu n

Trường Đại Học Nguyễn Tất Thành

Khoa Công Nghệ Sinh Học

SẢN XUẤT PROTEIN

TRONG Y HỌC

TS TRẦN HOÀNG DŨNG

Tháng 04/2012

Chương 1 DNA - CẤU TRÚC VÀ CHỨC NĂNG

Những khái niệm chính

Các thông tin di truyền được chứa trong các axit nucleic

DNA là một sợi đôi xoắn song song ngược chiều nhau

Cặp base (A với T và G để C) giữ hai sợi xoắn lại với nhau

Sự sao chép DNA xảy ra thông qua việc tháo xoắn của các sợi DNA và saochép trên mỗi chuỗi

Các nguyên lý trung tâm của sinh học phân tử:

DNA phiên mã RNA dịch mã Protein

Phiên mã là việc sản xuất một bản sao RNA của một trong các sợi DNA

Dịch mã là giải mã của một phân tử RNA để sản xuất protein

Mỗi sinh vật sở hữu các thông tin cần thiết để xây dựng và duy trì một bản saosống của chính nó Các khái niệm cơ bản về di truyền và kết quả cho thấy các gen cóthể được truy hồi trở lại năm 1865 và các nghiên cứu của Gregor Mendel được thảoluận bởi Orel (1995) Từ những kết quả của thí nghiệm của ông với đậu Hà Lan,Mendel kết luận rằng mỗi cây đậu Hà Lan có hai alen cho mỗi gen nhưng chỉ hiển thịmột kiểu hình đơn lẻ Có lẽ thành tích xuất sắc nhất của Mendel là khả năng xác địnhđúng một hiện tượng phức tạp mà không có sẵn những kiến thức về các quá trình phân

tử liên quan đến việc hình thành các hiện tượng đó Sự di truyền qua tinh dịch và trứngđược biết cùng một thời điểm và Ernst Haeckel ghi nhận tinh trùng bao gồm phần lớncác vật liệu từ nhân, mặc nhiên đã công nhận rằng nhân đóng vai trò về tính di truyền

1.1 Acid nucleic là vật chất của di truyền

Ý tưởng cho rằng vật chất di truyền là chất truyền từ cha mẹ sang con theo quyluật tự nhiên đã được thừa nhận như là các khái niệm về sự di truyền đã được kế thừatrước đây Cả hai protein và axit nucleic được xem là chất có vai trò quan trọng trongvật chất di truyền Cho đến những năm 1940, nhiều nhà khoa học nghiên cứu vềprotein Có hai lý do chính cho việc này Thứ nhất, protein có nhiều ở các tế bào, mặc

dù số lượng của một protein riêng biệt thay đổi đáng kể từ các loại tế bào khác nhau,hàm lượng protein tổng thể của tế bào nhất chiếm trên 50% trọng lượng khô Thứ hai,axit nucleic có thể dễ dàng để vận chuyển các thông tin phức tạp, cần thiết để truyềnđạt những đặc điểm của tính di truyền DNA (deoxyribonucleic acid) lần đầu tiên đượcxác lập vào năm 1869 bởi nhà hóa học Thụy Sĩ Johann Friedrich Miescher Ông táchnhân từ tế bào chất của tế bào và sau đó nó được tách bởi một chất có tính axit từ cácnhân mà ông gọi là nuclein Miescher cho thấy nuclein có chứa một lượng lớnphosphorus và không có lưu huỳnh, đặc tính mà có thể phân biệt chúng với protein Từnhững gì đã được chứng minh cho ta có một cái nhìn tổng thể, ông cho rằng "nếumuốn giả định rằng một chất đơn lẻ là nguyên nhân của sự thụ tinh thì chúng ta nênchắc chắn rằng tất cả các suy nghĩ đầu tiên là về nuclein

Năm 1926 dựa trên ý tưởng về DNA bao gồm bốn nhóm nucleotide khác nhau,bằng cách xác định các loại hình liên kết mà nó đã tham gia liên kết với các

Sản xuất protein trong y học

nucleotide, Levene và Simms đề xuất một cấu trúc của bốn nucleotide (Hình 1.1) đểgiải thích trình tự sắp xếp hóa học của nucleotide trong axit nucleic (Levene vàSimms, 1926) Họ tìm thấy một nucleotide đơn của bốn loại đã được lặp đi lặp lạinhiều lần để tạo thành phân tử acid nucleic dài Bởi vì cấu trúc của bốn nucleotide làtương đối đơn giản, axit nucleic không có khả năng làm biến đổi tính chất hóa học củacác vật chất di truyền Protein có chứa 20 acid amin khác nhau

Hình 1.1 Đề xuất của Levene Simms năm 1926 về các mô hình bốn nucleotide của cấu trúc axit nucleic Vào thời gian đó mô hình này đã được đề xuất, người ta cho rằng acid nucleic của thực vật và động vật có thể là khác nhau và sự khác biệt giữa DNA và RNA chưa hoàn toàn được hiểu rõ.

Năm 1928, Frederick Griffith tiến hành thí nghiệm bằng cách sử dụng một vài

chủng vi khuẩn Streptococcus pneumoniae khác nhau (Griffith 1928) Một số các dòng

sử dụng được gọi là dòng độc hại, chúng gây ra viêm phổi ở cả người và chuột Một sốdòng khác thì không gây độc và không gây bệnh Cả hai dòng này có hình thái riêngbiệt trong đó các dòng gây bệnh có một lớp vỏ polysaccharide bao quanh vi khuẩn vàhình dáng bên ngoài mượt mà, tạo bề mặt nhẵn khi được nuôi cấy trên các tấm thạch

Vi khuẩn không độc thì không có lớp vỏ và tạo một vùng nhám trên cùng một mẫu.Các vi khuẩn dòng nhẵn thì nguy hiểm vì các viên đường cấu tạo từ lớp vỏ sẽ loại bỏ

hệ thống miễn dịch của động vật nhiễm bệnh và do đó chúng có thể nhân rộng và gây

ra bệnh viêm phổi Các vi khuẩn gặp khó khăn khi không có các viên nangpolysaccharide nên sẽ không có sự bảo vệ này, do đó chúng dễ dàng xâm nhập và pháhuỷ hệ thống miễn dịch của vật chủ

Griffith biết rằng chỉ có vi khuẩn độc sống sẽ tạo ra bệnh viêm phổi khi tiêm vàochuột Nếu giết chết vi khuẩn gây độc bởi nhiệt sau đó tiêm vào chuột, kết quả chothấy không có bệnh viêm phổi cũng giống như vi khuẩn sống không độc, không gâybệnh khi tiêm vào chuột Thí nghiệm quan trọng của Griffith (hình 1.2) liên quan đếnviệc tiêm vào chuột vi khuẩn sống không độc (avirulent) kết hợp với vi khuẩn độc xử

lý nhiệt Không có loại tế bào gây ra tử vong ở chuột khi họ tiêm, nhưng tất cả nhữngcon chuột thu được kết hợp tiêm thuốc thì sẽ bị chết Các phân tích máu của những conchuột đã chết cho thấy một số lượng lớn các vi khuẩn độc sống khi nuôi trên các tấmthạch Griffith đã kết luận rằng nhiệt giết chết vi khuẩn nhẵn và bằng cách nào đó chúngđóng vai trò chuyển vi khuẩn nhẵn vào vi khuẩn sống Ông gọi hiện tượng này là hiệntượng biến nạp và cho rằng nguyên tắc biến nạp có thể là do một số thành phần của viênnang hay hợp chất polysaccharide là nguyên nhân để tổng hợp nên tác nhân gây bệnh,mặc dù ông lưu ý rằng các viên đường một mình nó không gây ra bệnh viêm phổi

Hình 1.2 Các tính năng chính của thí nghiệm của Griffith, kết hợp với dữ liệu của Avery, MacLeod và McCarty để xác định DNA là nguyên tắc chuyển đổi từ Streptococcus pneumoniae Griffith lưu ý rằng tiêm vi khuẩn nhẵn sống vào chuột dẫn đến sự hình thành của bệnh viêm phổi và cuối cùng đến cái chết của chuột Xử lý nhiệt trước khi tiêm vi khuẩn không gây ra sự hình thành của bệnh Không độc đối với chủng vi khuẩn, mà không gây ra các bệnh riêng của chúng, có thể được chuyển đổi bằng cách tiêm kết hợp với xử lý nhiệt vi khuẩn độc hại Avery, MacLeod và McCarty xác định DNA là nguyên tắc chuyển đổi.

Như vậy tác nhân nào đó từ phế cầu khuẩn đã biến nạp và làm cho phế cầu khuẩn

từ R chuyển sang S Người ta chứng minh được rằng :DNA tách từ vi khuẩn S nếuđược đưa vào vi khuẩn R thì gây nên sự biến đổi kiểu R sang S, phát hiện này khẳngđịnh DNA là vật chất di truyền Trong hơn 10 năm trời kể từ sau thí nghiệm của ông,Oswald Avery cùng với Macleod và McCarty đã tiến hành trở lại thí nghiệm biến nạpnày nhưng dùng trong in vitro

Năm 1944, Oswald Avery, Colin MacLeod và Maclyn McCarty xuất bản tácphẩm của họ cho thấy rằng các phân tử đóng vai trò là yếu tố cơ bản chuyển đổi làDNA (Avery, MacLeod và McCarty, 1944) Họ bắt đầu bằng cách nuôi số lượng lớn tế

bào Streptococcus pneumoniae nhẵn Các tế bào được thu nhận từ các môi trường nuôi

cấy và sau đó giết chết bởi nhiệt Sau đó đồng nhất và sử dụng chất tẩy rữa, họ thuđược một phần chiết được kiểm tra bằng cách tiêm vào vi khuẩn sống theo nhữngnguyên tắc biến nạp Protein đã được gỡ bỏ từ dịch chiết của chloroform vàpolysaccharides được nhiều enzyme tiêu hóa và loại bỏ Cuối cùng, những phần kếttuả với ethanol đã tạo ra một khối lượng xơ mà vẫn giữ lại khả năng gây ra biến nạpcủa các tế bào vi khuẩn sù sì (avirulent) Từ 75 lít môi trường nuôi cấy của các tế bào

Sản xuất protein trong y học

vi khuẩn, sau quá trình thu được 10-25 mg từ các yếu tố hoạt động Những thí nghiệmđược thiết lập qua một nghi ngờ rằng nguyên tắc biến nạp là DNA Khối lượng các sợi

sơ được phân tích dựa trên tỷ lệ nitơ / phốt pho, được biểu hiện trùng khớp với tỷ lệ dựkiến với DNA Để loại bỏ tất cả các chất gây ô nhiễm có thể xảy ra từ chúng khi giảiphóng, họ tiến hành xử lí với nó với enzym thủy phân protein trypsin và chyomtrypsin

và sau đó họ dùng phương pháp xử lí bằng cách tiêu hóa nó với một RNA enzyme tiêuhóa ribonuclease, nó sẽ bị phá hủy bất kỳ hoạt động còn lại của protein và RNA nhưngvẫn giữ lại các hoạt tính chuyển đổi Việc xác nhận cuối cùng DNA đã được chuyểnđổi bằng cách tiêu hóa dịch chiết với deoxyribonuclease, chúng sẽ bị phá hủy hoạtđộng chuyển đổi

Năm 1944, O.T Avery Mc Carti đã chứng minh được rằng tác nhân biến nạp làDNA Phế cầu khuẩn bị xử lí bằng protease hoặc RNA-aza thì hoạt tính biến nạp vẫncòn: nhưng nếu phế cầu khuẩn S bị xử lí bởi DNA-aza thì hoạt tính biến nạp không cònnữa (Cơ sở và phương pháp phân tích sinh học phân tử, T.s Chu Hoàng Mậu, trang 9).Việc thứ hai chứng minh bằng chứng rằng ADN là vật liệu di truyền đã được

cung cấp bởi các nghiên cứu về sự lây nhiễm của vi khuẩn Escherichia coli bởi một

trong những virus phage T2 Thường gọi đơn giản là thể thực khuẩn, virus bao gồmmột lớp vỏ protein bao quanh một lõi của DNA (xem hình 1.3)

Hình 1.3 Vòng đời của thể thực khuẩn T2 Trong quá trình xâm nhiễm, vi khuẩn bám vào các bề mặt của tế bào Escherichia coli Truyền các thông tin di truyền nhưng không phải là toàn bộ nhân thể thực khuẩn được chèn vào trong vi khuẩn, nơi nó được nhân rộng Các thể thực khuẩn được sao chép, lớp vỏ protein vẫn còn ở bề mặt của vi khuẩn Sau khi tổng hợp các nhân thể thực khuẩn mới được sản xuất, ly giải tế bào vi khuẩn và các nhân thể thực khuẩn được giải phóng vào môi trường xung quanh.

Trong những năm 1950 chúng ta ít được biết về thể thực khuẩn lây nhiễm Thểthực khuẩn được biết là hấp thụ vào bề mặt của vi khuẩn, sau đó có một giai đoạn tiềm

ẩn của chúng khoảng mười phút trước khi các virus lây nhiễm bắt đầu được thực hiện,cuối cùng dẫn đến ly giải tế bào và phóng thích thể thực khuẩn Alfred Hershey vàMartha Chase lý luận rằng nếu họ biết bản chất của các protein thể thực khuẩn và acidnucleic vào đầu của quá trình xâm nhiễm, họ sẽ hiểu hơn về bản chất của những bướcđầu tiến trình.

Hình 1.4 Hershey -Chase thử nghiệm cho thấy acid nucleic là vật chất di truyền Hershey và Chase tăng bacteriophages T2 là vi khuẩn có khả năng truyền tải P 32 trong môi trường (để đánh dấu phốt pho của axit nucleic) hoặc S 35 (để đánh dấu lưu huỳnh của các protein trong các chuỗi bên của các axit amin methionine và cysteine chứa lưu huỳnh) Họ sử dụng phóng xạ đánh dấu bacteriophages của chúng để lây nhiễm một môi trường nuôi cấy mới của vi khuẩn không đánh dấu Sau khi ủ bệnh ngắn, vi khuẩn đã được thu nhận bằng cách ly tâm và đưa vào máy khuấy để tách các vi khuẩn

đi từ thể thực khuẩn gắn liền với bề mặt của nó Họ thấy rằng, khi DNA đã được đánh dấu, các chất đánh dấu được chuyển vào các tế bào vi khuẩn, trong khi các protein đánh dấu vẫn được gắn phage thực khuẩn Họ kết luận là vật chất di truyền -tức là các vật chất truyền cho con cái - là nucleic acid.

Họ sử dụng đồng vị phóng xạ P32và S35để thực hiện theo các thành phần phân tửcủa các thực khuẩn trong xâm nhiễm (Hình 1.4) Vì DNA có chứa phốt pho nhưngkhông chứa lưu huỳnh, P32hiệu quả với DNA và bởi vì các protein có chứa chứa lưuhuỳnh nhưng không phốt pho, S35 được đánh dấu lên protein Nếu E coli tế bào đượcnuôi cấy trong sự hiện diện của P32hoặc S35và sau đó bị nhiễm virus T2, các tổng hợpthực khuẩn mới sẽ có cả một lõi DNA được đánh dấu phóng xạ hoặc protein vỏ đánh

Sản xuất protein trong y học

dấu phóng xạ tương ứng Những thực khuẩn có đánh dấu có thể được phân lập từ môitrường nuôi cấy bị nhiễm bệnh và được sử dụng để lây nhiễm vi khuẩn khác không đượcđánh dấu Hershey và Chase đánh dấu các thực khuẩn T2 với một trong hai chất phóng

xạ S35 hoặc P32và cho phép chúng hấp thu vi khuẩn không được đánh dấu Các tế bàonày sau đó được tách ra bằng cách ly tâm Các tế bào được tạo huyền phù và việc dừngpha trộn để tách phần bên trong của thể thực khuẩn từ vi khuẩn bị nhiễm bệnh Nhữngphần không chứa các vật chất di truyền, mà được nhân rộng trong các vi khuẩn chủ.Hershey và Chase thấy rằng khoảng 80% của S35 đánh dấu đã được gỡ bỏ từ các vikhuẩn trong khi chỉ khoảng 20% của P32đánh dấu đã được gỡ bỏ Họ kết luận rằng hầuhết các DNA thể thực khuẩn xâm nhập vào tế bào và một dư lượng có ít nhất 80%protein có chứa lưu huỳnh của thể thực khuẩn vẫn còn ở bề mặt tế bào Điều này chothấy cùng với lúc đó Avery, MacLeod và McCarty cung cấp bằng chứng rằng DNA làphân tử có vai trò về tính di truyền học Hershey và Chase hơi nghi nghờ về những pháthiện của họ và sau đó họ kết luận protein không có chức năng trong nhân thể thực khuẩn

và DNA có một số chức năng (Hershey và Chase, 1952)

1.2 Cấu trúc của acid nucleid

Như chúng ta đã thấy trong phần trên, các vật chất di truyền là DNA hay đúnghơn axit nucleic Trong hầu hết các sinh vật, vật chất di truyền là DNA Tuy nhiên,một số virus sử dụng RNA (ribonucleic acid) là những khối vật chất xây dựng cho hệgen của chúng DNA và RNA là những phân tử cao phân tử được tạo thành từ chuỗituyến tính của các tiểu đơn vị nucleotide Mỗi nucleotide có ba phần: một gốc basenitơ, 5 nguyên tử carbon, đường và một nhóm phosphate (Hình 1.5) Sự kết hợp củacác base và đường được gọi là một nucleoside, trong khi các base-phosphate- đườngđược gọi là một nucleotide Chúng bao gồm đường 2’-deoxyribose, các nucleotide củaDNA được gọi là deoxyribonucleotides, trong khi những thành phần của RNA có chứacác đường ribose được gọi là ribonucleotides Các base của nucleotide có thể là baogồm một vòng purine hoặc một pyrimidine DNA và RNA được xây dựng từ hai vòngpurine và hai vòng pyrimidine có chứa nucleotide Cácvòng purin của cả DNA vàRNA là như nhau bao gồm adenine (A) và guanine (G) Các vòng pyrimidine gồmcytosine (C) cũng được tìm thấy ở cả hai loại axit nucleic, trong khi pyrimidine gồmthymine (T) được giới hạn trong DNA, nó được thay thế bởi uracil (U) trong RNA

Hệ thống đánh số cho nucleotide được sử dụng rộng rãi trong các văn bản nàyđược thể hiện trong hình 1.5 Mỗi nguyên tử carbon và nitơ trong vòng pyrimidine của

cả hai và vòng purine được đánh số tương ứng 1-6 hoặc 1-9 Các nguyên tử cacboncủa vòng đường hoặc là ribose hoặc deoxyribose được đánh số từ 1 đến 5 Như vậy,2’-deoxyribose thiếu một nhóm hydroxyl thuộc carbon 2 của vòng đường.Cácnucleotide riêng biệt được kết nối với nhau trong cả DNA và RNA thông qua gốcphosphate- đường kết nối từ các nhóm hydroxyl trên carbon số 3 của một nucleotidevới nhóm phosphate vào carbon số 5 trên một nucleotide khác Xem (Hình 1.6 )Hainucleotide liên kết với nhau được gọi là một dinucleotide, ba được gọi là trinucleotide

và nhiều kết nối trong một chuỗi dài được gọi là một polynucleotide

Hình 1.5 Cấu trúc của các purin và pyrimidine các axit nucleic Các base được đánh dấu bằng màu da cam và các nhóm đường được đánh dấu bằng màu xanh Bên dưới là hệ thống đánh số được sử dụng trong văn bản này Các nguyên tử của vòng purine được đánh số từ 1 đến 9 và các thành phần của vòng pyrimidine được đánh số

từ 1 đến 6 Các nguyên tử của các đường được đánh số từ 1 đến 5.

Hình 1.6 Việc liên kết của các nucleotide như adenine và guanine của một nucleotide Các phosphate gắn với đường trên vòng của guanine được chỉ định là α, β hay γ Trong sự hình thành của các dinucleotide, pyrophosphate (đại diện cho β và γ phosphate) là bị mất và các liên kết trong đó liên kết phosphodiester các hydroxyl 3’

Sản xuất protein trong y học

đến phosphate về các bon 5‘nguyên tử của đường Các phân tử DNA luôn có một phosphate 5’tự do và hydroxyl 3’.

Trong những năm 1950, nhà hóa học Erwin Chargaff thực hiện thí nghiệm tìm racấu trúc, thành phần hóa học của axit nucleic và ông nhận ra rằng axit nucleic chứa cácthành phần tỷ lệ không bằng nhau của mỗi nucleotide Chargaff tách DNA từ một sốsinh vật, cả hai sinh chất và nhân điển hình (Chargaff, Lipshitz và Green, 1952, vàcộng sự Chargaff, 1951; Zamenhof, Brawerman và Chargaff, 1952) Ông thủy phânDNA vào thành phần nucleotide của nó bằng cách xử lý với axít mạnh và sau đó táchcác nucleotide bằng sắc ký giấy Thí nghiệm của ông cho thấy các tỷ lệ tương đối của

4 base không bằng nhau nhưng cũng không phải ngẫu nhiên Số lượng adenine (A)(residues )dư lượng trong tất cả các mẫu DNA đã bằng với số thymine (T) dư lượng,trong khi số lượng guanine (G) dư lượng ngang bằng với số cytosine (C) dư lượng(Bảng 1.1) Chargaff quy định rằng đối với bất kỳ loài nào thì:

A = T và G = C

Tổng các purin = Tổng các pyrimidine

Tỷ lệ phần trăm (C + G) không nhất thiết phải bằng tỷ lệ phần trăm (A+T)

Những phát hiện này mở ra khả năng cho sự sắp xếp chính xác của cácnucleotide trong một phân tử DNA, nhưng ý nghĩa cơ bản của các T = A và G = C sựtương quan giữa C đã không được đầy đủ nhận thấy cho đến khi cấu trúc ba chiều củaDNA được tìm ra Như chúng ta sẽ thấy sau này, trong DNA thì A luôn cặp với T và

vào một nguyên tử trong chuỗi đó chúng sẽ được nhiễu xạ và các chùm tia nhiễu xạđược phát hiện như những đốm trên phim của tia X Phân tích các mẫu nhiễu xạ thìcho biết các thông tin về cấu trúc và hình dạng của các phân tử trong chuỗi Đầu năm

1938 William Astbury áp dụng các kỹ thuật lên các sợi DNA Tới năm 1947, ông đãphát hiện một chu kỳ trong DNA dài khoảng 0,34 nm Giữa năm 1950 và 1953,Rosalind Franklin được cải tiến dữ liệu tia X từ các mẫu DNA tinh khiết cao Côngviệc của bà khẳng định có tính chu kỳ và cho rằng cấu trúc của DNA bao gồm một sốdạng xoắn Franklin đã không đề xuất một mô hình cho cấu trúc của DNA Thay vào

đó, Linus Pauling và Robert Corey sử dụng dữ liệu của Franklin, cùng với điều đó củamột người khác và đã đề xuất rằng DNA là một chuỗi xoắn ba với phosphate gần trungtâm của trục và các base ở bên ngoài (Pauling và Corey, 1953)

1.3 Sợi xoắn kép

Franklin đã lưu ý rằng các sợi DNA có thể cho hai loại hình ảnh nhiễu xạ khác

nhau và chúng phụ thuộc vào cách chuẩn bị và lưu trữ các mẫu Điều đầu tiên (cấu trúcA) là các sợi tương đối mất nước, thứ hai (Cấu trúc B) đã được phổ biến trên một loạtcác ghi nhận Bà nhận thấy rằng sự thay đổi từ cấu trúc A đến cấu trúc B được đảongược, tùy thuộc vào mức độ mẫu hydrat hóa (Franklin và Gosling, 1953) Người tacho rằng các dạng B của DNA là quan trọng trong cấu tạo sinh học Dạng DNA (hìnhdạng A xoắn phải và hình dạng Z xoắn trái) chắc chắn vẫn tồn tại nhất định trong cácđiều kiện và có thể đóng vai trò quan trọng trong quá trình vận chuyển của các tế bào

Ví dụ, một loại của các protein liên kết đặc biệt với Z-DNA gần đây đã được mô tả(Schwartz và cộng sự năm 2001) Ở đây chúng tôi sẽ tập trung vào các đặc tính và sựtương tác của hình dạng cấu trúc B của DNA

Năm 1953, James Watson và Francis Crick đã cố gắng để xây dựng mô hìnhphân tử của ADN và nhận ra rằng các cấu trúc Pauling -Corey là không chính xác, một

số nguyên tử cần phải xích lại gần nhau hơn Bằng cách kết hợp mẫu nhiễu xạ tia Xcủa Franklin cùng với nguyên tắc Chargaff, Watson và Crick đã đề xuất mô hình xoắnkép vào năm 1953 (Watson và Crick, 1953a) Mô hình này thể hiện trong hình 1.7, nó

có các tính năng chủ yếu dưới đây và một trong số đó đã được cập nhật một ít từ môhình ban đầu trong ánh sáng của độ phân giải cao trong dữ liệu nhiễu xạ tinh thể tia X.(A) Hai chuỗi polynucleotide dài cuộn quanh một trục trung tâm, tạo thành mộtchuỗi xoắn kép hướng xoắn phải, điều này có nghĩa rằng các các vòng xoắn theo chiềukim đồng hồ khi nhìn từ trên xuống trục xoắn ốc

(B) Hai chuỗi được xoắn đối song song, có nghĩa là mỗi chuỗi có một hướngxoắn đặc trưng và chạy ngược chiều nhau

(C) Các base của cả hai chuỗi là những cấu trúc phẳng, nằm vuông góc với trục.Chúng được "xếp chồng lên nhau", cách nhau 0,34 nm và hướng vào bên trong củađường xoắn ốc này

(D) Base nitơ của các sợi ngược chiều nhau được liên kết với nhau bởi liên kếthydro

Sản xuất protein trong y học

(E) Mỗi vòng xoắn hoàn chỉnh có chiều dài là 3,4 nm Điều này có nghĩa là chỉ

có hơn 10 cặp base từ mỗi sợi (10,4 bp) tạo thành một vòng hoàn chỉnh của đườngxoắn ốc này

(F) Theo chiều dài của một phân tử, các khe lớn thì rộng và các khe nhỏ thì hẹpđược phân biệt rõ ràng trong cùng đường xoắn ốc

(G) Kích thước đường kính của đường xoắn được tăng gấp đôi khoảng 2 nm.Các liên kết của các base nitơ ở trung tâm của đường xoắn ốc là tính năng quantrọng nhất của mô hình của Watson và Crick Tuy nhiên, một số tính năng khác cũngrất quan trọng để hiểu được chuỗi xoắn kép

1.3.1 Các sợi xoắn đối song song

Bản chất của các sợi xoắn đối song song của hai chuỗi polynucleotide là mộtphần quan trọng của chuỗi xoắn kép Do hạn chế của các góc liên kết của các cặp base

và phosphate , đường, các chuỗi xoắn kép có thể không được hình thành một cách dễdàng nếu cả hai chuỗi chạy song song cùng chiều Một chuỗi xoắn chạy bắt đầu từ đầu3’đến 5’ và các chuỗi khác chạy bắt đầu từ đầu 5’ đến 3’ Điều này được minh họatrong hình 1.8

Hình 1.7 Các Watson và Crick mô hình của DNA

Các danh pháp đầu 5’ và 3’ là bắt nguồn từ hệ thống đánh số của vòng đường màchúng ta đã thấy trong hình 1.5 Theo quy ước, trình tự DNA được viết theo hướng 5’đến 3’ Điều này có nghĩa là một chuỗi DNA duy nhất bắt đầu với một nhómphosphate tự do trên carbon 5 của một vòng deoxyribose Nucleotide bổ sung đượctham gia vào chuỗi thông qua liên kết phosphodiester, mà liên kết các nhóm hydroxyltrên nguyên tử cacbon 3 của một đường với các phosphate trên nguyên tử cacbon 5 củamột đường liền kề Chuỗi kết thúc bằng một nhóm hydroxyl tự do trên các nguyên tửcacbon 3 của đường cuối cùng

Hình 1.8 Các cặp base của DNA liên kết và bổ sung Hai chuỗi xoắn này, mũi tên trong hướng 3 đến 5, được xoắn đối sog song Các cặp base trên một sợi xoắn được bổ sung cho nhau trên sợi đối diện, một cặp base A luôn luôn cặp với T và cặp base G luôn luôn cặp với C.

1.3.2 Cặp Base và cách sắp xếp

Các base của cả hai chuỗi DNA là những cấu trúc phẳng nằm gần vuông góc vớitrục xoắn ốc Các base của chính nó được xếp chồng lên nhau trong mỗi chuỗi Sắpxếp này là minh họa tốt nhất qua sự kiểm tra của một mô hình mà máy tính đưa ra đểkiểm tra độ phân giải cao dữ liệu của nhiễu xạ tia X (hình 1.9) Nó có thể được lưu ýrằng không phải tất cả các cặp base là đều vuông góc với trục xoắn và một số vị tríxoắn cho thấy các cặp base của các vòng purine và pyrimidine không nằm bằng phẳngvới nhau nhưng chúng xoắn đối với mỗi vị trí khác, như các cánh trong cùng một cánhquạt (Dickerson, 1983) Các liên kết của một vòng purine (A hoặc G) với mộtpyrimidine (T, C) trong vòng xoắn này là quan trọng đối với sự hoàn chỉnh của cácđường xoắn ốc

Sản xuất protein trong y học

Hình 1.9 Máy tính tạo ra mô hình của DNA Cấu trúc của dạng DNA sợi B gấp đôi bắt nguồn từ nhiễu xạ tia X có độ phân giải cao của các tinh thể DNA Nguyên tử oxy được tô màu đỏ, phosphorus là màu cam, màu trắng carbon và nitơ là màu xanh.

Độ dài liên tục của vòng purine-pyrimidine ghép nối sẽ bị phá vỡ nếu xảy ra cáccặp purine-purine (quá lớn) hoặc pyrimidine-pyrimidine (quá nhỏ) Các cặppyrimidine- purine được bổ sung cho nhau và hai sợi của một phân tử ADN đơn lẻ bổsung cho nhau Như vậy, nếu trình tự 5’-ATGATCAGTACG-3’ xảy ra trên một sợiAND thì các sợi khác phải có trình tự 5’-CGTACTGATCAT-3’ Hai chuỗi được bổsung cho nhau:

Chúng ta sẽ thấy trong nhiều chương sau, những ý tưởng của sự phân bổ giữa haisợi DNA là cơ sở của nhiều thí nghiệm trong kỹ thuật di truyền Các liên kết của haisợi DNA rất cụ thể, chính xác phù hợp giữa hai sợi DNA Giống như những liên kết

ở trên có tính ổn định cao và dễ dàng hình thành xoắn Như chúng ta sẽ thấy sau này,hai sợi DNA mà không bổ sung cho nhau nhưng có vẫn còn ở mức bổ sung cao vẫngiữ lại khả năng tương tác với nhau

1.3.3 Các thông tin có được truyền đến nhau hay không khi mà chúng ta phá vở các sợi xoắn kép ra xa nhau

Làm thế nào để thông tin có thể tổ chức trong chuỗi DNA được đọc mà khôngcần phải làm sáng tỏ các chuỗi xoắn kép? Bản chất bất biến của liên kết giữa đường -phosphate dường như không thể bị phá vở các trình tự cơ bản DNA Các khe dọc theotrục xoắn ốc đã cung cấp một cơ chế mà trong đó các base có thể được phân biệt vớinhau Như chúng ta có thể thấy trong hình 1.7

Hình 1.10 Sự tương tác giữa các gen ức chế-λ của vi khuẩn λ và DNA Máy tính tạo ra mô hình của sự tương tác giữa DNA, chúng được thể hiện bằng cách sắp xếp màu như trong hình 1.9 và gen ức chế λ, có α-xoắn được thể hiện trong màu xanh lá cây và được liên kết bởi các axit amin mà không thông qua cấu trúc thứ Hai phân tử của gen ức chế λ (một dimer) tương tác với một phân đoạn bp 17 của-DNA chuỗi xoắn kép (B) chuỗi xoắn 5 của gen ức chế λ Mỗi monomer gen ức chế của DNA ràng buộc miền λ có sợi xoắn 5, đánh số 1-5 từ cuối amin của protein Đường xoắn 3 nằm trong rãnh lớn và các chuỗi bên (không hiển thị) mở rộng đến các cạnh của các rãnh lớn, tiếp xúc với các cơ sở DNA Hình dạng xoắn 2 và 3 xoắn cuộn ràng buộc motif DNA được tìm thấy trong nhiều loại protein liên kết ADN Sợi xoắn 3 là chuỗi xoắn nhận dạng và có hình dạng chuỗi đặc trưng trình tự ADN trong các khe lớn, trong khi xoắn

2 là chuỗi xoắn ổn định tương tác không đặc trưng với các trục chính của sợi DNA

để cung cấp ổn định cho các protein tương tác DNA.

DNA bao gồm các khe được xếp chủ yếu và một số khe nhỏ dọc theo trục của nó.Đây là kết quả của các liên kết glycosidic có đính kèm một cặp base với đường trongvòng của nó, chúng không nằm trực tiếp đối diện nhau qua trục xoắn ốc Kết quả làtrục chính của các chuỗi xoắn kép liên kết giữa đường- phosphate không đều nhau dọctheo trục xoắn và các khe hình thành giữa các trục chính không bằng nhau Các khelớn rộng (~ 0,22 nm) và nông, trong khi các khe nhỏ hẹp (~ 0,12 nm) và sâu Cácnhóm chính bao gồm chủ yếu là nitơ và oxy nguyên tử của mỗi cặp base

Ngược lại, khe nhỏ được che lấp bởi nguyên tử nitơ và oxy nói chung hoặc là cácvòng purines hoặc pyrimidine Như vậy, khả năng tương tác các rãnh lớn cho cho thấy

Sản xuất protein trong y học

nó phụ thuộc nhiều vào trình tự cơ bản của các rãnh nhỏ Phát hiện này đã dẫn tới sựsuy đoán rằng trình tự ADN cụ thể nhận ra các protein liên kết DNA bằng cách hìnhthành liên kết hydro chủ yếu giữa các nhóm cụ thể ở vị trí bên trong và dọc theo cácđường rãnh lớn Một trong những cách phổ biến nhất trong đó các protein có thể nhận

ra các chuỗi ADN cụ thể là bằng cách chèn các protein xoắn α vào các rãnh chính củaADN Các chuỗi xoắn α, ban đầu được mặc nhiên công nhận bởi Pauling và Coreynăm 1951 Nó là một protein cấu trúc thứ cấp, trong đó một vòng xoắn phải được hìnhthành bởi các axit amin trên một chuỗi polypeptide (Pauling và cộng sự năm 1951).Mỗi axit amin trong chuỗi xoắn chiếm một khoảng cách 0,15 nm, và có 3,6 amino acidcủa các chuỗi xoắn (xem phụ lục 1) Đường kính của trục polypeptide trong một xoắn

α là khoảng 0,5 nm, tuy nhiên acid amin chuỗi có kích thước xa trục xoắn ốc Kết quả

là protein xoắn α có thể để phù hợp với hầu như chính xác vào các rãnh chính DNAsợi đôi Acid amin kích thước chuỗi đi từ xoắn α có thể hình thành liên kết hydro vớicác cặp base của ADN trong chính các rãnh Các loại protein-DNA tương tác được thểhiện trong hình 1.10

1.3.4 Liên kết hydrogen

Các mô hình Watson và Crick cấu trúc DNA dự đoán rằng hai chuỗipolynucleotide được giữ với nhau bằng liên kết hydro không cộng hóa trị hơn là tươngtác cộng hóa trị Điều này đặt ra một số câu hỏi quan trọng như liên kết hydro là gì và

nó đủ mạnh để duy trì tính toàn vẹn của chuỗi xoắn kép?

Để giải quyết câu hỏi đầu tiên, một liên kết hydro là một sự tương tác tĩnh điệnyếu giữa liên kết cộng hóa trị của nguyên tử hydro và một nguyên tử khác với một cặpđiện tử không có ái lực, một đặc tính của liên kết cộng hóa trị giữa nguyên tử oxy vànitơ Các nguyên tử hiđrô giả định tích điện dương, trong khi các cặp điện tử không có

ái lực giả định tích điện âm Các nguyên tử này tích điện trái dấu thì hút nhau bằngliên kết hóa học yếu

Nói chung, một liên kết hóa học là một lực hấp dẫn để giữ các nguyên tử vớinhau Sự hình thành ngẫu nhiên của một liên kết giữa hai nguyên tử tự do liên quanđến việc giải phóng năng lượng nội bộ của các nguyên tử không liên kết và chuyển đổisang một hình thức năng lượng, ví dụ như nhiệt Lực của một liên kết cụ thể được đobằng lượng năng lượng giải phóng theo sự hình thành của liên kết Các liên kết mạnhhơn, năng lượng nhiều hơn được giải phóng Sự thay đổi năng lượng ( G) đi kèm với

sự hình thành liên kết được sử dụng để mô tả lực của một liên kết Giá trị của  Gđược tính theo phương trình sau đây:

Khi tìm thấy trong các chuỗi xoắn kép, hình thức adenine hình thành 2 liên kếthyđrô với thymine, và các hình thức cytosine ba liên kết hydro với guanine (xem hình1.8) Trong khi một liên kết hydro duy nhất giữa chính nó là rất yếu 2500 hay như vậyliên kết hydro mà giữ lại với nhau mỗi kilobase DNA cung cấp mức độ bất thường của

sự ổn định để xoắn Điều này cũng có nghĩa là, như chúng ta sẽ thấy dưới đây và trongcác chương sau, có một cặp base AT là kém ổn định hơn về mặt nhiệt động lực họchơn là một cặp cơ sở GC

1.4 Biến tính thuận nghịch của DNA

Mạch đôi DNA là một phân tử rất bền Trong một mẫu mất nước, nó có thể tồntại gần như nguyên vẹn trong hàng ngàn năm Những đoạn DNA đã được phân lập từxác ướp Ai Cập cách đây khoảng 3.000 năm Trong những mẫu này, chuỗi xoắn képvẫn còn nguyên vẹn, nhưng DNA đã bị đứt gãy Hiện tại một chuổi gồm hàng triệunucleotide được ghép lại kề nhau thì tạo được một đoạn DNA ngắn, dài khoảng 500-

1000 (bp), với một số mối liên kết đồng hóa trị tạo thành khung phosphodiester bị gãyvụn

Tác dụng chủ yếu của liên kết không cộng hóa trị là giữ chặt hai sợi xoắn kép,đồng thời nó cũng làm cho sợi đôi DNA có thể bị tách ra (biến tính) đơn giản bằngcách nung nóng Nhiệt năng được cung cấp cho một đoạn DNA bằng cách nung nóng

sẽ phá vỡ liên kết hydro, nhưng sẽ không ảnh hưởng đến các liên kết đồng hóa trị màgiữ mỗi chuỗi với nhau (Lin và Chargaff, 1966) Việc tách hai sợi DNA trong một cấutrúc xoắn được kèm theo những thay đổi về tính chất vật lý của DNA Một trongnhững thay đổi này là sự hập thụ tia UV của DNA DNA hấp thụ ánh sáng ở bướcsóng 260 nm do sự hiện diện của các liên kết đôi và liên kết đơn xen kẽ trong cácbases DNA (hình 1,5) Mỗi một bases của bốn loại nucleotid có phổ hấp thụ khác nhaukhông nhiều, và quang phổ hấp thụ tổng thể của DNA là trung bình cộng của chúng.Một dung dịch DNA tinh khiết được nhìn thấy trong suốt bằng mắt, và sự hấp thu trởnên không thể đo được đến khoảng 320 nm Giảm bước sóng dần xuống thì có mộtđỉnh hấp thụ vào khoảng 260 nm, tiếp theo được giảm xuống giữa 220 và 230, và sau

đó dung dịch trở nên mờ đi về bản chất trong tia cực tím Một dung dịch sợi đôi, DNA

tự nhiên,với nồng độ là 0,05 mg/ml, có độ hấp thụ (hoặc mật độ quang học, OD)khoảng 1,0 at ở đỉnh cao 260nm

Khi một chuỗi xoắn DNA được biến tính để trở thành sợi đơn duy nhất, ví dụbằng cách nung nóng, tăng hấp thụ Cùng một nồng độ 0,05 mg/ml dung dịch sợi đôiDNA mà chúng tôi sử dụng trên sẽ có một mức hấp thụ là 1,5 khi ở dạng sợi đơn Đây

là số liệu hấp thụ thường được thể hiện dưới dạng hiển thị dưới đây:

1.0 A 260nmsợi đôi DNA = 50 μg/mL

1.0 A260nmsợi đơn DNA = 33 μg/mL

Sự gia tăng hấp thụ như sợi DNA kép trở thành sợi đơn, gọi là hiệu ứnghyperchromic (Thomas, 1993), cho thấy sự tương tác giữa các điện tử lưỡng cực trongviệc xếp chồng các bases sợi đôi xoắn kép và được trình bày sơ lược trong hình 1.11.Việc xếp chồng của các cặp bases trong sợi đôi DNA có tác dụng làm giảm sự hấp thucủa riêng nucleotide do sự tương tác cạnh tranh của các cặp bases liền kề trong ngăn

Sản xuất protein trong y học

xếp Ở dạng sợi đơn, không có cạnh tranh như vậy xảy ra và kết quả là DNA sợi đơnhấp thụ ánh sáng với mức độ lớn hơn so với sợ đôi của nó

Hình 1.11 Ảnh hưởng của việc nung nóng sợi đôi DNA Như là một phân tử DNA sợi kép được đốt nóng trên nhiệt độ môi trường xung quanh, các liên kết hydro không cộng hóa trị giữ hai sợi với nhau bắt đầu bị phá vỡ Điều này được đi kèm với

sự gia tăng hấp thụ ở 260 nm Ở nhiệt độ cao trên 90 0 C hai sợi DNA sẽ hoàn toàn tách biệt nhau Quá trình này có thể thuận nghịch Nếu nhiệt độ giảm tương đối chậm, hai sợi DNA bổ sung sẽ sửa đổi để tạo ra một phân tử DNA sợi kép kết hợp một cách chính xác Nhiệt độ nóng chảy (Tm) là nhiệt độ mà tại đó một nửa số sợi được tách

Khi một mẫu DNA được đun nóng, cấu trúc xoắn bắt đầu tách ra, trong một quátrình đôi khi được gọi là nóng chảy Cặp bases A-T chỉ có hai liên kết hyđrô giữ chúnglại với nhau, các vùng DNA với mật độ A và T cao sẽ tách ra trước Khi nhiệt độ tiếptục tăng, và tăng cao liên tục thì DNA sẽ mang tích chất của một sợi đơn tự nhiên, chođến khi hai sợi tách ra hoàn toàn Nhiệt độ mà tại đó một nửa là DNA sợi đơn được gọi

là nhiệt độ nóng chảy (Tm) Nhiệt độ nóng chảy của toàn bộ phân tử DNA thì khônggiống nhau, và được quyết định dựa trên chiều dài của DNA, và tỉ lệ các cặp bases G-

C và A-T Thông thường những phân tử DNA ngắn có giá trị Tmthấp, như bao gồm tỉ

lệ cao của các cặp bases A-T Nhiệt độ nóng chảy của phân tử DNA dài được tính toándựa theo phương trình:

Tm= 16.5(log[Na+]) + 0.41(%GC) + 81.50C

Ở đây [Na+] là nồng độ của các ion natri trong các dung dịch DNA và (% GC) là

tỷ lệ phần trăm của G-C còn lại trong mạch đôi Vì vậy, đối với một phân tử DNA cóchứa 40% GC còn lại (điển hình cho một bộ gen động vật có vú) trong một dung dịchNaCl có nồng độ 50 mM NaCl, nhiệt độ nóng chảy là 76,40C Như chúng ta sẽ thấytrong chương sau, các phân tử DNA ngắn (15-30 bases) thường được sử dụng trong

các thí nghiệm kỹ thuật di truyền Vì những trình tự bổ sung ngắn, phương trình trênkhông còn đúng nữa, và theo dự toán (đôi khi được gọi là quy tắc Wallace) được sửdụng để xác định Tm (Wallace và cộng sự năm 1979.,):

Tm = 2(AT) + 4(GC)

Trong đó, cứ mỗi cặp bases A-T ở cấu trúc mạch kép đóng góp 20C ổn định củasợi đôi xoắn kép, trong khi mỗi cặp G-C đóng góp 40C ổn định Do đó, mộtoligonucleotide của 20 bases của sợi đơn DNA có chứa năm chất thừa, còn lại 6 T, 3 C

và 6 G sẽ có một nhiệt độ ủ bổ sung vào chuỗi ADN xấp xỉ 2 (11) + 4 (9) = 58 0C.Tầm quan trọng của nhiệt độ ủ sẽ trở nên rõ ràng khi chúng ta nhìn vào phản ứng dâychuyền polymerase (PCR) và lai tạo acid nucleic trong các chương sau

Việc làm nóng các chuỗi DNA xoắn kép để tạo ra sợi đơn là cả một quá trìnhngược DNA sợi đơn được thực hiện bằng cách đun nóng duplex sẽ thay đổi khi nhiệt

độ giảm Khi nhiệt độ giảm xuống, năng lượng nhiệt đã được sử dụng để phá vỡ cácliên kết hydro giữa các sợi bị giảm theo, và va chạm ngẫu nhiên giữa các sợi sẽ giúpcác sợi gắn lại theo nguyên tắc bổ sung Nhiệt năng cung cấp giảm tương đối chậm (1-

20C / giây), sự tạo thành mạch kép sẽ hoàn tất Hai sợi đơn phân tử DNA bổ sung sẽđến với nhau và sửa đổi chính xác mạch kép (duplex) ban đầu trước khi mẫu được đunnóng Nếu nhiệt độ giảm xuống nhanh chóng, ví dụ như nhúng chìm một mẫu DNA tại

940C trực tiếp vào nước đá, sự điều chỉnh các cặp bases sẽ không xảy ra và các DNA

sẽ được giữ lại ở dạng một đơn tương đối

1.5 Cấu trúc của DNA trong các tế bào

Các loại axit nucleic được sử dụng để hình thành hệ gen của sinh vật phụ thuộcvào chính sinh vật đó Ví dụ, virus có bộ gen gồm hai sợi DNA kép, sợi DNA đơnhoặc RNA, tùy thuộc vào loại virus Nhiễm sắc thể của hầu hết các sinh vật nhânchuẩn bao gồm các sợi đôi DNA Các bộ gen của các sinh vật prokaryote thường baogồm một phân tử DNA vòng tròn Nghĩa là, thay vì phải có đầu 5’ tự do và đầu kếtthúc 3’, các đầu được nối với nhau để tạo thành một vòng liên tục của chuỗi xoắn képADN Một số nhiễm sắc thể bổ sung phân tử DNA, gọi là plasmid, được tìm thấy trongcác tế bào prokaryote Như chúng ta sẽ thấy trong chương 3, hiểu biết như thế nào về

sự phân chia các tế bào với những plasmids có vai trò hoạt động then chốt trong sinhhọc phân tử và kỹ thuật di truyền tiên tiến Phân tử DNA plasmid thường đóng vòngcủa sợi đơn hay sợi đôi DNA.Khi nhìn vào cấu trúc của DNA được trình bày tronghình 1.7, nó rất dễ nhằm lẫn là chuỗi xoắn kép, đúng hơn là một chất rắn thiếu linhhoạt hơn Tuy nhiên, không chỉ đơn giảm là vậy Hình ảnh dưới kính hiển vi điện tửcủa các phân tử DNA (hình 1.12) cho thấy DNA có dạng chuỗi nhiều hơn dạng que, vàbao xung quanh chính nó để tạo thành một loạt các cấu trúc bất thường Bên trong một

tế bào nhân chuẩn, DNA được liên kết với một loạt các protein Ví dụ, protein cầnthiết cho nhân bản của nó, sao chép nó vào RNA và bao bọc của nó trong tế bào Nhiềuprotein cuốn quanh DNA của chính nó, hoặc bằng cách nhốt hoặc bẻ cong phân tửDNA Đối với các phân tử DNA thẳng ngắn, loại hạn chế này không phải là một vấn đềnghiêm trọng Điểm stress được đặt trong một phần của một phân tử DNA, ví dụ, chuỗixoắn kép có thể được thuyên giảm bởi sự tháo xoắn một phần khác của DNA

Sản xuất protein trong y học

Hình 1.12 Hình ảnh của sợi DNA kép được tìm ra bởi kính hiển vi điện tử DNA vòng phân lập từ polyoma virus cho thấy nhiều crossings của sợi DNA đôi, chỉ ra rằng DNA là xoắn cực đại Sao chép từ Vinograd và cộng sự (1965)

Đầu kết thúc tự do của đoạn DNA dài cho phép quay tương đối tự do quanh sợiDNA Đối với các phân tử DNA dạng vòng Tuy những stress có thể rất khó để chứngminh Khi những đầu tận cùng của DNA không tự do, nó không thể lơi lỏng ra vàchống lại sự xoắn tại một nơi nào đó trong phân tử Kết quả của các phân tử DNAxoắn trong sự hình thành của DNA xoắn cực

đại (Hình 1,13)

Năm 1965 Jerome Vinograd và các đồng

nghiệp cho rằng các phân tử DNA vòng kín có

thể chấp nhận một hình thức xoắn tròn

'(Vinograd và cộng sự năm 1965.,) Như một

hình thức sẽ có kết quả nếu, trước khi tham gia

kết thúc của một sợi đôi DNA dài thành một

vòng tròn kép kín, một đầu được xoắn tương

đối khác để mở đầu cho một số khuynh hướng

trong phân tử Như cuộn xoắn DNA của chính

nó được gọi là supercoil Supercoil chỉ có thể

được hình thành hoặc phá vỡ từ một phân tử

DNA vòng tròn kín bằng cách phá vỡ ít nhất

một trong những khung xương phosphodiester

Hình 1.13 Sự hình thành của DNA xoắn

cực đại Một phân tử DNA vòng không chứa supercoil được hiển thị Hai nửa của phân

tử này đã được đánh dấu màu đỏ và màu xanh để giúp dễ phân biệt Một lần xoắn trong phân tử sẽ dẫn đến việc hình thành một cực dương (+) và supercoils cực âm(-) Quá trình này không dẫn đến một thay đổi số lượng kết nối Tuy nhiên, khung xương DNA bị

phá vỡ và sau đó được đóng kín lại sau khi một đoạn của DNA đã bị rạn nứt, sau đó là

số liên kết được giảm thành 2 Phân tử bây giờ là không còn xoắn cực đại.

Mức xoắn cực đại trong một phân tử DNA đặc trưng có thể được mô tả bởi sốlượng kết nối của nó (Lc) Con số này tương ứng với số vòng đôi xoắn trong phân tửtuyến tính ban đầu Quá trình đưa sự xoắn cực đại vào một phân tử DNA làm giảmhoặc tăng số vòng xoắn ốc bị mắc kẹt khi vòng tròn được hình thành, và kết quả trongnhững thay đổi trong các số liên kết với các loài có vòng khép kín cuối cùng Sự khácbiệt liên kết (Lc) chỉ thị của các mức độ của cấu trúc xoắn cực đại trong một phân tửcần quan tâm (Hình 1,13) Các độc giả quan tâm cần tham khảo các tài liệu phổ biếncho một mô tả đầy đủ hơn của DNA cấu trúc liên kết và các vấn đề liên kết của nó(Bates và Maxwell, 1993)

Vòng DNA khép kín được phân lập từ tế bào prokaryote thì không có cấu trúcxoắn cực đại Nghĩa là, DNA tương đối không được tốt so với trạng thái tuyến tính của

nó Mặc dù tế bào Eukaryotic có chứa các phân tử DNA tuyến tính, độ dài của DNAtrong nhiễm sắc thể có nghĩa là những điểm hạn chế trong một phần của phân tử DNAkhông thể dễ dàng làm giảm bằng cách chuyển sự căng thẳng đến một trong nhữngđoạn kết thúc Tương tự thích hợp ở đây là để suy nghĩ về cách bạn sẽ mở gu t một

ô ng nươ c vườn xoắn Bạn sẽ tháo xoắn bằng cách chuyển xoắn đến hết đường ống.Cuối cùng, sự quay của ống chính nó sẽ dẫn đến việc giải phóng cho nút thắt này Đây

là loại hành động để tháo một xoắn hoặc xoắn trong một phân tử DNA tuyến tính sẽtương đối đơn giản nếu DNA bị ngắn Chiều dài phân tử DNA nhiễm sắc thể, tuynhiên, gặp một số khó khăn mà làm cho loại hình này tách ra hạn chế không thực tế.Chiều dài của DNA có liên quan sẽ làm cho nó khó khăn để di chuyển xoắn từ giữaDNA để kết thúc, và sự kết hợp của các DNA với các protein sẽ tạo nên một rào cảnđối với loại hình chuyển động này Trở lại với ô ng nươ c, một cách khác để loại bỏcác nút thắt (mặc dù ít thực tế hơn trong vườn) các đường ống sẽ được cắt để tạo ra kếtthúc mới gần các đoạn của đoạn xoắn Các đường ống sau đó có thể là không xoắn tạiđịa vị trí và chuẩn bị mẫu để loại bỏ các xoắn và cải cách các đường ống Đó là trongthời trang còn đối với việc giải quyết các tế bào với các chủng trong DNA Họ có cácenzym, được gọi là topoisomerases DNA, làm cho các vết cắt trong các phân tử DNAđơn hoặc sợi đôi phá vỡ khung phosphodiester để cho phép các vị trí và sự tháo xoắncủa chuỗi DNA Các enzyme topoisomerase sau đó đánh dấu khung xương DNA đểcải cách các phân tử DNA

1.6 Thể nhân eukaryote

Mỗi tế bào trong cơ thể chúng ta chứa một lượng lớn DNA Những nhiễm sắc thểkhác nhau của bộ gen người chứa khoảng 3.2 x 109 cặp base của DNA Vì chúng ta lànhững sinh vật lưỡng bội, có hai bộ nhiễm sắc thể, tổng số lượng DNA lớn nhất trongtoàn bộ tế bào của chúng ta là 6.4 x 109 cặp base Tại 0.33 nm cặp base (hình 1.7),tương ứng với toàn bộ chiều dài ở trên khoảng 2.1 m Kết hợp của các protein bênngoài quấn quanh DNA tạo nhân Trong kỳ giảm phân, các vật liệu di truyền (cùng vớicác protein liên kết) tương đối duỗi thẳng và phân tán khắp trong nhân giống như

Sản xuất protein trong y học

nhiễm sắc thể Khi bắt đầu nguyên phân, nhiễm sắc thể co lại rất nhiều, trong kỳ trước

có thể nhận biết nhiễm sắc thể Độ dài của chúng co lại khoảng 10 000 lần

Các vật chất di truyền khi phân lập từ vi khuẩn và vurus bao gồm sợi DNA vàRNA hầu như không có protein Tuy nhiên, ở sinh vật nhân chuẩn, số lượng đáng kểcủa protein kết hợp với DNA để hình thành hình dáng chất nhiễm sắc thể Quan sátbằng kính hiển vi điện tử ta thấy rằng cấu trúc sợi nhiễm sắc thể được kết hợp cácmảng tuyến tính của các hạt hình cầu Các hạt này xuất hiện thường xuyên dọc theotrục của một nhiễm sắc thể và giống các hạt trên chuỗi Các hạt, ban đầu gọi là v –bodies (olins và olins, 1974), ngày nay gọi là thể nhân

Digestion của sợi nhiễm sắc thể với những nuclease cố định, chẳng hạn như phân

tử nuclease, số lượng các đoạn DNA dài khoảng chừng 200 bp, hoặc nhiều hơn nữa(Wingert và Von Hoppel, 1968) Nếu digestion của DNA nhiễm sắc thể là ngẫu nhiên,sau đó các các đoạn có kích thước khác nhau được tạo ra Do đó điều này đã chứngminh rằng DNA của nhiễm sắc thể được che chở (bảo vệ) từ sự phân cắt của cácenzyme Từ DNA chúng sẽ bắt đầu và cắt bởi nulease, và tại hai hay nhiều vị trí đượcnối lại với nhau Các protein kết hợp với ADN trong nhiễm sắc thể được chia thành cơbản, histon tích điện dương và ít tích điện dương khi không histones Protein kết hợpvới DNA, việc sử dụng histone có vai trò cấu trúc quan trọng nhất Histone chứa mộtlượng lớn điện tích dương axit amin lysine và arginine (xem phụ lục1), làm cho nó cóthể liên kết thông qua tương tác tĩnh điện với nhóm phosphate tích điện âm của cácnucleotide DNA Có năm loại protein histone khác nhau: H1, H2A, H2B, H3 và H4.Một hạt nhân bao gồm hai bản sao của mỗi histone H2A, H2B, H3 và H4 để tạo thànhmột octamer xung quanh histone khoảng 150 cặp base của DNA được bao bọc trongmột chuỗi xoắn kép trái, hình thành khoảng 1,7 vòng xoắn trong nhân (hình 1.14) Gầnđây, để hiểu biết về cấu trúc của các thể nhân, vào năm 1997 Richmond và các đồngnghiệp đã có thể làm sáng tỏ được cấu trúc tinh thể tia X của phức hợp DNA thể nhân

ở cấp độ phân tử Tại cấp độ phân tử này, hầu hết các nguyên tử của mỗi histone đều

có thể nhìn thấy, và các chiều chuỗi xoắn DNA rõ ràng vì nó bao quanh các octamerhistone có thể được nhìn thấy (hình 1.15) Cấu trúc ở cấp độ cao phân tử cho biết rằngamino kết thúc cuối cùng của một số các histon nhô ra từ octamer các và project đi từnhân Ý nghĩa của các amino cuối cùng ở doạn cuối thì có khả năng tương tác với cácthể nhân bên cạnh tạo contacts (sự tương tác, mối quan hệ) Chúng sẽ cạnh tranhsignficance các histone cuối cùng ở xa hơn nữa khi look của biểu hiện gen

Mở rộng nghiên cứu về cấu trúc của nhân đã cung cấp cơ sở để dự đoán sự hìnhthành các sợi chất nhiễm sắc trong nhân tế bào, và chúng cuộn thành các nhiễm sắc thểmitotic Mô hình này được minh họa trong hình 1.16 Có 2 nm chuỗi DNA xoắn képcuộn ban đầu thành một lõi trong nhân khoảng đường kính 10 nm Khoảng 200 cặpbase của mỗi DNA liên kết hạt nhân để hình thành "hạt trên dây” có thể nhìn thấy hìnhảnh trong kính hiển vi Histone H1, nó không phải là một phần của lõi octamer, có thểđược nằm ở vị trí mà DNA hình thành và rời khỏi nhân và có thể chức năng để xácdịnh các DNA trên thể nhân

Hình 1.14 DNA bao xung quanh lõi nhân thể nhân gồm hai phân tử của histone H4, H3, H2A và H2B Trong các hình đại diện ở đây chỉ là một monomer của H2A và H2B có thể quan sát được, các monome khác được đặt ở mặt sau của octamer này Gần 150 bp của DNA quấn quanh lõi octamer, tạo thành khoảng hai lần.

Hình 1.15 Cấu trúc của phức hợp DNA-nhân được làm sáng tỏ bằng cách crystallography X-quang ở cấp độ phân tử Trong cả hai hình trên, các sợi của DNA (thể hiện trong màu xanh lá cây và màu da cam) bọc quanh octamer histone Các lõi protein là hầu như chỉ nằm bên trong, ngoại trừ phần đuôi histone amino cuối cùng được mở rộng ra từ cái phức tạp Điều này được cung cấp bởi Tim Richmond (ETH Zurich) và được tái bản với sự cho phép từ thiên nhiên (Luger và cộng sự, 1997) bản quyền (1997) Các nhà xuất bản Macmillan Ltd.

Sự hình thành của nhân đại diện cho mức độ bao quanh, như vậy chiều dài DNAđược giảm xuống còn khoảng một phần ba chiều dài ban đầu Tuy nhiên, trong hạt nhân,chất nhiễm sắc không tồn tại trong hình thức duỗi thẳng Thay vào đó, trong sợi nhiễm

Sản xuất protein trong y học

sắc 10 nm đã dược xoắn cuộn từ một sợi dài 30 nm, sợi nhiễm sắc thề ban đầu đó đượcgọi là solenoid Không hiểu rỏ các quá trình chuyển đổi giữa sợi 10 nm và cac1 sợi 30

nm biểu hiện cho đặc tính sinh lý hoặc cho dù điều đó chỉ xảy ra trong ống nghiệm xemnhư là kết quả của sự thay đổi nồng độ muối Tuy nhiên, các sợi 30 nm, gồm nhiều nhânđược kết hợp (đóng gói) chặt chẽ với nhau, nhưng các định hướng chính xác và chi tiếtcủa cấu trúc không rõ ràng Gần đây, người ta có thể chấp nhận rằng trong một sợi 30

nm compact xoắn zig-zag mẫu với khoảng bốn nhân cho mỗi 10 nm (Beard và Schlick,

2001) Sự hình thành các sợi 30 nm tạo ra một cấp độ thứ hai của việc đóng gói, khi đóchiều dài tổng thể của DNA được giảm một nửa so với ban đầu

Hình 1.16 Packaging của DNA trong nhiễm sắc thể nhân chuẩn Các chuỗi xoắn kép DNA 2 nm được gói thành nucleosome như minh họa trong hình 1.15 Tại một số điểm histone H1 ở trong phức tạp, có thể ở DNA / điểm xuất từ nhân Các thể nhân có thể hình thành sợi dài 10 nm trong nhân Các thể nhân có thể tiếp tục kết hợp để tạo thành một sợi nm 30 tạo ra đường zig-zag trong nhân Các sợi 30 nm sau đó được bọc tạo một proteins caffold, chúng có thể gấp cuộn để hình thành các nhiễm sắc thể trong phân bào, được quan sát dưới kính hiển vi điện tử.

1.7 Sự sao chép DNA

Vào năm 1953, Watson và Crick đã hoàn thành bài viết nổi tiếng của mình về cơchế sao vật chất di truyền Từ việc sắp xếp và tính chất của các base mà mỗi mạch củacác chuỗi xoắn kép ADN có thể làm một khuôn để tổng hợp của một mạch bổ sung

nột mạch gốc ban đầu theo nguyên tắc bổ sung sẽ có các nucleotide giống với cácnucleotide của mạch còn còn lại (Watson và Crick, 1953b) Như vậy, mỗi mạch DNAgốc có thể làm một khuôn để tổng hợp một mạch DNA mới, vì thế có thể dẫn đến việchình thành hai mạch đôi DNA giống như nhau Trong mô hình này, DNA mới đượctổng hợp bao gồm một mạch gốc ban đầu và một sợi mới được tổng hợp theo nguyêntắc bổ sung, do đó, quá trình được gọi là sao chép semi-conservative.

Hình 1.17 Các bản sao của mạch đôi DNA theo đề nghị của Watson và Crick Việc tách mạch DNA gốc xoắn kép (màu đen), mỗi sợi có thể làm một khuôn mẫu cho

sự tổng hợp hình thành một chuỗi ADN mới (màu xanh) Điều này được gọi là sao chép semi-conservative, phân tử DNA mới gồm một chuỗi cũ và một sợi mới.

Hai phương thức khác của bản sao này cũng dựa vào các sợi gốc ban đầu conhiệm vụ làm mẫu cho sự tổng hợp DNA mới Trong nhân bản conservative, nhữngđường xoắn ốc của mạch gốc ban đầu sẽ được tháo xoắn, một chuỗi xoắn mới tổnghợp sẽ được hình thành theo nguyên tắc bắt cặp bổ sung Hai mạch DNA mới tổng hợp

sẽ kết hợp với nhau sẽ tạo thành một đường xoắn ốc và xoắn của mạch gốc sẽ đượcsửa đổi Trong cơ chế khác, gọi là nhân bản dispersive, mạch DNA gốc từ một sợi cóthể được tách ra và kết hợp một trong các mới sợi tổng hợp, tạo ra những mạch hỗnhợp giữa ADN mới và cũ

Matthew Meselson và Franklin Stahl đã cung cấp bằng chứng thực nghiệm chorằng nhân bản semi-conservative đã được sử dụng bởi vi khuẩn từ việc sản xuất cácphân tử DNA mới (Meselson và Stahl, 1958) Các kết quả thí nghiệm của tác giả được

mô tả trong hình 1,18 Ông đã đã tăng trưởng các tế bào E coli cho nhiều thế hệ trongmột môi trường, trong đó các nguồn nitơ duy nhất dẫn xuất của amoni clorua(15NH4Cl) Điều này có nghĩa rằng DNA của những tế bào E coli, ở 15N được kết

Sản xuất protein trong y học

hợp với thành phần của base, nặng hơn so với ADN từ các tế bào phát triển về bìnhthường amoni clorua (14NH4Cl) Các dạng bình thường và nặng của DNA có thể đượctách sau khi ly tâm, bằng gradient nồng độ của caesium chloride Trong điều kiện đó,các DNA nặng hơn sẽ đi xa hơn các ADN nhẹ hơn Điều này giúp theo dõi các cấp độcủa mỗi nitơ đồng vị trong việc nha6 bản DNA của vi khuẩn như nó đã được sao chép.Meselson và Stahl đã đưa vi khuẩn có chứa DNA nặng và chuyển chúng thành phươngpháp di truyền có chứa amoni clorua vào ADN bình thường và sau đó cô lập mỗi thế

hệ kế tiếp Sau một vòng duy nhất của quá trình sao chép DNA trên phương pháp ditruyền bình thường, hiện nay ông tìm thấy rằng DNA của vi khuẩn có mật độ trunggian giữa các vị trí dự kiến chứa toàn bộ15N và 14N DNA Kết quả này phù hợp vớinhân bản semi-conservative, nhưng không phải với nhân bản conservative Sau khi tếbào phên chia, Meselson và Stahl đã quan sát sự hiện diện của hai mạch của các mật

độ ban đầu khác nhau tương ứng với vị trí của một loài 14N/15N DNA và lần thứ hai,các bằng cường độ ánh sáng, tương ứng với vị trí dự kiến của 14N/14N DNA Chu kỳtiếp theo của quá trình nhân đôi DNA dẫn đến một tỷ lệ tăng các14N/13N mạch DNA

Các thí nghiệm mô tả ở trên cho thấy rằng nhân bản conservative không xảy ra,nhưng không thể loại trừ nhân rộng dispersive Tuy nhiên, Meselson và Stahl, bác bỏ

cơ chế sao chép này trong việc tách các mạch riêng lẻ của DNA sao chép Họ đunnóng DNA (hình 1.11) và được cho thấy rằng có sợi riêng lẽ hoặc cường độ 15N hoặc

14N chứa DNA sợi đơn, nhưng không phải là của một cường độ trung bình mà có thể

đã được kết hợp nếu một sợi DNA mới tổng hợp có chứa các mạch hỗn hợp của mạchgốc và mạch vừa được tổng hợp trình tự Sao chép semi-conservative có cũng đượcbiểu hiện ở sinh vật nhân chuẩn (Taylor, Woods và Hughes, 1957), và bây giờ đượccoi như là cơ chế chung cho nhân đôi DNA

1.8 DNA Polymerase

Cả ở tế bào vi khuẩn và tế bào eukaryotic đều có nhiều enzyme DNA Polymerase

E coli chứa 3 loại enzyme này ( bảng 1.2 ) DNA polymerase I chủ yếu tham gia vào

quá trình sửa chữa DNA hơn là tham gia tái bản DNA polymerase II củng tham giavào sửa chữa DNA, trong khi đó DNA polymerase III chủ yếu tham gia vào quátrình tái bản (Kornberg and Baker, 1992) DNA polymerase III là một enzyme đa cấu

tử có chức năng như là chất nhị trùng (dimer) của nhiều tiểu đôn vị Nhiều enzymeDNA polymerase đã được nghiên cứu ở các cấp cấu trúc, trong đó kết hợp với phântích sinh hóa đã dẫn đến sự giải thích cơ chế hoạt động của chúng Enzyme DNApolymerase có 3 hoạt động riêng biệt

Tất cả các enzyme DNA polymerase tổng hợp trực tiếp đoạn DNA theo hướng 5’-3’.Nhiều DNA polymerase có hoạt động exonuclease từ đầu 3’- 5’ Điều này chophép cắt bỏ các nucleotide ở đầu 3’ của sợi mới tổng hợp Hoạt động này được xem làhoạt động đọc sửa (proof-reading activity ) mà có thể để cắt bỏ các nucleotide sai hỏngtrước khi nó thay thế các base đúng

 Một số DNA polymerase củng hoat động exonuclease theo hướng 5’- 3’ Điềunày cho phép enzyme loại bỏ các trình tự đã được tổng hợp và tham gia đến việc nốicác đoạn DNA được tổng hợp dựa trên sợi muộn trong thời gian tái bản DNA

DNA polymerase không có khả năng tự bắt đầu tổng hợp Chúng cần một yêucầu tuyệt đối là có đầu 3’ tự do mà enzyme có thể nối thêm các nucleotide mới Điềunày có nghĩa rằng cần phải có hai mồi để khởi đầu sự sao chép DNA theo mỗi hướng

từ điểm gốc, mỗi mồi sẽ bổ xung cho một sợi DNA được sao chép Như đã nêu ở trên,

sự tổng hợp DNA chỉ diển ra theo hướng 5’- 3’, các nucleotide mới sẽ được nối vàođầu 3’của chuỗi polynucleotide Điều này dẫn đến một vấn đề, cả hai sợi gốc đều phảiđược tái bản nhưng chỉ có một sợi được định hướng 5’ – 3’từ điểm gốc của sự saochép Sợi này được gọi là sợi sớm, nó được sao chép một cách liên tục Sự tái bản ởsợi muộn không thể xảy ra theo hướng 3’ – 5’ Sợi muộn được tái bản một cách khôngliên tục ( hình 1.19) Sự tổng hợp các doạn ngắn không liên tục theo hướng 5’ – 3’(Okazaki 1968) mà sau đó được nối lại với nhau thành một sợi hoàn chỉnh

Sản xuất protein trong y học

Còn có một loại enzyme mà chúng ta sẽ được tìm hiểu trong chương sau là DNApolymerase phụ thuộc RNA gọi là enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase).Enzyme được tìm thấy ở một số virus gọi là retrovirus có vật chất di truyền là RNA thay

vì DNA Sau khi nhiễm vào tế bào chủ các RNA này được dùng làm khuôn cho sự tổnghợp phân tử DNA bổ xung (cDNA) Các DNA sau đó được đưa vào hệ gen vật chủ , nếuDNA được biểu hiện thì bộ gen virus được tạo ra Việc sử dụng enzyme phiên mã ngượctrong ống nghiệm để sản xuất DNA từ RNA được thảo luận trong chương 5

1.9 Quá trình tái bản

Làm thế nào để bắt đầu và kết thúc sự sao chép DNA? Như chúng ta đã biết cácDNA trong tế bào là rất quan trọng và cần phải được kiểm soát chặt chẽ sự tái bản DNA

là điều hiển nhiên Quá trình tái bản gồm 3 giai đoạn : khởi đầu, kéo dài và kết thúc

Hinh 1.19: Tái bản DNA bởi DNA polymerase III Sợi DNA gốc (đen) được tháo xoắn bởi helicase tại chạc ba tái bản Sợi sớm và sợi muộn sau đó được tổng hợp bởi DNA polymerase III Tái bản DNA trên sợi chính xảy ra theo hướng 5 ’ – 3 ’ bằng cách kéo dài mồi RNA đơn Trên sợi muộn đòi hỏi cần phải có nhiều mồi để tổng hợp các đoạn ngắn (đoạn okazaki), sau đó các đoạn được nối lại bởi DNA ligase

Giai đoạn khởi đầu: Việc khởi đầu tái bản DNA không xảy ra ở các vị trí ngẫunhiên trong bộ gen mà được bắt đầu tại một điểm cụ thể gọi là điểm gốc tái bản Khi

sự tổng hợp DNA được bắt đầu, hai chạc ba tái bản đươc tách dài theo hai hướng từđiểm gốc tái bản, điều này cho phép tái bản toàn bộ genome Ở vi khuẩn chẳng hạn E

coli Chỉ có một điểm gốc tái bản (gọi là Ori C) Nhưng ở tế bào eukaryote thì lại có

nhiều điểm gốc tái bản ví dụ ở nấm men Saccharomyces cerevisiae có khoản 300 điểmgốc tái bản, ở tế bào người có khoản 20000 điểm trong bộ gen Ori C là một đoạnDNA có 245 bp , đoạn DNA này chứa các vị trí liên kết với một số protein ( cụ thể làDnaA, B and C) Các liên kết của protein này thúc đẩy sự nóng chảy của chuổi DNAxoắn, một quá trình cần thiếc để enzyme đọc trình tự base Sự nhân đôi ở prokaryotes vàeukaryotes có thể đáp ứng cùng một chức năng tổng thể nhưng điểm gốc tái bản của tếbào prokaryotes sẽ không thay thế cho eukaryotes và ngược lại Khi xoắn được tháo ra

thì DNA polymerase có thể tiến đến và tổng hợp sợi DNA bổ xung Tuy nhiênpolymerase chỉ hoạt động khi đầu 3’ có nhóm OH tự do Nhóm OH được cung cấp bởimột mồi RNA (liên kết bổ xung với sợi DNA gốc) có chiều dài khoản 5 – 15 nucleotide.

Sự tổng hợp mồi được thực hiện bởi RNA polymerase (còn gọi là primase) mà khôngcần đầu 3’tự do để bắt đầu tổng hợp Sự tái bản DNA sau đó được thực hiện đồng thờitrên cả hai sợi Các protein khác cũng cần thiết để quá trình tái bản được xảy ra Các sợiđơn DNA không bắt cặp trở lại là nhờ sự kéo căng của các protein (SSBs) khi chúngliên kết với sợi đơn DNA và khi đó DNA tháo ra tạo thành phức hợp với polymerasevới sự giúp đỡ của enzyme helicase (hình 1.19) Ngoài ra, enzyme topoisomerase cầnthiết để làm giảm độ căng trong cấu trúc xoắn để đi đến quá trình tháo xoắn

 Giai đoạn kéo dài: DNA polymerase III chỉ có thể sao chép theo hướng 5’– 3’,vậy làm thế nào để cả hai sợi đều được sao chép đồng thời? Cơ chế về sự tổng hợp cácsợi DNA sớm và muộn đươc biểu diển ở hình 1.19 Trong mô hình này DNApolymerase III có khả năng sao chép một cách liên tục trên sợi sớm Ở sợi muộn để sựsao chép DNA xảy ra theo hướng 5’ – 3’ thì quá trình sao chép xảy ra theo từng đoạnngắn (gọi là đoạn Okazaki) tạo nên các vòng lặp Sau khi tổng hợp 1000 – 2000 cặpbase, các monomer của enzyme sẽ gặp đoạn Okazaki được bổ xung, lúc này enzyme sẽtách ra khỏi sợi muộn Một vòng lặp mới sau đó được hình thành và quá trình được lặplại như vậy Sự hoạt động exonuclease theo hướng 5’ – 3’ có thể hổ trợ để tạo thànhcác đoạn okazaki hoàn chỉnh Sau đó enzyme ligase sẽ tham gia hình thành các liên kếtphosphodiester nối các đoạn okazaki hoàn thành quá trình tổng hợp ở sợi muộn.Chúng ta sẽ thảo luận cơ chế hoạt động của DNA ligase và cách sử dụng nó trong kĩthuật di truyền ở chương 2

 Giai đoạn kết thúc: Cũng quan trọng như việc bắt đầu tổng hợp, sự kết thúc

phải được kết thúc chính xác Đối với vi khuẩn chẳng hạn như E coli.chúng chứa bộ

gen vòng, nếu sự khởi đầu tái bản xảy ra tại một điểm duy nhất thì sau đó sự kết thứcxảy ra tại một điểm nằm dối diện với điểm khởi đầu Sự kết thúc không phải là mộtquá trình thụ động mà xảy ra ở các trình tự DNA xác định ( gọi là trình tụ kết thúc ) ở

đó có sự hoạt động liên kết với các protein gọi là Tus Tus liên kết với trình tự kết thúcbất đối xứng cho phép chạc ba tái bản đi theo một hướng để vượt qua nhưng khốiDNA được tái bản theo hướng ngược lại (Kamada và cộng sự, 1996) Giai đoạn kếtthúc ở eukaryotes chưa được biết rõ

Sản xuất protein trong y học

Hình 1.20 Chu kì tế bào eukaryotes Sau khi phân chia xong, tế bào phát triển trong phase G1 Sự tổng hợp DNA sau đó xảy ra (S) trước khi bước qua phase G2 Cuối cùng, nhiễm sắc thể nhân đôi và tách ra riêng biệt sau đó xảy ra phân chia tế bào Các giai đoạn của chu kì được điều khiển bởi proteins – cyclins và cyclin- dependent kinases (CDKs) Đây gọi là các trạm kiểm soát.

Trong tế bào eukaryotes sự tái bản phải được phối hợp với chu kì tế bào để khiphân chia tế bào có sẳn hai bản sao của bộ gen Chu kì tế bào trải qua 4 giai đoạn dựatrên quan sát sự phân chia tế bào dưới kính hiển vi ( hình 1.20 ) Những quan sát nàycho thấy tế bào phân chia thông qua các chu kì lặp đi lặp lại của pha giữa khi sự phânchia nhân và tế bào xảy ra, ở kì trung gian có một vài thay đổi có thể phát hiện đượcdưới kính hiển vi Sự tái bản DNA xảy ra trong kì gian phân Bốn giai đoạn của chu kì

tế bào là:

M-phase (mitosis): thời kì nhân và tế bào phân chia.

 G1-phase (gap 1): pha tăng trưởng, sự phiên mã, dịch mã và các hoạt động

chung của tế bào xảy ra

S-phase (synthesis): xảy ra sự tổng hợp DNA và tái bản bộ gen.

G2-phase (Gap 2): Giai đoạn tăng trưởng chuẩn bị cho sự phân chia tế bào.

Tế bào người trong môi trường nuôi cấy mất khoảng 20h để hoàn thành chu kì tếbào , trong đó, phase G1 cần hơn 9h, phase S mất khoản 8h và G2 kéo dài khoảng 2h.Thời gian thực tế để phân chia tế bào (phase M) chỉ mất khoảng 45 phút Rõ ràng,phase S và phase M là hai phase rất quan trọng nó điều phối quá trình tái bản bộ gentrước khi sự phân chia tế bào xảy ra Các giai đoạn trước khi vào phase S và phase M

có vai trò là các trạm kiểm soát chu kì tế bào Proteins, cyclins và cyclin-dependentkinases (CDKs) hoạt động kiểm soát trong mỗi giai đoạn của chu kì tế bào Cyclins làmột họ protein mà chúng liên kết và kích hoạt một số thành viên trong họ CDK.Cyclin có nồng độ thay đổi đột ngột trong chu kì tế bào làm tạo ra các dao động trong

sự hoạt động của CDK hình thành cơ sở cho sự kiểm soát chu kì tế bào Các trạm kiểmsoát khác cung tồn tại chủ yếu trong phase S, ví dụ DNA bị sai được sữa chữa trướckhi sự tái bản hoàn thành Lee Hartwell, Paul Nurse và Tim Hunt được trao tặng giảiNobel sinh lý y học cho những khám phá về sự kiểm soát chu kì tế bào

1.10 Tái tổ hợp

DNA thì không bao giờ được xem như là một phân tử tĩnh Nó thay đổi liên tục

và một cơ chế được tạo bởi sự thay đổi này được mang lại là tái tổ hợp (recombination)

Sự tái tổ hợp là sự sắp xếp lại trên quy mô lớn các phân tử DNA Kiểu sắp xếp lại nàyxảy ra như là một hệ quả của việc chia sẻ hai phân tử DNA hay những khu vực rộnglớn của chuỗi tương đồng (Sự tái tổ hợp tương đồng) hoặc những khu vực rất ngắn cótính tương đồng (Sự tái tổ hợp vùng đặc trưng) Các tế bào lưỡng bội có nhiều cơ hội

để tìm những phần tương đồng khi xuất hiện sự tái tổ hợp Sự tái tổ hợp ở vi khuẩn thìđược giải thích đầu tiên bởi Alfed Hershev và Max Delbruck năm 1947 Họ nghiêncứu sự xâm nhiễm của E.coli với những thể thực khuẩn Nếu một tế bào E.coli đượcxâm nhiễm cùng lúc với hai thể thực khuẩn T2 khác nhau về mặt di truyền, kết quả làquần thể thể thực khuẩn kể cả kiểu thể thực khuẩn tái tổ hợp cũng như các kiểu thểthực khuẩn gốc ban đầu (Hershey, 1947)

Sự tái tổ hợp tương đồng xảy ra giữa hai phân tử DNA có trình tự chuỗi tươngđồng về bản chất Thông tin bộ về gen thì được trao đổi và hòa hợp giữa hai bản DNAsao cho những phân tử DNA được tái tổ hợp là một hỗn hợp của những DNA ban đầu.Một vài cơ chế đã được đề xuất để giải thích cơ sở phân tử của những vấn đề này.Nguyên tắc để hiểu được quy trình phân tử phức tạp trong sự tái tổ hợp nêu ra vào năm

1964 bởi Robin Holliday (Holliday, 1964) Mẫu tái tổ hợp của ông đòi hỏi phải có mộtđiểm cắt (phân cắt tại liên kết phosphodiester giữa hai nucleotide) xuất hiện tại cùngmột vùng trong hai phân tử DNA tương đồng (được gọi là DNA cho và nhận) Tươngtác trao đổi trên sợi DNA sau đó xảy ra, tiếp theo đó DNA ligase sẽ hàn gắn lại nhữngchỗ đó Sự trao đổi trên sợi DNA cho và nhận dẫn đầu để tạo ra sự hình thành của mộtHolliday junction- một cấu trúc mà trong đó những chuỗi DNA lai kết hợp với phân tửDNA cho và nhận Holliday junction có thể trải qua sự di động trong phân chia, dẫnđầu để tái tổ hợp nhiều hơn giữa hai sợi từ hai phân tử DNA khác nhau Cuối cùng,chức năng xoắn cuộn cung cấp nhiều phân tử DNA tái tổ hợp Ở đó, mặc dù, chúng tôitập trung vào cơ chế biến đổi được đề xuất bởi Meselson và Radding (1975) kể từ khi

sự kiện tái tổ hợp được công bố là có thể tạo ra một vết cắt đơn lẻ trên sợi DNA hay nóđúng hơn là những mẫu sớm hơn, dựa vào hai vết cắt DNA đã tái tổ hợp trước đó cóthể xảy ra Một mẫu đơn giản chỉ ra ở hình 1.21(a) Cùng với sự hình thành Holliday

junction và sự xoắn cuộn của nó, với một vài protein E coli biết được tiến trình xoắn

cuộn, được chỉ ra bên dưới

Vết cắt được tạo bởi RecBCD endonuclease, chất mà sẽ tách sợi của chuỗiDNA được gọi là chi ( ) ở vị trí (5’-GCTGGTGG-3’).

Sự xâm nhập vào chuỗi được xúc tác bởi RecA protein, dọc theo sợi đơn DNAliên kết với protein (SSB), là chất sẽ làm duỗi thẳng sợi DNA

‘D-loop’ là được tạo thành sau khi sợi bị cắt một lần nữa bởi RecBCDendonuclease

Xuất hiện và kết thúc sự thay đổi trên sợi và được nối lại sử dụng DNA ligase.Hình thức này được gọi là Holliday junction

Sản xuất protein trong y học

Hình thức của Holliday junction tiếp theo là sự vận chuyển nhánh được xúc tácbởi protein RuvA và RuvB

Sự chuyển hóa của Holliday junction đòi hỏi phải có RuvC protein, chứa hai vếtcắt trên sợi DNA DNA ligase sau đó nối các sợi sau khi nó đã bị cắt

Hình 1.21 Tái tổ hợp tương đồng và tại những vị trí riêng biệt (a) Mẫu Meselson-Radding của tái tổ hợp tương đồng (b) Sự hòa hợp của  DNA bên trong

hệ gen E.coli Xem nội dung để hiểu rõ hơn.

Tại thời điểm cuối của tiến trình, tế bào sẽ có hai phân tử là DNA được biến đổi.Tiến trình tương tự được chỉ ra ở trên cũng diễn ra ở Eukaryotes, sử dụng loài enzyme

đã được hoạt hóa tương tự Gần đây cấu trúc chuyển hóa cấp cao của Holliday junctionđược giữ ổn định bởi RuvA protein đã được giải quyết (Hargreaves và cộng sự, 1998).Không giống như tái tổ hợp tương đồng, tái tổ hợp trên vị trí riêng biệt xảy ra khi cómột DNA đặc biệt, nó không phải là tất cả các điểm tương đồng của DNA khác, có

một chuỗi hoạt động có mục đích khi xảy ra sự tái tổ hợp DNA khác Ở Prokaryotes,khi các nhóm DNA cuả bacterriophagae bên trong NST của E coli, nơi mà nó sẽ tồn

tại trạng thái phóng thích vi khuẩn Chúng tôi sẽ chỉ ra chu kỳ sống của  rõ hơn ở

chương 3 Sự tái tổ hợp xảy ra giữa các vị trí ở DNA bacteriophage (attP) có sự tươngđồng chuỗi với các vị trí trong DNA vi khuẩn (attB), thậm chí ở cả hai phân tử DNAkhác nhau hoàn toàn trong tất cả các chuỗi khác Sự tái tổ hợp này được chỉ ra ở hình1.21(b) Enzyme xúc tác cho những quá trình này được gọi là enzyme integrase (Int),cùng với protein chủ yếu tố chủ đính vào (integration host factor- IHF) Khi DNA của

thể thực khuẩn được cắt bỏ từ hệ gen của E.coli để bắt đầu cho sự hình thành một

lượng thể thực khuẩn mới, một protein của thể thực khuẩn được gọi là Xis Tái tổ hợptrên vị trí riêng biệt vẫn đòi hỏi cặp baze của vùng tương đồng (vị trí attP với attB),không bao gồm bất kỳ protein nào của chuỗi phản ứng hóa sinh tái tổ hợp tương đồng

1.11 Gen và genome

Thông tin di truyền bao gồm trình tự trên chuỗi DNA chỉ ra sản phẩm protein vàenzyme xây dựng nên tế bào Acid nucleic được sắp xếp thành các đơn vị được gọi làgen, tổng hợp tất cả các gen là genome Hầu hết tất cả các gen thì được sử dụng như làkhuôn để sản xất các loại protein Protein bổ sung trong một loại tế bào riêng biệt thìđặc biệt một nang lông sẽ sản xuất keratin và một tế bào tuyến tụy sẽ sản xuấtinsulin nhưng hàm lượng protein của tế bào cũng có thể thay đổi một cách đáng kể,như tính sẵn có của các chất dinh dưỡng Điều này có nghĩa là những loại tế bào riêngbiệt, những gen riêng biệt sẽ được thể hiện và một số khác sẽ không và tế bào phải cókhả năng hoạt hóa những gen riêng biệt này để đáp ứng lại những tín hiệu từ bênngoài Và những gen này sẽ làm tăng các tín hiệu đó Làm thế nào để tế bào có khảnăng nhận biết được những gì bên trong hệ gen của nó, cái nào là gen cái nào không,làm thế nào tế bào có khả năng mở những gen riêng biệt trong khi tại cùng một thờiđiểm đó nó không có tác động đến sự thể hiện của gen khác

1.12 Gennome

Gen là gì? Nhưng chưa có câu trả lời nào thỏa đáng nhất Gen được coi là mộtđơn vị di truyền bao gồm các acid nucleotic Trong di truyền học cổ điển, một genđược mô tả như một phần rời rạc của nhiễm sắc thể xác định một đặc tính đặc biệt Ởđây chúng tôi sẽ mô tả khung đọc mở (ORF – khu vực của gen sẽ được phiên mã vàdịch mã thành protein) cùng với các yếu tố kiểm soát phiên mã (promoter andterminator) Vì vậy, một gen không chỉ là trình tự mã hóa chính nó mà nó còn chứacác thông tin cần thiết cho sự biểu hiện của các trình tự mã hóa đó Hầu hết các ORFsđều có một dạng chung ( Hình 1.22) Chúng đều bắt đầu với một bộ ba riêng biệt củaDNA (ATG) và kết thúc dựa vào tín hiệu dừng, một lần nữa một bộ ba căn cứ vàoDNA (TGA, TTA, TAG) Các trình tự ở giữa sẽ trực tiếp mã hóa cho các protein (sinhvật nhân sơ) hoặc được chia thành một loạt các exon và intron (sinh vật nhân chuẩn).Chúng ta sẽ thảo luận về exon và intron sau, nhưng với sự ra đời của bộ gen đầy đủtrình tự (Chương 9), một gen được định nghĩa như là một chuỗi DNA có ít nhất 100codon ở giữa, có mã mở đầu và mã kết thúc Với các trình tự đơn, tuy nhiên là không

Sản xuất protein trong y học

đủ để sản xuất trực tiếp protein Mỗi gen đòi hỏi các trình tự DNA khác nhau liên kếtvới nhau tạo thành các protein như RNA polymerase, các yếu tố điều hòa phiên mã vàdịch mã Khi kết hợp, các thành phần mã hóa gen, các promoter và terminator củamẫu gen chức năng, đôi khi được gọi là đơn vị phiên mã

Làm thế nào để nhiều gen có mặt trong một bộ gen, làm thế nào để có nhiều gencần thiết cho tế bào và nó được thể hiện cùng một lúc trong cơ thể Sự ra đời của một

bộ gen hoàn chỉnh (Chương 9) đã giải quyết được một phần câu hỏi trên

Hình 1.22 Các hình dạng đặc thù của gen prokaryotes và eukaryotes mã hóa protein.

Ở prokaryotes tập hợp các gen cần thiết, ví dụ tạo ra các enzyme cần thiết trongquá trình phiên mã Operon gồm các liên kết RNA polymerase (promoter) và các yếu

tố kích thích quá trình phiên mã như cAMP gắn vào kích hoạt protein (CAP) Khi gắnlên protein được kích hoạt quá trình phiên mã diễn ra nhanh hơn Ngoài ra, các operoncòn chứa các liên kết với với các protein bị ức chế, khi liên kết với DNA, đểpolymerase liên kết và dừng quá trình phiên mã Quá trình phiên mã dừng lại với mãkết thúc tại đầu 3’ của operon Hình dưới đây là trình tự của vùng kiểm soát của lacoperon Ở sinh vật eukaryotes, gen được sản xuất đơn lẻ và theo quy định riêng Chúngchứa các chất hoạt hóa và các chất ức chế ở đầu 5’ Nó cũng chứa vài nghìn base ởđầu gen để biểu hiện gen đầy đủ Kích hoạt lắp ráp phức hợp polymerase RNAholoenzyme II tại hộp TATA và quá trình phiên mã bắt đầu một khoảng ngắn về phiađầu 3’ Một lần nữa kết thúc quá trình phiên mã xảy ra tại điểm vào cuối gen tại đầu3’ Có sự khác biệt lớn giữa sinh vật prokaryotes và sinh vật eukaryotes là sự hiện diệncủa đoạn intron và extron Ở eukaryotes, các đoạn intron bị cắt bỏ, nối các đoạn exonlại với nhau trước khi đi vào quá trình dịch mã Các trình tự DNA của vùng khởi độngcủa gen β-globin chuột cũng được biểu diễn

 Làm thế nào nhiều gen có thể chứa trong cùng một bộ gen? Các bộ gen của vikhuẩn E.coli ( dài 4.6 Mb) có khoảng 4.200 gen Độ dài trung bình của một gen trongE.coli là khoảng 950 bp, sự tách biệt trung bình của các gen là 118 bp, do đó phần lớn

mã hóa cho RNA hoặc protein Các Saccharomyces cerevisiae, một eukaryote đơn

bào, có kích thước bộ gen lớn hơn (13.5 Mb) và có khoảng 6000 gen Con người, bộgen lớn gấp 250 lần bộ gen của nấm men (3300 Mb), nhưng có khoảng 30000 gen –đại diện cho sự gia tăng gấp 5 lần

Làm thế nào để có nhiều gen cần thiết trong cơ thể? Để xác định một gen cầnthiết cho cơ thể thì chức năng của gen đó phải suy yếu một mức độ nào đó Điều nàythường đạt được bằng sự loại thải gen, nơi mà gen được lấy ra từ hệ gen và các biểuhiện của nó trên tế bào xác định tính khả thi Phân tích như thế này cho thấy rằngkhoảng một nữa bộ gen của vi khuẩn E.coli và nấm men cần thiết cho khả năng tồn tại.Nhiều gen dường như không cần thiết Tỷ lệ phần trăm của các gen có thể phản ảnhsuy biến chức năng giữa các bộ nhất định của gen

Làm thế nào nhiều gen được biểu hiện cùng một lúc? Các gen được thể hiệntrong một tế bào đặc biệt Một số gen biểu hiện trong tế bào gan phải khác với nhữnggen biểu hiện trong tế bào da Phân tích toàn bộ bộ gen của tất cả các gen trong sinh vật

có đầy đủ trình tự như nấm men cho thấy rằng khoảng 90% gen được biểu hiện cùngmột lúc, nhưng 80% trong số này được thể hiện với mức độ phong phú thấp theo thứ tự

là 0.1 – 2 Mức độ biểu hiện của các gen cũng sẽ rất khác nhau Rất nhiều protein đượcsản xuất từ các gen có mức biểu hiện cao, trong khi các protein khác biểu hiện ở mức độthấp hơn nhiều thường được sản xuất từ gen được thể hiện ở mức độ thấp

Sản phẩm trung gian giữa DNA và protein là RNA Quá trình chuyển đổi chuỗiDNA thành các protein xảy ra qua hai giai đoạn DNA được phiên mã ra RNA sau đóđược dịch mã ra các chuỗi polypeptide của protein Như chúng ta đã nhìn thấy (Hình1.5) RNA khác với DNA ở chỗ nó có chứa một đường ribose thay vì một đườngdeoxyribose Ngoài ra, Uracil thay thế cho Thymine như là base bổ sung cho Adeninetrong RNA Phiên mã cũng tương tự như quá trình tự sao mã DNA chỉ khác là mộttrong hai sợi DNA được sao chép Có hai loại RNA được tạo ra từ sự phiên mã, RNAthông tin (mRNA) và RNA cấu trúc (ribosome RNA (rRNA) và RNA vận chuyển(tRNA)) Mặc dù cho đến nay, hình thức phong phú nhất của RNA trong hầu hết các tếbào đại diện cho một vài phần trăm trong tổng số RNA là mang thông tin di truyền

Sản xuất protein trong y học

Quá trình phiên mã bắt đầu từ trình tự DNA đặc trưng được goi là mã mở đầu.Giống như nhân đôi DNA, phiên mã xảy ra trong ba giai đoạn : bắt đầu, kéo dài, kếtthúc Bắt đầu phiên mã thường xảy ra ở đầu 3/cuả mã mở đầu, chấm dứt dựa vào trình

tự kết thúc Thoạt nhìn, các cấu trúc tổng thể của gene prokaryotic and geneeukaryotic tương tự nhau Tuy nhiên, vùng kiểm soát các gen nhân chuẩn sẽ khônghoạt động trong tế bào prokaryote và ngược lại

Hầu hết các gen mã hóa protein ở sinh vật nhân sơ hoạt động phiên mã mộtcách tự động Khi vắng mặt các yếu tố khác, RNA polymerase có thể nhận ra vùng

mở đầu, liên kết với nó và tạo ra RNA Các RNA polymerase của sinh vật nhân điểnhình khi tham gia vào việc mã hóa protein (pol II) không nhận biết được các trình tựcủa vùng mở đầu của riêng mình Vì vậy, ở các gen sinh vật nhân chuẩn quá trìnhphiên mã không diễn ra trong trường hợp không có các yếu tố khác Ở Prokaryotes vàEukaryotes phiên mã là một quá trình có quy định Đúng thời gian và mức độ biểuhiện gen cần thiết cho hầu hết các qúa trình của tế bào

1.13.1 Quá trình phiên mã ở Prokaryotes

Francois Jacob and Jacques Monod là những người đầu tiên đã xây dựng một môhình gene điều hòa trong tế bào vi khuẩn Họ thực hiện trên hệ thống trao đổi chấtlactoza trong vi khuẩn đường ruột (E.coli) Lactoza là một disaccharit của galactoza

và glucoza Khi vi khuẩn sống trong môi trường chứa đường lactose nó biểu thị nhữnggen cấu trúc sau: β-galactosidase: enzyme xúc tác sự phân giải lactose thành glucose

và galactose Nó được mã hóa bởi gene lac Z Lactose permease: enzyme khoangmàng tế bào và mang lactose vào tế bào Nó được mã hóa do gen lac Y

Thiogalactoside transacetylase: các chức năng của enzyme này không được biết

rõ Nó được mã hóa do gen lac A Ba enzyme nằm liền kề nhau trong hệ gen của vikhuẩn E.coli (Hình 1.23) và một vùng của DNA có trách nhiệm phiên mã quy địnhnằm ở đầu 5/ của gen cấu trúc Nó được gọi là operon lac Để chuyển hóa đườnglactose, các gen cấu trúc phải được biểu hiện và protein phải được tạo ra Nguồnđường để cung cấp cho E.coli là đường glucose, vì nó không cần phải chuyển đổi khivào cơ thể Vì vậy, nếu cả glucose và lactose có sẵn, vi khuẩn sẽ ngừng quá trìnhchuyển hóa đường lactose thành glucose.Các operon lac gồm các thành phần sau:

 Operator (lacO) – vùng vận hành, protein ức chế có thể liên kết làm ngăn cản

sự phiên mã

 Promoter (lacP) – vùng khởi động, nơi mà RNA polymerase bám vào và khởi

đầu phiên mã

Repressor (lacI) gene – vùng ức chế protein.

Pi vùng mở đầu của lac I

CAP liên kết cAMP/CAP

Trong trường hợp không có lactose, RNA polymerase liên kết với vùng khởiđộng, nhưng nó ngăn cản sự phiên mã của các gen cấu trúc bởi các protein ức chếliên kết với vùng vận hành (Lee and Goldfarb, 1991) Do đó, không có RNA được tạo

ra, không tạo ra protein Các chất ức chế được sinh ra từ lac I do RNA polymerase liên

cảm ứng Một số phân tử lactose liên kết với protein ức chế làm biến đổi cấu hìnhkhông gian ba chiều của nó làm cho protein ức chế không liên kết được với vùng vậnhành Khi đó RNA polymerase có thể lên kết với vùng khởi động và RNA có thể đượctạo ra từ 3 gen cấu trúc Lactose có thể được chuyển hóa.

Một câu hỏi đặt ra ở đây là cách chuyển hóa lactose được quay về như ban đầu.Như đã nêu ở trên, các gen cấu trúc dịch mã tạo ra các enzyme phân giải đường khi môitrường có lactose, khi không có đường lactose quá trình phiên mã bị dừng lại Vì vậy, có

vẻ như không thể đạt được kích hoạt, kể cả kích hoạt là cần thiết để phân giải đườnglactose trong cơ thể Tuy nhiên đây là một quá trình đơn giản Mỗi gen cấu trúc đượcphiên mã ở mức độ thấp, trung bình (khoảng 5 bản sao mỗi tế bào) trong trường hợpkhông có lactose Có nghĩa là vi khuẩn khi gặp một nguồn lactose nó có thể vận chuyểnmột vài phân tử vào trong tế bào gây cảm ứng tác động lên gen cấu trúc Sau khi gâycảm ứng lên các gen cấu trúc khoảng 5000 bản sao của protein có mặt trong tế bào

Hình 1.23:Việc kích hoạt của operon lac trong E.coli Trong trường hợp không

có lactose, các protein ức chế liên kết với vùng vận hành (O) và ngăn không cho RNA polymerase liên kết với vùng khởi động để tiến hành phiên mã Khi môi trường có lactose, một số phân tử lactose liên kết với protein ức chế làm biến đổi cấu hình không gian ba chiều của nó làm cho protein ức chế không thể liên được với vùng vận hành Bây giờ, ARN polymerase có thể liên kết được với vùng khởi động để tiến hành phiên

mã từ 3 gen cấu trúc (lacZ, lacA and lacY) Việc kích hoạt các gen lac chỉ xảy ra khi không có glucose catabolite activator protein (CAP) liên kết với vùng vận hành và để cho RNA polymerase liên kết với vùng khởi động.

Quá trình kiểm soát vùng vận hành phức tạp hơn vì nó cần dừng lại nếu cóglucose, không cần biết lactose trong môi trường có hay không Khi glucose trong cơthể cao, sản xuất theo chu kỳ AMP (cAMP) bị ức chế, khi nồng độ đường giảm, mộtchất liên lạc là AMP vòng được sản xuất cAMP gắn vào và hoạt hóa CAP (cataboliteactivator protein), sau đó gắn lên DNA tại vùng vận hành Điều này kích hoạt cho sựphiên mã của các gen cấu trúc diễn ra nhanh hơn bằng cách tăng ái lực cho các RNA

Sản xuất protein trong y học

polymrase gắn vào vùng khởi động để tiến hành phiên mã Hiện tượng này gọi làcatabolite repression, khi đường ức chế sự phiên mã của operon lac bằng cách khôngcho kích hoạt đầy đủ Giống như operons ở prokaryotes, ba gen cấu trúc được phiên

mã như là một mRNA Mỗi ORFs chứa ribosome của riêng nó trong mRNA được mãhóa độc lập với các gen khác

Chúng ta xem quá trình phiên mã diễn ra như thế nào, và quá trình phiên mã kếtthúc như thế nào? Một RNA polymerase bắt đầu quá trình phiên mã, di chuyển dọctheo DNA, tổng hợp RNA, cho đến khi nó kết thúc Ở đây, các polymerase dừng lạinối thêm nucleotide vào chuỗi RNA, tạo các sản phẩm hoàn chỉnh và tách ra khỏichuỗi DNA Kết thúc quá trình phiên mã dựa vào 2 yếu tố sau:

Rho-dependent termination: các protein rho liên kết với các chuỗi RNA mớiđược tổng hợp và nó xuất hiện để kết thúc quá trình phiên mã khi polymerase dừng ởcác trình tự DNA nhất định

Rho-independent termination: kết thúc độc lập Hình thức kết thúc độc lập nàykhông phụ thuộc các yếu tố khác và là hình thức phổ biến nhất kết thúc quá trình phiên

mã trong E.coli

1.13.2 Quá trình phiên mã ở Eukaryotes

Quá trình kích hoạt biểu hiện gen ở sinh vật nhân chuẩn (eukaryotes) phức tạphơn nhiều so với sinh vật nhân sơ (prokaryotes) Có sự khác biệt nhiều giữa các sinhvật eukaryotes và sinh vật prokaryotes là các va chạm khi kích hoạt gen và quá trìnhtạo ra RNA

Sinh vật eukaryotes có nhiều enzyme RNA polymerase

Việc đóng gói DNA vào thể nhân đại diện cho một rào cản đối với sự phiên mã

Việc tách biệt của nhân (nơi xảy ra phiên mã) và tế bào chất (nơi diễn ra dịchmã) ở eukaryotes có nghĩa là phải có cơ chế để bảo vệ mRNA khỏi suy thoái trong tếbào chất trước khi hoàn thành quá trình dịch mã

Gen ở sinh vật eukaryotes là monocistronic, mỗi gen được phiên mã theo từngđoạn riêng bắt đầu với phần khởi động riêng của nó

Gen ở sinh vật eukaryotes không liên tục và được chia thành các vùng mã hóa

liên kết protein- protein để RNA polymerase thông qua miền kích hoạt Một trongnhững chức năng này có thể được điều chỉnh biểu hiện gen để đáp ứng các tín hiệu cụthể.

RNA

Hình 1.24 Vai trò của những chất kích hoạt làm tăng khả năng biểu hiện ở gen

eukaryotes Các liên kết của các chất hoạt hóa protein thông qua miền liên kết trên DNA (DBD) có thể xảy ra ở một phần thể nhân hoặc trên DNA.

Một vấn đề bổ sung cho quá trình phiên mã của các gen ở sinh vật eukaryotes làphần lớn các DNA được đóng gói tại thể nhân, là rào cản để lắp ráp các phức hợpphiên mã Nhiều chất hoạt hóa có thể liên kết với các trình tự trên DNA Sau khi liênkết DNA, kích hoạt một hoặc nhiều hơn những phức hợp gen

Chromatin-modifying complexes: protein histone tạo thành lõi của thể nhân.Tuy nhiên, như đã thấy ở hình 1.15, các acid amin ở trình tự kết thúc của histone nhô

ra ngoài Những phần nhô ra đó có thể sửa đổi được, bởi các tiên tố, phosphoryl hóa và

Sản xuất protein trong y học

methyl hóa của các acid amin cụ thể (Figure 1.25(a)), và việc thay đổi đóng vai tròquan trọng trong quá trình phiên mã Mặc dù các đuôi đó không cần thiết để duy trì sựtoàn vẹn cấu trúc nucleosome, nó không có vai trò trong cấu trúc nhiễm sắc thể bậccao và trong các tương tác với các non-histone chromosomal proteins Sự acety hóacủa histone được thực hiện bởi các enzyme histone acetyltransferases (HATs) trongkhi các phản ứng ngược lại được xúc tác bởi enzymehistone deacetylases (H-DACs)

Sự acelty của lysine trong việc loại bỏ các điện tích dương từ protein (Hình 1.25 (b)).Những đuôi histone acelty hóa có thể tương tác với DNA lỏng lẻo hơn để các phứchistone – DNA linh động và có thể dễ dàng phân ly để quá trình phiên mã xảy ra

Hình 1.25 Sửa đổi các “đuôi” histone

Nhiễm sắc thể tái hợp: những phức hợp chẳng hạn như SWI/SNF proteins sửdụng năng lượng có nguồn gốc từ ATP để di chuyển thể nhân Cơ chế chính xác thìkhông rõ ràng, nhưng chúng có chức năng như ATP điều khiển chuyển động dọc theoDNA và phá vỡ liên kết protein- DNA khi di chuyển

Các tương tác giữa các chất hoạt hóa và protein mô tả ở trên dẫn đến một môhình để kích hoạt gen phải liên kết với DNA Các chất hoạt hóa làm thay đổi cấu trúcnhiễm sắc thể và sau đó tái hợp lại để loại bỏ thể nhân từ promoter, và cuối cùng Pol

II được đưa đen vùng khởi động để quá trình phiên mã có thể bắt đầu Cấu trúc thểnhân các điện tích dương (lysine và arginines) của histone được đặt liền kề với chuỗixoắn DNA âm tính

Hình 1.26 Cấu trúc của enzyme RNA polymerase II (a) Mô hình chung cho 10 tiểu đơn vị của RNA polymerase Các hình cầu lớn màu đỏ trong khe ở trung tâm của phân tử đại diện cho các ion magiê Một sơ đồ sắp xếp của tiểu đơn vị trong cấu trúc protein, được biểu hiện trong bảng (b) và protein vòng với

cả cấu trúc DNA xoắn lại (màu xanh dương

và xanh lá cây) và RNA (màu đỏ) trong hình (c).Những thông tin này được cung cấp từ Patrick Cramer (Đại học Munich) và được tái bản với sự cho phép bộ khoa học (Cramer và cộng sự, 2000; Gnatt và cộng sự, 2001.) Bản quyền thuộc Hiệp hội Khoa học Mỹ vì sự tiến

bộ khoa học.

Hình 1.27 Cấu trúc của một phân tử mRNA ở sinh vật nhân chuẩn Sau khi được

phiên mã, đầu 7 methyl-guanosine được gắn vào đầu 5’ của đoạn mRNA tại vị trí nhóm đường ribose đầu tiên, đôi khi là thứ 2, nucleotide được methyl hóa ở vị trí 2’ Đầu 3’ được polyadenin hóa do gắn thêm 100-200 adenin.

Thật vậy, bằng chứng gần đây cho thấy các enzyme và các chất tham gia vàophiên mã, RNA được phiên mã và dịch mã có thể rộng rãi cùng với sự biểu hiện hìnhthức tối đa hóa hiệu quả và đặc trưng của mỗi giai đoạn của biểu hiện gen (Maniatis vàReed, 2002)

1.14 Quá trình hình thành RNA

Có lẽ sự khác nhau rõ rệt nhất giữa bộ gene của sinh vật nhân nguyên thủy vàsinh vật nhân chuẩn đó là bộ gene của loài tiến hóa hơn được chia thành exon (vùng