bài giảng về flavonoid

- Có hoạt tính phytoestrogen: chống ung thư, loãng xương, tim mạch.. - Flavon - Flavonol- Flavanon - Flavanonol - Chalcon - Dihydrochalcon DHC - Auron - Anthocyanidin AC - Catechin

1

• Cấu trúc cơ bản của 3 nhóm Flavonoid.

• Các tính chất căn bản của Flavonoid

• Nguyên tắc chiết xuất, định tính, định lượng Flavonoid

• Các tác dụng & công dụng của Flavonoid

• Một số dược liệu chứa Flavonoid chính

- hoa Hòe - Diếp cá - Núc nác

- Râu mèo - Artisô - Kim ngân

- Hoàng cầm - Hồng hoa - Dây mật - Tô mộc

Carotenoid

Xanthon

Quinon Alkaloid

sắc tố hoa …

• Flavonoids là nhóm chất lớn trong thực vật, khoảng

6000 chất đã biết Vai trò trong cây cỏ bao gồm: hấp

thu UV, gây ngán ăn, dẫn dụ côn trùng gây thụ phấn

• Khung cơ bản có 15 C (C6-C3-C6)

• Được nhiều nhà hóa học, dược học, sinh học quan tâm

- 1664, R Boyle: hoa Viola tricolor (Pensée) → màu tím (màu xanh / kiềm, tím / trung tính, đỏ / acid).

- 1814, Chevreul : gỗ Morus tinctoria → Morin

- 1835, L.C Marquart : hoa Centaurea cyanus

→ anthocyanin (Δ’ 2-benzo pyrilium)

Sau đó, đã phân lập:

- phloridzin / Táo (1835), naringin / Bưởi (1857),

- glycyphyllin / Smilax glycyphylla (1881)

Về mặt hóa học

Sự liên quan về̀ cấu tạo hóa học chưa được làm rõ,

các nghiên cứu chưa hệ thống → tên không thống nhất

anthoxanthin, anthoxanthidin, anthocyanin, anthochlor, chymochromeNăm 1952 :

T.A Geissman : → Flavone (Δ’ 2-phenyl chromon)

→ những chất # Flavone này được gọi là Flavonoid

- do từ-nguyên (flavus = màu vàng)

- do chất flavone của T.A Geissman FLAVONOID

Về mặt dược học

- Derris elliptica thuốc cá, diệt côn trùng (rotenon) →

- 1938, S Györgyi → vitamin P → Citrin

(hesperidin + eriodictyol) chống xuất huyết

- 1954, Bradbury & White → Formononetin và Genistein từ cỏ Trifolium (làm cừu ↓ sinh sản)

- 1970, Kupchan → eupatin, eupatoretin,

centaureidin (kháng khối u)

- từ Pueraria trilobata → Daidzein

- từ Glycine max → Genistein và Daidzein

γ -pyron (flavilium)

benzo pyrilium pyran dihydropyran γ -pyron dihydroγ -pyron

CÁC KHUNG CƠ BẢN

eu-flavonoid iso-flavonoid neo-flavonoid

Vị trí vòng B trên vòng chroman

CẤU TRÚC FLAVONOID

(C6 - C3) - C6 diphenyl propan

B

A

O

O OH

O

A

B C

B

C

1 5

4

3 2

7

2

3 4 5

6

7

1

3 5

7

3 4

6

5 1

B: số phụ

I EU-FLAVONOID

- Xuất hiện ít, thường không màu, chủ

yếu trong họ Đậu, Lay ơn

- Có hoạt tính phytoestrogen: chống ung

thư, loãng xương, tim mạch

Isoflavone từ đậu nành

III NEO-FLAVONOID O

4

2 3

4-phenyl chroman 4-phenyl coumarin

brazilein

(tô mộc)

O

O HO

Thường xuất hiện trong họ Bứa, Đậu

- ít quan trọng, chủ yếu gặp / ngành Hạt trần

- Cấu trúc : Flavonoid – Flavonoid (dimer)

- Đại đa số : Flavon(ol) – Flavon(ol)

(apigenin – apigenin)

- Thường : nối C-C (~120 chất), C-O-C (~20 chất)

C4’ - C6 : robusta-flavonC6 - C6 : cupressu-flavonC3' - C8 : amento-flavonC6 - C8 : agathis-flavon

IV BI-FLAVONOID

O

O OH

MeO

OMe O

O OH

HO

OH

3' 8

Ginkgetin /Ginkgo biloba

Kháng viêm, thiếu máu não

V CẤU TRÚC KHÁC

O HO

OH

OH OH

OH

O HO

OH OH OH

OH

O HO

OH

OH OH

OH

proanthocyanidin

Chống oxi hóa

OH OMe

silybin / Silybum marianum

Flavo-Lignan

OR OR

- Flavon - Flavonol

- Flavanon - Flavanonol

- Chalcon - Dihydrochalcon (DHC)

- Auron - Anthocyanidin (AC)

- Catechin - Leuco-anthocyanidin (LAC)

PHÂN LOẠI EU-FLAVONOID

mức độoxy hóatăng dần

Flavonol (tính Oxy hóa mạnh nhất)

Anthocyanidin, Flavon,

Flavanonol, Flavanon, LAC,

Catechin (tính Oxy hóa yếu nhất)

OH Flavon

apigenin luteolin tricetin

Kháng oxi hóa

Kháng viêm

Gout

Chống dị ứng Kháng viêm Kháng ung thư

Kháng oxi hóa Kháng ung thư

OH HO

OH HO

O

O

O

OH OH HO

O

O

O OH

OH

OH OMe

O HO

hesperidin

iso-liquiritigenin

OH HO

Chalcon

butein

OH HO

OH O

OH

OH OH

OH

HO

O OH

phloretin

Dihydrochalcon (DHC)

O OH

nubigenol

O

O OH

OH

OH

OH

HO O

O OH

OH

OH HO

O

O OH

OH HO

bracteatin4,6,4’-

trihydroxy auron

O HO

OH OH OH

OH

O HO

OH OH OH

O HO

OH

OH OH OH

OH

O HO

OH

OH OH OH

OH HO

leuco-cyanidin

Nghiên cứu gần đây cho thấy

naringenin chống tăng sinh tế

bào ung thư tuyến tiền liệt.

(Phytomedicine 13 (9-10),

732-4 2006.)

ISOFLAVONOIDS

6 6a

7 8

2 3

6a 7

9 10 11

O

Phân loại isoflavonoid

- Hoạt tính estrogen

- Ngăn ngừa ung thư phổi

- Giảm cholesterol

- Chống loãng xương

COOH

OH OH

O P

CH 2

COOH

C COOH O

41Phần C3 + C6 (B)

CH 2

O H

C OH

CH 2

O H

CH 3 C CH 2 C CH 2 C OH

O O

O

HO O

OH

C

O O

CH 3

O O

tạo chalcon

3 đơn vị acetic

kết hợp với C6 – C3

Sinh tổng hợp theo con

đường mevalonat thông

qua malonyl CoA

Như vậy, phân tử flavonoid được sinh tổng hợp từ hai tiền chất:

- Theo con đường shikimic acid thông qua phenylalanin sẽ hình thành vòng B và khung 3 cacbon của flavonoid

- Theo con đường mevalonat thông qua malonyl CoA tạo thành vòng A của flavonoid

Ý NGHĨA VỀ MẶT CẤU TRÚC

3.1 Trạng thái

• Flavonoid được phân lập dưới dạng

- genin/glycosid : hầu hết flavon(ol), flavanon, chalcon

- chủ yếu genin : flavanonol, catechin, LAC, biflavonoid

- chủ yếu là glycosid : AC

• dạng glycosid thường khó kết tinh

• dạng genin thường kết tinh, điểm chảy cao

• biflavonoid thường bền, điểm chảy cao

3 LÝ TÍNH FLAVONOID

3.2 Màu sắc

- flavanon(ol), DHC : không màu

- catechin, LAC : không màu

- flavon, isoflavon : không màu → vàng nhạt

- flavonol : vàng nhạt → vàng

- chalcon, auron : vàng → đỏ cam

- anthocyanidin : vàng cam, đỏ, tím (tùy pH)

Trong cùng nhóm : càng ít OH → màu càng nhạt

47

3.3 Độ tan

3.3.1 Độ tan của genin

- tan / dung môi phân cực vừa đến ph.cực mạnh

(EtOAc, Me2CO, MeOH, EtOH )

- kém tan / d.môi kém ph.cực (hexan, Bz, EP, Et2O )

- càng nhiều OH → càng khó tan / d.môi kém ph.cực

- càng nhiều OMe → càng dễ tan / d.môi kém ph.cực

- tan / kiềm loãng, kém tan / dung dịch acid

3.3.2 Độ tan của glycosid

- tan trong MeOH, EtOH

- mạch đường dài / nhiều : có thể tan / nước nóng

- AC (ion, glycosid) : dễ tan / nước, cồn loãng

kém tan /cồn cao độ

- OH/C-7: tính acid → tan / NaOH, Na2CO3, NaHCO3

O OH

OH HO

O H

3 5

7

4'

6.1 Của các nhóm -OH

Có tính acid yếu (-OH/C-7 > 4' > 3' > 3, 5)

Tính acid giảm khi -OH ở gần chức carbonyl

6 HÓA TÍNH FLAVONOID

tính acid yếu

tính acid mạnh hơntính acid

mạnh hơn

6.1.1 Tạo glycosid với đường

- thường : glc, rha, gal, xyl là O-glyc ở 3,7, 4',5

- số mạch : 1, 2 mạch, ít khi > 3 mạch

- mỗi mạch gồm 1, 2, ít khi > 3 đường

- mạch thường thẳng, hiếm khi phân nhánh

- nếu có glc : sát genin (OH/C1 của ose → OH/genin)

- các biosid đáng chú ý: (R = αL-rha, G = βD-glc)

rutinose R1 → 6G gentibiose G1 → 6G

neohesperidose R1 → 2G sophorose G1 → 2G

6.1.2 Tạo muối

- với kiềm loãng : → phenolat kém bền (↑ màu)

- tạo sulfat-glycosid (-OH thành -OSO3K),

6.1.3 Tạo phức với ion kim loại

(Al+++, Fe+++, Mg++, Pb++, Zn++, Zr++)

Đặc biệt với (-OH/C-3; C-5) hoặc (o-diOH/B)

Các phức này có độ bền khác nhau / HCl

Căn cứ vào độ bền này → cấu trúc của flavonoid

(biết được nhóm OH thuộc vòng A hay B, C)

6.2 Hóa tính của vòng γ-pyron

6.2.1 Tính kiềm

- vòng γ-pyron : kiềm yếu, với acid → tạo muối kém bền

- flavon(ol) có thể tan một phần trong acid

- nhóm -OH / C-5, 7, 4' làm tăng tính kiềm của vòng C

- vòng pyrilium của anthocyanidin có tính kiềm mạnh

với acid → muối bền, tồn tại trong tự nhiên

Như vậy, flavonoid : lưỡng tính (vừa acid vừa kiềm)

6.2.2 Tính oxy hóa khử

a khi khử

vòng γ-pyron / γ-dihydropyron → vòng pyrilium

(tăng màu, quan trọng / định tính) Nếu có xúc tác, có thể khử → catechin hay LAC

b khi oxy hóa

flavanon → flavanonol → flavon → flavonol

6.3 Hóa tính của các vòng thơm (A và B)

Phản ứng thế azoic : tạo màu, dùng / định tính

Tác nhân : p-nitroanilin, acid sulfanilic đã được diazo-hóa,

Điều kiện : - môi trường kiềm yếu,

- các vị trí o- hay p-(/OH) còn trống

- không bị cản trở lập thể

O

O OH

OH HO

6.4.1 Kiềm phân eu-flavonoid

Flavonoid + kiềm đặc và nóng (NaOH 2M, KOH )

→ các mảnh nhỏ và đơn giản

So sánh các mảnh nhỏ này với các chuẩn có sẵn,

→ xác định cấu trúc của flavonoid

Quan trọng trong biện giải cấu trúc của flavonoid

O

OH OH OH

O

R O

OH

R O

H HO

- Trong môi trường kiềm, các iso-F có H-5 sẽ bị mất 1 carbon C-2, tạo deoxybenzoin thế và formiat

- Tách deoxybenzoin bằng Et2O / HCl; so sánh

(SKLM ) với các chuẩn (có nhóm R khác nhau),

→ cấu trúc ban đầu của iso-F

6.4.3 Thủy phân Flavonoid

Sự thủy phân dễ hay khó tùy theo

- loại glycosid (C-glycosid / O-glycosid),

- loại đường (-ose / -uronic),

- kiểu mạch đường (biose nối 1-2 / 1-6),

- vị trí gắn đường (vị trí số 3 / 7 / 4' )

- khung genin (flavon glycosid > flavonol glycosid)

Nói chung, C-glycosid bền hơn O-glycosid

O-glycosid : - glycuronid bền hơn glycosid -7-O > 4'-O > 3-O-glycosid

a Thủy phân bằng acid

Với HCl 2N / MeOH (1:1), cách thủy 1 giờ thì :

không thủy phân thphân 1 phần thphân h.toàn

Nếu nhóm -OH của ose bị acyl-hóa hoặc bisulfat-hóa

thì glycosid của chúng cũng có thể không bị thủy phân

Kiểm tra và theo dõi phản ứng thủy phân bằng SKLM

Có thể thủy phân flavonoid glycosid bằng nhiều cách:

b Thủy phân bằng kiềm loãng (KOH 0.5% / N2)

- Ít sử dụng đối với các flavonoid glycosid

- dùng để phân biệt 3-O- với 7-O- và glycosid

(3-O- bền hơn 7-O- và 4'-O-glycosid)

O

O

O O

O OH

ose

ose

ose 3

7

4'

- các biosid nối (1 → 2) bền hơn (1 → 6)

[neohesperidose bền hơn rutinose]

bị thủy phân sau 1-2 h

acid glucuronic glucuronidase

c Thủy phân bằng enzym

Mỗi loại enzym sẽ thủy phân 1 vài glycosid nhất định Các loại enzym này có bán sẵn trên thị trường

7.1 Dùng ROH + nước

- Thường : MeOH, EtOH (70-90%) nóng hoặc nguội

(thu được các glycosid + genin ph.cực + tạp ph.cực)

- Loại tạp kém phân cực bằng các d.môi kém ph.cực

- Kết tinh / tủa trong các dung môi thích hợp

- Thu được genin + tạp kém ph.cực (ch’ béo, chlorophyll) → loại tạp tiếp bằng các phương pháp thích hợp

- Thường áp dụng với các polymethoxy flavonoid

7.2 Dùng d.môi ph.cực trung bình (Cf, DCM )

7.3 Dùng dãy dung môi

- Ngấm kiệt với (ROH + H2O),

- Cô, loại tạp kém phân cực bằng cách lắc với EP

lớp nước chứa flavonoid + tạp phân cực (đường )

- Lắc lớp nước này với Et2O rồi với EtOAc,

lớp Et2O chủ yếu chứa genin,

lớp EA chủ yếu chứa glycosid + ít genin còn sót lớp nước chủ yếu chứa ose,

- Tiếp tục phân lập bằng các kỹ thuật khác (SKC…)

- Áp dụng với các glycosid phân cực

bột dược liệu

7.4 Dùng cồn acid

- Ngấm kiệt bằng ROH loãng chứa 0.1% - 1% acid

(HCl, AcOH, tartric, citric )

- Cô dịch chiết ở nhiệt độ thấp hoặc đông khô

- Loại tạp, rồi tinh chế bằng các ph.pháp thích hợp

- Áp dụng đối với các flavonoid kém bền

7.5 Dùng cồn kiềm

- Chiết dược liệu với (ROH + H2O) + NaOH

- Trung hòa dịch (= acid vô cơ loãng), cô dung môi,

- acid hóa, Flavonoid (glycosid & aglycon) sẽ tủa

- Tinh chế bằng (C* + ROH nóng) thu dịch cồn nóng

- Để nguội, để lạnh → Flavonoid sẽ kết tinh

- Kết tinh lại lần 2, nếu cần

- Thường áp dụng với các Citro-Flavonoid / chi Citrus

Nói chung, Flavonoid là các hợp chất phân cực, khó phlập.Độ phân cực Flavonoid thì :

• kém hơn đường, tannin

• xấp xỉ saponosid, anthraglycosid

• mạnh hơn sapogenin > anthraquinon > phytosterol

> coumarin, tinh dầu, chất béo

Trong Flavonoid, độ phân cực giảm dần theo dãy:

• glycuronid glycosid > glycosid

• bidesmosid > monodesmosid; polymer > monomer

• tri-OH > di-OH > mono-OH (aglycon)

Để phân lập 1 hỗn hợp Flavonoid → các Flavonoid tinh khiết,có thể dùng các kỹ thuật :

• chiết phân bố (lỏng – lỏng)

• SKC phân bố đảo (Si-gel RP; Diaion HP-20)

• SKC phân bố thuận (Polyamid, Cellulose)

• SKC rây phân tử (Sephadex G, Sephadex

LH-20)

Đáng chú ý là SKC với Diaion HP-20 và các Sephadex

Trên cột Si-gel pha thuận, Nhôm oxyt; với d.môi phân cựckém / trung bình : Flavonoid thường bị giữ lại ở đầu cột !

• SKC Diaion HP-20 với (H2O – MeOH; MeOH % ↑ dần)

- Flavonoid sẽ ra sau đường, tannin (là những chất phân cực hơn Flavonoid)

• SKC Sephadex G/LH-20 với (H2O – MeOH)

- thường thì Flavonoid sẽ ra sau tannin (thường, M của tannin > M của Flavonoid)

- Flavonoid có M lớn sẽ ra trước, M nhỏ hơn sẽ ra sau

8.1.1 Với kiềm đặc-nóng

Phá vỡ cấu trúc (→ phloroglucinol) dùng để xác định cấu trúc flavonoid

8 ĐỊNH TÍNH

O

OH OH OH

OH

8.1 Phản ứng với kiềm (KOH, NaOH)

8.1.2 Với kiềm loãng

Flavonoid tăng màu (tạo phenolat, Δ’ có Δ liên hợp)Th.khảo các bảng màu chuẩn → cấu trúc flavonoid

auron vàng cam → đỏ - tía

anthocyanin đỏ hay tím → xanh

Trên giấy lọc, sắc đồ, dùng hơi NH3 : Flavonoid sẽ tăng màu

trước khi + kiềm sau khi + kiềm

→ vàng sậm, cam (huỳnh quang !)

chalcon → mất màu

(flavanon)

isoflavon isoflavanon → vàng

8.3 Phản ứng Cyanidin (Shinoda, Shibata, Pew)

a với Mg* / HCl đ.đặc

Flavon(ol), Flavanon(ol)Chalcon

b với Zn* / HCl đ.đặc Chỉ Flavanonol → đỏ đậm / magenta

Flavanon → không màu / hồng nhạt

đỏ đậm / magenta

→ AC, màu đỏFlavonoid bột Mg, Zn

EtOH HCl đ.đặc+

Lắc sản phẩm của phản ứng Cyanidin với octanol

- dạng glycosid : dịch màu đỏ / lớp EtOH (dưới)

- dạng aglycon : dịch màu đỏ / lớp octanol (trên)

PHÂN BIỆT GENIN / GLYCOSID *

octanol

glycosid aglycon

* I.I Samokish, A.L Shinkarenko, V.A Makarov (1969)

8.4.1 Với d.dịch FeCl3 loãng

Flavonoid + FeCl3 → phức xanh (nâu, lá, đen)

- để sơ bộ nhận định số lượng nhóm OH / phân tử

- càng nhiều OH (đ.biệt là o-di-OH): màu càng đậm

- các dẫn chất 3',4',5' tri-OH : tạo màu xanh đen

8.4 Phản ứng tạo phức màu với muối kim loại

O

O OH

HO

OH

OH OH

OH

O

O OH

8.4.2 Với dd acetat chì : Tạo phức tủa có màu

- dd acetat chì kiềm : → tủa vàng nhạt đến sậm với hầu hết các flavonoid (và cả các polyphenol)

- dd acetat chì trung tính: → tủa vàng nhạt đến sậm với các flavonoid có ortho-di-OH phenol

Màu tủa thay đổi tùy số lượng và vị trí các nhóm thế

nghiên cứu Flavonoid → không dùng chì acetat để loại tạp

8.4.3 Với dung dịch AlCl3 / ROH

- Là thuốc thử tăng màu (shift reagent), dùng để khảo sát cấu trúc flavonoid bằng quang phổ UV

- dựa vào Δλmax, → số lượng & vị trí các nhóm -OH /

khung

Chú ý : Thuốc thử này chỉ quan sát rõ dưới UV 365 nm

Dưới ánh sáng thường: không thấy rõ sự th.đổi

8.4.4 Với thuốc thử Martini-Bettòlo (SbCl5 / CCl4)

flavon → tủa màu vàng đến camchalcon → tủa màu đỏ đến tím