Bài giảng THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP

Khái niệm Thẩm định phương pháp là việc khẳng định bằng kiểm tra và cung cấp bằng chứng khách quan chứng minh rằng các yêu cầu xác định cho việc sử dụng phương pháp đó được đáp ứng f

TH M Đ NH PH Ẩ Ị ƯƠ NG PHÁP

Trần Cao Sơn Viện Kiểm nghiệm An toàn VSTP quốc gia

Khái niệm

 Thẩm định phương pháp là việc khẳng định

bằng kiểm tra và cung cấp bằng chứng

khách quan chứng minh rằng các yêu cầu xác

định cho việc sử dụng phương pháp đó được đáp ứng (fit for the purpose)

Kn tương đương

Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp Phê duyệt phương pháp

Method validation

Kết quả của thẩm định phương pháp được sử

dụng để đánh giá chất lượng, độ tin cậy và

độ chắc chắn của kết quả phân tích

Khi nào cần thẩm định/thẩm định lại?

 Phương pháp không tiêu chuẩn

Độ đặc hiệu/chọn lọc

 Xác định:

 Khả năng xác định chính xác chất phân tích khi có

mặt các chất ảnh hưởng

 Liệu tín hiệu (pic) xuất hiện là một pic hay nhiều pic?

 Độ đặc hiệu: thường dùng cho 1 chất

 Độ chọn lọc: thường sử dụng khi phân tích một nhóm chất

thường được sử dụng lẫn lộn

Độ đặc hiệu/chọn lọc

 Cách thực hiện:

 Phân tích mẫu trắng (của nhiều nền mẫu khác nhau)

So sánh khi phân tích dung dịch chuẩn ở nồng độ gần LOQ

 Phân tích mẫu thêm chuẩn

 Yêu cầu: mẫu trắng phải không được cho tín hiệu

Nếu có hơn 10% số mẫu trắng cho tín hiệu thì cần thay đổi phương pháp để loại trừ

 Trong sắc ký:

 Độ tinh khiết của pic

 So sánh 2 pic sắc ký

Độ tinh khiết của pic

 Cần loại trừ các điểm lạc trên đường chuẩn

Đường chuẩn là yếu tố sống còn của kết quả phân tích!

Các loại đường chuẩn

 Đường chuẩn trên chuẩn tinh

Để xây dựng đường chuẩn tốt

1. Nồng độ chuẩn phải đảm bảo chính xác

2. Tín hiệu ở mỗi nồng độ giữa các lần đo phải

có độ lặp lại đạt yêu cầu

3. Cần loại trừ sai số ngẫu nhiên (sai số thô)

Loại trừ sai số thô

Exercise !

LOD & LOQ

Ba vùng kết quả!

Không

phát hiện Phát hiện Vùng định lượng được

LOD LOQ

LOD & LOQ đối với các phương pháp sắc ký

LOQ: |RSD| < 20%

S/N=2H/h

LOD & LOQ đối với các phương pháp khác

 Tính LOD và LOQ từ độ lệch chuẩn của mẫu trắng hoặc mẫu thêm chuẩn ở nồng độ thấp gần giới hạn phát hiện:

LOD, LOQ = F.SD/a

 F: hệ số 3.3 và 10 đối với LOD và LOQ tương ứng

 SD: độ lêch chuẩn của mẫu trắng hoặc mẫu thêm

chuẩn; hoặc độ lệch chuẩn của hệ số chặn từ đường chuẩn

 a: độ dốc của đường hồi quy tuyến tính

 Số lần phân tích lặp: 10 lần trở lên

Tính LOQ theo đường chuẩn

Độ chụm RSD%

Nồng độ (ppm) LOQ

+ Xác định độ chụm mong muốn khi định lượng

+ Chuẩn bị các mẫu thêm chuẩn nồng độ khác nhau

+ Mỗi nồng độ làm 6 lần + Tính RSD % ở mỗi nồng độ + Vẽ đường cong độ chụm theo nồng độ + LOQ là nồng độ ứng với RSDmong đợi muốn

Độ tái lặp

SD, CV%

TCVN 6910 (1-6) = ISO 5725:1994

Độ đúng

 So sánh giá trị phân tích được với giá trị thực

 Khi độ lệch ≤ 15% so với giá trị thực thì được chấp nhận (Ở LOQ ≤ 20%.) theo FDA

 Cách thực hiện?

 CRM certified reference material – mẫu chuẩn được chứng nhận

 RM reference material – mẫu chuẩn

 Spike mẫu thêm chuẩn – tính độ thu hồi

 So sánh với phương pháp khác, với phòng thí

nghiệm khác (phòng chuẩn)

Độ chêch (%) = 100 x GT phân tích - Giá trị thực

Giá trị thực

Độ thu hồi

 Thêm chuẩn (đã biết) vào mẫu trắng (hoặc mẫu thực)

 Thực hiện phân tích theo quy trình

 Tính lượng chuẩn thu được

 Tính độ thu hồi (%)

Độ thu hồi (%) = 100 x C (mẫu+chuẩn) - C (mẫu)

C (Chuẩn thêm)

Độ thu hồi phụ thuộc vào nồng độ chất (AOAC)

Hàm lượng [ %] Tỷ lệ chất Đơn vị Độ thu hồi [%]

Điều kiện môi trường Giống Khác Khác

Phòng thí nghiệm Giống Giống Khác

Độ chụm phụ thuộc vào nồng độ

chất (theo AOAC)Hàm lượng % Tỷ lệ chất Đơn vị RSD (%)

Độ ổn định

 Độ ổn định các dung dịch:

 Thời gian lưu và diện tích: CV < 2%

 Độ ổn định dài ngày: Lưu mẫu trong điều

kiện nghiên cứu từ 20 ngày trở lên

 Độ ổn định đông – rã đông: phân tích

song song 3 vòng đông – rã đông

 Kết quả độ ổn định nên được theo dõi bằng bảng kiểm tra (control chart)

Nồng độ tính được (mg/ml)

Phân tích xu hướng

Nồng độ tính được (mg/ml)

Phân tích xu hướng

Dừng

X

Độ vững

 Khi thay đổi một số yếu tố của phương pháp phân tích mà không làm ảnh hưởng đến kết quả => phương pháp có tính vững (robustness)

 Các yếu tố thuộc về phương pháp (method parameters) bao gồm: pH, tốc độ dòng, nhiệt

độ cột, thể tích tiêm mẫu, bước sóng phát hiện, thành phần pha động

Độ chắc chắn

 Khi thay đổi một số yếu tố thuộc về điều kiện phân tích mà không ảnh hưởng đến kết quả => phương pháp có độ chắc chắn (ruggedness)

 Các yếu tố thuộc về điều kiện phân tích (test conditions) bao gồm: phòng thử nghiệm, người phân tích, thiết bị, lô hóa chất thuốc thử, thời điểm thực hiện

 Độ chắc đô sự tái lặp của kết quả, trong nhiều trường hợp thường liên quan đến độ chụm trung gian

Độ không đảm bảo đo

Độ không đảm bảo đo

T-student table

n Expected concentration Calculated concentration Recovery

n Expected concentration Calculated concentration Recovery

Kết luận

 Phương pháp trước khi đưa vào sử dụng cần thiết phải thẩm định Kết quả thẩm định nhằm mục đích đảm bảo phương pháp đáp ứng được yêu cầu (fit for the purpose)

 Thẩm định là một quá trình liên tục, rất nhàm chán, khó khăn và mất nhiều thời gian; tuy nhiên lại rất quan trọng

 Cần phải làm đúng ngay từ đầu (doing right

at the first time)

Any question?

Thank you for

your attention!