Giáo trình Sản xuất protein trong Y học: Phần 2

Tiếp nối phần 1, phần 2 của giáo trình Sản xuất protein trong Y học trình bày về vectors; tạo dòng gen; xác định gen; tạo đột biến; sản xuất và tinh sạch protein; phân tích hậu genome. Giáo trình phục vụ cho các bạn chuyên ngành Y học và những bạn quan tâm tới lĩnh vực này.

 Việc lựa chọn các vecto dựa vào kích thước phân tử DNA được chèn vào nó.

 Các Vecto đã được khai thác cho nhiều mục đích khác nhau: sản xuất sợi đơnDNA, sự biểu hiện cấp độ cao của các gen mã hóa protein, và việc sản xuất RNA.Phần lớn các thí nghiệm nhân dòng vô tính phân tử sử dụng vi khuẩn E coli chonhân dòng DNA vô tính Thậm chí nơi được đưa các đoạn DNA vô tính vào là tế bàoeukaryote Các cấu trúc DNA hầu như luôn luôn được sản xuất trong E.coli trước rồisau đó mới đưa vào vật chủ cuối cùng Việc nhân dòng vô tính có thể khả thi vớinhững ưu điểm của E.coli nên nó được sử dụng rộng rãi trong kĩ thuật di truyền.E.coli, được đặt tên từ nhà vật lý học người Đức Theodor Escherich (1857–1911) là vikhuẩn gram âm, hình que di chuyển bằng cách quay nhanh lông roi Có nhiều trongmiệng và ruột người giúp bảo vệ vùng ruột khỏi các vi khuẩn truyền bệnh, giúp tiêuhóa và sản xuất một lượng nhỏ vitamin B12 và K Như là một sinh vật sử dụng trongphòng thí nghiệm, E.coli có những ưu điểm sau:

Dễ dàng tăng trưởng trong môi trường đơn giản, ít tốn kém

Là sinh vật có khả năng nhân đôi nhanh chóng khoảng 20-30 phút trong phase log

Bộ máy di truyền học của nó đã được hiểu rõ

Sử dụng E.coli trong phòng thí nghiệm thường an toàn và ngăn chặn đột biến làcho chúng không thoát ra được môi trường phòng thí nghiệm

Có một bộ gen đã được xắp sếp và lập chuỗi

Các bản sao nhiễm sắc thể phụ của DNA (các Plasmid và thể thực khuẩn DNA) cóthể được lợi dụng để mang các DNA ngoại lai.

Các tế bào E.coli hầu hết là sinh sản vô tính nhưng để tăng tính đa dạng và tăngtính truyền đạt thông tin gen, chúng có các cơ cấu để chuyển các vật chất di truyền từmột vi khuẩn đến loài khác Trở lại giữa thập niên 1940 các tế bào vi khuẩn được cho

là có khả năng trao đổi vật chất di truyền với loài bán giới tính Thí nghiệm củaLederberg and Tatum đã mô tả rõ ràng sự vận chuyển thông tin di truyền thông qua sựtiếp hợp vi khuẩn Khả năng để thực hiện được sự vận chuyển này là từ một bộ genđược gọi là F Những gen này tồn tại trong mảnh vòng của DNA mà được sao chép lạimột cách độc lập từ nhiễm sắc thể vi khuẩn, hoặc chúng có thể được hợp nhất vàotrong nhiễm sắc thể Vi khuẩn mang những gen này ( thường là những vi khuẩn đực)dùng tua để bám vào một vi khuẩn gần nó, 2 tế bào được kéo lại gần nhau, và DNAđược chuyển từ vi khuẩn này đến vi khuẩn kia Có 3 biểu hiển của nhân tố di truyền:

.F hay Fepisome là phân tử sợi đôi DNA tròn, lớn mà chỉ mang những gen ditruyền, được giữ trong vi khuẩn như là một sợi nhiễm sắc thể phụ plasmid

.Hfr: thành tố F đã được hợp nhất vào trong bộ gen E.coli Khi sự tiếp hợp xảy ra,các gen F di chuyển qua tua kéo theo phần còn lại của gen sau chúng Cuối cùng tua bịđứt, vì thế bộ gen không được chuyển hoàn toàn Bộ gen vi khuẩn có thể được đotrong nhiều phút từ khi bắt đầu chuyển với một lược thời gian cần cho từng gen riêngbiệt để được chuyển từ vi khuẩn này đến vi khuẩn kia cho biết được bao lâu kể từ khibắt đầu sao chép

.F’ : đây là phân tử sợi đôi DNA mang các gen di truyền và một số loại gen khác.Những gen này được vận chuyển với hiệu suất rất cao bởi vì độ dài của sợi DNA đượcchuyển khá ngắn đủ để nó có thể di chuyển dọc theo khúc nối giữa 2 tế bào vi khuẩntrước khi tua bị đứt

Khả năng của F’ episome để tái tổ hợp và được giữ như là một thực thể tách biệt vớicác nhiễm sắc thể vi khuẩn làm nó lý tưởng để mang các trình tự DNA ngoại lai Tuynhiên kích thước của F’episome là ngăn cản sự phân tích và thao tác trên nó và thuộctính gen chuyển của nó có thể làm cho không ổn định

Về tổng quan các DNA ngoại lai cần được mang trong vecto để bảo đảm sự truyền

và tái tổ hợp trong tế bào vật chủ Vecto được mô tả tốt nhất như là các trình tự DNA

tự tái tổ hợp mà có thể được dùng để mang các DNA ngoại lai Các vecto có nền tảngdựa trên các chuỗi DNA được tìm thấy có thể được tái tổ hợp dưới những hình thứckhác nhau Hầu hết các vecto được sử dụng dựa vào cả plasmid và thực khuẩn λ Tổngquan, các vecto được xem như các môdun riêng biệt mà cung cấp các điều kiện cơ bảnthiết yếu cho việc nhân dòng vô tính phân tử hiệu suất cao Các vecto được sử dụngtrong tái tổ hợp DNA thường được quy cho là các vecto dòng vô tính, trong khi nếu nóđược sử dụng cho biểu hiện gen được mang trong DNA dòng vô tính, nó được gọi làvecto biểu hiện

Các vecto phải mang một trong các đặc điểm sau đây để làm cho nó trở nên hữudụng trong nhân dòng vô tính phân tử:

3.1 PLASMID

Plasmid thường được tìm thấy trong các đoạn DNA thuộc nhiễm sắc thể phụ mà thế

hệ fromone được thừa hưởng ổn định từ một vùng nhiễm sắc thể phụ khác Plasmidđược phân tán rộng rãi trong prokaryote khoảng 1500bp đến hơn 300kbp Hầu hếtplasmid hiện diện như là các phân tử sợi đôi DNA vòng kín và thường có một kiểuhình riêng biệt trên tế bào vi khuẩn, nơi mà chúng được sao chép lại Đó là vì plasmidthường mang gen mã hóa để chống lại các tác nhân kháng sinh và kim loại nặng, hoặc

để sản xuất nguồn DNA hạn chế và các enzyme sửa chữa, những thứ mà vi khuẩn khibình thường thì không có được Sự sao chép plasmid thường được ghép đôi với tế bàochủ nơi mà chúng được giữ lại, cùng với sự sao chép plasmid là sự sao chép lại bộ gencủa tế bào vật chủ Plasmid thường được mô tả như dư dả (relaxed) hoặc khan hiếm(stringent) là dựa vào lượng bản sao của plasmid được giữ trong tế bào, plasmid dư tứcnhiều bản sao được giữ lại trong một tế bào(10-200), trong khi plasmid khan hiếm khichỉ hiện diện 1 hoặc 2 bản sao trong một tế bào.Nền tảng của sự khác nhau này là do

cơ cấu khác nhau được thực hiện bởi plasmid để tự nhân đôi Nói chung,plasmid dưthừa sử dụng vật chủ có nguồn gốc từ protein, trong khi plasmid khan hiếm mã hóa cácnhân tố protein cần thiết cho sự nhân đôi của chúng

Hầu hết các plasmid được sử dụng ngày nay dựa trên nguồn gốc sự tự nhân đôiđược tìm thấy trong plasmid E.coli ColE1 hoặc họ hàng gần của nó là pMB1 ColE1

là phân tử DNA vòng đóng dài 6646bp mã hóa cho tác nhân kháng sinh của vi khuẩn,

colicin E1 và các gen đề kháng mà giúp vi khuẩn vật chủ thoát khỏi ảnh hưởng của tácnhân kháng sinh Colicin E1 là protein vận chuyển trên màng gây nên sự khử cực gâychết màng của vi khuẩn (Konisky và Tokuda, 1979) Gen kháng thuốc mã hóa choprotein ngăn cản hoạt động của Colicin bằng cách kiềm chế khả năng hình thành kênhxuyên màng vi khuẩn (Zhang và Cramer, 1993) Vi khuẩn có chứa pladmid ColE1 cóthể khác biệt so với những vi khuẩn không chứa plasmid này bởi chúng có khả năngphát triển trong một dĩa có chứa colicin E1 Tuy nhiên việc bảo vệ cho quá trình pháttriển này là khá khó khăn và đã lâu kể từ khi các kĩ thuật bảo vệ thuốc kháng sinhkhông còn được sử dụng nữa.

Plasmid ColE1 được sao chép theo kiểu độc lập sử dụng DNA polymerase đượccung cấp từ tế bào vật chủ Không giống như nguồn gốc sao chép thuộc vi khuẩn, sựsao sao chép của ColE1 chỉ diễn ra theo một chiều Plasmid không mã hóa cho proteinkhởi sướng quá trình sao chép nhưng lại mã hóa cho các phân tử RNA không dịch mã,các RNA này có liên quan đến sự khởi sướng quá trình sao chép cũng như một proteinđóng vai trò điều hòa các phân tử RNA Nguồn nhân đôi DNA của ColE1 là một vùngcủa DNA mà 2 phân tử RNA (RNAI và RNA II) được phiên mã từ nguồn khởi xướngcủa chúng (hình 3.2) RNA II được bổ sung vào gốc sao chép ColE1 và gắn vào nóhình thành nên dạng lai DNA-RNA (Cesarenivà cộng sự, 1991) Phân tử gắn RNA IIđược tách ra từ gốc, bởi enzyme mã hóa vật chủ RNase H và đáp ứng như một đoạnmồi nơi mà sự sao chép DNA xảy ra Trong quá trình bắt cặp base, RNAII chỉ có thểgắn lên 1 sợi DNA, và kể từ đây sự sao chép DNA là đơn hướng

Hình 3.2: Plasmid ColE1 và gốc sao chép Plasmid ColE1 là một sợi đôi DNA vòng

kín, dài 6646bp Nó mã hóa cho tác nhân kháng sinh trong vi khuẩn colicin E1 và protein miễn dịch giúp ngăn các ảnh hưởng từ chất độc trong các tác nhân kháng khuẩn có trong plasmid Sự sao chép DNA chỉ xảy ra theo 1 hướng như được chỉ ra từ mũi tên ori Hai phân tử RNA chưa phiên mã, gọi là RNAI và RNAII, và sản phẩm protein của gen rop điều khiển quá trình sao chép Mũi tên trên các gen cho thấy chiều hướng phiên mã.

Điều khiển quá trình sao chép được thực hiện bởi một phân tử RNA chưa phiên

mã khác RNAI được bổ xung vào gốc 5’ của RNAII và dạng RNA kép giữa RNAI vàRNAII không thể thực hiện như là một đoạn mồi cho sao chép RNAI có tồn tại tươngđối ngắn, do đó plasmid ColE1 được giữ ở mức 15-20 bản sao trong một tế bào Sựtương tác giữa RNAI và RNAII được giữ ổn định bởi protein ROP(Helmer-Citterichvàcộng sự, 1988)

Cơ cấu sao chép DNA thực hiện bởi ColE1 có một số vai trò quan trọng, 2plasmid với cùng một gốc sao chép không thể cùng tồn tại trong một tế bào RNAI củagốc plasmid ngăn cản RNAII của plasmid đi vào để khỏi hình thành đoạn mồi, đâykhông gọi là sao chép Điều này quan trọng trong các thí nghiệm nhân dòng vô tínhkhi mà một tập hợp các plasmid được hòa trộn, điều mà tạo ra các phản ứng thắt nút,được chuyển vào trong vi khuẩn Các cá thể chuyển theo phương pháp chỉ mang mộtplasmid đơn mà không phải là một tập hợp Các Plasmid với các gốc sao chép khácnhau không thể cùng tồn tại trong một tế bào MỘt hệ quả của cơ cấu sao chép ColE1

là sự tổng hợp DNA mới không cần khởi sướng sự sao chép DNA Sự hiện diện cácyếu tố kháng sinh mà ngăn cản sự tổng hợp protein, sự sao chép DNA nhiễm sắc thể bịngừng lại nhưng với plasmid nền tảng ColE1 vẫn tiếp tục được sao chép và tích lũyvới nồng độ cao (1000–2000 bản sao một tế bào) (Clewell, 1972)

 Gốc sao chép : pBR322 mang gốc sao chép ColE1 và gen rop để bảo đảm mộtlượng bản sao plasmid hợp lý ( 15-20 một tế bào) có thể tăng lên 200 vòng nhờ sựkhuyếch đại chloramphenicol

Gen kháng kháng sinh: pBR322 mang 2 gen mà có thể được sử dụng như là các tínhiệu chọn lọc Gen kháng ampicilin được nhân dòng vô tính vào trong plasmid nhờ

gen nhảy Tn3 Gen kháng tetracyline được nhân dòng vô tính từ plasmid pSC101(Bernardi và Bernardi, 1984).

Vùng nhân dòng vô tính: plasmid mang các vùng nhận diện enzyme giới hạn.mộtvài trong số này có trong cac gen kháng kháng sinh Ví dụ như vùng cho PstI, PvuI vàSacI được tìm thấy trong gen kháng ampicilin hoặc vùng cho amHI và HindIII tronggen kháng tetracylin

Các gen kháng kháng sinh trong pBR322 cho phép chọn lọc trực tiếp các chất tái tổhợp trong một chu trình được gọi là bất hoạt vùng gắn (insertional inactivation) Ví dụ,nếu chúng ta muốn nhân dòng vô tính một đoạn DNA vào trong vùng BamHI củapBR322, sau đó DNA gắn sẽ làm ngắt quãng vai trò của gen KHÁNG chống tetracilin,nhưng vai trò của gen chống ampicilin vẫn không bị thay đổi Các tế bào đã biến đổiđược nuôi trên một đĩa thí nghiệm mang ampicilin để diệt hết tất cả các tế không mangplasmid Sau đó được cho phát triển tiếp trên mội trường có cả ampicilin và tetracilin.Những tế bào có thể phát triển khi có ampicilin nhưng lại chết dưới sự chọn lọc củatetracilin sẽ mang plasmid có DNA gắn vào Nói cách khác, sự thêm vào các đoạnDNA ngoại lai vào các gen kháng kháng sinh làm bất hoạt gen và dẫn tới tính nhạycảm với yếu tố kháng sinh

Hình 3.4 Sự lồng vào yếu tố gây bất hoạt của gen kháng kháng sinh trong pBR322.

Nếu đoạn DNA được lồng vào vùng nhận diện enzyme giới hạn BamHI bên trong gen tetracyline, gây ra bởi plasmid tái tổ hợp khi được chuyển vào trong vi khuẩn sẽ vẫn

đem lại sự sống trên môi trường chứa ampiciline nhưng sẽ không thể xúc tiến được sự phát triển trong môi trường chứa tetracilin Gen kháng Tetracilin sẽ bất hoạt về mặt chức năng khi có mặt DNA gắn.

3.1.2 pUC plasmid

PBR322 là một đột phá trong lĩnh vực sinh học phân tử như là một plasmid lần đầutiên được sử dụng trong nhân dòng vô tính phân tử nhưng tiêu tốn thời gian và dể gặplỗi Vào 1982 một chuỗi plasmid được phát triển cho phép nhận diện tế bào mangDNA ngoại lai trong bước sàng lọc đơn là plasmid pUC (Vieira và Messing, 1982) Nó

có 3 đặc tính quan trong khi so với pBR322

 Lượng bản sao lớn – đột biến trong gốc sao chép sản xuất ra 500-600 bản sao củaplasmid trong một tế bào mà không cần dùng tác nhân khuyếch đại chloroamphenicol

 Sàng lọc xanh- trắng – Sàng lọc theo kiểu này là một dạng đặc biệt của hoạt hóavùng gắn

 Nhiều vùng nhân dòng vô tính Đây là một loại DNA nhân tạo mà chứa trình tựcủa nhiều vùng nhận diện enzyme giới hạn Nó được gắn vào một phần của vecto mãhóa β-galactosidase α-peptide theo chiều hướng để không ảnh hưởng đến chức năng vàbiểu hiện của nó Tuy nhiên việc gắn DNA ngoại lai vào hầu như luôn luôn làm phá vỡhoạt động của α-peptide Do đó các cụm tái tổ hợp vẫn còn màu trắng trong khi cụmkhông tái tổ hợp lại chuyển xanh

Hình 3.5- pUC plasmid

Ưu điểm của pUC plasmid so với pBR322 là đoạn DNA ngoại lai có thể được nhândòng vào nhiều vùng nhận diện enzyme giới hạn khác nhau và các chất tái tổ hợpnhanh chóng được sàng lọc Thêm vào đó gốc α-bổ trợ chỉ cần một gen nhỏ để mangtrên plasmid DNA mã hóa α-peptide trong chuỗi pUC trong các vecto thì nhỏ hơn400bp Nếu như toàn bộ khung đọc mở LacZ được cần đến, trên 3500bp sẽ được giữlại trong những vecto này Nói chung, sự ổn định của nhiều vecto plasmid giảm trong

khi chiều dài của chúng tăng Kết quả trong giới hạn chiều dài DNA là có thể đượcnhân dòng vô tính vào trong một plasmid riêng biệt Ví dụ, khả năng tế bào vi khuẩnvẫn còn plasmid pUC tái tổ hợp giảm mạnh khi kích thước của chúng đạt đến 15kbp.

3.2 Lựa chọn chỉ thị (Dấu chuẩn chọn lọc)

Một đặc điểm cơ bản của các plasmid là chúng tạo điều kiện cho vector được

dễ dàng phát hiện Các plasmid như vậy được sử dụng thường xuyên như các vectortrong thí nghiệm tạo dòng Nhiều loại plasmid được tìm thấy trong tự nhiên trong các

vi khuẩn và trong một số nấm men Việc lựa chọn đánh dấu thường phụ thuộc vào các

tế bào vật chủ được chuyển Một số dấu hiệu chỉ có chức năng với các sinh vật nhân

sơ, trong khi những một số khác có một tác động rộng hơn Một số dấu hiệu thườngđược sử dụng lựa chọn được liệt kê dưới đây, cùng với cơ chế hoạt động của chúng

 Ampicillin – gắn vào và ức chế một số enzym trong màng tế bào vi khuẩn có

liên quan đến sự tổng hợp của các thành tế bào Gram âm Do đó, tế bào không nhânbản trong trường hợp có sự hiện diện của ampicillin Các gene kháng ampicillin(AMPR hoặc bla) mã hóa cho các enzyme β-lactamase được tổng vào khe quanh tế

bào chất của vi khuẩn, nơi mà nó xúc tác thủy phân của vòng β-lactam củaampicillin Do đó, các sản phẩm của gen AMPR làm mất hiệu lực chất kháng sinh.Theo thời gian ampicillin trong môi trường nuôi cấy trên đĩa petri có thể bị mất hiệulực khá rõ bởi β-lactamase Khi điều này xảy ra, sức ép chọn lọc để duy trì cácplasmid sẽ không còn nữa và quần thể tế bào có thể phát sinh mà không có plasmid

 Tetracycline – kết hợp với một protein tiểu đơn vị 30S của ribosom để ức chế

sự di chuyển ribosome dọc theo mRNA và do đó cản trở quá trình dịch mã tổng hợpprotein Các gen kháng tetracycline (TETR) được mã hóa bởi 399 amino acid ở bênngoài màng liên quan đến protein của tế bào Gram âm và ngăn chặn các kháng sinhxâm nhập vào tế bào Như vậy, gene kháng thuốc không làm mất hiệu lực của khángsinh Sức ép chọn lọc sẽ được duy trì trong suốt quá trình nuôi cấy tế bào để giữ chocác plasmid có chứa gene kháng thuốc

 Chloramphenicol – kết hợp với các tiểu đơn vị 50S ribosome để ức chế sự tổng

hợp protein Các chloroamphenicol acetyltransferase (CAT) được mã hóa bởi genkháng chloramphenicol (CMR) Các protein CAT là bốn (tetrameric) bào thể protein,trong sự hiện diện của acetyl coenzyme A, xúc tác hình thành các chất dẫn xuấthydroxyl acetoxy của chloramphenicol nó không thể liên kết với các ribosome Nhưvới ampicillin, các sản phẩm gen CMRlàm mất hiệu lực của chất kháng sinh

 Kanamycin và neomycin – kết hợp với các thành phần ribosome và hạn chế tổng

hợp protein Các protein được tổng hợp bởi mã hóa gene KANRđược tổng hợp ở khequanh tế bào chất và cản trở việc vận chuyển các chất kháng sinh vào trong tế bào.Giống như các gene kháng tetracycline, gene KANRkhông làm mất hiệu lực các chấtkháng sinh

 Bleomycin và zeocin – các kháng sinh glycopeptide liên kết với DNA và ức chế

DNA và sự tổng hợp RNA Chúng tác động chống lại hầu hết các vi khuẩn (bao gồm

cả E Coli), vi sinh vật có nhân điển hình (ví dụ như nấm men), các tế bào thực vật và

tế bào động vật Các gene Sh ble từ vi khuẩn Streptoalloteichus hindustanus mã hóa

một protein nhỏ có đề kháng đối với zeocin bằng cách gắn vào các chất kháng sinh(Gatignol, Durand và Tiraby, 1988)

 Hygromycin B - ức chế bằng cách can thiệp dịch chuyển vị ribosome Kháng

sinh tác động chống lại cả hai sinh vật nhân sơ và sinh vật nhân chuẩn Các genkháng (HYGR, mã hóa hygromycin-B-phosphotransferase) bất hoạt các kháng sinhbởi sự phosphoryl hóa

Mặc dù vectơ plasmid được sử dụng cực kỳ rộng rãi sử dụng trong nhiều ứng dụngcủa việc tạo dòng và đã được thiết kế với mục đích tạo ra nhiều chức năng hơn.Những chức năng trong số này sẽ được thảo luận trong chương sau của cuốn sáchnày, nhưng ở đây tôi sẽ liệt kê một số ví dụ để cung cấp cho người đọc một chứcnăng chính trong sự đa dạng của việc sử dụng plasmid

 Tách dòng - hầu hết các thao tác thực hiện trên DNA trong phòng thí nghiệm

đều lựa chọn có mang plasmid Dễ dàng thao tác sử dụng và lưu trữ của plasmid nênthường được sử dụng trong các thí nghiệm về DNA tái tổ hợp

 Vector con thoi - những plasmid không chỉ chứa toàn bộ thông tin gốc nhân bản

và lựa chọn đánh dấu cho E coli, những trình tự cũng có chức năng tương tự để duytrì truyền lại ở các tế bào vật chủ khác Ví dụ, plasmid cho nhân bản và biểu hiện củagen ở nấm men Saccharomyces cerevisiae có chứa toàn bộ thông tin nhân bản vàđánh dấu lựa chọn cho cả E coli và nấm men Hầu hết các các thao tác DNA sẽ đượcthực hiện bằng cách sử dụng E coli là tế bào chủ trước khi chuyển thành DNA cuốicùng được tạo ra vào trong nấm men

 Tạo ra RNA - nhiều plasmid đã được thiết kế để nhân bản đoạn DNA ngoại và

nó có thể phiên mã thành RNA Như vậy plasmid bao gồm các vùng khởi động(promoter ) cho một RNA polymerase, ví dụ: Ở bacteriophages có T3, T7 hoặc SP6,Giả sử RNA có thể được thực hiện trong ống nghiệm bằng cách sử dụng RNApolymerase tinh khiết và DNA plasmid Các RNA được thực hiện bằng phương phápnày thường được sử dụng như thăm dò lai trong Northern blotting

 Sản xuất Protein - nhiều plasmid chứa trình tự khởi đầu (promoter) để biểu hiện

các gen ngoại mà chúng có Biểu hiện thường được thực hiện trong E coli, nhưngbằng cách sử dụng các đoạn khởi động (promoter) phù hợp, protein biểu hiện có thểđược định hướng hầu như bất kỳ trong cơ thể nào Sản xuất protein ở mức độ cao cóthể được điều khiển từ một promoter mạnh, trong khi sản xuất ở mức thấp có thể sẽ

là từ các promoter yếu hơn Mức độ sản xuất protein cũng có thể được điều khiểnbằng cách thay đổi số lượng bản sao của plasmid này

Trong kỹ thuật di truyền, các plasmid gặp trong tự nhiên thường được sửa đổinhiều để tạo ra các vector có các đặc điểm mong muốn Ví dụ, nếu bạn đã nhân bản

vô tính một gen, bạn có thể muốn biểu hiện các sản phẩm của gene ở mức cao trong

E coli, trong khi cũng thể biểu hiện protein trong môi trường nuôi cấy tế bào độngvật có vú và sản xuất một protein mới dựa trên protein đã biểu hiện mà kháng thể đơndòng có sẵn để dùng Các hệ thống nên được thiết kể để vận chuyển vào các đoạn

ADN giữa các vector mà không cần phải sử dụng enzyme giới hạn Một trong những

hệ thống được phác thảo (hình 3.7)

Hình 3.7. Gene xáo trộn giữa các plasmid bằng cách tái tổ hợp Các gen được chuyển giao từ các plasmid cho đến plasmid nhận tại địa điểm LoxP sử dụng enzyme Cre recombinase.

Ở đây, các đoạn DNA mã hóa gene mục tiêu được chuyển từ một plasmid khác dotác động của các enzyme Cre recombinase Cre nặng 38 kDa protein recombinase từcác vi khuẩn P1 (Sternberg và cộng sự, 1981) Nó làm trung gian để điều chỉnh giữa

sự tái tổ hợp và trong các trình tự DNA tại các điểm cụ thể gọi là các điểm loxP (

Abremski và Hoess, 1984 ) Các điểm này bao gồm một cặp 13 bp ngược lặp đi lặp

lại cách nhau bởi một vùng đệm 8 bp Vùng đệm 8 bp trong điểm loxP được định

hướng rằng sự tái tổ hợp xảy ra theo một chiều hướng chính xác và định hướng

trước Plasmid cho chứa hai điểm loxP và hai điểm đó kẹp giữa hai đầu của gene mục tiêu Plasmid nhận chứa một điểm loxP và các yếu tố mà các gen mục tiêu sẽ trở

thành hợp nhất Các gen mục tiêu khi chuyển sẽ liên kết với các yếu tố biểu hiện cụ

thể mà các vector nhận đã được thiết kế Hơn nữa, nếu các trình tự mã hóa cho cácgen quan trọng nằm trong khung ngược dòng với các điểm loxP ở vector cho nó sẽ tựđộng được nằm trong khung với tất cả các chuỗi axit amin đã thiết kế ở vector nhận.Một plasmid cho được thay thế và hệ thống chấp nhận plasmid đó là dựa vào mộtđiểm đặc biệt các phản ứng tái tổ hợp trung gian bởi thể thực khuẩn λ (Karimi, Inze

và Depicker, 2002)

Trong trường hợp này, các đoạn DNA tái tổ hợp hai bên các điểm ( att ) có thểđược chuyển vào vector tái tổ hợp có chứa các điểm tương thích ( att × attP hoặc attL

× attr ) trong một phản ứng trung gian bởi các protein tái tổ hợp λ

Tính linh hoạt của plasmid đã dẫn đến chúng được sử dụng rộng rãi như là cácvectơ cho các thí nghiệm về thao tác trên gene Tuy nhiên nó cũng có một số hạn chếđáng kể Thứ nhất, hiệu quả mà plasmid được chuyển đến một tế bào vi khuẩn là rấtthấp Phân tử DNA plasmid được đưa vào tế bào vi khuẩn phải được tế bào chấpnhận ( xem Chương 2 ), nhưng điều này không phải lúc nào cũng được đáp ứng.Plasmid được chuyển vào tế bào E coli được cho là có mức độ thích nghi tốt nhất 1

× 109 tế bào chuyển đổi có thể được tạo ra mội microgram phân tử DNA plasmid.Đối với một plasmid điển hình, 1 μg đại diện cho khoảng 1,5 × 1011 phân tử Điềunày có nghĩa là các tế bào thu được ít hơn 1 % các phân tử DNA có sẵn Thứ hai,năng suất của các plasmid để chuyển các đoạn lớn của DNA ngoại lai là rất hạn chế(Bảng 3.1) Hầu hết các plasmid trở nên không ổn định nếu kích thước của chúngvượt quá khoảng 15 kbp.Trong nhiều trường hợp, điều đó không thành vấn đề, nhưngtrong một số ứng dụng, điều quan trọng là phải tăng kích thước của các đoạn lên tối

đa trước khi tác dòng Cần có các vector có khả năng tiếp nhận các đoạn DNA lớn.Các loại vector có như vậy được phát triển để khắc phục những khó khăn này

3.3 λ Vectors

Vào đầu năm 1950, Andre lwoff đã miêu tả một đặc tính kì lạ của Escherichia coli.Khi ông soi sáng một chút sự căng của những tế bào E.coli với một lượng ánh sáng cựctím vừa phải, vi khuẩn dừng hẳn sự phát triển và, sau đó khoảng 90 phút, vi khuẩn dunggiải và phóng thích ra nhiều mẫu virut, gọi là λ , bên trong môi trường trung gian(Figue 3.8)

Những virut, nhiều khi được gọi là thể ăn vi khuẩn hoặc đơn giản là thể thực khuẩn,

có thể gây nhiễm tới các tế bào E coli khác mà trước đây không gây nhiễm bởi nhữngthể thực khuẩn λ Không chỉ tất cả những tế bào vi khuẩn chịu sự biến đổi phân hủy nàykhi bức xạ bằng con đường này Tuy nhiên, vi khuẩn đầu tiên tiêu diệt thễ ăn khuẩn A,nhưng không thể phân hủy, là đặc điểm khác thường.Chống lại sự lây nhiễm bởi thể

ăn khuẩn A, những tế bào E coli sẽ chịu đưng một trong 2 cách thức sau Hoặc tế bàothủy phân và tổng hợp nên nhiều mảnh thể ăn khuẩn mới sẽ phóng thích vào trong xungquanh khoảng giữa, hoặc, một sự lựa chọn nữa , thể ăn khuẩn có thể thay đổi đột ngộtvào trong Dormant lifestyle mà thể ăn khuẩn DNA trở nên hợp nhất trong nhiễm sắcthể E coli bên trong nguyên nhân này là sự phân giải lifestyle được tiếp tục

Chu trình sống của thể ăn khuẩn λ được diễn tả trên biểu đồ hình 3.9.

Thực ra nó là vi khuẩn phân giải mà nó tỏ ra phân hủy nhanh chóng để chống lạibức xạ cực tím Trong phòng thí nghiệm, thể ăn khuẩn λ phát triển và tái tạo đượckiểm tra trên đĩa petri (hình 3.10)

Thể ăn khuẩn được pha trộn với những tế bào E coli xem là 1 dung dịch mềm dẻoagar được gọi là top agar hỗn hợp được rót trên bề mặt dinh dương agar một lớpmỏng và được ủ cho vi khuẩn phát triển.

λ phát triển là nguyên nhân của cái chết (sự phân giải) của những tế bào E.colixung quanh vị trí tiêm nhiễm lúc ban đầu Trong những vị trí được theo dõi trên đĩa

có một chút hỗn độn những màng trong vải batit vi khuẩn DNA λ có thể được lọc từnhững mẫu thể ăn khuẩn bao gồm có những màng này

Di truyền học và phân tử sinh vật học ở cấp độ phân tử của thể thực khuẩn λ vừađược nghiên cứu rộng khắp – xa hơn là cung cấp thông tin về λ , độc giả được hướngdẫn bởi văn bản hết sức hoàn hảo bởi Mark Ptashne (Ptashne, 1992) DNA bao gồmthể ăn khuẩn là 1 phân tử sợi đôi thẳng với kích thước 48502 bp, đầu 5- và 3- kếtthúc của λ hệ gene có 12 cặp base mà sợi đôi được gọi là cố kết hay cos kết thúc.Những chuỗi này bổ sung và có thể được thấu với một vài thứ khác tới dạng 1 phân

tử sợi đôi mạch vòng (hình 3.11) Chức năng liên quan tới gene của λ thường đượctập hợp lại với nhau tạo nên hệ gene λ loại trừ 2 gene điều hòa dương N và Q, nhữnggene bên trên phía bên tay trái của bản đồ gene quy ước mã hóa cho protein đầu vàcuối của mảnh thể ăn khuẩn

Theo sau nó là những gene mà sản phẩm protein liên quan với sự tái tổ hợp vàquá trình hoạt hóa thực khuẩn của nhiễm sắc thể thể ăn khuẩn được chèn vào bêntrong nhiễm sắc thể chủ và được tái tạo ổn định như là tiền thể ăn khẩn Phía bên tayphải của bản đồ gene có liên quan đến sự điều chỉnh bản sao và tiền ăn khuẩn nhiễmvào cho tới lần thứ 2 ( N, cro,cl), theo cùng là những gene cho sự tổng hợp DNA,chức năng điều chỉnh chậm trễ (Q) và sự phân hủy của những tế bào chủ.

Sự hiểu biết khá lớn của chúng ta về thể thực khuẩn λ và những con đường mà nóphân hủy và phân giải chu trình sống được điều khiển vừa được tạo nên λ một vector

lý tưởng để mang những mảnh DNA ngoại bào Lợi thế chủ yếu của λ căn cứ vàonhững vector ngoài bào plasmid có khả năng mà thể ăn khuẩn có thể xâm nhiễm vào

tế bào E.coli Khi chúng ta thực sự có 1 buổi thảo luận, sự biến nạp DNA plasmid vàotrong vi khuẩn là 1 quy trình không có hiểu quả, sự xâm nhiễm λ là một con đường cóhiệu quả để đưa DNA vào trong tế bào vi khuẩn

Để nghiên cứu làm thế nào mà λ có thể được lợi dụng như là một vector, thật làquan trọng để có 1 hiểu biết cơ bản về chính thể ăn khuẩn Thể ăn khuẩn λ lây nhiễm

và phân giải xảy ra được định rõ trong trong từng buớc sự lây nhiễm xảy ra như làkết quả của sự hút bám của mảnh thể ăn khuẩn λ tới tế bào vi khuẩn bằng việc kếthợp với receptor maltose Bộ gen DNA của λ được tiêm nhiễm vào trong tế bào vàhầu như gửi thông tin ngay lập tức ngay tại điểm này nó có thể xâm nhập bằng 1trong 2 con đường

 Con đường Lýogenic DNA thể ăn khuẩn trở thành hợp nhất với hệ gen vi khuẩntái tổ hợp via tương đồng giữa attP và khu vực hệ gene attB vi khuẩn) và tái tạo cùngvới DNA của vi khuẩn di chứng DNA tiền thực khuẩn kết hợp cho tới khi nó gây

ra việc xâm nhập bằng con đường phân giải

 Con đường phân giải Số lượng to lớn của những mảnh thể ăn khuẩn (protein vàDNA) xảy ra mà cuối cùng dẫn đến sự phân giải tế bào.

Sự giả quyết khi sự phân giải hay phân huỷ xảy ra là kết quả của hoạt động củaprotein cII, Hoạt tính của CII thì phụ thuộc vào bản sao của chất ức chế cI Và một vàigene phụ thuộc vào sự hoà hợp với DNA thể ăn khuẩn bên trong nhiễm sắc thể E.coli.hoạt tính cII là kết quả sự chấp nhận con đường phân giải , trong khi cII không hoạt tínhkết quả trong con đường phân huỷ cũng được kéo theo

Protein cII thì tương đối không bền và dễ bị ảnh huởng tới sự phân tách và pháhuỷ của protease vi khuẩn Những điều kiện của môi truòng ảnh huởng tới hoạt tínhcủa những protease này Khi phát triển ở mức trung lớn, ví dụ , proteases có hoạtđộng chung , giống như cII bị suy biến và λ phân giải xảy ra

Dưói những điều kiện của E.coli starvation , protease ít thiết thực và cho nên λ sẽ cónhiều sự phân giản thường xuyên hơn Cách hoạt động này rất có ý nghĩa cho tế bào thiếuđới này sẽ ít cấu thành thiệt suy yếu để tạo nên những mảnh thể ăn khuẩn mới

Con đường phân huỷ được mô tả bởi 1 chuỗi những bản sao xảy ra mà sản xuất sựkhác biệt của nhưng protein mà phụ thuộc vào sự tái tạo ra DNA thể ăn khuẩn và sảnphẩm của những mảnh thể ăn khuẩn mới

 Bản sao sớm bản sao của gene N và cro xuất hiện bản sao này được đưa ra đểngăn cản bởi sản phẩm của gene cI và trong 1 quá trình phân giải sự ngăn cản này là

cơ bản của sự miễn dịch lần hai

 Bản sao chậm trễ sớm bản sao protein N kêt shợp với RNA polymerase vi khuẩn

và đẩy mạnh bản sao của gene thể ăn khuẩn cuộn tròn vào trong bản sao DNA

 Sự tái tạo sự tái tạo lớn tiến đến 1 đơn khởi nguyên của khu vực tái tạo sự táitạo chậm trễ dẫn đến via 1 chu trình lăn cuôn tới sản xuất long concatamer của DNAthể ăn khuẩn mà nó kết hợp với những thể ăn khuẩn khác tại những vị trí cos

Bản sao trễ Sản phẩm protein của gene cro che lấp đi mức độ quan trọng và sau

đó dừng lại ở bản sao sớm sản phẩm của gene Q hoạt hoá bản sao, đưa đến kêt quảsản phwmr protein cần đến cho đầu và đuôi của mảnh thể ăn khẩun truởng thành, vànhững thể ăn khuẩn đó phụ thựôc vào sự phân huỷ tế bào vi khuẩn

Cuối cùng, tập hợp thể ăn khuẩn mang đến khi 1 đơn vị chiều dài của DNA đượcmang vào tập hợp đầu bởi sự phân tách concatameric DNA tại vị trí cos Đuôi thìđược thêm vào và những mảnh truởng thành thể ăn khuẩn được hoàn tất Cùng với sựphân huỷ tế bào , khoảng 100 mảnh thể ane khuẩn tổng hợp mới được phóng thích từ

1 tế bào lây nhiễm đơn vi khuẩn

Wild-type λ DNA bao gồm một vài vị trí nhận ra enzyme hạn chế khác thườngbên trong những mảnh DNA ngoại lai có thể được nhân vô tính, và do vậy mà nókhông hoàn toàn thích hợp như là 1 vector để mang nhiều chuỗi thêm vào đó, sựgắn kết của DNA vào trong λ thể ăn khuẩn có kích cỡ giới hạn

Khả năng gắn kết sẽ chỉ mang đến với những mảnh DNA tương ứng giữa 78 và

105 % so với kích thuớc của hệ gene wild – type ( 37 – 51 kbp) Những giới hạn đạt

ra hạn chế gay gắt với số lượng DNA mà có thể n\tạo dòng trong hệ gene thể ăn

khuẩn Hai luận điểm quan trọng, tuy nhiên, giả thiết đưa ra mà λ có thể phù hợp như

là vector tạo dòng

Đầu tiên nó được xác định sản phẩm gene phụ thuộc vào sự tái tổ hợp có thể bịloại bỏ bởi hệ gene λ và phân huỷ chu trình sống có thể vẫn đựoc hoàn thiện vànhững mảng có hình thái, DNA còn lại, thường nhắc đến như ở bên tay trái hay taiphải của hệ gene λ , khả năng có điều kiện tất cả chức năng tất yếu cho cong đưòngphân huỷ mang tới Điều thứ hai, tất nhiên mang lại những enzyme giới hạn bởinhững vị trí được nhận ra có thẻ được được loại trừ mà không có chức năng gene quá

ít, mà cho phép sự phát triển của vector với vị trí duy nhất cho sự găn vào của DNAngoại bào 1 vector có thể theo cách đó được xây dựng mà nó thiếu những gene phụthuộc vào sự tái tổ hợp, và vì vậy mà có thể chỉ nhập vào chu trình phân giải, nhưng

có khả năng mang nhiều DNA lớn ngoại bào thêm vào Hai buớc cơ bản của vectorvừa được phát triển:

Vector thêm vào – DNA được thêm vào trong 1 enzyme giới hạn nhận biết vị trí cắt

Vector thay thế - DNA ngoại bào thay thế cho những mảnh DNA (mảnh nhồi) củavector

Sự thuận lợi của vector thay thế mà nó có khả năng mang nhưng đoạn DNAlớn ví dụ, λEMBL4 có 1 vector 42 kbp mà nó bao gồm có 14 kbp DNA đệm giữa bêntay trái và phải của λ Sự gắn chặt chỉ của nhửng chủng λ sẽ tạo ra 1 hệ gene λ 28kbp.Cái đó quá nhỏ để xếp vào trong 1 mảnh λ sự thêmvào DNA ngoại bào giữa 2 chủng

λ tuy nhiên hệ gene đạt tới kích cỡ gói gọn Giới hạn kích thuớc gói gọn là cách thức

mà λEMBL4 có khả năng lưu giữ những mảnh DNA ngoại lai khoảng chùng kíchthuớc 23kbp ( hình 3.12)

Giới hạn kích thước của gói λ như vậy cung cấp 1 bộ máy chắc chắn để DNA ngoạibào được thêm vào giữa chủng λ tới dạng tái tổ hợp Một vài kế hoạch cơ bản khác đểtìm ra để nhận dạng những thể ăn khuẩn λ tái tổ hợp

Sự khử của gene cI Một vài vector thể ăn khuẩn λ ( e.g λgt 11) có duy nhấtenzyme cắt giới hạn nhận dạng những vị trí cắt chứa đựng vị trí gene cI Những thể ănkhuẩn mà gene cI phá vỡ bởi sự thêm vào DNA ngoại lai có 1 thay đổi hình thái, mànhững mãng tạo ra xuất hiện “ clear” khi kháng lại sự hỗn độn tấm chắn của loại này

là kĩ thật khó và phụ thuộc vào khả năng kết nối kỉ năng trên từng phần của nguờiquan sát

Tấm chắn blue – white Những vector ăn khuẩn λ ( e.g λZAP) được xây dựng đểchứa đựng gen lacZ giống hệt nhau của the α-fragment và β -galactosidase Tấm chắncho những thể ăn khuẩn tái tổ hợp có thể sau đó được hình thành trong tế bào E coliNhanh chóng từ the ω-fragment của β –galactosidase trong 1 con đường giống nhau tạonên tấm chắn tái tổ hợp trong pUC base plasmid Một lựa chọn là hệ gene λ được tạo

ra, vấn đề là làm thế nào để đưa DNA vào trong vi khuẩn mà nó có thể tái tạo lại trong

E coli ( hình 3.13), bình thưòng gói gọn trong vivo của λ DNA bao gồm đầu tiên làmpre-head

Một đơn vị chiều dài của DNA λ sau khi được thêm vào bên trong pre- head , vớiđơn vị chiều dài chuẩn bị bởi sự phân chia của hệ gene λ concatamerized tại những vịtrí xung quanh Một protein capsid thứ yếu D sau khi thêm vào trong pre – head đểhoàn thiện đầu chín, và những sản phẩm của những hệ gene khác đáp ứng như là

protein chính yếu, bảo đảm sự liên kết của những đuôi đã hàn thành với dầu hoànthành Gói gọn λ của hệ gene tái tổ hợp có để xảy ra trong in vitro bằng cách lợi dụng

2 đoạn E.coli mà chống lại λ phân giải kìm hãm những điểm khiếm khuyết khác nhaugói gọn trong cô đưòng này

Một điểm khuyết trong sản xuất protein E, kết quả từ một sự thay đổi t\bên tronggene E, ngăn cản pre-head thành dạng thẳng BHB2688 một sự thay đổi trong gene Dcản trở sự thay đổi của pre-head, với DNA kết thúc, bên trong dầu hoàn thiện trongstrain BHB2690 thành phần của BHB2699/BHB2690 dung giải nhỏ nhất, tuy nhiên,hoàn thành một vài thứ thiếu hụt khác nhau và cung cấp tất cả những sản phẩm góigọn chính xác ( hình 3.13 ) Do đó, hệ gene λ tái tổ hợp có thể đựoc tạo nên bằng invitro và gói gọn trong mảnh thể ăn khuẩn bình thường truớc khi tái sinh và nhân lêntrong tế bào Ecoli

3.4 Các vector cosmid

Chỉ những đoạn DNA phù hợp cho in vitro mới được chuyển vào thể thực khuẩn λtại 2 điểm cos trong chuỗi trình tự ở khoảng 37 – 51 kbp Vector cosmid đã được pháttriển nhờ quan điểm này, và nó giống plasmid ở chỗ được đưa vào trong thể thựckhuẩn λ ở điểm cos (Collins and Bruning, 1978) Hình 3.14 cho thấy toàn bộ cấu trúccủa một vector cosmid và một hệ thống tạo dòng vô tính để chuyển DNA ngoại lai.Cũng như plasmid, cosmid gồm một bản sao và một marker lựa chọn Cosmid cũngchỉ có duy nhất một enzyme giới hạn để nhận biết điểm để chèn các đoạn DNA vào.Sau khi phản ứng chuyển vừa xảy ra, thể λ mới sẽ được đưa vào tế bào E.coli DNAđược chuyển vào cũng giống như các λ DNA bình thường và nó sẽ truyền đạt thông tin

bổ sung cho các điểm cos Sẽ có hiện tượng thiếu hụt các chuỗi λ có nghĩa, tuy nhiên,những đoạn λ chuyển sẽ không chuyển sang giai đoạn này Thông tin trong DNA sẽđược bảo vệ trong tế bào E.coli Do vậy sự chọn lọc các thể biến dị sẽ dựa trên cơ sởcủa sự kháng thuốc kháng sinh và khuẩn lạc của vi khuẩn sẽ có dạng chứa các cosmidtái tổ hợp Khi tiền thể thực khuẩn λ có thể chèn vào khoảng 37 – 51kbp, và hầu hếtcosmid có kích thước khoảng 5kbp thì đoạn DNA ở khoảng 37 – 41 kbp có thể đượctạo dòng thành những vector Đây là một tính chất quan trọng so với việc tạo dòng từchính các vector λ

Cosmid, giống plasmid, rất bền vững, tuy nhiên phải chèn vào một đoạn DNA lớnđiều này có ý nghĩa trong việc bảo vệ vector trong tế bào vi khuẩn Các chuỗi DNAlặp lại thường gặp ở các DNA của sinh vật eukaryote, và sự tái cấu trúc của DNA cóthể dẫn đến sự tổ hợp lại các trình tự lặp lại của DNA chèn vào cosmid Khó khănchính khi làm việc với cosmid là những sản phẩm tuyến tính, chuyển đoạn DNA vàocosmid và chèn nhiều vị trí cùng lúc Hai vấn đề cơ bản đặt ra:

Các phản ứng chuyển vào cosmid và chèn DNA, giống như những gì đã trìnhbày trong hình 3.14, sẽ tạo ra những phân tử DNA vòng không có khả năng tham giavào phản ứng “bao gói” in vitro

Có nhiều hơn một phân tử DNA được lồng vào sẽ gắn vào giữa đoạn DNAcosmid Điều này khiến cho cấu trúc DNA được lồng vào có vẻ sai khác

Những khó khăn này có thể được khắc phục với việc cắt cosmid với 2 enzyme giớihạn khác nhau bằng việc tạo ra các điểm giới hạn trái và giới hạn phải để không kết hợpvới vị trí nào khác (Ish-Horowicz and Burke, 1981) Enzyme phosphastase sẽ tác độnglên DNA chèn để đảm bảo những đoạn lồng vào sẽ không chèn vào DNA của cosmid.

3.5 M13 vectors

M13 và các họ hàng của chúng là f1 và fd là thực khuẩn E.coli, dạng sợi M13 là

một lysogenic phage giống đực đặc trưng (male – specific) – thực khuẩn thể sinh ra virus phân hủy vi khuẩn khi bị kích thích Hệ gene của chúng là một DNA chuỗi đơn

dạng vòng dài 6407 bp (hình 3.15) Thực khuẩn thể M13 (M13 phage) có kích thước

900 * 9 nm, chứa một vòng đơn phân tử DNA (goi là chuỗi +) M13 xâm nhập vào vikhuẩn qua “cảng” là tiêm mao Phage gắn một đầu vào tiêm mao rồi chuỗi đơn DNAcủa chúng xâm nhập vào vi khuẩn ( hình 3.16) Chuỗi đơn nhân đôi một cách nhanhchóng tạo chuỗi kép ( relicative form, RF) bằng cách tổng hợp mạch DNA bổ sung(mạch -) sử dụng DNA polymerase của vi khuẩn Dạng RF của phage tăng lên theocấp số nhân, khoảng 100 phân tử RF xuất hiện trong vi khuẩn Quá trình phiên mã của

hệ gene virus sản xuất những protein cần thiết cho sự lắp ráp một virus mới Chuỗiđơn mã hóa protein (protein mã hóa bởi gene 2 ) thúc đẩy sự sao chép RF DNA chỉ có

trên một mạch đơn của DNA virus( mạch +) Các chuỗi phân tử DNA mạch đơn đượclắp ráp trong các cơ thể virus mới rồi được giải phóng khỏi tế bào mà không phá hủy

tế bào đó Một tế bào vi khuẩn giải phóng khoảng 1000 phage trong một vòng đời của

nó Sự xâm nhiễm của thực khuẩn thể M13 không gây chết tế bào Tế bào E.colikhông bị phá hủy nhưng chúng phát triển chậm lại do phải gánh vác việc tổng hợp các

bộ phận của phage M13 nguyên thủy của quá trình sao chép (gọi là f1 ori) chứa 2chuỗi DNA riêng biệt xếp chồng lên nhau có nhiệm vụ kiểm sóat quá trình sinh tổnghợp DNA Hai vị trí – f1 initiator (khởi đầu) và f1- terminator (kết thúc) là dấu hiệunhận biết sự bắt đầu và kết thúc sinh tổng hợp DNA Vị trí khởi đầu được nhận biếtbởi protein tổng hợp từ gene 2 – nằm trên mạch + trong RF DNA Ở vị trí này, vòngDNA bắt đầu sao chép theo một chiều nhất định và kết thúc ở vị trí f1 terminator cũngđược nhận biết bởi protein mã hóa bởi gene 2

Sự chuyển đổi giữa dạng mạch đôi RP và mạch đơn (+) của hệ gene của M13 làmnảy ra ý tưởng ứng dụng chúng làm vector Chúng ta sẽ theo dõi ở chương sau, DNAmạch đơn tổng hợp từ phage rất thuận tiện trong kĩ thuật chuyển gene đột biến invitro(chương 7) và DNA sequencing (chương 8) Khác với λ, M13 không có “ vùng khôngcần thiết” có thể bị hủy trước khi gắn DNA ngoại lai Nhưng lại có vùng intergenic(vùng hoạt động) giữa vùng khởi đầu của quá trình lặp và gene 2( hình 3.15) trong đóđoạn DNA ngoại lai được chèn vào Vector M13 được phát triển cuối thập niên 70 khi

gene lacZ (mã hóa α- peptide của β-galacttosidase ) được chèn vào hệ gene M13

(Messing và cộng sự, 1977) Sau đó, polylinker tương tự và những đoạn α–peptide như

dòng pUC plasmid được chuyển gene vào hệ gene M13, vùng nhận biết của enzyme cắtgiới hạn bị loại bỏ (Yanisch-Perron, Vieira and Messing, 1985; Norrander, Kempe andMessing, 1983) Dạng RF của vector M13 có thể được xử lí qua các bước chuẩn bị nhưDNA plasmid và DNA ngoại lai được chèn vào như plasmid thông thường

Những ứng dụng đặc trưng của vector M13 giúp chúng được sử dụng như nhữngphương tiện hình thành chuỗi đơn DNA Một đoạn DNA ngoại lai được tạo dòng vôtính trong M13, một lượng lớn chuỗi đơn sau đó được cô lập dễ dàng từ các phagetrưởng thành xuất ra từ tế bào vi khuẩn E.coli Khó khăn chính ở dạng vector này làchúng sẽ không ổn định khi đoạn DNA ngoại lai gắn vào lớn hơn vài kilobases.(Zinder and Boeke, 1982)

3.6 Phagemids

Phagemids là những plasmid chứa đọan phage f1 gốc của sự sao chép để sinhmạch đơn DNA Phagemids thường là những đoạn plasmid nhỏ vì vậy chúng có khảnăng tiếp nhận những đoạn DNA lớn hơn chèn vào đó hơn vector M13-based.Phagemids lần đầu tiên được phát triển vào đầu những năm 1980, khi người ta khámphá ra rằng sự thêm vào của bản gốc f1 khi tái sinh có thể sao chép thành pBR322 đểsinh mạch đơn DNA (Dotto và Horuichi, 1981; Dotto, Enea và Zinder, 1981) Sự saochép bản gốc f1 không đủ để điều khiển sự sản sinh mạch đơn DNA, nhưng nếu mộtgiống vi khuẩn mang phagemid trong cơ thể bị nhiễm độc bởi cấu trúc wild-type M13hoặc f1 helper phage, thì sự sản sinh mạch đơn phagemid DNA sẽ xảy ra Cácphagemid mạch đơn DNA sẽ được đóng thành các hạt virus và tiết vào môi trườngxung quanh theo cùng một cách mà các hạt thực khuẩn M13 được sản sinh Ngoài ra,người ta khám phá rằng việc nhân bản bản gốc f1 trong việc định hướng đảo ngược sẽdẫn đến việc sản sinh các mạch đối diện của DNA (Dente, Cesavent and Cortese,1983) Vì vậy, mạch đơn DNA đại diện hoặc mạch của sợi nhân bản có thể sản sinhsau khi nhân bản vô tính thành một vector phagemid phù hợp Những phagemids cómột điểm là, khi phage hỗ trợ vắng mặt, sợi đôi DNA được tách ra như một plasmidbình thường Hơn nữa, sự thiếu các gene bổ sung của thể thực khuẩn mà các vectorcần mang nghĩa là kích thước nhỏ của chúng có sự gia tăng về công suất để mangnhững đoạn DNA bên ngoài

Những phagemids khác đã được phát triển để tận dụng lợi thế từ những khía cạnh

khác nhau của plasmids, λ phage và M13 phage Chúng ta thấy rằng sự sao chép bản

gốc f1 đều có cùng khởi đầu và kết thúc Trong bộ máy di truyền của thể thực khuẩnM13, những giải trình tự này trùng lập với nhau, như vậy việc sao chép lại sẽ bắt đầu

và kết thúc sau khi đã hình thành bộ máy di truyền hình vòng Những phần tử khởi đầu

và kết thúc sẽ được phân cắt riêng biệt để xác định những điểm khởi đầu và kết thúc

cho việc sao mã DNA Một loại vector λ bổ sung, λZAP, được xây dựng như vậy phía bên trái và phải của cánh tay λ sẽ được kết nối thông qua giải trình tự DNA của một

phagemid bắt đầu với f1 khởi đâu và kết thúc với f1 kết thúc (Short và cộng sự, 1988).Loại Vector này (hình 3.17) có khả năng thực hiện chức năng của một thể thực khuẩn

λ, ví dụ, xây dựng cấu trúc thư viện cDNA Tuy nhiên, DNA ngoại bào có thể được cắt

từ λ phage dưới dạng một plasmid sau khi dã gây nhiễm lần 2 bằng thể thực khuẩn M13 λZAP chứa đựng tất cả những giải trình tự λ DNA cần thiết cho sự tăng trưởng

của các yếu tố gây phân hủy (lytic), và giữa các sợi DNA này là một giải trình DNAcần thiết cho sự sao mã plasmid và chọn lọn (ColE1 ori và AMPR) Thêm vào dó,

λZAP chứa gene lacZ và nhiều mạng lưới tự nhân bản với cùng một hình dáng tương

tự với pUC plasmids Giải trình tự plasmid trong vector bắt đầu với f1 khởi đầu và kếtthúc với f1 kết thúc Vector mang DNA ngọai bào có thể được chọn lọc bởi bộ lọcxanh-trắng của màng λ và DNA bổ sung có thể bị cô lập dưới dạng của một plasmidkhi vi khuẩn chứa các thể thực khuẩn λ bị nhiễm bởi phage f1 hỗ trợ Mạch đơn DNA

sẽ phát “thông tư” và sẽ được đóng gói như một M13 – như một thể thực khuẩn và tiết

ra từ tế bào Sự ra đời của thể thực khuẩn M13 sẽ hợp thành chủng F_E.coli và việc

chọn lọc trên các ampicillin sẽ dẫn đến việc hình thành một cụm chứa những plasmidtái tổ hợp, để rồi sau đó có thể bị cô lập như những plasmid mạch đôi.

3.7 Nhiễm sắc thể nhân tạo.

Hạn chế chủ yếu của hầu hết các vector mà chúng ta đã nghiên cứu cho đến nay làgiới hạn về kích thước của DNA cần tạo dòng NST của sinh vật nhân chuẩn chứahàng trăm hoặc hàng ngàn gene, cùng với DNA những yếu tố cần thiết cho sự ổn định

về chức năng của NST như telomeres và centromeres Telomeres, trong đó bao gồmDNA và protein, được đặt ở cuối NST và bảo vệ chúng khỏi bị hư hỏng Centromeres(tâm động) là những phân đoạn DNA lặp lại rất cần thiết cho sự sắp xếp của NSTtrong suốt quá trình phân bào

Các vector phải được thiết kế hợp lý sao cho nhân bản được nhiều đoạn DNA, do

đó, để khôi phục sự sao chép NST một cách chủ động trong các phân đoạn DNA cóthể dung kĩ thuật nhân bản vô tính Nhân bản vô tính theo cách này cũng tương tự nhưnhân bản vô tính trong phage λ – với sự tái tạo lại của các phân tử DNA – ngoại trừcác DNA ngoại lai có thể được nhân bản vô tính với tỉ lệ cao hơn

3.7.1 YACs

Các NST nhân tạo của nấm men (YAC) Vector YAC cho phép tạo dòng, trong các

tế bào nấm men, các đoạn DNA ngoại lai có thể có kích thước tới 500 kbp Trongnhững vector chứa các thành phần quan trọng của NST, bao gồm cả các thành phầnsau đây

A yeast centromere (CEN4) Trình tự của tâm động, đảm bảo sự chia đôi và đi về 2

cực của tế bào như tâm động, được quy định bởi một đoạn DNA với kích thước 125

bp Chuỗi hoàn chinh bao gồm 3 yếu tố: một phân đoạn dài 78-86 bp với hơn 90%lượng AT, một đoạn bảo tồn ở một bên và một đoạn bảo toàn ngắn ở bên khác (ghinhận của Clarke – 1990)

Yeast autonomously replicating sequence (ARS1) Trình tự sao chép tự chủ của

nấm men, là yếu tố cần thiết của quá trình nhân bản trong tế bào nấm men từ sự tự saochép của NST ở nấm men

Yeast telomeres (TEL) Trình tự đầu cuối của NST, Telomeres là trình tự đặt biệt

(5_-TGTGGGTGTGGTG-3_) có mặt ở các đầu của NST trong nhiều bản sao và là cầnthiết cho sự tái tạo và duy trì NST

Genes for YAC selection in yeast Các gen phù hợp với sự lựa chọn của YAC.

Vector có một bản sao chức năng của URA3, một gen liên quan đến sự sinh tổng hợpuracil, và TRP1, một gen liên quan đến sự sinh tổng hợp tryptophan, đó là sự lựa chọncủa các tế bào nấm men có mang vector

Bacterial replication origin and a bacterial selectable marker Vi khuẩn tái tổ hợp

và vi khuẩn chuẩn di truyền Để truyền các vector YAC vào trong các tế bào vi khuẩn,trước khi chèn vào hệ gen, các vector YAC thường chứa các ori ColE1 và các genkháng ampicillin giúp cho sự tăng trưởng và phân tích trong E.coli

Hình 3.18 Cloning of very large DNA fragments into a YAC vector.

Quá trình tạo dòng các đoạn DNA trong 1 YAC được thể hiện sơ lược trong hình3.18 Các YAC được cắt ở một vị trí xác định bằng một enzyme cắt giới hạn tạo thànhhai nhánh mà mỗi nhánh đều có 1 chuỗi telomere ở cuối Một trong hai nhánh chứa 1trình tự sao chép tự chủ (ARS1), 1 trình tự trung tâm (CEN4) và có dấu chuẩn ditruyền (TRP1).

Nhánh khác chứa dấu chuẩn di truyền (URA3) Những đoạn DNA lớn (>100kbp)được nối giữa 2 nhánh (Anand, Villasante and Tyler-Smitu, 1989) Việc chèn cácDNA ngoại lai vào đã bất hoạt tRNA của gen SUP4, thể hiện chức năng tRNATyrtrong

DNA vector Trong một ade2–ochre của tế bào nấm men, sự biểu hiện của SUP4 là sự

hình thành các khuẩn lạc màu trắng, trong khi đó việc chèn các DNA ngoại lai sẽ thểhiện các khuẩn lạc màu đỏ (Burke, Carle and Olson, 1987) Tế bào nấm men được độtbiến ở gen sản phẩm ADE2 (mã hóa cho các enzyme phosphoribosylamino-cacboxylaza-imidazol) tạo ra nhiều con đường sinh tổng hợp adenine, làm chúng tích

tụ trong không bào Sự tích tụ này đã tạo cho tế bào có màu đỏ Các YACs tái tổ hợp

đã biến đổi một loại nấm men mà trong đó có sự sai sót ở các bản sao NST của các genura3, trp1 và ade2 Quá trình biến nạp này đã được xác định bằng các khuẩn lạc pháttriển bất định trên những vùng thiếu uracil và tryptophan Điều này đảm bảo rằng các

tế bào đã nhận được một nhiễm sắc thể nhân tạo có cả hai telomere (vì sự bổ sung của

2 yếu tố dinh dưỡng) và nhiễm sắc thể nhân tạo có chứa DNA chèn (vì tế bào có màuđỏ) Có những khó khăn liên khi làm việc với YACs Một số trong số này là được liệt

kê dưới đây

 Rất nhiều phân tử DNA lớn rất yếu và dễ gãy, vấn đề đầu tiên là sắp xếp lại

 Theo ước tính có khoảng 10-60% bản sao được lưu trong thư viện bộ gen là thểkhảm, tức là từ các vùng khác nhau của bộ gen trở thành một bản sao YAC đơn(Green và cộng sự, 1991.)

 Dòng vô tính có xu hướng không ổn định, với các DNA ngoại lai thường bị biếnmất Trình tự DNA vốn có lặp lại rất hiếm trong hệ gen của nấm men, và với việc chèncác trình tự DNA của người sẽ làm tăng tầng số tái tổ hợp trong YAC Điều này có thểlàm cho YAC không ổn định Thật thú vị, tuy nhiên, các vector YAC lớn hơn ổn địnhhơn so với các vector ngắn, do đó nó được chọn để tạo các DNA lớn (Smith, Smythand Moir, 1990)

 Có một tỷ lệ lớn các YAC nguyên chất mất trong suốt quá trình tăng trưởng

 Thật khó khăn để tách các YAC từ các NST vật chủ khác vì kích thước củachúng quá giống nhau Việc tách chúng đòi hỏi kĩ thuật phức tạp pulsed-field gelelectrophoresis (PFGE) (điện di trên gel với trường dao động)

 Sản lượng của ADN là không cao khi YAC được phân lập từ tế bào nấm men

3.7.2 PACs

Để khắc phục một số vấn đề liên quan đến sử dụng cosmid hoặc hệ thống YAC,một phương pháp để nhân bản và đóng gói các đoạn DNA bằng cách sử dụng thể thựckhuẩn P1đã được phát triển để cung cấp khả năng sao chép các đoạn DNA với kíchthước lớn từ 70-95 kbp Thể thực khuẩn P1 có một bộ gen lớn hơn nhiều so với phage

λ (trong khoảng 110-115 kbp), và vector cũng được thiết kế với các thành phần thiết

yếu để P1 kết hợp vào một plasmid (Ioannou, 1994.) Sau khi được đưa vào E coli,thể thực khuẩn P1 hoặc có thể thể hiện chức năng lytic của nó, sản xuất 100-200 hạtthể thực khuẩn mới và thay thế các hạt thể thực khuẩn bị hỏng, hoặc các hạt thểkhuẩn bị hỏng có thể kiềm chế chức năng lytic của nó, và bộ gen của thể thực khuẩnđược thống nhất trọn vẹn, ổn định, bản sao plasmid thấp Thể thực khuẩn P1có haiquá trình tái tạo – một để kiểm soát quá trình chọn dòng vi khuẩn có chứa DNA lytic,

và một cái khác là để duy trì plasmid trong suốt quá trình tăng trưởng không lytic.Trong chu kì không có lytic, các DNA thể thực khuẩn mới được tạo ra và được cắt taimột vị trí pac trước khi được chèn vào các phần tử thể thực khuẩn

Các bản sao của đoạn DNA ngoại lai trong vector P1, hoặc NST nhân tạo của P1(PAC), được thể hiện trong hình 3,19 Các vector PAC được đồng hóa vớicác enzyme giới hạn ScaI và BamHI để tạo ra hai nhánh vector: một nhánh ngắn

và một nhánh dài Những đoạn dài từ 70 – 95 kb đã bị tách ra và bị thắt giữa 2 nhánhcủa vector để tạo ra một loạt các phân tử dài Nếu thắt giữa 2 nhánh ngắn, kết quả sẽtạo các phân tử không có P1 gốc và cũng không có gen KANR, và sẽ không khả thi.Nếu ở cả hai nhánh dài thì tại đó đều không có vị trí pac, và quá trình đóng gói cácphage không xảy ra Quá trình tái tổ hợp chỉ khả thi khi chèn các trình tự vào mộtnhánh ngắn và một nhánh dài Phage P1 sử dụng 1 “head-full” để đóng gói và có thểchứa một lượng DNA dài khoảng 110 – 115 kbp

Điều này có nghĩa rằng khi chèn bất kì một đoạn có chiều dài hơn 90 – 100 kbpDNA đóng gói sẽ bị cắt trước khi loxP được chèn vào phage, và các phân tử này sẽkhông thể truyền được thông tin khi đưa vào các vật chủ Sau khi tiêm vào các tế bàovật chủ cre+ E coli, các protein sẽ truyền thông tin đến các vị trí loxP trên DNA, vàDNA sao chép bằng cách sử dụng các plasmid gốc Các vector BamHi được đưa vàocác DNA ngoại lai, nằm trong gen sacB của vi khuẩn (mã hóa lavansucrase) Biểu hiệncủa gen này là hạn chế sự phát triển của tế bào E.coli trên sucrose Do đó tăng sucrosegiúp việc lựa chọn các PACs Sự lan truyền của các tế bào nấm men có chứa các PACtái tổ hợp trên các vùng có hàm lượng sucrose cho phép các khuẩn lạc phát triển.Các PACs tái tổ hợp được duy trì như những plasmid trong thời gian E.coli sử dụnggen kháng kanamycin như một gen marker Số lượng bản sao plasmid có thể được tăng

lên 25 lần bởi isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) đã kích thích promoter lac

kiểm soát quá trình tạo bản sao trong PAC tái tổ hợp

Các phân tử DNA tái tổ hợp sau đó được tách plasmid bằng cách sử dụng cácphương pháp truyền thống Bằng việc sử dụng hệ thống đóng gói DNA P1, hệ genDNA trong khoảng 70 – 95 kbp có thể dễ dàng nhân bản và thao tác Các vector đượcthiết kế để cho phép tạo ra các PACs có thể chứa các đoạn chèn từ 130 – 150 kbp Các

ưu điểm chính của phương pháp đóng gói DNA P1

 Các đoạn DNA có kích thước lớn cũng có thể được chèn vào các vector

 Không có sự sắp xếp lại hay sự xóa các DNA bị methyl hóa do sử dụng hạn chếcác giống vật chủ

 DNA tái tổ hợp có thể dễ dàng phục hồi như plasmid

Hình 3.19 Việc tạo dòng trong vector PAC Các vector PAC chứa plasmid của vi

khuẩn P1 và replicons lytic, cùng với một pac cho phép lắp ráp DNA vào các phage Ngoài ra, các vector có thành phần pUC và các gen kháng ampicillin cho quá trình truyền đạt thông tin và lựa chọn các vector cho chính nó.Những trình tự bị mất trong PAC tái tổ hợp Các DNA cần tạo dòng được chèn trong các gen sacB và đóng gói trong ống nghiệm để đưa vào phage P1.

3.7.3 BACs

Nhiễm sắc thể nhân tạo của vi khuẩn (BAC) được tạo ra từ những kiểu plasmid

F (Shizuya và cộng sự, 1992) BAC có khả năng mang khoãng 200kbp chuỗi DNAđược chèn vào và điểm gốc nhân tố F của sao mã (oriS) duy trì cấp độ của nó khoảng 1

bản sao trên mỗi tế bào thêm vào đó, BACs còn chứa 4 gene nhân tố F, là gene cầnthiết cho quá trình sao mã và duy trì số lượng bản sao, repE, parA, parB và parC Hình3.20 mô tả cấu trúc toàn diện của một dạng BACs.

Ngoài các gene nhân tố F, pBeloBac11 cũng chứa một maker kháng kháng sinh

có thể được chọn (CAMR) và gene lacZ' chứa một dòng vô tính phức tạp cho screeningxanh da trời - trắng của các BAC chứa các trình tự DNA thêm vào (Kim và cộng sự,1996b) Ngoài ra, BAC chứa một vị trí  cos (cosN) và một vị trí loxP

Những vị trí này được dùng cho quá trình phân tách đặc biệt của các trình tựđược chèn vào chứa BAC trong suốt quá trình xắp xếp giới hạn vị trí cosN có thểđược tách ra bằng cách dùng terminase alpha (Rackwitz, 1985), trong khi loxP đượctách bởi protein Cre với sự hiện diện của một oligonucleotide trình tự loxP (Abremski,1983) ngoài ra BAC được tạo ra chứa những vị trí chấp nhận những enzyme cắt giớihạn cực kì hiếm ví dụ như I-Scel là một intron được mã hóa enzyme cắt giới hạn từ tythể của nấm men Saccharomyces cervisia (Monteilhet và cộng sự, 1990)

Hình 3.20 Cấu trúc của vector BAC

Trình tự chấp nhận nó (5'- TAGGGATAACAGGGTAAT-3') không xuất hiện trong

hệ gene người và do do rất hữu ích cho quá trình tuyến tính hóa vector không có sựtách ra của các đoạn DNA được chèn vào

DNA được thêm vào một BAC xuất hiện rất bền vững, nó có thể tồn tại nguyên vẹntrong vòng hàng trăm thế hệ tế bào E coli và xuất hiện ít hơn trong các quá trình táixắp xếp và hủy bỏ khi duy trì trong sự tái tổ hợp của tế bào chủ E.coli khiếm khuyết.trở ngại chính trong việc sử dụng các vector BAC là chúng hiện diện chì một hoặc là 2bản sao điều náy có thể gây rắc rối trong quá trình phân lập và screening

3.7.4 HACs

Nhiễm sắc thể nhân tạo của người (HAC) đã được tạo ra và có thể tồn tại trongnhững khoảng thời gian dài trong những tế bào nuôi cấy như chúng ta đã biết, 3 yếu tốđược yêu cầu cho sự bền vững của nhiễm sắc thể - trung đoạn, phần kết thúc và mộtorigin cho quá trình sao mã đoạn cuối trong nhiễm sắc thể người lặp lại trình tự ( 5'-

TTAGGG-3'), nhưng nó khác với trình tự tương đượng của nấm men và cả 2 khôngthể thay thế cho nhau một YAC sẽ không có chức năng như một Nhiễm sắc thể trongcác tế bào người để giúp đỡ trong quá trình phân lập trung đoạn và các trình tự origincho quá trình sao mã ở người, các HAC được tạo ra có thể thay đổi và duy trì trong các

tế bào người (Henning và cộng sự, 1999) phương pháp này nhận ra các đoạn lặp lạiphức tạp của một trình tự DNA có 171 bp (được gọi là một đoạn lặp vệ tinh alpha)được chứa trong một đoạn DNA có 3 triệu cặp base của nhiễm sắc thể X có nhữngchức năng như một trung đoạn (Schueler và cộng sự, 2001) tính chất lặp đi lặp lại củanhững trình tự này làm cho chúng khó nghiên cứu và làm cho quá trình xác định trungđoạn của chính nhiễm sắc thể đó rất khó khăn

Hình 3.21 Một NST nhân tạo ở người trong các tê bào nuôi cấy Một vệ tinh alpha

tổng hợp chứa vi nhiễm sắc thể được hình thành bởi transfection của DNA vệ tinh alpha và các trình tự cuối từ các tế bào nuôi cấy Một dòng vô tính được phân lập và cho thấy chứa 1 HAC (mũi tên trên hình) tìm thấy từ DNA transfected và không từ sự cắt cụt của các nhiễm sắc thể nội sinh.

Hệ gene người chứa những gốc phức tạp cho quá trình sao mã trung bìnhnhiễm sắc thể người chứa khoãng 150x106 bp DNA trong khi chức năng của enzymeDNA polymerase tối đa chỉ khoãng 3000 base được tái tạo mỗi phút Quá trình sao mãđược bắt đầu tại một điểm riêng biệt, mỗi nhiễm sắc thể sẽ tách ra trong vòng 1 tháng

để được sao mã, hơn lúc nó thật sự xảy ra Những điểm gốc sao mã phức tạp ám chỉđến có nhiều nơi trên nhiểm sắc thể prokaryote nơi mà quá trình sao mã có thể bắt đầu

và quá trình sao mã diển ra sau đó với tốc độ nhanh hơn Trình tự của điểm gốc sao mãthì thoái hoá, nhưng sự phát triễn của HAC cho phép một sự xắp xếp chính xác hơncủa những vùng này

Các HAC có tiềm năng lớn như là công cụ cho cả các nghiên cứu cơ bản và cácphương pháp chữa bệnh trong y học Các nhiễm sắc thể nhân tạo có thể điều khiển cácvector liệu phap gene với nhiều thuận lơi hơn các vector từ virus trước đó

Chúng tồn tại như những thành phần thêm vào nhiễm sắc thể và vì thế sẽ khôngxuất hiện đột biến chèn vào.Chúng không giới hạn về số lượng DNA mà chúng có thểmang Vì sự khác nhau giữa trạng thái của trung thể trong quá trình nguyên phân vàgiảm phân, chúng có thể được thiết kế không có chức năng trong phôi

Những khả năng này vẫn còn trong tương lai và sẽ phụ thuộc vào sự hiểu biếthơn nữa về chức năng của nhiễm sắc thể

Chương 4

POLYMERASE CHAIN REACTION

Những khái niệm chính:

 PCR là khuếch đại những trình tự DNA cụ thể in vitro

 PCR cần có 2 mồi (primer), một trong hai mồi đó sẽ bổ sung cho mỗi mạchDNA và một DNA polymerase

 Những chu kì nóng và lạnh được lặp đi lặp lại nhiều lần sẽ làm khuếch đại đoạnDNA ở giữa hai vị trí liên kết của mồi thành một số lượng lớn DNA tái bản

Kĩ thuật PCR khởi đầu vào giữa thập niên 1980 (Saiki và cộng sự, 1985; Mullisand Faloona, 1987), không phải là không hợp lí khi nói rằng các tác động của PCR lênsinh học phân tử, khoa học pháp lí, chuẩn đoán các bệnh lí về gen ở người đã trở nênrộng mở hơn Tự bản thân của quá trình này là một sự kéo dài cực kì đơn giản của chutrình sao chép DNA, nhưng nó sử dụng nhiều cách khác nhau để tạo nên nhiều sự nhânbản và thao tác trên DNA trong nhiều trường hợp thì dễ dàng và thích hợp hơn tronglần đầu tiên Khái niệm đơn giản nhất thì PCR là sự sao chép lặp lại nhiều lần của mộtđoạn trên chuỗi DNA kép Tiến trình này được trình bày sơ lược trong hình 4.1 Sự ưuviệt của PCR là do nó có khả năng nhân bản một số lượng lớn các bản sao từ một phânđoạn DNA cụ thể trong một thời gian ngắn PCR cũng có thể khuếch đại nhanh chóngmột vùng nào đó trên phân tử DNA mạch đơn trong ống nghiệm để sinh ra một lượng

đủ có thể được nhân bản, nối dài, hoặc phân tích bằng cách xác định giới hạn Tác dụngcủa PCR đã được tôn vinh vào năm 1993 với giải thưởng Nobel hóa học cho KaryMullis cho sự đóng góp của ông với khoa học Mullis đã viết về các phát minh thú vịcủa mình (Mullis, 1990) và có thể tìm thấy cuốn tự truyện thú vị của Mullis trên website giải Nobel (http://www.nobel.se/chemistry/ laureates/1993/mullis-autobio.html).PCR liên quan đến hai mồi là hai chuỗi oligonucleotide, thường có chiều dài khoảng 17đến 30 nucletide, cái mà nhận diện trình tự DNA mục tiêu để sao chép

Một trong hai mồi có trình tự giống với một mạch DNA (sense - mồi xuôi)trong khi mồi còn lại thì có trình tự giống như chuỗi DNA còn lại (antisense - mồingược) Mồi xuôi sẽ liên kết, bổ sung bắt cặp với các base, với mồi ngược và bắt đầutổng hợp mạch DNA mới Tương tự, mồi ngược cũng liên kết với mồi xuôi và tổnghợp mạch DNA mới của mồi xuôi mới Chương trình PCR được chia làm ba giai đoạnriêng biệt, mỗi giai đoạn thực hiện ở nhiệt độ khác nhau (hình 4.1) Chu kì quá trìnhbiến tính – bắt cặp với mồi (hay còn gọi là lai) – kéo dài được lặp lại 20-30 lần để đạtđược mức độ khuếch đại mong muốn của một trình tự DNA cụ thể Ba bước trong mỗichu kì như sau:

 Biến tính: hai mạch của phân tử DNA được tách ra bằng nhiệt độ Như chúng

ta đã biết trong chương 1, DNA có thể bị biến tính thuận nghịch bởi chu kì nóng vàlạnh Bước này thường được thực hiện ở nhiệt độ là 94oC

 Bắt cặp với mồi (lai): hai mạch mục tiêu sau đó được làm lạnh với sự có mặtcủa các đoạn mồi oligonucleotide Một mồi sẽ nhận diện và gắn vào mạch DNA mục

tiêu và một mồi khác cũng sẽ nhận diện và gắn vào mạch còn lại Các mồi được thiết

kế sao cho đầu 3’ của mỗi đoạn mồi phải đối mã với cái còn lại, vì vậy sự tổng hợpDNA diễn ra trên cả hai mạch trong vùng giữa hai mồi Nhiệt độ để bắt cặp của mỗimồi với DNA mẫu thì phụ thuộc vào chiều dài và trình tự của mồi, và mức độ đặctrưng của các phản ứng PCR cụ thể thì có trong chương 2 Nhiệt độ thông thườngđược chọn trong phạm vi 45-60oC

 Kéo dài: DNA polymerase sẽ gắn vào đầu 3’ của mỗi liên kết oligonucleotide

và sử dụng dNTP để tổng hợp mạch DNA mới theo chiều 5’-3’ Các thí nghiệm PCRđầu tiên sử dụng các phân đoạn Klenow DNA polymerase I như là enzym sao chép,nhưng do bước biến tính nhiệt, các enzym được thêm vào trong suốt mỗi chu kì Một sựđột phá khi đưa ra Tag DNA polymerase từ vi khuẩn ưa nhiệt Thermus aquaticus(Lawyervà cộng sự, 1989) Tag DNA polymerase kháng với nhiệt độ cao, nó có chịuđược nhiệt độ 94oC của giai đoạn biến tính và vẫn còn khả năng hoạt động tốt Điều này

có nghĩa là enzym không cần phải được bổ sung trong suốt phản ứng và các chu kì nóng

- lạnh cần thiết trong PCR có thể được thiết kế tự động Hơn nữa Tag DNA polymerase

có nhiệt độ tối ưu cho sự sao chép DNA là 72oC Ở nhiệt độ cao mà lúc đó các phản ứngkéo dài vẫn có thể diễn ra thì có nghĩa là giai đoạn bắt cặp mồi không bị sai sót

 Sau mỗi vòng của quá trình nhân bản PCR, một phiên bản mới của mỗi mạchDNA được tổng hợp, như minh họa trong hình 4.1 Vị trí bắt đầu của sự tổng hợpDNA được quyết định bởi liên kết của đoạn mồi oligonucleotide với DNA mẫu Cụ thểtrong quá trình lai thông qua liên kết hydro giữa cặp base, chính xác từng vị trí mỗinucleotide cho tới các trình tự, cái mà được bổ sung vào mạch mẫu Không có gì quáphức tạp, tuy nhiên sự tồng hợp DNA kết thúc như thế nào Nếu chúng ta kiểm tra kếtquả của một phản ứng PCR điển hình trên gel agarose như trong hình 4.2, ta sẽ thấynhững dải đơn rời rạc được tạo thành Điều này cho thấy những phân đoạn DNA đượctạo thành đồng nhất, và chúng bắt đầu và kết thúc ở cùng vị trí Để hiểu điều này xảy

ra như thế nào, ta xem các đoạn DNA được tạo thành trong suốt nhiều chu kì của PCR.Một phân tử DNA mục tiêu (được mô tả bằng màu đỏ và xanh) chứa các trình tự

bổ sung với hai oligonucleotide Các oligonucleotide có tác dụng như là điểm bắt đầucho sự nhân bản DNA Các sản phẩm của mỗi chu kì PCR đều là mẫu cho sự nhân bảnDNA của chu kì tiếp theo Trong hình là sản phẩm của chu kì đầu PCR (xanh lá), chu

kì hai (tím), chu kì ba (nâu) Sự hoàn thành chu kì dẫn đến hình thành hai phân tửDNA mạch đôi (được đóng khung), cái mà đầu của mạch 5’ và 3’ thích hợp chính xácvới đầu của đoạn mồi oligonucleotide Các chu kì tiếp theo dẫn đến sự gia tăng theocấp số nhân của phân tử DNA này

Trong suốt chu kì PCR đầu tiên, hai mạch DNA mục tiêu được tách ra và quátrình nhân bản DNA bắt đầu tại điểm liên kết với mồi Hai mạch DNA mới được tổnghợp ở cuối chu kì 1 (ở hình 4.3), sẽ có đầu 5’ xác định, như là được quy định bởi vị tríliên kết với mồi, nhưng đầu 3’ không xác định Quá trình tổng hợp DNA không giớihạn ở một điểm cụ thể, nhưng nó sẽ chỉ dừng lại trong suốt bước biến tính nhiệt củachu kì 2 Mỗi mạch DNA có ở cuối chu kì 1 sẽ tiếp nối vào chu kì kế tiếp của PCR, vàmỗi mạch sẽ có tác dụng như là mẫu cho sự liên kết với các mồi mới Trong chu kì 2,

mồi sẽ gắn với mạch DNA mẫu ban đầu và các mạch được tổng hợp trong chu kì 1.Liên kết giữa mồi với mạch mẫu ban đầu sẽ đưa đến kết quả là tạo thành các sản phẩmtương tự trong suốt chu kì 1.

Lặp lại

Hình 2: Khuếch đại PCR của một gen từ DNA Hai đoạn mồi oligonucleotide

được thiết kế để flank gen trong bộ gen người Một phản ứng PCR diễn ra 25 chu kì,

Biến tính

Bắt cặp mồi (lai)

Kéo dài bằng DNA polymerase

một phần mười phản ứng được chạy trên gel agarose sắp xếp theo kích thước DNA Gel được nhuộm với ethium bromide và được chụp dưới kính hiển vi.

Hình 4.3: Các sản phẩm tạo thành trong suốt 3 chu kì đầu của một thí nghiệm PCR.

Tuy nhiên, liên kết giữa mồi với mạch DNA được tổng hợp trong chu 1, tiếptheo đó là sự nhân bản, dẫn đến việc tạo thành một mạch DNA với đầu ở đầu 3’ và 3’đều xác định Điều này xảy ra bởi vì sự nhân bản DNA sẽ chấm dứt khi không có thêmtrình tự DNA nào nữa được sao chép Vì thế khi kết thúc chu kì 2 thì 2 mạch DNAđược tạo thành (thể hiện trên hình với màu tím) có đầu 5’ và 3’ xác định Tuy nhiêncác base bắt cặp với các đoạn DNA có đầu 3’ không xác định Một lần nữa, sản phẩmtrong chu kì 2 của tiến trình PCR sẽ đi vào chu kì 3, lần nữa mỗi mạch DNA được sửdụng làm mẫu để mồi gắn vào Vào cuối chu kì 3, phân tử DNA mạch đôi được tạothành và cuối mạch 5’ và 3’ bắt đầu và kết thúc tại những vị trí mồi gắn vào trình tựDNA mục tiêu ban đầu

Ngoài chu kì 3 của PCR, các chu kì biến tình nhiệt, bắt cặp mồi, kéo dài đượclặp lại sẽ dẫn đến sự nhân lên theo cấp số mũ của một đoạn DNA mục tiêu cụ thể (hình4.1) Sau 25 chu kì, thông thường của các thí nghiệm PCR, mong đợi sẽ khuếch đạikhoảng 30 triệu lần, và sự khuếch đại vẫn đạt được như vậy trong thực tế Tất cả cácphản ứng PCR “bị nhiễm” bởi một lượng ít các phân đoạn DNA được tạo thành khôngđúng với chủ định nhưng không đáng kể, bởi vì phần lớn là sự khuếch đại của cácphân đoạn DNA cụ thể

Có nhiều yếu tố cần được xem xét khi khuếch đại một trình tự DNA cụ thểbằng phương pháp PCR Nó bao gồm việc chọn lựa DNA polymerse được sử dụng,mẫu DNA, điều kiện phản ứng và trình tự mồi oligonucleotide Chúng tôi sẽ thảo luậnngắn gọn về mỗi vấn đề ở phía dưới như là các thí nghiệm về kĩ thuật gen có thể bị ảnhhưởng như thế nào, nhưng cái độc giả hướng tới là các văn bản với những khía cạnhthực tế của PCR theo chiều sâu hơn.

 Deoxynucleotide triphosphates (50 μMeach of dATP, dCTP, dGTP, dTTP)

 Thermostable DNA polymerase (2 units)

 A total reaction volume of 50–100 μL

Chúng tôi sẽ nói về enzyme polymerase, DNA mục tiêu và mồi rõ hơn ở phầndưới Một số thành phần phản ứng(Tris, KCl and MgCl2), nồng độ của các ion magiêtrong phản ứng đóng vai trò quan trọng trong sự thành công của một phản ứng PCR(Hình 4.4) Mg là chất cần thiết cho DNA polymerase hoạt động, nhưng các đặc điểmcủa bất kỳ phản ứng PCR phụ thuộc vào nồng độ của Mg được sử dụng Nồng độ Mgthấp , phản ứng không xảy ra vì enzyme polymerase không hoạt động Nồng độ Mgcao, phản ứng sẽ mất đi đặc trưng và sản xuất nhiều sản phẩm không mong muốn.Nồng độ tối ưu Mg cần phải được xác định bằng thực nghiệm cho mỗi bộ mồi PCRriêng biệt, nhưng thường sẽ có trong khoảng từ 1-5 mM Các thành phần đệm và muốicủa phản ứng (Tris và KCl) thường được sử dụng thường xuyên, mặc dù làm giảmnồng độ KCl kích thích DNA polymerase ở lại trên mẫu lâu hơn và đạt được một chiềudài lớn hơn của sản phẩm khuếch đại (Foord và Rose, 1994)

Hình 4.4 : Ảnh hưởng của nồng độ Mg về hiệu quả và đặc trưng của một thí

nghiệm PCR Một thí nghiệm PCR đã được thiết lập có chứa nồng độ MgCl2 khácnhau Sau khi PCR, các sản phẩm đã được tách trên gel agarose và nhuộm vớiethidium bromide Các kích thước của sản phẩm PCR thu được được so sánh với mộtthang DNA mẫu (M) Tái sản xuất các yếu tố quan trọng cho thành công của PCR ,của Qiagen GmbH

Một khi các phản ứng PCR đã được thiết lập, nó thường được phủ một lớp dầu

để ngăn chặn sự bốc hơi của mẫu trong quá trình làm nóng - cách khác, một máy PCRvới một nắp sẽ ngăn chặn sự bốc hơi nước nóng - trước khi được chịu các nhiệt độkhác nhau mà sẽ thúc đẩy sự biến tính, nhiệt luyện, và các thành phần mở rộng củamột chu kỳ PCR Điều kiện một chu kỳ cho một thí nghiệm PCR có thể được

 94°C, 30 s – giai đoạn biến tính

 60°C, 30 s – giai đoạn lai

 72°C, 1 min – giai đoạn kéo dài

Giai đoạn biến tính và lai ngắn, nhưng đủ để cho phép phá vỡ và gắn các liênkết hydro giữa các sợi DNA Bắt đầu bao gồm một bước biến tính ban đầu (940 C, 2phút) để đảm bảo rằng các mẫu DNA ban đầu là chuỗi đơn Điều này thường khôngxảy ra khi tiếp xúc lâu với nhiệt độ cao sẽ chặn lại trong DNA mẫu Chiều dài của sảnphẩm PCR khuếch đại trong thời gian cho phép cho bước kéo dài của phản ứng Hầuhết các polymerase sử dụng trong PCR sẽ tái tạo DNA trong ống nghiệm với tỷ lệkhoảng 500-1000 bp min-1 (Bảng 4.2) Thời gian mà các thí nghiệm PCR được ủ ởnhiệt độ giãn được điều chỉnh tùy thuộc vào chiều dài của sản phẩm ban đầu

Số chu trình PCR được thực hiện trong một thử nghiệm cá nhân phụ thuộc vào

số lượng cả hai mẫu DNA ban đầu trong phản ứng và lượng DNA cần thiết sau quátrình khuếch đại Nói chung, để tránh các lỗi sao chép (xem bên dưới), như vài chu kỳ

có thể sẽ được thực hiện Điều này thường sẽ có trong khoảng 17-25 chu kỳ Sau khihoàn thành các chu kỳ , phản ứng chuẩn PCR bao gồm một bước kéo dài cuối cùng(72°C trong 5 phút) để đảm bảo rằng tất cả các DNA trong phản ứng này đã được nhânlên thành dạng mạch đôi Giai đoạn kéo dài cuối cùng có thể làm tăng hiệu quả nhânbản của sản phẩm PCR (Li và Guy, 1996)

4.2 DNA POLYMERASE CHỊU NHIỆT:

Các vi khuẩn Thermus aquaticus lần đầu tiên được phát hiện tại một số suốinước nóng ở Công viên quốc gia Yellowstone (Brock and Freeze, 1969) Từ đó nóđược tìm thấy sống trong môi trường nhiệt trên khắp thế giới Sinh vật này sống ởnhiệt độ từ khoảng 50 và 80°C, và nhiệt độ tối ưu tốc độ tăng trưởng của nó là khoảng

700C Taq ADN polymerase là enzym monomeric với trọng lượng phân tử 94 kDađược phân lập từ các sinh vật (Chien,Edgar và Trela, 1976; Luật sư và cộng sự, 1989) Các enzyme chịu nhiệt, nó lặp DNA tại 740C và vẫn còn chức năng ngay cả sau khi ủ

ở 950C enzyme này bao gồm một hoạt động polymerase 5’ tới 3’ một hoạt độngexonuclease 5’tới 3’, nhưng nó thiếu một 3’tới 5’ exonuclease (proofreading) hoạtđộng Việc thiếu proofreading hoạt động có nghĩa là nếu một cơ sở không chính xácđược đưa vào chuỗi polynucleotide mở rộng, nó không thể được loại bỏ và do đó TaqADN polymerase là dễ bị lỗi và gây những đột biến cho các sản phẩm PCR khuếchđại Trong thử nghiệm in vitro, Taq ADN polymerase misincorporates một base 104-

105 những base lặp lại (Barnes năm 1992; Cline, Braman và Hogrefe, 1996) Các sự

khác biệt lớn trong tỷ lệ lỗi ước tính là do, một phần, với những phương pháp được sửdụng gây những đột biến Theo ước tính mức độ thấp nhất, với tỷ lệ lỗi của 10 -4lỗicho mỗi cặp base tái sử dụng, nếu một chuỗi 1 kb là khuếch đại cho 25 chu kỳ với Taqsau đó khoảng 10 phần trăm của các sản phẩm khuếch đại sẽ có đột biến Tuy nhiên, vìnhững đột biến xảy ra trong một chu kỳ sẽ được khuếch đại trong chu kỳ sau đó, thực

tế tần số đột biến có thể khác nhau từ các thí nghiệm thử nghiệm Mức độ báo lỗi làkhông, tuy nhiên, ảnh hưởng đến ảnh hưởng đến kết quả của một thí nghiệm.Nếu phảnứng PCR đang được thực hiện chỉ đơn thuần là để xác định sự có mặt hay vắng mặtcủa một gen trong một phân tử DNA mục tiêu, sau đó sự thành công của phản ứng này

sẽ không bị ảnh hưởng bởi sự xuất hiện của lỗi vào trong trình tự khuếch đại Tuynhiên nếu là để khuếch đại gen để nghiên cứu chức năng, sau đó PCR sai sót có thểảnh hưởng đến thử nghiệm Các vấn đề về báo lỗi có nghĩa là, tuy nhiên, sản phẩmPCR có thể bị phân tích trình tự DNA trước khi chúng được sử dụng trong các thínghiệm nhân bản Ngoài ra, một số dòng vô tính PCR độc lập nên được lựa chọn đểđảm bảo rằng các trình tự thu là điển hình

Một chức năng khác của Taq ADN polymerase tác động đến trình tự của sảnphẩm PCR cuối cùng là xu hướng của các enzyme để kết hợp một deoxynucleotide(thường là một adenosine) một cách độc lập mẫu kết thúc ở đầu 3’của sợi DNA mớitổng hợp Một hệ quả của hoạt động này là sản phẩm PCR được sản xuất bởi Taqkhông thể kết thúc, nhưng đã có đầu 3’ đơn A nhô ra dư lượng Đặc tính này đã đượckhai thác để hỗ trợ nhân bản của sản phẩm PCR (xem bên dưới) Kể từ khi tìm ra Taqpolymerase DNA, một số ADN polymerase chịu nhiệt khác đã được mô tả và đã được

sử dụng trong các thí nghiệm PCR Trong khi Taq vẫn là thông dụng nhất của cácenzym chịu nhiệt cho PCR, polymerase từ các nguồn khác có tính chất khác nhau màlàm cho chúng hữu ích cho các ứng dụng nhất định (Bảng 4.2)

Một số các DNA polymerase chịu nhiệt khác, ví dụ Pfu polymerase cô lập vớifuriosis vật Pyrococcus, không có một hoạt động 3’tới 5’ exonuclease proofreading, vànhư vậy tốc độ đột biến giảm Sử dụng ví dụ trên, nếu là 1 kb phân đoạn của DNAđược khuếch đại hơn 25 chu kỳ với Pfu polymerase, sau đó chỉ có 0,1 phần trăm củacác sản phẩm khuếch đại sẽ có đột biến Ngoài ra, một số các DNA polymerase chịunhiệt khác sản xuất sản phẩm PCR thấp (Bảng 4.2) Các hoạt động 5’ tới 3’exonuclease của Taq polymerase DNA có nghĩa là enzyme có khả năng làm suy giảmmồi oligonucleotide trong phản ứng PCR Điều này đặc biệt có liên quan trong bướcbiến tính đầu tiên của chu kỳ 1, khi các oligonucleotides không bị ràng buộc với cácmẫu DNA, và trùng hợp tự do trong dung dịch Trong chu kỳ nóng nhất, nhiệt độ củahỗn hợp PCR tăng từ nhiệt độ phòng (hoặc 4 0 C nếu phản ứng đã được thiết lập ởnhiệt độ) tới 94 0 C Điều này có nghĩa rằng, tại một số điểm, nhiệt độ trong ống sẽđược 720 C - tối ưu cho polymerase - nhưng các enzyme sẽ không thể sao chép DNA

vì tái sử dụng trong số các oligonucleotides với mẫu DNA Nhiệt độ vượt qua nhiệt

độ của enzyme mà sự sao chép không xảy ra sẽ có xu hướng dẫn đến suy thoái mồi, vàPCR không hiệu quả Để khắc phục vấn đề này, và để ngăn chặn các sản phẩm PCRkhông đặc trưng được tổng hợp trước chu kỳ, Taq polymerase DNA có thể được thêm

vào hỗn hợp phản ứng đã ở 94 0 C Khi tăng nhiệt độ tăng cả sản lượng và đặc trưngcủa phản ứng PCR Ngoài ra, Taq polymerase DNA có thể được trộn với một khángthể cụ thể mà liên kết với enzyme và ức chế hoạt động của nó (Kellogg và cộng sự,1994.) Các kháng thể - ức chế enzyme phức tạp sao chép ở nhiệt độ thấp, nhưng phứctạp không thể phục hồi phân ly ở nhiệt độ cao, sau đó enzyme là không ngăn cản cácchức năng của nó.

Sự tồn tại của một số ADN polymerase chịu nhiệt với những đặc tính khác nhau

đã dẫn đến sự "pha trộn" của polymerase cho các chức năng cụ thể Ví dụ, Taq ADNpolymerase sản xuất sản lượng cao của sản phẩm PCR, nhưng dễ gây lỗi và có kích thướcsản phẩm PCR tối đa khoảng 5-7 kbp Pfu DNA polymerase, mặt khác, là ít hơn nhiều dễgây lỗi, nhưng vẫn còn gặp khó khăn hiệu quả sản xuất sản phẩm PCR trên 7 kbp Mộthỗn hợp của hai polymerase (15 phần Taq và 1 phần Pfu ) đã được tìm thấy các mảnhDNA có hiệu quả khuếch đại lên đến 35 kbp dài với độ trung thực cao (Barnes, 1994)

4.3 DNA KHUÔN MẪU

Hầu như mẫu DNA nào cũng có thể được sử dụng như một khuôn cho mộtphản ứng PCR, bao gồm dạng thẳng, plasmit DNA dạng tròn và đóng xoắn, genomeDNA, cDNA… DNA có nguồn gốc từ những chất phi vật thể, do vậy PCR đơn thuần

là một chuỗi những phản ứng tiếp diễn Với yêu cầu duy nhất là vị trí liên kết mồi tạothành chuỗi giữa chúng là nguyên vẹn

Trong các trường hợp, nhìn về tương lai cho những lợi ích rõ ràng, chúng ta cânnhắc kĩ cho việc khuyết đại DNA mục tiêu đơn Khi điều này chắc chắn đạt được trongthực tiễn và thường được tiến hành với quy mô số lượng DNA lớn Khi với một lượngnhỏ DNA được sử dụng nhưng khi bị nhiễm tạp chất trong phản ứng PCR có thể trởnên một vấn đề nghiêm trọng Khuếch đại đặc tính PCR trên quy mô lớn mà bị nhiễmtạp chất vào DNA có thể gây hỏng thí nghiệm Nhiễm tạp chất có thể do nhiều nguyênnhân khác nhau bao gồm người đang tiến hành thí nghiệm,những mồi xuôi và mồingược sử dụng để thiết lập phản ứng và enzyme hoặc các chất cần thiết trong chínhphản ứng Trong một thí nghiệm PCR điển hình giữa 0,1 và 1 μg DNA sẽ được thêmvào phản ứng với một lượng tương đối thấp số chu kỳ PCR nhưng vẫn có thể đượcthực hiện được với nguyên liệu đầy đủ cho các thí nghiệm Điều này làm giảm khảnăng gây tạp nhiễm vào sự khuếch đại mong muốn Với bao nhiêu bản sao của chuỗimục tiêu đủ lượng DNA cần thiết? Nếu bạn thêm 1 μg DNA bộ gen của người để chomột phản ứng PCR, điều này tương đương với 1×10-6/ (6,4×109×650) = 2,4 × 10-19mol, khi đó DNA của người có khoảng 6,4×109 bp của DNA và khối lượng trung bìnhcủa bp là 650 Da Thành ra 1 μg DNA của người tương ứng 2,4 ×10-

19mol×6×1023(Avogadro’s number)=khoảng 144.000 phân tử.Điều này có nghĩa là với

1 gen đơn trong 1 μg sẽ tạo ra 288.000 DNA đôi Tám triệu lần khuếch đại của một

1000 bp trong genomic DNA, trải qua 25 chu kì PCR, khoảng 10 μg của 1000bp củađoạn DNA Với một phần nhỏ sản phẩm của PCR đủ để phát hiện bằng ethidiumbromide trên điện di agarose

4.4 MỒI OLIGONUCLEOTIDE

Sự thành công trong một thí nghiệm PCR là gần như hoàn toàn phụ thuộc khimồi oligonucleotide Các đoạn mồi cần phải được thiết kế để nhận ra đoạn DNA màchúng cần được nhân lên Mồi có những đặc điểm sau đây

+ Độ dài mồi khoảng 17-30 nucleotid

+ Số lượng G và C vào khoảng 50%

+ Cách tính nhiệt độ của các cặp mồi được tính theo công thức 2(A+T) +4(G+C)- sử dụng làm thí nghiệm xấp sỉ bằng nhau

+Các mồi riêng lẻ không nên bắt cặp bổ sung với nhau Ví dụ, một mồi có trình

tự như sau 5’-GAGATCGATGCATCGATCTC-3’ có thể là một lựa chọn tốt cho mồiPCR (dài 20 nucleotid, 50% GC, không có sự bắt cặp giữa các trình tự), nhưng nó sẽtạo thành cấu trúc kẹp nếu đầu 5’ kết thúc liên kết với 3’ kết thúc có thể gây khó khăntrong việc bắt cặp của mồi trong phản ứng PCR nên không khuếch đại được

Hình 4.5 Các vị trí của mồi để khuếch đại một phần của gen GAL4 từ Saccharomyces

cerevisiae

(a) Các trình tự DNA, và acid amin tương ứng trình tự, một phần của genGAL4 Các chuỗi ADN mã hóa đầu tiên 100 axit amin của protein Gal4p được thểhiện với màu nâu Các vị trí của mồi để khuếch đại trình tự này được hiển thị Lưu ýrằng mồi 1 là cùng trình tự như là mạch xuôi (sense strand) và sẽ do đó liên kết với cácmạch ngược (antisense strand) và DNA polymerase sẽ tổng hợp ra một sợi mới Tương

tự như vậy, mồi 2 là trình tự giống như mạch antisense, để nó nhận ra các mạch sense

và sẽ dẫn đến sự hình thành của một mạch antisense mới

(b) Các kết quả của thí nghiệm PCR được thực hiện với mồi của chính nó, hoặc

là sự kết hợp của cả hai mồi Các sản phẩm PCR sẽ được nhìn thấy sau khi ethidiumbromide phát huỳnh quang trên gel agarose

Không nên có sự bắt cặp bổ sung giữa hai mồi hoặc trong đầu 3’ của một mồi

Ví dụ, hai mồi sau đây lần nữa xuất hiện là một sự lựa chọn tốt:

5’-GATCGATCGATACGTGATCC-3’ và

5’-CGTAGCTAGCTAGGATCACG-3’

Tuy nhiên, đầu 3’ của những đoạn mồi được bổ sung cho nhau và có thể xảy raviệc tự bắt cặp mồi, điều này có thể sẽ được nhân lên trong các chu kỳ đầu tiên củaphản ứng PCR:

Hầu hết mồi phù hợp với các tiêu chí trên có thể được sử dụng trong thí nghiệmPCR, nhưng một số gói phần mềm miễn phí sẵn có, bao gồm cả một số trong đó đượcdựa trên web, đã được viết để hỗ trợ việc thiết kế mồi (Rozen và Skaletsky, 1998)

4.4.1 Tổng hợp mồi Oligonucleotide

Hầu hết các oligonucleotides được thực hiện trên việc tổng hợp acid nucleicbằng cách sử dụng phương pháp phosphoramidite hóa học Phosphoramiditeoligonucleotide được tổng hợp hóa học đã được giới thiệu gần 20 năm trước (McBride

và Caruthers, 1983) Các khối được sử dụng để tổng hợp được DNA phosphoramiditenucleoside (đôi khi được gọi là monome) Đây là những sửa đổi để ngăn chặn sự bắtcặp hoặc phản ứng phụ không mong muốn khác xảy ra trong quá trình tổng hợp.Chúng sửa đổi đầu 5’ (với một nhóm dimethoxytrityl) và đầu 3’ (với một β-cyanoethyl bảo vệ nhóm 3’-phosphite), và cũng có thể bao gồm thêm sửa đổi để bảo

vệ các amin trong phản ứng chính có các cấu trúc vòng nucleoside

Phosphoramidite dẫn đến việc tổng hợp oligonucleotide diễn ra trong bốn bướcnhư hình 4.6 Tự tổng hợp được thực hiện trên các chất hỗ trợ, thường dùngpolystyrene Polystyrene được nạp vào một cột nhỏ như các buồng phản ứng Một cộtnạp được gắn vào đường dây phân phối thuốc thử trên một tác nhân tổng hợp DNA vàhóa chất phản ứng tiến hành dưới sự kiểm soát máy tính Căn cứ được thêm vào chuỗingày càng tăng theo một chiều 3’-5’ (ngược với sự tổng hợp enzyme của polymeraseDNA) Tổng hợp là bắt đầu sử dụng polystyrene, đã tác động với base đầu tiên thôngmột liên kết este tại 3’-hydroxyl (Hình 4.6 (a))

Sự tổng hợp primer bắt đầu bằng sự phân cắt của nhóm 5’-trityl (hình 4.6 (b))bằng cách sử lí với axit Monomer kích hoạt bởi tetrazole được nối với 5’-hydroxyl(hình 4.6 (c)) và kết quả là liên kết phosphite bị ôxi hóa thành phosphate bằng cách xử

lý với i-ốt (hình 4.6 (d)) Điều đó hoàn tất một 'chu kỳ' của tổng hợp oligonucleotide