Enzyme là chất xúc tác sinh học

Enzyme là chất xúc tác sinh học được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực của đờisống, đặc biệt trong công nghiệp thực phẩm nó đóng một vai trò quan trọng trong quy trình chế biến. Một số quy trình nếu thiếu enzyme thì không thể tiếp tục được.Ở Việt Nam, công nghệ enzyme chưa phát triển. các nghiên cứu có đề cập đến hầu hết các loại enzyme của động vật, thực vật và VSV, nhưng chưa có enzyme nào được sản xuất theo quy mô công nghiệp. Nước ta vẫn hoàn toàn phụ thuộc vào nguồn enzyme từ nước ngoài, các loại enzyme đang sử dụng nhiều trong nước làcác enzyme của hãng NOVO Đan Mạch. Vì vậy, việc hiểu biết, nghiên cứu, phát triển sản xuất enzyme trong nước là việc rất cần thiết và là 1 ngành công nghiệp đầy tiềm năng. cellulase là 1 trong những enzyme được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp như công nghệ sản xuất cồn,... hiện nay nó được sản xuất chủ yếu từ vi sinh vật do có nhiều ưu điểm: tốc độ sinh sản của VSV rất mạnh, enzyme thu nhận từ VSV có hoạt tính rất cao.

MỤC LỤC

MỤC LỤC 1

KẾT LUẬN 34 1

TÀI LIỆU THAM KHẢO .1

KẾT LUẬN 34

TÀI LIỆU THAM KHẢO

LỜI CÁM ƠN

“Học đi đôi với hành” là một chân lý không bao giờ thay đổi Hiểu được vấn đề đó nên trong quá trình học tập suốt 4 năm, em đã cố gắng tiếp thu kiến thức từ Thầy Cô và trong quá trình làm đề tài tốt nghiệp này em đã có cơ hội kiểm chứng và hoàn thiện kiến thức cho mình

Để hoàn thành tốt chuyên đề tốt nghiệp, em đã nhận được sự giúp đỡ rất nhiều từ phía ban giám hiệu nhà trường, đặc biết là cán bộ giảng viên khoa MT và CNSH Vì thế, em xin chân thành cám ơn:

- Cán bộ giảng viên khoa MT và CNSH đã tạo điều kiện giúp đở và chỉ dạy trong quá trình học tập tại trường

- Đặc biệt là sự nhiệt tình chỉ dẫn và giúp đỡ của Thầy Huỳnh Văn Thành là người trực tiếp hướng dẫn giúp em hoàn thành tốt chuyên đề tốt nghiệp nay

- Cám ơn Ba Mẹ là người luôn sát cánh và ủng hộ con

- Cám ơn sự hợp tác của bạn đồng hành, là người cùng hoàn thành chuyên đề tốt nghiệp

Trong quá trình thực hiện chuyên đề khó tránh khỏi những thiếu sót, em rất mong nhận được sự đóng góp chân thành của Thầy Cô

Em xin chân thành cảm ơn!

Lời mở đầu:

Enzyme là chất xúc tác sinh học được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực của đờisống, đặc biệt trong công nghiệp thực phẩm nó đóng một vai trò quan trọng trong quy trình chế biến Một số quy trình nếu thiếu enzyme thì không thể tiếp tục được.Ở Việt Nam, công nghệ enzyme chưa phát triển các nghiên cứu có đề cập đến hầu hết các loại enzyme của động vật, thực vật

và VSV, nhưng chưa có enzyme nào được sản xuất theo quy mô công nghiệp Nước ta vẫn

hoàn toàn phụ thuộc vào nguồn enzyme từ nước ngoài, các loại enzyme đang sử dụng nhiều trong nước làcác enzyme của hãng NOVO Đan Mạch Vì vậy, việc hiểu biết, nghiên cứu, phát triển sản xuất enzyme trong nước là việc rất cần thiết và là 1 ngành công nghiệp đầy tiềm năng.

cellulase là 1 trong những enzyme được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp như công nghệ sản xuất cồn, hiện nay nó được sản xuất chủ yếu từ vi sinh vật do có nhiều ưu điểm: tốc độ sinh sản của VSV rất mạnh, enzyme thu nhận từ VSV có hoạt tính rất cao

Phần 1: TỔNG QUAN

1.1 Enzyme Cellulase

Enzyme Cellulase là một phức hệ enzyme có tác dụng thuỷ phân cellulose thông qua việc thuỷ phân liên kết 1,4-β-glucoside tạo ra sản phẩm glucose cung cấp cho công nghiệp lên men Nguồn thu enzyme cellulase lớn nhất hiện nay là vi sinh vật.

Cellulase là enzyme đa cấu tử gồm: endo-1,4-glucanase, exoglucanase, và glucosidase, hai enzyme chính của phức hệ này là enzyme Cl và enzyme Cx hoạt động phối hợp để thủy phân cellulose thành glucose

β-Dạng 1: Endo-β-1,4-glucanase được gọi là endoglucanase hoặc 1,4-β-D-glucan-4- glucanohydrolase hay CMCase (EC 3.2.1.4) Endo-β-1,4-glucanase thuộc vào dạng 1 của

phức hệ cellulase

Dạng 2: là exoglucanase, gồm 1,4-β-D-glucan-4-glucanohydrolase (giống như cello dextrinase) (EC 3.2.1.74) và 1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase

cellobiohydrolase) (EC 3.2.1.91)

Dạng 3: là β-glucosidase hoặc β - glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21) Enzyme Cx

có hai loại: exo β–1,4–glucanase và endo β–1,4–glucanase Enzyme Cl có khả năng phân giải (thủy phân) sợi cellulose tự nhiên, có tính đặc hiệu không rõ ràng do đó cũng chưa xác định được tên hệ thống của nó Endoglucanase thủy phân ngẫu nhiên bên trong phân tử cellulose tạo ra các loại oligosaccharide có chiều dài khác nhau Exoglucanase thủy phân các liên kết ở đầu khử và đầu không khử của chuỗi cellulose để giải phóng ra glucose (glucanohydrolase) hoặc cellobiose

(cellobiohydrolase).

1.2 Giới thiệu cơ chất

Enzyme cellulase có khả năng sử dụng nhiều loại cơ chất Người ta phân ra làm 2 loại chủ yếu sau:

• Cơ chất tự nhiên: Gồm các nguồn phụ phẩm của các ngành nông nghiệp như bã mía, bã cà phê, rơm rạ, sợi bông, cọng khoai mì, dây đậu sau thu hoạch…Chẳng hạn như cellulose là homopolymer mạch thẳng, được cấu tạo khoảng vài ngàn gốc glucose nối với

nhau bằng liên kết β-1,4-glucoside Cellulose có cấu tạo sợi, cấu trúc không đồng nhất gồm vùng kết tinh và vùng vô định hình Khoảng 40 sợi liên kết lại với nhau tạo thành liên kết microfibrin Nhiều sợi microfibrin tập hợp lại thành sợi macrofibrin có đường kính mặt cắt khoảng 0,5nm.

 Cơ chất nhân tạo: gồm các cơ chất dùng để phân tích hoạt tính enzyme cellulase như CMC (carboxulmethyl cellulose), HEC (hydroxyethyl cellulose… CMC (Carboxymethylcellulose) là một dẫn xuất của cellulose Cấu trúc của CMC dựa trên liên kết β-(1 4)-D-glucopyranose, có thành phần tương tự nhưng chỉ có liên kết của phần vô định và ngắn hơn so với cellulose

1.3 Cơ chế thuỷ phân cellulose của enzyme cellulase

• Endocellulase: xúc tác quá trình cắt liên kết α-1,4- glucoside trong cellulose, lignin và

α -Dglucan một cách ngẫu nhiên Sản phẩm của qúa trình phân giải là các cellulose phân tử nhỏ, cellobiose và glucose

• Exocellulase: cắt 2 hoặc 4 đơn vị glucose từ đầu không khử của chuỗi cellulose tạo thành các cellobiose (disaccharide) và một số cellotetrose.

• Cellobiase: tham gia phân giải cellobiose (disaccharide) và cellotetrose thành glucose.

Hình 1: Cơ chế thuỷ phân cellulose của enzyme cellulase

1.4 Cồn sinh học

1.4.1 Tình hình ethanol nhiên liệu thế giới

Gasohol còn gọi là xăng sinh học được chế tạo từ hỗn hợp ethanol khan 99,5% pha xăng

tỷ lệ 5, 10, 20 hoặc 40% ethanol khan, với hỗn hợp ethanol trong gasohol khoảng 10-20% thì không cần cải tạo động cơ

Brazil đã thành công trong việc sản xuất bioethanol theo quy mô công nghiệp từ những năm 1970 khi nước này phụ thuộc nặng nề vào dầu nhập khẩu Ngày nay, toàn bộ xe hơi ở Brazil sử dụng xăng có pha ít nhất 25% ethanol, và 60% số xe có khả năng “linh động về nhiên liệu” (có thể sử dụng 100% ethanol làm nhiên liệu)

Brazil sản xuất bioethanol hầu như chỉ từ cây mía Trong mô hình này, mỗi tấn mía cho năng suất 72 lít ethanol Loại ethanol này có thể được tinh lọc thêm để pha vào xăng, hoặc dùng làm ethanol nhiên liệu tinh

Nước Mỹ đang bám theo Brazil và đầu tư mạnh vào sản xuất nhiên liệu sinh học

Hiện tại Mỹ đang sử dụng toàn bộ xăng có pha 10% ethanol, với những cải tiến nhằm tăng tỉ

số này Đa phần mọi phương tiện bán ở Mỹ đều phải có động cơ linh hoạt về nhiên liệu Liên minh Châu Âu cũng đã tiến đến việc khuyến khích năng lượng tái sinh cho tương lai với những đạo luật về điều khoản sử dụng phương tiện giao thông tối thiểu cho các nước thành viên

Trong tương lai, Colombia bắt buộc những thành phố có dân số trên 500.000 dân

phải bán xăng có pha 10% ethanol Ở Venezuela, công ty dầu quốc gia đang hỗ trợ dự án xây dựng 15 nhà máy chế cồn từ mía trong 5 năm tới khi chính phủ sắp ban hành đạo luật bắt buộc

sử dụng xăng E10 (pha 10% ethanol) Chính phủ Canada nhắm đến việc 45% xăng trong cả nước có pha 10% ethanol vào năm 2010 Ở Đông Nam Á, Thái Lan đã ban hành luật cho việc

sử dụng xăng pha 10% ethanol bắt đầu từ 2007 Ở Ấn Độ, một chương trình bioethanol đã kêu gọi người dân sử dụng xăng E5 trên cả nước, tiến tới việc sử dụng xăng E10 và E20

1.4.2 Tình hình ethanol nhiên liệu ở Việt Nam

Ở Việt Nam, công nghiệp sản xuất ethanol đã được hình thành từ rất lâu Phần đông ethanol sản xuất từ rỉ đường mía, dùng làm ethanol cho thực phẩm và công nghiệp Tổng cộng năng suất là 25 triệu Lit/năm, trong đó có 3 nhà máy sản xuất 15000 – 30000 Lit/ngày là nhà máy đường Lam Sơn, nhà máy đường Hiệp Hoà và nhà máy rượu Bình Tây và hàng trăm cơ

sở sản xuất 3000 – 5000 Lit/ngày

Cho đến thời điểm này, ethanol nhiên liệu vẫn chưa được tiêu thụ trên thị trường

Tuy nhiên, có rất nhiều nghiên cứu được thực hiện trong lĩnh vực này Điển hình là sự

hợp tác giữa Công ty rượu Bình Tây, Saigon Petro và Công ty Nguyễn Chí từ năm 2005 Các doanh nghiệp này đã triễn khai 5 đề tài: gasohol từ cồn công nghiệp (cồn 96%), gasohol từ cồn khan (cồn 99,5%), đầu tư nhà máy sản xuất gasohol, đầu tư nhà máy sản xuất cồn công nghiệp, đầu tư nhà máy sản xuất cồn khan Tất cả nhằm mục đích đưa xăng sinh học với tỉ lệ 10-12% vào thị trường năng lượng

1.4.3 Triển vọng ethanol tương lai

Cần có những nghiên cứu để tăng hiệu quả của bioethanol cũng như của quá trình

chuyển hóa biomass thành nhiên liệu bền vững để thay thế xăng dầu Điều này có liên

quan đến việc giảm chi phí chuyển hóa, tăng năng suất và tăng sự đa dạng của các nguồn nguyên liệu có thể sử dụng Hướng đi cho những nghiên cứu để phát triển và cải tiến bioethanol là tìm những phương pháp chuyển hóa hemicellulose thành đường để lên men Một khía cạnh rất thú vị, và cũng được nghiên cứu trong đề tài này, là quá trình đường hóa và lên men đồng thời (SSF) Những phương pháp hiện nay có thể đạt được hiệu suất 50 – 72% ethanol cho mỗi gam glucose, giới hạn bởi khả năng chịu ảnh hưởng của nấm men đối với ethanol Điều này dẫn đến hướng khả thi nghiên cứu những chủng nấm men có khả năng chịu

ức chế tốt hơn Ở khía cạnh này, công nghệ sinh học và vi sinh sẽ đóng vai trò rất quan trọng trong công nghệ gene, không chỉ ở việc phát triển nấm men, mà còn ở việc phát triển những giống vi sinh vật khác có khả năng chuyển hóa cellulose và lignin tạo thành đường và lên men ethanol

Phần 2: NGUYÊN LIỆU VÀ VẬT LIỆU TRONG SẢN XUẤT CỒN

2.1 Nguyên liệu

2.1.1 Nguyên liệu dùng trong sản xuất cồn

Nguyên liệu đường – mật rỉ

Mật rỉ hay rỉ đường là thứ phẩm của công nghệ sản xuất đường, thường chiếm từ 3- 5% so với lượng đường mía đưa vào sản xuất Tỷ lệ này phụ thuộc vào chất lượng mía và công nghệ sản xuất Từ một tấn mật rỉ chúng ta có thể thu được: 300 lít cồn 1000, 50

kg nấm men bánh mì, 160 kg CO2 lỏng, 14 kg glyxerin, 14.2 kg mì chính và một số sản phẩm khác Trong số các chất khô thì đường chiếm tới 60%, gồm 30 - 40% là saccaroza và 20 - 25%

là đường khử Số chất khô còn lại gọi chung là chất phi đường và gồm 30 - 32% là hợp chất hữu cơ và 8- 10% là chất vô cơ Thành phần mật của mật rỉ phụ thuộc vào giống mía đất trồng trọt và điều kiện canh tác cũng như công nghệ sản xuất đường Bình thường lượng chất khô trong mật rỉ chiếm 80÷85%, nước chiếm 15÷20%.Trong số các chất khô thì đường chiếm tới 60% , gồm 35÷40% là saccaroza và 20÷25% là đường khử Số chất khô còn lại gọi chung là chất phi đường và gồm 30÷32% là hợp chất hữu cơ và 8÷10% là chất vô cơ Hợp chất hữu cơ gồm các chất chứa nitơ,cacbon, oxy và hydro, chất hữu cơkhông chứa nitơ gồm có: pectin, chất nhầy furfurol và oxymetyl furol , axit v.v…

Ngoài ra còn chứa các chất khử nhưng không lên men được như caramen, chất màu v.v…Hợp chất hữu cơ chứa nitơ phần lớn là dạng amin như glutamic, lơxin, alanin v.v…Lượng nitơ trong rỉ đường mía chỉ khoảng 0,5÷1%, ít hơn so với rỉ trong củ cải(1,2÷2,2) Do chứa ít nitơ nên khi lên men rỉ đường chúng ta phải bổ xung lượng nitơ từ ure hoặc amoni sunfat Nguyên liệu chủ yếu mà các nhà máy rượu nước ta thường dùng là sắn, sau đó là ngô

và một phần gạo hoặc tấm Thành phần của củ sắn tươi dao động trong giới hạn khá lớn: tinh bột 20 - 34%, protein 0.8 -1.2%, chất béo 0.3 – 0.4%, xenluloza 1 – 3.1%, chất tro 0.54%, polyphenol 0.1 – 0.3% và nước 60 – 74.2%

Mật rỉ dùng để sản xuất luôn chứa một lượng vi sinh vật Trong đó nguy hiểm nhất là vi khuẩn lactic và axetic Mức độ nhiễm khuẩn được xác định bằng sự tăng độ chua khi để mật rỉ

“tự lên men” Mức tăng độ chua cho phép khoảng 0.2 đến 0.30C

2.1.2 Nguyên liệu chứa tinh bột

Nguyên liệu chủ yếu mà các nhà máy rượu nước ta thường dùng là sắn, sau đó là ngô và một phần gạo hoặc tấm Thành phần của củ sắn tươi dao động trong giới hạn khá lớn : tinh bột 20 - 34%, protein 0.8 -1.2%, chất béo 0.3 – 0.4%, xenluloza 1 – 3.1%, chất tro 0.54%, polyphenol 0.1 – 0.3% và nước 60 – 74.2% Ngoài các chất kể trên trong sắn còn chứa mổt lượng vitamin

và độc tố Vitamin trong sắn thuộc nhóm B, trong đó B1 và B2 mỗi loại chiếm 0.03 mg% còn B6 0.06 mg% Các vitamin này sẽ bị mất một phần khi chế biến và nhất là khi nấy trong sản xuất rượu Độc tố trong sắn có tên là phazeolunatin gồm 2 glucozit Linamarin và Lotaustralin Hàm lượng chung của phazeolunatin chỉ vào khoảng 0.001 – 0.04 mg% và chức nhiều trong sắn đắng, tập trung chủ yếu ở vỏ cùi Bình thường phazeonatin không độc nhưng khi bị thủy phân thì các glucozit này sẽ giải phóng HCN Hàm lượng HCN trong củ sắn tươi nhỏ hơn 50 mg/kg chưa gây độc hại cho người, từ 50 đến 100 người sẽ bị ngộ độc và HCN lớn hơn 100 mg/kg người ăn sẽ bị tử vong (tùy ăn nhiều ít) Để tránh bị ngộ độc sắn trước khi luộc cần ngâm và bóc bỏ vỏ cùi Sắn tươi đã thái lát và phơi khô sẽ giảm đáng kể hàm lượng glucozit gây độc kể trên Trong sản xuất rượu, khi nấu lâu ở nhiệt độ cao đã pha loãng nước nên với hàm lượng ít chưa ảnh hưởng đến nấm men Hơn nữa, các muối xyanat khi chưng cất không bay hơi nên bị loại cùng bã rượu.Linamarin – 10H17O6N có phân tử lượng m = 247.2 kết tinh trong etyl axetat, nhiệt độ nóng chảy 143 – 1440C Lotaustralin – C11H19O6N có phân tử lượng M = 261.2 nóng chảy ở 123.5 – 124.50C Sắn dùng trong sản xuất rượu chủ yếu là sắn lát khô hoặc sắn dui

Ngoài sắn khô chúng ta còn dùng gạo tấm và ngô để sản xuất ra cồn có chất lượng cảm quan cao, dùng pha chế các loại rượu cao cấp và xuất khẩu

2.2 Vi sinh vật trong sản xuất cồn

2.2.1 Nấm mốc:

Nấm mốc rất phổ biến trong thiên nhiên, chủ yếu là trong đất và cỏ cây Có nhiều giống và loài nấm mốc khác nhau nhưng phần lớn đều có cấu tạo sợi và mang đính bào tử Khác với nấm men và vi khuẩn, nấm mốc thuộc vi sinh vật đa bào Cơ thể nấm được gọi là mixen, gồm nhiều sợi đang chéo nhau tựa rễ cây, nhờ đó nấm hút được chất dinh dưỡng từ canh trường Từ những sợi nấm sẽ mọc ra các bào tử và trở thành cơ quan sinh sản sau này Phương pháp sinh trưởng rất khác nhau đối với các giống, loài Bào tử của loài Asppergillus khi gặp điều kiện

thuận lợi sẽ phát triển tạo nhiều sợi và phân nhánh đan chéo nhau thành mixen Từ đây mọc

lên những sợi hình kim mang trên đầu những bào tử Trong sản xuất chế phẩm amylaza dùng

cho sản xuất rượu, người ta dùng nhiều nhất là Asppergillus, sau đó là Mucor Asppergillus và

Mucor thuộc vi sinh vật háo khí, chúng phát triển chủ yếu trên bề mặt của mơi trường rắn hoặc lỏng nhưng cũng có thể tạo thành mixen trong canh trường lỏng có sục khí Một số chủng Mucor trong môi trường lỏng sẽ phân ly thành những tế bào riêng rẽ giống như nấm men Vì thế còn gọi là nấm men Mucor Nấm men mucor có khả năng lên men rượu Các điều kiện cần

và đủ để sản xuất chế phẩm amylase có hoạt lực cao:

a Chủng giống vi sinh vật:

Đây là điều kiện hàng đầu Muốn nhận chế phẩm amylase có hoạt lực cao, trước hết phải tuyển chọn, nghiên cứu xem chủng giống nào có khả năng tích tụ nhiều amylase

b Môi trường dinh dưỡng:

Khi nuôi cấy vi sinh vật ta có thể sử dụng môi trường dinh dưỡng Chất dinh dưỡng bao gồm glucid, protid, chất khoáng, các nguyên tố vi lượng, vitamin v.v…trong sản xuất chế phẩm amylase theo phương pháp nuôi cấy bề mặt trên canh trường rắn người ta hay dùng nhất là cám lúa mì Đây là môi trường tự nhiên tốt nhất để sinh tổng hợp nhiều enzym Điều kiện tối

ưu khi nuôi cấy là: nhiệt độ 320C, độ ẩm 57% và nuôi trong 42 giờ Ngoài tinh bột môi trường cần chứa maltoza và dextrin Ngoài gluxit để tổng hợp enzym, vi sinh vật đều cần đến chất chứa nitơ Nguồn nitơ có thể có sẵn trong cám, bột ngô, khi cần thiết có thể bổ sung thêm từ khô lạc khô đậu tương hoặc từ các muối amoni hoặc ure Nhiều nguồn đạm hữu cơ cũng có tác dụng tốt đến sinh trưởng của nấm mốc nhưng về phương diện tích tụ enzyme

c Điều kiện nuôi cấy :

_ Nhiệt độ: