BAI 8.SINH TỔNG HỢP PROTEIN

HỌC THUYẾT TRUNG TÂM 8.1.1 Các đặc điểm của quá trình tổng hợp protein 2  Khuôn mẫu để tổng hợp nên protein không phải là protein Nơi chứa DNA mang thông tin di truyền và chỗ sinh t

SINH TỔNG HỢP PROTEIN

1

BÀI 8:

GV: ThS Chu Thị Bích Phượng

8.1 HỌC THUYẾT TRUNG TÂM 8.1.1 Các đặc điểm của quá trình tổng hợp protein

2

 Khuôn mẫu để tổng hợp nên protein không phải là protein

Nơi chứa DNA mang thông tin di truyền và chỗ sinh tổng hợp protein tách rời nhau về không gian

RNA là chất trung gian chuyển thông tin từ DNA ra tế bào chất và làm khuôn để tổng hợp protein

HỌC THUYẾT TRUNG TÂM (central dogma)

(Crick - 1956 )

Trình tự đặc hiệu của các amino acid trên phân tử protein sẽ

được mã hóa bằng nhóm các nucleotide trên phân tử DNA

Đơn vị mã hóa (codon) gồm 3 nucleotide

3

8.1 HỌC THUYẾT TRUNG TÂM

8.1.1 DNA và mã di truyền

Bảng mã

di truyền

 Codon kết thúc

 Tính suy biến

 Tính phổ biến

8.2.1 Nguyên tắc chung

- Chỉ một trong hai mạch của phân tử DNA được dùng làm khuôn tổng hợp RNA

- Enzyme mRNA-polymerase bám vào DNA làm tách mạch và di chuyển theo hướng 3’ đến 5’ trên DNA để mRNA được tổng hợp theo hướng 5’ đến 3’

4

Tên gọi chính xác: RNA polymerase phụ thuộc DNA

Ở prokaryote sự phiên mã có đặc điểm:

- Chỉ có một loại RNA-polymerase tổng hợp tất cả các loại RNA

- mRNA thường chứa thông tin nhiều gene nối tiếp

5

8.2.2 Sự phiên mã ở prokaryote

Promoter: nơi bám vào DNA của RNA polymerase – đoạn

khởi động

CAT: điểm xuất phát phiên mã (CAT nằm cách khoảng 7

base phía sau chỗ bám về phía đầu 3’ mạch bổ sung

6

8.2.2 Sự phiên mã ở prokaryote

7

8.2.2 Sự phiên mã ở prokaryote

8

8.2.2 Sự phiên mã ở eukaryote Phiên mã ở eukaryote có các đặc điểm sau:

• RNA-polymerase II chịu trách nhiệm tổng hợp mRNA còn hai RNA – polymerase khác tổng hợp RNA của ribosome và các loại RNA khác

• mRNA chứa thông tin của 1 gene

• Gen của eukaryote có tính gián đoạn: bao gồm các exon và các intron

• Qua trình phiên mã phức tạp hơn nhiều: ở đầu 5’ của mRNA có gắn chóp là 7-methylguanosine còn cuối mRNA phía 3’ có thêm đuôi polyadenine dài 100-200 adenine

• Đặc biệt là bản phiên mã đầu tiên còn gọi là tiền mRNA chưa được sử dụng trực tiếp mà phải qua quá trình chế biến

3 giai đoạn:

- Gắn chóp: gắn 7-methyl-Guanylate vào đầu 5’P

- Thêm đuôi: nối poly -A vào đầu 3’OH

- Cắt nối: cắt bỏ các intron, nối các exon lại với nhau 9

8.2.2 Sự phiên mã ở eukaryote

3 Loại:

 rRNA: chiếm tỉ lệ cao, có thể đến 75% của tổng RNA của tế bào, là thành phần căn bản của các ribosome

 tRNA:

10

8.2.3 Phân loại rRNA

ít nhất mỗi loại tRNA

20 amino acid

tRNA chiều dài khoảng 73 đến 93 nucleotide, cấu trúc gồm một mạch cuộn lại như hình lá chẻ ba nhờ

bắt cặp bên trong phân tử, và đầu mút 3' có

trình tự kết thúc CCA

amino acid luôn luôn gắn vào đầu CCA

- Ít nhất mỗi loại tRNA đặc hiệu cho 1 trong 20 amino acid Amino acid với tRNA bởi enzyme aminoacyl-tRNA synthetase

 mRNA:

11

8.3 QUÁ TRÌNH DỊCH MÃ (TRANSLATION)

8.2.2 Ribosome

Ribosome: gồm rRNA,

enzyme và các protein cấu trúc

- 2 tiểu đơn vị: Đơn vị lớn của

ribosome của Prokaryote gồm

2 phân tử rRNA và 35 protein;

đơn vị nhỏ có một rRNA và

khoảng 20 protein

- Khi không thực hiện tổng hợp

protein, mỗi đơn vị tồn tại

tách rời trong tế bào chất

12

8.3 QUÁ TRÌNH DỊCH MÃ (TRANSLATION) 8.2.2 Các giai đoạn

3 giai đoạn:

+ Khởi sự + Nối dài + Kết thúc

13

8.3 QUÁ TRÌNH DỊCH MÃ (TRANSLATION) 8.2.2 Các giai đoạn

+ Khởi sự Nhân tố

khởi sự IF

Codon bắt đầu: AUG

mã hóa methionine

Khi tRNA khởi sự gắn với đơn

vị nhỏ ribosome, phức hợp sẽ

bám vào các trình tự nhận biết

đặc biệt của ribosome dở đầu 5'

hóa cho protein Nhờ đó,

anticodon của

tRNA-methyoninee khởi sự bắt cặp với

codon xuất phát AUG trên

đó, đơn vị lớn và nhỏ gắn vào

vẹn

- tRNA khác mang anticodon tương ứng bắt cặp với codon ở điểm-A (A-site) còn trống

- Tiếp theo amino acid đã được gắn tRNA nằm ở điểm -P được tách ra gắn với amino acid trên tRNA ở điểm-A

- tRNA ở điểm-P sẽ được phóng thích

- Phản ứng nối các amino acid kề nhau được xúc tác bởi enzyme peptidyl transferase

- Ribosome di chuyển từ đầu 5' của mRNA đến đầu 3'

14

8.3 QUÁ TRÌNH DỊCH MÃ (TRANSLATION) 8.2.2 Các giai đoạn

+ Nối dài

15

8.3 QUÁ TRÌNH DỊCH MÃ (TRANSLATION) 8.2.2 Các giai đoạn

+ Nối dài

16

8.3 QUÁ TRÌNH DỊCH MÃ (TRANSLATION) 8.2.2 Các giai đoạn

+ Kết thúc

Nhân tố tách mạch RF Codon kết thúc: UAA, UAG, UGA

17

8.3 KỸ THUẬT TÁI TỔ HỢP DNA

2 ENZYME CẮT GIỚI HẠN

18

Enzyme là công cụ hữu hiệu được sử dụng trong quá trình cắt, nối

và chép gen Các enzyme nuclease, ligase, DNA polymerase,… và có vai trò hàng đầu là các enzyme cắt giới h

 Enzyme cắt giới hạn (Restriction Endonucleases)

19

- Là các enzyme nội sinh đặc biệt (phát hiện đầu tiên ở tế bào

vi khuẩn Haemophilus influenzae – Hind II)

- Có thể nhận biết một trình tự nucleotide đặc hiệu trong chuỗi DNA sợi đôi và cắt cả hai sợi DNA đó

Enzyme giới hạn

trong tế bào có vai

trò phát hiện và phân

cắt DNA của các tế

bào lạ Chúng không

phân cắt DNA của

chính chúng do trong

tế bào còn tồn tại hệ

thống enzyme cải

biên (thường là

enzyme methylase –

methyl hóa cytosine

ở vị trí C5 và

adenine ở vị trí C6

thuộc vùng giới hạn

– chuỗi đích)

enzyme cải biên

bảo vệ DNA

Bảng 1 Các loại enzyme giới hạn chính

20

Công bố mới nhất hiện nay có 3945 RE, trong đó có 3834 enzyme loại II (97%) và 641 enzyme loại này được thương mại hóa (R Roberts, 2009)

(http://rebase.neb.com/rebase/rebase.html)

Enzyme loại

2 nhận biết DNA mạch kép ở những trình tự nhận biết và cắt DNA ở điểm này hay điểm kế cận

Enzyme giới hạn loại II là các endonuclease cắt DNA ở các vị trí chuyên biệt  sử dụng trong các nghiên cứu

về sinh học phân tử

21

2 dạng cắt:

 Cắt đầu dính (sticky ends)

 Cắt đầu bằng (blunt ends)

Palindrome

Enzyme nối: ligase

22

- Nối một sợi đơn không liên tục trong chuỗi kép DNA

- Nối vị trí bị đứt gãy ở cả 2 mạch DNA bổ sung với nhau trong chuỗi kép DNA

Enzyme nối: ligase

23

Cơ chế: Hình thành cầu nối phosphodiester giữa nhóm 3’-hydroxyl của một nucleotide này với nhóm phosphate của một nucleotide khác

Video: enzyme cắt giới hạn

DNA ligase

24

3 CÁC VECTOR

25

Khái niệm về vector

Là 1 phân tử DNA có khả năng

tự tái sinh, tồn tại độc lập trong

tế bào và mang được gen cần chuyển:

 Có điểm khởi đầu sao chép ori

để có thể tự sao chép mà tồn tại độc lập

 Có trình tự nhận biết để RE cắt

và gắn đoạn gen mới vào

Có trình tự điều hòa (promoter) tạo thuận lợi cho sự phiên mã gen lạ

Có các gen đánh dấu để dễ dàng phát hiện ra chúng và các gen lạ gắn vào

Để chuyển gen từ Sv này sang Sv khác có thể thực hiện bằng cách biến nạp hoặc bơm trực tiếp DNA vào TB Tuy nhiên:

-Phần lớn DNA xâm nhập vào tb sẽ bị phân hủy hoặc mất sau qtr phân bào -Gen thường chỉ có 1 đoạn duy nhất, rất nhỏ so với chiều dài

bộ máy DNA  khó

mong muốn

 Muốn chuyển gen

có chủ định phải sao chép ra nhiều bản

Plasmid

27

Plasmid thường

thấy ở tế bào vi

khuẩn, và nấm

men, có kích thước

từ 1 – 1000 kbp, số

lượng có thể thay

đổi từ 1 – 1000 ,

được xem là bộ gen

di động vì có khả

năng tiếp hợp, một

cơ chế chuyển gen

theo chiều dọc

Plasmid là một công cụ quan trọng trong CNDT và SHPT

để nhân hay biểu hiện gen đặc biệt Gen mong muốn chèn vào plasmid sau đó plasmid chèn vào VK Sử dụng chất kháng sinh để chọn lọc

Hai trường hợp tồn tại của

plasmid ở trong tế bào VK

CÁC VECTOR

Các ứng dụng của vector

• Tạo dòng và khuếch đại trình tự của DNA

• Nghiên cứu sự biểu hiện của 1 đoạn trình tự DNA

• Đưa gen vào các tế bào vi sinh vật hay động thực vật

• Sản xuất RNA

• Sản xuất protein từ gen được tạo dòng

CÁC VECTOR Các loại plasmid

• Plasmid thế hệ thứ nhất: tìm thấy trong tự nhiên (ColE1, pSC101 )

ColE1

Plasmid thế hệ

thứ 1 hiện nay

không sd nữa

CÁC VECTOR Các loại plasmid

• Plasmid thế hệ thứ hai: tập trung các đặc tính quý của plasmid tự nhiên vào 1 cấu trúc duy nhất (các pBR, ví dụ: pBR322)

pBR322

Có khả năng sao chép độc lập với tế bào E coli và tồn tại trung bình từ

20 – 30 bản sao cho 1 tê bào

pBR322 có chứa gen kháng Amp, gen kháng Tetra và nhiều trình tự nhận biết của enzme cắt giới hạn

CÁC VECTOR Các loại plasmid

• Plasmid thế hệ thứ ba: mạnh nhất hiện nay

Có kích thước nhỏ, mang 1 polylinker (nhóm

pUC, nhóm pSP và Gemini, nhóm Bluescript)

pUC 18

Plasmid đa

năng và chuyên

dụng Polylinker

có chứa cả chục

trình tự nhận

biết khác nhau

CÁC VECTOR

Các phage:

Là virus xâm nhiễm và phân giải VK

Ưu điểm:

Xâm nhập dễ dàng vào TB vi khuẩn và có khả năng sinh sôi nhanh, hiệu quả

Kích thước nhận lớn hơn plasmid

Nhược điểm:

Thao tác phức tạp

Lamda phage

CÁC VECTOR

Sự chuyển gen bởi phage lamda

Ưu điểm nổi bật

của phage là có

xâm nhập và sinh

chủ

Phage 

34

VECTOR TÁI TỔ HỢP

35

Vetor tái tổ hợp (recombinant vector)

Định nghĩa:

Vector chuyển gen + DNA lạ = vector tái tổ hợp (Plasmid + DNA lạ = plasmid tái tổ hợp)

36

VIDEO: DNA recombinant

Vector tái tổ hợp

 Qua 3 bước chính:

B1: Tách DNA plasmid và

DNA tế bào cho

B2: Cắt DNA plasmid và DNA tế bào cho với cùng một loại emzim giới hạn

B3: Nối DNA plasmid và DNA tế bào cho nhờ enzim nối ligase tạo thành vector tái tổ hợp

Ứng dụng:

Insuline là một protein do tuyến tụy tiết ra để điều hòa lượng đường trong máu Cơ thể thiếu insulin dẫn đến quá trình rối loạn TDC làm tích tụ đường trong nước tiểu Trước đây, insulin được trích từ tuyến tụy của gia súc hoặc tổng hợp hóa học qua 170 phản ứng khác nhau  chuyển gen tổng hợp insulin vào E.coli nuôi cấy

1 tg ngắn thu được 200 g insulin tương đương lượng chiết từ 8000 – 10.000 con bò

Interferon: trước đây phải tách chiết từ máu nên rất tốn kém  từ

1980 đã điều chế thành công interferon bằng cách nuôi cấy E coli

HGH (somatotropin): thông thường muốn chế được HGH phải chích từ tuyến yên của tử thi, muốn chữa bệnh lùn cần HGH từ 100 –

150 tử thi  1 lit dịch E coli lên men thu lượng HGH tương đương 60 tử thi