Bài giảng kỹ thuật FISH

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT LAI TẠI CHỖ HUỲNH QUANG ĐỂ PHÁT HIỆN SỚM MỘT SỐ BẤT THƯỜNG NHIỄM SẮC THỂ PGS.. ứng dụng kỹ thuật fish trong chẩn đoán trước sinh một số bất thường nst 3.. ứng dụng kỹ

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT LAI TẠI CHỖ HUỲNH QUANG ĐỂ PHÁT HIỆN SỚM MỘT SỐ BẤT THƯỜNG NHIỄM SẮC THỂ

PGS TS Trần Thị Thanh Hương

đề tài khoa học công nghệ cấp bộ

DTTB – PT: FISH

Tiêu chuẩn phát hiện ĐB NST

phát hiện

BĐ gen Phát hiện ĐB NST: SL, RL nhỏ

Các loại ADN dò

ADN dß ph?n tâm

ADN dß đ?u mút

ADN dß t?

ch?c h?ch nhân

ADN dß l?p đ?c hi?u trên b ăng R

ADN dß toànb? NST

ADN dß đ?c hi?u nhánh NST ADN dß đ?c hi?u locus

TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU KT FISH

• 2004 BM YSH – DT ĐHYHN: hoàn chỉnh, CĐTS HC Down

• 2007 viện HH-TM: CĐ leceumia

DTTB khó hoặc không thể phát hiện

1 Hoàn chỉnh kỹ thuật FISH trên NST ở kỳ giữa và trên

nhân tế bào gian kỳ của đầu dò ADN 13, 18, 21, X, Y

sinh một số bất thường NST 13, 18, 21, X, Y

loạn cấu trúc NST liên quan NST 21, NST X

Dị dạng chi, nội quan

Lấy mẫu – làm tiêu bản

Lai ADN dò và ADN đích

Nhuộm mẫu lai bằng thuốc nhuộm huỳnh quang

Phân tích tín hiệu lai dưới KHV huỳnh quang(50 nhân gian kỳ/mẫu - 20 cụm kỳ giữa/mẫu)

1 Lµm tiªu b¶n TB èi ë gian

4 Nhu m m u lai b ng ộ ẫ ằ

thu c nhu m huúnh quang ố ộ

QUY TRÌNH THỰC HIỆN KT FISH (Vysis)

§Çu dß ADN TelXp Phin läc green

1 Không đánh giá vì hai

tế bào chồng lên nhau

T­ vÊn DT Theo dâi –

QT mang thai, sau sinh

1 Hoàn chỉnh kỹ thuật FISH

2 ứng dụng kỹ thuật fish trong chẩn

đoán trước sinh một số bất thường nst

3 ứng dụng kỹ thuật fish trong chẩn

đoán một số rối loạn nst

Bảng 1 Kết quả hoàn chỉnh kỹ thuật FISH với đầu dò ADN 13, 18, 21, X, Y trên nhân gian kỳ

M u ẫ TuÇn thai

KẾT QUẢ FISH (sè tÝn hiÖu lai)

KÕt qu¶ DTTB

HOÀN CHỈNH CÁC NỘI DUNG

• Thể tích dịch ối:

– Thai 15-18w: 5ml

– Thai 28-32w: 10ml

• Xử lý nhân TB

– Loại trừ máu mẹ (nếu lẫn)

– Trypsin 0,25% trong 15 – 25’ tuỳ thuộc tuần thai

• Biến tính ADN: 730C x 3’

• Lai ADN dò và ADN đích:

– thể tích vùng lai giảm từ 22x22mm xuống 10x10mm

– Thời gian lai 20-22h

• Phân tích tín hiệu lai

– Tín hiệu lai thật: phát sóng ở bước sóng đặc hiệu & kích thước

ổn định

– Tín hiệu lai giả: phát sáng dưới nhiều phin lọc, kích thước không

Kết quả FISH trên nhân tế bào gian kỳ của đầu dò ADN

13, 18, 21, X, Y và karyotyp của thai nam bình thường

Đầu dò ADN 13, 21

NST 21

NST 21 NST 13

NST 13

Đầu dò ADN 18, X, Y

NST 18

NST 18 NST X

NST Y

Trước sinh Đầu dũ ADN 13, 21

Kết quả FISH trờn nhõn tế bào gian kỳ của đầu dũ ADN

13, 18, 21, X, Y và karyotyp của thai nữ bỡnh thường

Bảng 2 Kết quả hoàn chỉnh kỹ thuật FISH với các đầu dò ADN 13, 18, 21, X, Y và Tel Xp/Yp; Tel Xq/Yq trên NST kỳ giữa

HOÀN CHỈNH CÁC NỘI DUNG

• Thu hoạch TB kỳ giữa: colcemid, KCl/huyÕt thanh, carnoy

• Phun tiêu bản: lam lạnh kèm kéo dài khử nước bằng

cồn 70%/2’, 80%/2’, 100%/2’.

• Biến tính ADN: 730C x 5’

• Lai ADN dò và ADN đích:

– thể tích vùng lai giảm từ 22x22mm xuống 10x10mm

– Thời gian lai 420C: 20-22h (13, 18, 21, X, Y )

22-24h (TelXp/Yp; TelXq/Yq)

• Phân tích tín hiệu lai: tín hiệu lai nằm trên NST 

đánh giá dễ hơn nhân gian kỳ

Đầu dò Telq/Yq trên NST kỳ giữa của thai nam bình thường

TelYq

TelXq

Đầu dò TelXp/Yp trên NST kỳ

giữa của thai nam bình thường

TelXp

TelYp

2 ứng dụng kỹ thuật fish trong chẩn đoán

trước sinh một số bất thường nst

Kết quả chẩn đoỏn trước sinh một số bất thường NST

Kết quả chẩn đoán trước sinh hội chứng Turner

Đối chiếu kết quả siêu âm – FISH – DTTB trong hội chứng Turner

Kết quả FISH trên nhân TB gian kỳ

và karyotyp của thai hội chứng Turner

NST X

NST 18

NST 18

Sơ đồ đối chiếu kết quả siêu âm nang bạch huyết với các bất thường NST

Kết quả chẩn đoán trước sinh hội chứng Down

Đối chiếu kết quả siêu âm – FISH – DTTB trong hội chứng Down

Sè l­

îng

FISH (sè tÝn hiÖu lai trªn NST)

Kết quả FISH trên nhân TB gian kỳ

và karyotyp của thai hội chứng Down

NST 13

NST 13 NST 21

NST 21 NST 21

Kết quả sàng lọc huyết thanh mẹ

của thai hội chứng Down

MoM

Thai

Kết quả chẩn đoán trước sinh hội chứng Edward

Đối chiếu kết quả siêu âm – FISH – DTTB trong h/c Edward

Sè l­

îng

mÉu KÕt quả siªu ©m

FISH (số tÝn hiÖu lai trên NST)

Dµy da g¸y 22 33 22 12 10 47, XY, +1847, XX, +18

1 Héi chøng Dandy Walker,

dÞ d¹ng tim, ch©n tay vÑo 2 3 2 1 1 47, XY, +18

1 Ch©n tay vÑo, søt m«i hë

hµm 2 3 2 1 1 47, XY, +18

Kết quả FISH trên nhân TB gian kỳ

và karyotyp của thai hội chứng Edward

NST X

NST X NST 18 NST 18

Kết quả sàng lọc huyết thanh mẹ

của thai hội chứng Edward

3 øng dông kü thuËt fish trong chÈn ®o¸n mét sè rèi lo¹n nst

 Bệnh nhân B.T.H 24 tuổi

Biểu hiện LS: HC Turner

Karyotyp 46,X, i(Xq)

Kết quả FISH trên cụm NST kỳ giữa

với đầu dò ADN Xq/Yq

NST isoXq

NST X

Thai phụ Đ.T.T.H, 32 tuổi

TS sinh con Down

Karyotyp: 45,XX,t(14;21)

Kết quả FISH trên cụm NST kỳ giữa

với đầu dò ADN 13, 21

NST t(13;13)

NST 13

NST 21

NST 21

Bệnh nhân T.T.M.H, 12 tuổi

Biểu hiện LS: HC Down

Karyotyp: 46,XX,idic(21)(pterq22.3::q22.3pter)

Kết quả FISH trên cụm NST kỳ giữa

với đầu dò ADN 13, 21

NST idic(21)(pter → q22.3::q22.3 → pter)

NST 13

NST 13

NST 21

Bệnh nhân L.H.N, 22 tuổi Biểu hiện LS: vô kinh I, lùn Karyotyp: 46,X,del(Xq),del(telXp)

Kết quả FISH trên cụm NST kỳ giữa

với đầu dò ADN 18, X, Y

NST del(Xq),del(telXp) NST 18

NST 18 NST X

Kết quả FISH trên cụm NST kỳ giữa

với đầu dò ADN TelXp/Yp

Tel Xp

Trẻ nam, karyotyp 46,XX Kết quả PCR: gen TDF (+)

Kết quả FISH trên cụm NST kỳ giữa

với đầu dò ADN 18, X, Y

NST Y NST X

NST 18

1 Hoàn chỉnh kỹ thuật FISH

- Thể tích dịch ối: thai 15-18w: 5ml, thai 28-32w:10ml

- Biến tính AND: 730C/3phút

- Lai: 420C/20h

- Giảm diện tích vùng lai xuống 10 x 10mm

giữa:

- Lam lạnh kết hợp khử nước alcol 70%, 80%, 100% (2 phút/bước)

 NST phân tán tốt, tín hiệu lai rõ

- Đầu dò Tel Xp/Yp và Tel Xq/Yq: biến tính 730C/5phút; lai

420C/24h )

3 ứng dụng kt FISH để xác định một số rlNST mà dttb khó hoặc không phát hiện được

- Trẻ nam 46,XX, TDF (+) Kết quả FISH phù hợp với kỹ thuật PCR

25 Turner; 9 thai Down; 7 thai Edward; 1 thai Patau.

- Kết quả FISH phù hợp với di truyền tế bào 100%.

Những đóng góp mới của đề tài

1 Khẳng định giá trị của KT FISH phát hiện đúng và sớm một số RLNST trong CĐTS.

2 Đã hợp tác với BV PSTW, BV PSHN, khoa Sản

BV BM ứng dụng KT DTTB và KT FISH trong

CĐTS , tư vấn DT nhằm giảm tỷ lệ sinh con dị tật.

3 áp dụng KT FISH phát hiện một số RLVCDT mà DTTB - phân tích NST khó hoặc không phát hiện

được.

con dÞ tËt.