Nghiên cứu động học các phân tử protein trong tế bào sống bằng phương pháp theo dõi đơn phân tử

Kết quả các thông số động học của các phân tử protein trong tế bào thứ 2đã xử lý.Các phân tử protein PGP-GFP phát huỳnh quang trong màng tế bào dưới ảnh TIRFM với nhiễu nền rất thấp a.C

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN VŨ ÁNH NGUYỆT

NGHIÊN CỨU ĐỘNG HỌC CÁC PHÂN TỬ PROTEIN TRONG TẾ BÀO SỐNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP THEO DÕI ĐƠN PHÂN TỬ

LUẬN VĂN THẠC SĨ VẬT LÝ

Thái Nguyên, năm 2018

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN VŨ ÁNH NGUYỆT

NGHIÊN CỨU ĐỘNG HỌC CÁC PHÂN TỬ PROTEIN TRONG TẾ BÀO SỐNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP THEO DÕI ĐƠN PHÂN TỬ

Học viên: Nguyễn Vũ Ánh Nguyệt

Cuối cùng ,tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, những người đã luôn bên tôi, động viên và khích lệ tôi trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu của mình

Mặc dù em đã cố gắng để hoàn thành đề tài nhưng không tránh khỏi những thiếu sót nhất định

Em rất mong được sự đánh giá, nhận xét và đóng góp ý kiến của các thầy cô giáo và các bạn để đề tài được hoàn thiện hơn

Xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, tháng 5 năm 2018

Học viên

NGUYỄN VŨ ÁNH NGUYỆT

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG………

DANH MỤC HÌNH………

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT………

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Phân tử Poly-glycoprotein 2 1.2 Chuyển động dịch chuyển ngẫu nhiên (Brownian) 5 1.3.Kính hiển vi quang học[7] 7 1.3.1.Khái niệm cơ bản về kính hiển vi quang học 7 1.3.2 Cấu tạo chung của kính hiển vi quang học 7

1.3.3 Nguyên lý hoạt động chung của kính hiển vi quang học 8

1.3.3.1 Nguyên tắc phóng đại ảnh của kính hiển vi 8

1.3.3.2.Khẩu độ số 12

1.4.2.3 Độ phóng đại 13

1.3.3.4.Độ phân giải 14

1.3.4 Một số loại kính hiển vi quang học 16

1.3.4.1 Kính hiển vi tương phản pha (Phase Contrast Microscopy[9] 16

1.3.4.2 Kính hiển vi huỳnh quang(Fluorescence microcope[10] 17

1.3.4.3 Kính hiển vi phản xạ nội toàn phần (total internal reflection microcope - TIRM ) 20

CHƯƠNG II 22

THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP THEO DÕI ĐƠN PHÂN TỬ 22

2.1 Chuẩn bị mẫu 22 2.1.1 Nuôi cấy tế bào P-glycoprotein 22

2.1.2 Tổng hợp P-glycoprotein trong màng tế bào 23

2.2 Cấu hình quang học kính hiển vi huỳnh quang phản xạ nội toàn phần 24 2.3 Phương pháp theo dõi đơn phân tử P-glycoprotein trong tế bào MDCKII 24 2.3.1 Cách tiến cận 25

2.3.2 Quy trình theo dõi một phân tử trong chất lỏng 25

2.3.2.1 Ghi một video dưới kính hiển huỳnh quang phản xạ nội toàn phần (TIRFM) 26

2.3.2.2 Xác định các vị trí các PGP trên ảnh 27

2.3.2.3 Theo dõi sự dịch chuyển các phân tử protein 27

2.3.2.4 Phân tích dữ liệu 31

Học viên: Nguyễn Vũ Ánh Nguyệt

3.1 Kết quả về tổng hợp protein trong màng tế bào 33

3.3 Đơn phân tử protein dưới kính hiển vi huỳnh quang phản xạ nội toàn phần

3.4.1 Kết quả tế bào 1 40

3.4.1.1 Hệ số khuếch tán 40

3.4.1.2 Quãng đường dịch chuyển 42

3.4.1.3 Vận tốc dịch chuyển 44

3.4.2 Kết quả tế bào 2 45

3.4.3 Kết quả tế bào 3 47

KẾT LUẬN 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Liệt kê sự kết hợp độ phóng đại và khẩu độ số của vật kính và thị kính cho

độ phóng đại nằm khoảng giới hạn cho phép……… 13

Bảng 1.2 Sự liên quan giữa độ phân giải với khẩu độ số và độ phóng đại……… 15 Bảng 2.1.Thời gian kích thích và nồng độ BS dung trong tổng hợp protein……… 24

Học viên: Nguyễn Vũ Ánh Nguyệt

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hình ảnh phân tử P-glycoprotein trong màng tế bào 4

Hình 1.2 Cấu trúc của P-glycoprotein 4

Hình 1.3 Các thành phần cấu tạo bên trong kính hiển vi quang học 8

Hình 1.4.Sơđồ tạo ảnh của kính hiển vi 8

Hình 1.5 Sơđồ kính hiển vi giới hạn chiều dài ống 10

Hình 1.6 Cấu hình tia truyền trong kính hiển vi hiệu chỉnh vô cùng 10

Hình 17 Sơđồ của kiểu chiếu sáng Kohler 12

Hình 1.8 Khẩu độ số của vật kính 12

Hình 1 9 Khẩu độ số phụ thuộc tiêu cự của vật kính 13

Hình 1.10 Giới hạn phân giải 15

Hình 1.11 Sự phụ thuộc của đĩa Airy vào khẩu độ số 15

Hình 1.12 16

Hình 1.13 Ảnh qua kính hiển vi trường sáng (trái) và tương phản pha (phải) 17

Hình 1.14 Đường đi ánh sáng kính thích và phát xạ qua kính lọc lập phương trong kính hiển vi huỳnh quang 18

Hình 1.15 Cấu tạo của kính hiển vi huỳnh quang 19

Hình 1.16.Ảnh tế bào qua kính hiển vi huỳnh quang 19

Hình 1.16.1 Nguyên lý phản xạ nội toàn phần 20

Hình 1.16.2 Cấu hình của kính hiển vi phản xạ nội toàn phần 20

Hình 1.16.3 Kính hiển vi phản xạ nội toàn phần 21

Hình 1.17 Hình ảnh bề mặt tế bào dưới kính hiển vi phản xạ nội toàn phần 21

Hình 2.1 Ảnh chụp một số đĩa thủy tinh dung để nuôi cấy tế bào 22

Hình 2.2 Cấu hình quang học của kính hiển vi huỳnh quang phản xạ nội toàn phần [10] 24

Hình 2.3 Sơ đồ minh họa quy trình theo dõi đơn phân tử 26

Hình 2.4 Video gồm 100 ảnh của 1 tế bào MDCKII dưới kính hiển vi huỳnh quang phản xạ nội toàn phần Các PGP là các đốm sáng trong ảnh 26

Hình 2.5 Mở video 27

Hình 2.6 Ảnh PGP trong tế bào MDCKII dưới kính hiển vi huỳnh quang phản xạ nội toàn phần với thông số: radius=3, cutoff=3, percentile=0,1 28

Hình 2.7 Ảnh PGP trong tế bào MDCKII dưới kính hiển vi huỳnh quang phản xạ

nội toàn phần với thông số: radius=3, cutoff=3, nhưng với percentile=0,1(trái) và percentile=0,4 (phải) 28

Hình 2.8 Quan sát tất cả các quỹ đạo của PGP Phần đóng khung mầu xanh được

phóng to đến hình bên phải để thấy rõ hơn các quỹ đạo dịch chuyển của PGP 29

Hình 2.9 Thông tin quỹ đạo xuất ra từ thuật toán của Mosaictrong không gian 2

chiều 30

Hình 2.10 Các tọa độ x và y tạo thành các điểm ảnh ở mỗi khung hình (frame)cho 1

quỹ đạo của phân tử 31

Hình 2.11 Quỹ đạo chuyển động của 1 PGP theo thời gian 31 Hình 3 1 Một chuỗi các ảnh tế bào MDCKII được chụp cùng 1 vị trí (chồng nhau)

dưới kính hiển vi tương phản pha và huỳnh quang tương ứng với các thời điểm khác nhau 1h; 12h; 18h và 23h40 cho 4 nồng độ BS khác nhau: a) 0,1 mM; b) 0,5 mM; c) 1mM và d) 2mM 35

Hình 3 2 Cường độ huỳnh quang của các tế bào MDCKII với các nồng độ BS

(0,1mM; 0,5mM; 1mM và 2mM) tại các thời điểm khác nhau 36

Hình 3 3 Quy trình tổng hợp protein PGP-GFP trong màng tế bào MDCKII 36 Hình 3 4 Hình thái màng tế bào MDCKII a) Ảnh chụp dưới kính hiển vi huỳnh

quang và b) là ảnh kính hiển vi tương phản giao thoa tương ứng, c) ảnh chụp dưới kính hiển vi tương phản pha và d) là ảnh chụp dưới kính hiển vi trường sáng 37

Hình 3 5 Hình ảnh của một tế bào chồng khít dưới kính hiển vi huỳnh quang (trái)

và TIRFM (phải) Các hạt PGP-GFP được bộc lộ chi tiết trên bề mặt của tế bào, phần phóng to bên phải cho thấy chi tiết hơn hơn về protein này 38

Hình 3 6 Phân biệt một phân tử duy nhất protein PGP-GFP và nhóm phân tử a) là

tín hiệu phát quang của 1 phân tử duy nhất và b) là tín hiệu một nhóm phân tử c) và d) là giản đồ mình họa cho hai loại phân tử này tương ứng 39

Hình 3 7 Theo dõi và phân tích một phân tử PGP-GFP (a) Quỹ đạo dịch chuyển

(x(t), y(t)) trong thời gian 1 giây (b) và cường độ tương ứng trong khoảng thời gian

đó là (c) 40

Hình 3 8 Bình phương dịch chuyển trung bình (MSD) của đơn phân tử PGP-GFP

Học viên: Nguyễn Vũ Ánh Nguyệt

Hình 3 9 Hai phân bố hệ số khuếch tán tương ứng với 2 loại phân tử: đơn phân tử

PGP-GFP (màu đỏ) và nhóm phân tử PGP-GFP (màu xanh) 42

Hình 3 10 Bình phương dịch chuyển trung bình (MSD) của nhóm phân tử

PGP-GFP theo thời gian Sử dụng phương trình (2.2 ở chương 2) để làm khớp số liệu thực nghiệm, ta thấy MSD gồm 2 phân đoạn tương ứng với các giá trị hệ số khuếch tán 𝐷1 = 0,057 ± 0,00628 𝜇𝑚2/𝑠và𝐷2 = 0,495 ± 0,0934 𝜇𝑚2/𝑠 42

Hình 3 11 Hai quỹ đạo chuyển động của PGP-GFP tương ứng một đơn phân tử duy

nhất (mầu đỏ) và nhóm phân tử (mầu xanh) chuyển động trong mặt phẳng (x,y) trong thời gian t=1,05s 43

Hình 3 12 Hai phân bố dịch chuyển tương ứng với hai loại phân tử trong cùng một

tế bào: đơn phân tử (mầu đỏ) và nhóm phân tử (mầu xanh) 44

Hình 3 13 Phân bố vận tốc của hai loại phân tử trong cùng một tế bào Kết quả vận

tốc trung bình của các đơn phân tử bằng 1,33 𝜇𝑚 𝑠và nhóm phân tử bằng 1,14 𝜇𝑚/𝑠 44

Hình 3 14 Kết quả các thông số động học của các phân tử protein trong tế bào thứ

2đã xử lý.Các phân tử protein PGP-GFP phát huỳnh quang trong màng tế bào dưới ảnh TIRFM với nhiễu nền rất thấp a).Các phân bố động học về hệ số khuếch tán và quãng đường dịch chuyển được thể hiện trong hình b và c 46

Hình 3 15 Kết quả các thông số động học của các phân tử protein trong tế bào thứ 3

đã xử lý.Các phân tử protein PGP-GFP phát huỳnh quang trong màng tế bào dưới ảnh TIRFM với nhiễu nền rất thấp a).Các phân bốđộng học về hệ số khuếch tán và quãng đường dịch chuyển được thể hiện trong hình b và c) d)-phân bố của vận tốc 47

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT STT Ký hiệu Tên đầy đủ Tên tiếng Việt

2 MDCKII Madin Darby Canine Kidney Tế bào ung thư thận chó

3 GFP Green fluorescent protein Protein phát sáng huỳnh quang

4 TIRFM Total internal reflection

Học viên: Nguyễn Vũ Ánh Nguyệt 1

MỞ ĐẦU

Chúng ta biết rằng, trong màng tế bào có rất nhiều các thành phần như; glucide, glycolipid, protein…do đó cấu trúc màng là vô cùng phức tạp.Một trong các thành phần quan trọng đó chính là protein mặc dù nó chiếm tỷ lệ nhỏ hơn so với các lipid màng.Các protein màng có liên quan đến các quá trình tế bào gốc như; di truyền sinh học hay truyền thông tin.Việc hiểu biết ở cấp độ phân tử là rất cần thiết cho thiết

kế các công cụ dược phẩm mới của các protein tế bào chất Trong tế bào, ngoài vai trò chính là thành phần trong cấu trúc của tế bào và mô, protein còn có nhiều chức năng phong phú khác quyết định những đặc điểm cơ bản của sự sống như sự truyền đạt thông tin di truyền, sự chuyển hoá các chất (các enzyme, các kháng thể chống lại bệnh tật, các hormon dẫn truyền các tín hiệu trong tế bào), v.v Bên cạnh đó, các phân tử protein cũng đóng góp rất lớn trong việc gây ra các bệnh lý, điều này là do các phân tử protein có những biến đổi bất thường về cả số lượng và chất lượng.Ngoài

ra, protein tham gia vào hệ thống miễn dịch của nhiều cơ quan, nhiều loại tế bào và nhiều loại protein thực hiện các chức năng riêng biệt tạo nên các hiệu quả miễn dịch đặc hiệu và không đặc hiệu Đặc biệt, trong tế bào ung thư các phân tử protein còn tham gia vào các quá trình kháng thuốc, đó là hiện tượng mà các nhà khoa học thuộc lĩnh vực sinh-y học hiện đang rất trăn trở và rất quan tâm nghiên cứu Đây là một trong những hiện tượng rất nghiêm trọng khi người bị mắc bệnh ung thư dùng nhiều lần cùng một loại thuốc sẽ bị mất tác dụng (nhờn thuốc) Các nghiên cứu trên thế giới

đã cho thấy một trong những protein cơ bản tham gia vào quá trình này chính là phân

tử poly-glycoprotein (PGP)-một loại đại phân tử trong màng tế bào ung thư Tuy nhiên, việc nghiên cứu chi tiết về động học của nó vẫn còn sơ sài và hiện nay đang là vấn đề thời sự

Để nghiên cứu các thông số động học protein tế bào, phương pháp theo dõi đơn hạt hay đơn phân tử là ứng viên sáng giá cho lựa chọn này Vì vậy trong luận văn này tôi tập trung thực hiện: nghiên cứu động học các phân tử protein trong tế bào sống bằng phương pháp theo dõi đơn phân tử

Ngoài phần mở đầu và kết luận, Báo cáo luận văn gồm 3 chương chính:

Chương 1: Tổng quan

Chương 2: Thực nghiệm và phương pháp theo dõi đơn phân tử

Chương 3: Kết quả và thảo luận

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

Để giải mã sự tương tác phức tạp giữa vô số các phân tử khác nhau thể hiện trong một môi trường (dung dịch hay tế bào) là một vấn đề đã và đang được tìm hiểu trong nhiều thập kỷ gần đây [1] Do đó, từ việc nghiên cứu kính hiển vi đã cho thấy rằng trong màng tế bào có nhiều thành phần như: glucide, photpholipit, protein Một trong các thành phần quan trọng đó là protein, ngoài vai trò chính là thành phần trong cấu trúc của tế bào và mô thì protein còn nhiều chức năng khác như : truyền đạt thông tin di truyền, vận chuyển các chất, tạo ra các kháng thể v.v… Do đó, các phân

tử protein đóng góp lớn trong việc gây ra các bệnh lý, điều này do các phân tử protein biến đổi bất thường về cả số lượng và chất lượng.Ngoài ra, protein còn tham gia vào hệ thống miễn dịch của nhiều cơ quan, nhiều loại tế bào và nhiều loại protein thực hiện chức năng riêng biệt tạo nên các hiệu quả miễn dịch đặc hiệu và không đặc hiệu Đặc biệt, trong tế bào ung thư các phân tửprotein còn tham gia vào quá trình kháng thuốc, đây là hiện tượng mà các nhà khoa học thuộc lĩnh vực y-sinh rất quan tâm nghiên cứu hiện nay Các nghiên cứu trên thế giới đã cho thấy một trong những protein cơ bản tham gia vào quá trình này chính là phân tử P-glycoprotein (PGP), một loại đại phân tử trong màng tế bào ung thư Đáng chú ý là không chỉ các nhà sinh họcđang có sự tiến bộ rất lớn trong việc làm sáng tỏ sự phức tạp của các tế bào,

mà còn có các nhà vật lý đang đóng một vai trò ngày càng quan trọng trong lĩnh vực này Do đó, khả năng theo dõi các phân tử đơn lẻ một cách tự nhiên trongtế bào sống cần được mô tả một cách định lượng và chính xác hơn về các quá trình động học để

kiểm soát chức năng tế bào

1.1 Phân tử Poly-glycoprotein

Poly-glycoprotein (P-glycoprotein) là một đại phân tử và là một trong các protein vận chuyển, chúng quyết định vận chuyển thuốc vào (uptake) hoặc vận chuyển ra (efflux) khỏi cơ thể Quá trình vận chuyển thuốc ảnh hướng đến nồng độ thuốc trong huyết tương và tại mô và cuối cùng ảnh hướng đến tác dụng của thuốc P-glycoprotein là một protein vận chuyển xuyên màng, nó vận chuyển các cơ chất từ trong ra ngoài tế bào Những thuốc ức chế hoặc cảm ứng P-glycoprotein có thể tương tác với các thuốc khác được vận chuyển bởi protein này P-glycoprotein được tìm thấy lần đầu trong các tế bào ung thư Những tế bào này có sự hiện diện quá mức của P-glycoprotein, điều này làm giảm việc thâm nhập của các thuốc độc tế bào (điều trị ung thư) vào trong cơ thể Bởi vì điều này tạo cho các khối u khả năng kháng thuốc trị ung thư, P-glycoprotein còn được biết đến như là protein gây đề kháng đa thuốc (multidrug resistance protein)[1] P-glycoprotein cũng hiện diện ở nhiều mô bình thường, không phải ung thư, với chức năng bài tiết (như ruột non, gan, thận)[1] và tại

Học viên: Nguyễn Vũ Ánh Nguyệt 3

các hàng rào máu-mô (như hàng rào máu - não, hàng rào máu – tinh hoàn, hàng rào nhau thai)[2]

Cùng với các enzyme cytochrome P450, sự hiện diện của P-glycoprotein được tin là một bước tiến hóa thích hợp của cơ thể để chống lại các chất độc hại tiềm tàng muốn thâm nhập vào cơ thể Với vài trò là một kênh vận chuyển đẩy thuốc ra khỏi cơ thể, nó làm giảm sinh khả dụng của các thuốc dùng đường uống bằng cách bơm ngược thuốc trở lại lumen ruột Điều này thúc đẩy bài tiết thuốc qua mật và nước tiểu, qua đó bảo vệ một số mô như não, tinh hoàn, nhau thai và bạch cầu Cơ chất vận chuyển bởi P-glycoprotein có rất nhiều cấu trúc khác nhau.P-glycoprotein tham gia thải trừ thuốc không nhiều Nó chỉ hiện diện tại bề mặt của tế bào ống lượn gần ở thận P-glycoprotein tham gia vận chuyển thuốc ra nước tiểu

P-glycoprotein đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa các tương tác thuốc-thuốc[3] Dược động học của thuốc có thể sẽ bị thay đổi khi được dùng cùng với một chất gây ức chế hoặc cảm ứng P-glycoprotein[3,5,6] Các chất ức chế bao gồm clarithromycin, erythromycin, ritonavir và verapamil Chất cảm ứng bao gồm rifampicin và St John’s wort (một loại thảo dược)

Có nhiều cơ chất được vận chuyển bởi P-glycoprotein tương tự với CYP3A4

Nó vận chuyển nhiều thuốc thuộc nhiều nhóm khác nhau, bao gồm:

+ Thuốc trị ung thư: docetaxel, etoposide, vincristine

+ Nhóm chẹn kênh calci: amlodipine

+ Nhóm ức chế calcineurin: cyclosporin, tacrolimus Digoxin

+ Kháng sinh nhóm macrolide: Clarithromycin

+ Nhóm ức chế men protease

Các cơ chất của P-glycoprotein có thể chia thành 2 loai: các thuốc không bị chuyển hóa ở người, chẳng hạn như digoxin và những thuốc là cơ chất của cả P-glycoprotein và enzym chuyển hóa thuốc, thông thường là CYP3A4[2,3] Nhiều cơ chất của P-glycoprotein cũng là cơ chất của CYP3A4 vì những chất ức chế P-glycoprotein thì cũng ức chế CYP3A4, nhiều tương tác thuốc- thuốc có liên quan đến

sự ức chế hay cảm ứng cả P-glycoprotein và CYP3A4 Một số thuốc là tác nhân của các tương tác trên như: cyclosporin, tacrolimus và rivaroxaban[3]

Hình 1.1 Hình ảnh phân tử P-glycoprotein trong màng tế bào

Hình 1.2 Cấu trúc của P-glycoprotein

Sự khác nhau về sinh khả dụng giữa các cá thể làm cho việc dự đoán một cách chính xác các tương tác thuốc- thuốc tiềm tàng thông qua P-glycoprotein trở nên phức tạp Điều này cũng ảnh hưởng đến những thuốc không bị chuyển hóa ở người( fexofennadine, dioxin) Cần có nhiều hơn nữa những kiến thức về vai trò của gen đối với hoạt động và biểu lộ của protein vận chuyển sẽ góp phần giúp hiểu rõ hơn về sự khác nhau về phân bố và tác dụng của thuốc giữa các cá thể và chủng tộc khác nhau[2]

Tóm lại, P-glycoprotein là một protein vận chuyển đẩy thuốc ra khỏi cơ thể ,nó có mặt tại nhiều cơ quan đóng vai trò qua trọng trong việc vận chuyển thuốc và

có vai trò quan trọngtrong hấp thu , phân bố, chuyển hóa, thải trừ thuốc Mặc dù các tương tác với protein vận chuyển thuốc trên lâm sàng có thể không có nhiều ý nghĩa, nhưng các cảnh báo về những nguy cơ xảy ra tương tác thuốc liên quan đến protein vận chuyển thuốc vẫn rất quan trọng Nếu tương tác xảy ra, hậu quả có thể là suy nhược hệ thần kinh trung ương, giảm hiệu quả điều trị HIV, thải loại mảnh

Học viên: Nguyễn Vũ Ánh Nguyệt 5

ghép.Trang bị những kiến thức về những tương tác tiềm tàng này sẽ giúp đảm bảo việc chăm sóc và điều trị hiệu quả trên nhóm các bệnh nhân nguy cơ

1.2 Chuyển động dịch chuyển ngẫu nhiên (Brownian)

Khi một hạt rắn đặt trong dung dịch, ngoài việc chúng chuyển động quay Brownian mà đồng thời chúng còn chuyển động dịch chuyển Các quy luật cơ bản của chuyển động dịch chuyển Browninan đã được thiết lập bởi Einstein và sau Perrin

là người phát triển sâu và đầy đủ hơn Chuyển động Brownian của một hạt rắn trong môi trường có độ nhớt η(T) được đặc trưng bởi một tập hợp các tham số bất thường

do kích động nhiệt Các luật cơ bản của chuyển động Brownian của một quả cầu nhỏ

tự do đắm mình trong một chất lỏng cho phép xác định các vị trí dịch chuyển của một hạt theo thời gian dài so với khoảng thời gian giữa hai "cú sốc" Chúng ta xét một hạt nhỏ chuyển động Brownian mà trong quá trình di chuyển nó bị bắn phá từ mọi phía bởi các phân tử của môi trường xung quanh do kích động của nhiệt

Vấn đề đặt ra là: sau mỗi khoảng thời gian, khoảng cách trung bình của hạt tại điểm tìm thấy nó là bao nhiêu? Chúng ta thấy rằng bình phương dịch chuyển trung bình tỷ lệ với thời gian Điều này có thể viết theo công thức dưới đây trong n chiều

ở đó D là hệ số khuếch tán dịch chuyển, τ là thời giantrôi của hạt dạng cầu

Để xác định D, chúng ta có thể viết các lực cân bằng tác dụng lên hạt bằng cách xem hạt chịu tác dụng của ma sát nhớt tỷ lệ thuận với tốc độ Sự cân bằng của các lực đó có thể như sau (theo một chiều), được gọi là phương trình Langevin:

Ở đó, 𝐹𝑒𝑥𝑡(𝑡) là ngoại lực tác dụng lên hạt trong môi trường, 𝑣𝑥(𝑡) là vận tốc theo trục𝑥, 𝜇 là hệ số ma sát, giá trị của 𝜇 có thể được xác định trực tiếp từ thực nghiệm

Nhân 2 vế của phương (3.2) với 𝑥 và lấy trung bình, ta nhận được :

Chúng ta biết rằng, ở điều kiện cân bằng nhiệt động: 1

2𝑚〈𝑣𝑥2〉 = 1

2𝑘𝐵𝑇 Với 𝑘𝐵là hằng số Boltzmann

Chúng ta có thể nhận được mối liên hệ theo hệ số khuếch tán dịch chuyển, hệ

số nhớt của môi trường và nhiệt độ từ các phương trình (1.3) và (1.9):

Đối với các hạt hình cầu, có thể chứng minh được công thức liên hệ giữa hệ số

ma sát với bán kính R của hạt và độ nhớt chất lỏng 𝜂 theo:

Từ đây ta có thể viết lại công thức bình phương dịch chuyển trung bình theo

hệ số khuếch tán:

Học viên: Nguyễn Vũ Ánh Nguyệt 7

- Xét trong không gian 3 chiều : 〈𝑟2〉 = 6𝐷𝑡

- Xét trong không gian 2 chiều : 〈𝑟2〉 = 4𝐷𝑡 (1.12)

- Xét trong không gian 1 chiều : 〈𝑟2〉 = 2𝐷𝑡

1.3.Kính hiển vi quang học[7]

1.3.1.Khái niệm cơ bản về kính hiển vi quang học

Kính hiển vi quang học là dụng cụ quang học dùng để tạo ra hình ảnh phóng đại của các vật nhỏ mà không thể quan sát được bằng mắt thường Một kính hiển vi thực hiện các chức năng sau: tạo ra ảnh phóng đại của mẫu, phân giải các chi tiết của ảnh, và làm cho các chi tiết đó quan sát được bằng mắt người hoặc camera Bằng sự kết hợp một số các thấu kính một cách chính xác, kính hiển vi có thể tạo ra giá hình ảnh với độ phóng đại rất lớn

1.3.2 Cấu tạo chung của kính hiển vi quang học

Cấu tạo của kính hiển vi quang học gồm ba phần chính:

vi, chúng ta cần biết cấu tạo cơ bản của hệ kính

Hầu hết các kính hiển vi có một cơ cấu dịch chuyển cơ học gắn vào bàn soi cho phép người dùng xác định đúng vị trí, hướng, và tập trung mẫu để tối ưu hoá việc quan sát và ghi lại ảnh Cường độ chiếu sáng và định hướng đường đi của ánh sáng trong kính hiển vi có thể được điều khiển bởi một hệ thống gồm thấu kính, diaphram, gương, lăng kính, các bộ phận tách chùm sáng và các thiết bị quang học khác để đạt được ảnh có độ phân giải, độ phóng đại, độ chói và độ tương phản như ý muốn trong mẫu

Hình 1.3.Các thành phần cấu tạo bên trong kính hiển vi quang học

Hình 1.1 là cấu tạo của một kính hiển vi quang hiện đại Hệ thống chiếu sáng được cung cấp bởi đèn đặt trong buồng đèn Ánh sáng phát ra từ đèn được truyền qua một hệ thống thấu kính tạo chùm tia song song được dẫn truyền trong đế kính hiển vi Ngoài ra trong đế kính hiển vi có một số phin lọc đặt trước gương phản xạ, sau khi ánh sáng phản xạ trên gương sẽ được truyền qua diapragm thị trường và tới buồng tụ sáng Bộ phận tụ sáng tạo ánh sáng có dạng nón chiếu vào mẫu (được định vị trên bàn soi), ánh sáng truyền qua mẫu đi vào trong vật kính Ánh sáng qua vật kính được tách thành hai chùm tia bởi một lăng kính để đi vào thị kính và camera

1.3.3 Nguyên lý hoạt động chung của kính hiển vi quang học

1.3.3.1 Nguyên tắc phóng đại ảnh của kính hiển vi

Khi nhìn vào kính hiển vi, ta không nhìn thấy mẫu mà nhìn thấy ảnh của mẫu Hình ảnh đó là đại diện của mẫu, chính xác đến từng chi tiết từ hình dáng tới màu sắc

Hình 1.4.Sơ đồ tạo ảnh của kính hiển vi

Học viên: Nguyễn Vũ Ánh Nguyệt 9

Để ảnh của vật được phóng đại lên thì cần đặt mẫu rất gần với tiêu cự của thấu kính thứ nhất (còn gọi là vật kính) Theo tính chất của thấu kính hội tụ, khi vật đặt rất gần ở tiêu cự thì cho ảnh là ảnh thật, ngược chiều vật, và được phóng đại lớn hơn nhiều lần tùy vào khoảng cách đặt vật cũng như độ dài tiêu cự vật kính Thấu kính được sử dụng có độ dày đủ mỏng để độ dài đường đi của ánh sáng qua vật kính là không đáng kể Ảnh thật được tạo qua vật kính gọi là ảnh trung gian Để quan sát được ảnh này người ta phải dùng một thấu kính thứ hai đặt gần ảnh trung gian để tạo

ra ảnh ảo trên võng mạc của mắt, thấu kính thứ hai này còn được gọi là thị kính Do

đó khi quan sát vật qua kính hiển vi ta luôn thấy được ảnh của nó nằm cùng chiều và lớn hơn nhiều lần so với mẫu vật [8]

Đặt khoảng cách từ vật tới tâm của vật kính (vật kính trong trường hợp này là

một thấu kính đơn) là a theo hình1.2, khoảng cách từ tâm của vật kính tới ảnh là b, tiêu

cự của vật kính là f.Theo tính chất thấu kính lồi dùng làm vật kính ta có công thức sau:

Hình 1.5 Sơ đồ kính hiển vi giới hạn chiều dài ống

Theo hình 1.2, một vật có chiều cao h1 đặt cách tâm vật kính một khoảng là a

cố định, ảnh trung gian được tạo ra bởi vật kính sẽ phụ thuộc vào tiêu cự và khoảng cách a, giả sử khoảng cách từ ảnh trung gian tới tâm vật kính là b thì độ cao của ảnh h2 được xác định là 1

a f

=

− ,a và f cố định nên khoảng cách b là cố định, dẫn đến chiều cao h2 của ảnh phụ thuộc vào khoảng cách a

và độ dài tiêu cự f của thấu kính Mô hình kính hiển vi chiều dài ống ống giới hạn sẽ cho độ phóng đại ảnh không đổi

Hình 1.6 Cấu hình tia truyền trong kính hiển vi hiệu chỉnh vô cùng

Mô hình kính hiển vi hiệu chỉnh tia sáng vô cùng được thiết kế thêm thấu kính đặt sau vật kính nhằm tạo tia sáng song song Ảnh trung gian thu được lúc này phụ thuộc vào vị trí đặt thấu kính phụ, khi thay đổi vị trí của thấu kính phụ ta sẽ lấy được các vị trí khác nhau của ảnh trung gian Ảnh của vật quan sát ngoài phụ thuộc vào vật kính còn phụ thuộc vào khoảng cách từ ảnh trung gian tới thị kính, khi khoáng cách

Học viên: Nguyễn Vũ Ánh Nguyệt 11

từ ảnh trung gian tới tâm thị kính càng ngắn thì ảnh ảo quan sát được càng lớn nên kính hiển vi hiệu chỉnh vô cùng của cấu hình kính hiển vi này cho người dùng có thể điều chỉnh độ lớn của ảnh quan sát Cấu hình kính hiển vi hiệu chỉnh tia sáng vô cùng thường được ứng dụng trong hệ kính hiển vi hiện đại

b) Kiểu chiếu sáng Kohler

Cách chiếu sáng của kính hiển vi đặc biệt quan trọng trong việc hình thành

chất lượng hình ảnh Để nâng cao hiệu suất chiếu sáng, năm 1893 Kohler (làm việc

tại tập đoàn Carl Zeiss) đã giới thiệu cấu hình chiếu sáng để tối ưu hóa nguồn sáng chiếu tới mẫu (Hình 1.5) Trong hình này, kính hiển vi được thiết kế với các diaphragma đặt trên đường đi của ánh sáng nguồn và ánh sáng đi qua vật kính Bằng cách đóng mở các diaphragma này, người ta điều khiển được độ đóng mở của chùm sáng kích thích (diaphragma 1) cũng như trường nhìn của thị kính (diaphragma 4) để nâng cao chất lượng chiếu sáng mẫu cũng như chất lượng của ảnh thu được

Hệ kính hiển vi hiện đại được thiết kế gồm tập hợp thấu kính và thành phần quang học khác để điều khiển chùm tia sáng Bộ dẫn chùm tia (condenser) trong kính

sẽ điều khiển đóng mở góc tia sáng chiếu tới mẫu theo những góc phương vị khác nhau Độ mở của bộ dẫn chùm tia kết hợp với độ mở của vật kính sẽ cho giá trị của khẩu độ số của cả hệ thống kính hiển vi Khi bộ dẫn chùm tia mở thì khẩu độ số của kính hiển vi tăng lênnên dẫn đến hiệu suất phân giải ảnh sẽ cao hơn

Hình 1.7 Sơ đồ của kiểu chiếu sáng Kohler

1.3.3.2.Khẩu độ số

Khẩu độ số của vật kính là đại lượng đặc trưng cho khả năng thu thập ánh sáng và phân tích chi tiết mẫu Khẩu độ số NA ảnh hưởng trực tiếp tới độ rõ nét của ảnh, Rayleigh đã đưa ra công thức phụ thuộc giữa giá trị này với khoảng cách giữa hai điểm gần nhất có thể quan sát được trên ảnh nhiễu xạ:

Học viên: Nguyễn Vũ Ánh Nguyệt 13

Với n là chiết suất môi trường nằm giữa mẫu vật và vật kính

 - là ½ góc của chùm sáng hình nón mà vật kính thu được

Khẩu độ số phụ thuộc vào tiêu cự của kính vật, tiêu cự càng nhỏ thì góc  càng lớn, do đó khẩu độ số càng lớn Nhưng  lớn nhất max=900, với môi trường là không khí thì giới hạn của NA trong trường hợp này sẽ là 1 Trong thực tế của NA thường là <0,95

Nếu tăng chiết suất n thì giá trị của NA sẽ tăng Người ta chế tạo các kính vật

“ngâm trong dầu” (“immersion oil”) với n=1,51 cho NA=1,4, hoặc kính vật “ngâm trong nước” với n=1,3 cho NA=1,2 để tăng độ phân giải của ảnh, vấn đề này được đề cập ở phần sau

Hình 1.9 Khẩu độ số phụ thuộc tiêu cự của vật kính

1.4.2.3 Độ phóng đại

Độ phóng đại là sự phóng ảnh của mẫu vật bằng hệ thống quang học của kính hiển vi Độ phóng đại là bội của độ phóng đại của vật kính (M1) và thị kính (M2):

M=M1 .M2

Độ phóng đại của kính hiển vi quang học thường là vài trăm lần

Tổng độ phân giải của vật kính và thị kính phụ thuộc vào khẩu độ số của cả hệ thống kính Độ phóng đại nhỏ nhất cần thiết cho việc phân giải ảnh được tính xấp xỉ bằng 500 x NA, còn độ phóng đại tối đa bằng 1000 x NA, nếu độ phóng đại vượt quá giới hạn hữu ích này thì ảnh thu được không được mịn và khó thấy được rõ chi tiết cần quan sát

Bảng 2.1.Liệt kê sự kết hợp độ phóng đại và khẩu độ số của vật kính và thị kính cho độ phóng đại nằm khoảng giới hạn cho phép

Vật kính(NA) Thị kính

d = 0 , 61  (- bước sóng ánh sử dụng) (2.6) Đối với kính vật có NA cao xấp xỉ hoặc lớn hơn 1, thì độ phân giải gần đúng

là /2 Như vậy, trong thực tế, giới hạn độ phân giải của kính hiển vi quang học sẽ là

150nm (khi  350nm, NA  1,4) Khẩu độ số càng cao thì độ phân giải ảnh càng tốt vì lúc đó khoảng cách d càng nhỏ

Mặt khác, độ phân giải còn bị giới hạn bởi nhiễu xạ (diffraction limit) Khi một nguồn sáng điểm được hiện ảnh bằng một thấu kính thì ảnh nhận được là một đốm sáng mờ với các vân giao thoa hay là ảnh nhiễu xạ - ảnh này được gọi là quầng sáng Airy (Airy pattern) Đốm sáng trung tâm của ảnh nhiễu xạ được gọi là đĩa Airy Giới hạn của độ phân giải được định nghĩa là khoảng cách d (tâm tới tâm) bằng bán kính của đĩa Airy (hình dưới)

Học viên: Nguyễn Vũ Ánh Nguyệt 15

Hình 1.10 Giới hạn phân giải

a) Quầng sáng Airy, đĩa Airy là điểm sáng trung tâm

b) d> r Airy

c) d= r Airy

Trong dải ánh sáng từ đỏ đến tím, kích thước của đĩa Airy giảm dần Ánh sáng màu đỏ (tương đương với  = 700nm) có kích thước lớn nhất và ánh sáng màu tím (

= 400nm) có kích thước đĩa bé nhất Kích thước của đĩa Airy phụ thuộc vào khẩu độ

số, với giá trị khẩu độ số bé thì kích thước của đĩa Airy lớn (Hình a), và ngược lại (Hình b & Hình c)

Hình 1.11Sự phụ thuộc của đĩa Airy vào khẩu độ số

Do đó, với những loại vật kính có khẩu độ số khác nhau thì ở mỗi một giá trị phóng đại sẽ cho độ phân giải khác nhau

Bảng 2.2 Sự liên quan giữa độ phân giải với khẩu độ số và độ phóng đại

Độ phóng đại Khẩu độ số (NA) d(µm)

100x 1.25 0.22

1.3.4 Một số loại kính hiển vi quang học

1.3.4.1 Kính hiển vi tương phản pha (Phase Contrast Microscopy[9]

a Nguyên lý

Với những vật trong suốt và sự khác biệt về chiết suất so với môi trường là không đáng kể thì rất khó phân biệt chúng với môi trường kể cả chụp ảnh hiển vi truyền qua Kính hiển vi tương phản pha hiện ảnh của sự khác biệt pha của sóng ánh sáng đi qua môi trường và đi qua mẫu, vì vậy ta có thể quan sát được ảnh của mẫu vật

Hình 1.12.Cấu hình quang học của kính hiển vi tương phản pha

Kính hiển vi tương phản pha là kỹ thuật tạo ảnh sử dụng sự khác biệt về pha để tạo

nên sự biến đổi về cường độ ánh sáng trên thị kính hoặc phim chụp

b Cấu tạo

Ánh sáng từ nguồn (1) được phân cực rồi đi qua một tấm chắn sáng vành

khuyên (2) để tạo góc chiếu tới mẫu (4) lớn (chiếu từ góc ngoài), do đó tạo độ dịch pha lớn Phần ánh sáng không đi qua mẫu (dịch pha bằng 0) và đi qua mẫu đều được vật kính thu nhận và truyền qua một tấm bản pha (7) thường là tấm λ/2 Ánh sáng không đi qua mẫu sẽ được truyền qua tấm bản pha gần như 100% Ánh sáng đi qua mẫu sẽ bị lệch pha so với ánh sáng không qua mẫu và mất đi một phần cường độ khi qua tấm bản pha Tùy vào cấu trúc của mẫu mà độ lệch pha sẽ là lớn hay nhỏ và do

đó phần cường độ mất mát khi đi qua tấm bản pha sẽ là nhiều hay ít Các ánh sáng

Học viên: Nguyễn Vũ Ánh Nguyệt 17

nhau tùy thuộc vào cấu trúc của vật và được đưa vào trường nhìn của thị kính (9) hoặc vào camera

Hình 1.13 Ảnh qua kính hiển vi trường sáng (trái) và tương phản pha (phải)[7 ]

c Ứng dụng

Kính hiển vi tương phản xa ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu tế bào, vi khuẩn

y sinh hoặc ứng dụng khi nghiên cứu những mẫu vật không thể quan sát được bởi

sự trong suốt của mẫu với môi trường

1.3.4.2 Kính hiển vi huỳnh quang(Fluorescence microcope[10]

a Nguyên lý

Ngoài loại kính hiển vi truyền qua thông thường, người ta chế ra loại kính hiển

vi huỳnh quang cho phép quan sát ảnh phóng đại của vật thể nhờ ánh sáng tự phát quang của chúng hoặc nhờ bức xạ huỳnh quang thứ cấp do gắn vật thể được quan sát với các chất đánh dấu phát quang

Kính hiển vi quang thông thường sử dụng ánh sáng chiếu vào mẫu vật và tạo hình ảnh phóng to của vật đó Kính hiển vi huỳnh quang sử dụng ánh sáng với cường

độ lớn hơn rất nhiều để chiếu vào mẫu vật Ánh sáng này sẽ kích thích huỳnh quang mẫu vật có bước sóng dài hơn Kính hiển vi huỳnh quang cũng tạo ra hình ảnh phóng

to của vật, nhưng hình ảnh này được tạo trên cơ sở nguồn sáng thứ cấp - ánh sáng huỳnh quang

b Cấu tạo

Hình 1.14 Đường đi ánh sáng kính thích và phát xạ qua kính lọc lập phương trong

kính hiển vi huỳnh quang

Trong kính hiển vi huỳnh quang, gương lưỡng chiết (dichroic mirror) được sử dụng để phân tách đường đi của ánh sáng kích thích và ánh sáng phát xạ

Gương lưỡng chiết có tính chất phản xạ đặc biệt cho phép phân tách đường đi của hai chùm ánh sáng Mỗi gương lưỡng chiết có một giá trị bước sóng giới hạn, gọi

là giá trị bước sóng chuyển pha, mà ở bước sóng đó 50% ánh sáng truyền qua Gương sẽ phản xạ những ánh sáng có bước sóng nhỏ hơn giá trị bước sóng chuyển pha và truyền qua ánh sáng có bước sóng lớn hơn giá trị này Chính vì tính chất này

mà gương có tên gọi là lưỡng sắc hay 2 màu (dichroic, two color) Trong điều kiện lý tưởng, bước sóng chuyển pha của gương lưỡng sắc được chọn ở giữa bước sóng kích thích và phát xạ Ánh sáng kích thích có bước sóng nhỏ hơn giá trị bước sóng chuyển pha nên sẽ phản xạ trên bề mặt gương lưỡng sắc và tới vật kính Ánh sáng huỳnh quang có bước sóng lớn hơn giá trị bước sóng chuyển pha nên sẽ truyền qua gương lưỡng sắc và đi tới thị kính hoặc hệ thống đầu thu (hình 1.13)

Trong kính hiển vi huỳnh quang có hai kính lọc (filter) được sử dụng cùng với gương lưỡng sắc là: kính lọc kích thích và phát xạ

Kính lọc kích thích (excitation filter): dùng để chọn lọc bước sóng kích thích, kính lọc kích thích được đặt trên đường đi của ánh sáng kích thích và trước gương lưỡng sắc Kính lọc phát xạ: dùng để lọc ánh sáng phát xạ từ mẫu vật và loại bỏ dấu vết của ánh sáng kích thích, kính lọc phát xạ được đặt ở dưới gương lưỡng Ở vị trí này, filter thực hiện cả hai chức năng là lọc ánh sáng phát xạ và loại bỏ bất kỳ dấu vết

Học viên: Nguyễn Vũ Ánh Nguyệt 19

Gương lưỡng sắc được gắn lên trên kính lọc lập phương (filter cube) Những kính lọc kích thích và phát xạ cũng thường được gắn với kính lọc lập phương Kính lọc lập phương này tạo điều kiện thuận lợi cho sự thay đổi của gương lưỡng chiết trong sự định hướng với các kính lọc

Hình 1.15 Cấu tạo của kính hiển vi huỳnh quang[7]

c Ứng dụng

Kính hiển vi huỳnh quang thường được sử dụng rộng rãi trong các thực hành và nghiên cứu y-sinh bởi sự đa dạng của các chất đánh dấu phát quang và do đó là sự đa dạng của các tính năng của chúng Kính hiển vi huỳnh quang còn có ứng dụng quan trọng trong nghiên cứu cấu trúc vật liệu, có thể cho ta thấy ảnh rõ nét của những cấu trúc siêu nhỏ

Hình 1.16.Ảnh tế bào qua kính hiển vi huỳnh quang

1.3.4.3 Kính hiển vi phản xạ nội toàn phần (total internal reflection

microcope - TIRM )

a Nguyên lý

Hình 1.16.1.Nguyên lý phản xạ nội toàn phần

Kính hiển vi phản xạ nội toàn phần sử dụng sóng biến dần ( evanescent wave ) (được tạo ra do phản xạ nội toàn phần của ánh sáng ở hai môi trường có chiết suất khác nhau) để kích thích các phân tử nằm gần bề mặt phân cách giữa hai môi trường

b) Cấu tạo

Hình 1.16.1 Cấu hình của kính hiển vi phản xạ nội toàn phần

Kính hiển vi phản xạ nội toàn phần có vật kính được chế tạo đặc biệt với khẩu

độ số lớn và độ phóng đại cao để dẫn chùm tia kích thích (cấu hình epi) và thu ánh sáng phát ra từ mẫu (hình 4.7.2.1 phải) khẩu độ số của vật kính dùng cho TIRFM

Học viên: Nguyễn Vũ Ánh Nguyệt 21

thường phải là ≥ 1,4 (ngâm trong dầu) Ngoài ra TIRFM còn có cấu hình sử dụng một lăng kính đặt trên mẫu để tạo phản xạ toàn phần Ánh sáng biến dần sẽ kích thích các phân tử bề mặt phân cách phát quang, kính vật đặt dưới mẫu sẽ thu ánh sáng huỳnh quang Kính hiển vi TIRFM tạo ảnh có độ phân giải < 200 nm do khẩu

độ số của vật kính > 1.4 và độ sâu của trường biến dần < 200nm

Hình 1.16 2 Kính hiển vi phản xạ nội toàn phần