Phân tử DNA của M13 có kích thước 6.4kb dạng vòng đơn, được nhóm thành 10 gen :gen 2,5,10 cần cho sự sao chép DNA, các gen 3,6,7,8,9 mã hóa cho các protein vỏ capsid, các gen 1,4 mã hóa cho các protein cần cho sự lắp ráp DNA và vỏ. Chỉ có một đoạn mạch đơn 507 nu là trình tự không mã hóa (vùng intergenicIS) và DNA mục tiêu có thể chèn vào mà không làm ảnh hưởng đến hoạt động của các gen ở phage. Vùng này cũng chứa trình tự khởi đầu sao chép (ori). M13 phage xâm nhập vào tế bào E. Coli chủ qua pilus (do đó M13 phage chỉ xâm nhập được vào chủng F+ E.Coli). Khi mới xâm nhập lớp protein capsule của phage được tháo bỏ. DNA bộ gene của phage tồn tại trong tế bào chủ ở dạng vòng, sợi đơn (mạch “+”). Ở giai đoạn đầu, M13 phage sử dụng enzyme của tế bào chủ để tạo DNA vòng, sợi đôi: RNA pol tạo đoạn mồi trên vòng đơn, sau đó DNA pol III sử dụng hoạt tính 3’5’ polymerase để tổng hợp đoạn DNA bổ sung với mạch khuôn. Kết thúc quá trình DNA dạng vòng kép (được goi là thể sao chép:
Trang 1Nhóm 37
Đề tài 5: Vector dựa vào M13 bacteriophage
CÁCH HOẠT ĐỘNG CỦA VECTOR DỰA TRÊN M13 PHAGE
I Đặc điểm cấu trúc bộ gene của phage M13.
Hình 1: DNA bộ gene của phage M13 Phân tử DNA của M13 có kích thước 6.4kb dạng vòng đơn, được nhóm thành 10 gen :gen 2,5,10 cần
cho sự sao chép DNA, các gen 3,6,7,8,9 mã hóa cho các protein vỏ capsid, các gen 1,4 mã hóa cho các protein cần cho sự lắp ráp DNA và vỏ Chỉ có một đoạn mạch đơn 507 nu là trình tự không mã hóa
(vùng intergenic-IS) và DNA mục tiêu có thể chèn vào mà không làm ảnh hưởng đến hoạt động của các gen ở phage Vùng này cũng chứa trình tự khởi đầu sao chép (ori) (hình 1)
II Chu trình xâm nhiễm của M13 phage
Tóm tắt chu trình xâm nhiễm của phage M13 (hình 2)
Trang 2Hình 2
Gồm 3 giai đoạn chính:
1 Giai đoạn 1: xâm nhiễm và tạo thể sao chép (RF) ( hình 3 )
M13 phage xâm nhập vào tế bào E Coli chủ qua pilus (do đó M13 phage chỉ xâm nhập được vào
chủng F+ E.Coli) Khi mới xâm nhập lớp protein capsule của phage được tháo bỏ DNA bộ gene của
phage tồn tại trong tế bào chủ ở dạng vòng, sợi đơn (mạch “+”)
Ở giai đoạn đầu, M13 phage sử dụng enzyme của tế bào chủ để tạo DNA vòng, sợi đôi: RNA pol tạo đoạn mồi trên vòng đơn, sau đó DNA pol III sử dụng hoạt tính 3’-5’ polymerase để tổng hợp đoạn DNA bổ sung với mạch khuôn Kết thúc quá trình DNA dạng vòng kép (được goi là thể sao chép:
replicative form – RF) được hình thành.
Trang 3Hình 3: xâm nhiễm và tạo thể sao chép (RF)
2 Giai đoạn 2: sự sao chép của RF
Giai đoạn này có sự tham gia của gene 2 protein (gene quy định protein này nằm trên DNA bộ gene
của phage), một protein xuất hiện trong giai đoạn sớm của quá trình xâm nhiễm
Gene 2 protein sẽ cắt RF trên 1 mạch, kích hoạt cơ chế sao chép vòng xoay (rolling circle
replication) (hình 4) Kết thúc quá trình sao chép vòng xoay, một DNA dạng vòng, mạch đơn mới được
hình thành (dạng “+”) DNA vòng đơn này sẽ sử dụng enzyme của tế bào chủ để tạo dạng RF
Hình 4: sao chép theo cơ chế vòng xoay
Kết quả của giai đoạn này là từ 1 RF ban đầu sẽ sinh ra nhiều RF trong tế bào chủ
Giai đoạn này cũng diễn ra quá trình tổng hợp một số protein cần thiết khác cho phage như protein capsule
Trang 43 Giai đoạn 3: hình thành phage trưởng thành và thoát khỏi tế bào.
Ở giai đoạn đoạn này, gene V binding protein (cũng do một gene trên DNA bộ gene của phage quy
định) sẽ bám vào DNA đơn khi vừa đươc hình thành từ quá trình sao chép vòng xoay, ngăn không cho
DNA đơn tổng hợp thành DNA mạch đôi (hình 5)
Phức hợp gene V binding protein, DNA mạch đơn được đưa tới màng tế bào, tại đây gene V binding protein được thay bởi protein capsule và một số protein khác để tạo thành phage trưởng thành trước khi
giải phóng ra khỏi tế bào (hình 6).
Hình 6
Hình 5
Một số điểm lưu ý:
- DNA bộ gene của M13 phage không chèn vào DNA bộ gene của tế bào chủ
Trang 5- Quá trình xâm nhiễm, nhân lên và giải phóng ra khỏi tế bào E.Coli của M13 phage không phá vỡ tế
bào chủ mà chỉ là cho sự sinh trưởng của tế bào chủ bị chậm lại
- Khi tế bào E.Coli chủ nhiễm M13 phage nhân đôi, DNA bộ gene của phage cũng được phân chia về 2
tế bào con
III Quá trình phát triển vector M13 bacterio phage từ các cấu trúc tự nhiên.
Biến đổi hệ gen của phage M13 tạo vector dòng hóa gồm những bước sau:
Bước 1: chèn gen lacZ’ vào vùng intergenic trên DNA của phage tạo M13mp1, gen lacZ’ mã hóa
β-galactosidase
M13mp1 chứa 6 nu GGATTA gần trình tự khởi đầu sao chép Chuối nucleotide đơn được biến đổi tạo thành GAATTC, đây chính là trình tự nhận biết của enzyme EcoRI Sự biến đổi này được thực hiền nhờ gây đột biến invitro và tạo ra M13mp2
M13mp2 thay đổi gen lacZ’ ( bộ ba thứ 6 bây giờ mã hóa cho asparagine thay vì aspartis acid), nhưng
β-galactosidase sản xuất bởi tế bào bị xâm nhiễm bởi bởi M13mp2 vẫn có chức năng.
Bước tiếp theo để phát triển vector M13 là chèn thêm những vị trí nhận biết của enzyme cắt giới hạn vào gen lacZ’ Điều này được thực hiện nhờ tổng hợp trong ống nghiệm 1 đoạn oligonucleotide gọi là polylinker, chứa 1 chuỗi vị trí nhận biết của enzyme cắt giới hạn và có đầu dính EcoRI
Polylinker chèn vào vị trí nhận biết EcoRI của M13mp2, tạo thành M13mp7, 1 vector phức tạp hơn với
4 vị trí có thế chèn DNA mục tiêu (EcoRI, BamHI, SalI, và PstI) Polylinker được thiết kế sao cho không làm ảnh hưởng tới hoạt động của gen lacZ’ Vector M13 càng tinh vi khi càng có nhiều
polylinker được chèn vào gen lacZ’
V Cách sử dụng.
1 Tạo vectro tái tổ hợp
Hình 7: Tạo M13mp2
Hình 8: Tạo M13mp7
Trang 6Vòng đôi RF của M13 có một số đặc tính giống như plasmid, nên có thể được xử lý như một plasmid
để đóng vai trò như một vector tạo dòng
Sử dụng các enzyme cắt giới hạn thích hợp để cắt DNA mục tiêu và vector M13 bacteriophage Sau đó dùng enzyme ligase gắn DNA mục tiêu vào RF tạo thành vector tái tổ hợp
2 Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào chủ
Hình 9: Hóa biên nạp
Có nhiều cách khác nhau để biến nạp vector vào tế bào E Coli: hóa biến nạp (hình 9), điện biện nạp…
Hình 10: phát hiện tế bào mang vector tái tổ hợp
3 Phát hiện tế bào mang vector tái tổ hợp
Trang 7Trải tế bào E Coli vừa biến nạp lên môi trường agar có chứa X gal ngay lập tức Nếu DNA mục tiêu
được chèn vào gene lacZ thì gene lacZ sẽ bị bất hoạt không tổng hợp được β-galactosidase dẫn đến xuất hiện vòng tan trong, ngược lại xuất hiện vòng tan xanh dương (chú ý: dù M13 không làm tan tế
bào E Coli nhưng vẫn làm giảm tốc độ tăng trưởng của E.Coli làm xuất hiện vòng tan) (hình 10)
VI Ứng dụng của vector M13 bacteriophage
1 Giải trình tự: một số phương pháp giải trình tự cần sử dụng DNA mạch đơn do đó tạo dòng bằng vector M13 rất hữu ích cho những phương pháp này
2 Sử dụng oligonucleotide tạo đột biến điểm trong dòng hóa gen (hình 11)
3 Phương pháp phage display: được sử dụng để nhận biết các tương tác protein – protein
Hình 11: Sử dụng oligonucleotide tạo đột biến điểm trong dòng hóa gen
Trang 8Hình 12: phage display.
