Axit Amin và phương pháp phân tích

Thủy phân bằng acid: Để thu nhận acid amin, phương pháp thường được dùng nhất là thủy phân bằng dung dịch HCl 6N dư ở nhiệt độ 100-120oC trong 24 giờ.. Các chất hấp phụ thường dùng là si

MỤC LỤC

I Giới thiệu về acid amin 1

1) Thành phần và cấu tạo 1

2) Màu sắc, mùi vị 1

3) Tính tan 1

4) Tính quang học 1

5) Tính lưỡng tính 3

II Thu nhận acid amin 3

A Tinh sạch protein trước khi thu nhận 3

B Các phương pháp thu nhận protein 6

III.Định lượng acid amin bằng phương pháp sắc ký 7

1) Sắc ký giấy 7

2) Sắc ký lớp mỏng 8

3) Sắc ký khí 8

IV Một vài phương pháp cụ thể 8

A Phương pháp sắc ký lỏng cao áp sau phản ứng tạo dẫn xuất với 1-fluoro-2,4-dinitrophenyl-5-L-alanine amide (thuốc thử Marfey) 8

B Xác định hàm lượng acid amin trong thực phẩm bằng phương pháp đảo pha trong phân tích sắc ký với dẫn xuất mới butylthiocarbamyl và benzylthiocarbamyl 13

V Tài liệu tham khảo 34

I Giới thiệu về acid amin:

1 Thành phần và cấu tạo:

Protein là polymer của các amio acid nối với nhau bằng các liên kết cộng hoá trị là liên kết peptide Protein có thể bị thuỷ phân tạo thành các acid amin tự do bằng nhiều phương pháp khác nhau Người ta đã xác định protein được cấu trúc từ 20 loại acid amin khác nhau

Acid amin là chất hữu cơ mà phân tử chứa ít nhất một nhóm carboxyl (-COOH) và ít nhất một nhóm amino (NH2), trừ prolin chỉ có nhóm NH (thực chất là một acid imin) Trong phân tử acid amin đều có các nhóm COOH và NH2 gắn với carbon ở vị trí α Hầu hết các acid amin thu nhận được khi thuỷ phân protein đều ở dạng L-α acid amin Như vậy các protein chỉ khác nhau ở mạch nhánh, hay còn gọi là chuỗi bên (thường được ký hiệu: R)

2 Màu sắc và mùi vị:

Các acid amin thường không màu, nhiều loại có vị ngọt kiểu đường như glycine, alanine, valine, serine histidine, triptophan; một số loại có vị đắng như isoleucine, arginine hoặc không có vị như leucine Bột ngọt hay còn gọi là mì chính là muối của natri với acid glutamic (monosodium glutamate)

ký hiệu bằng dấu (-) Góc quay đặc hiệu của acid amin phụ thuộc vào pH của môi trường

Tuỳ theo sự sắp xếp trong cấu trúc phân tử của các nhóm liên kết với carbon bất đối

mà các acid amin có cấu trúc dạng D hay L (hình 1) gọi là đồng phân lập thể Số đồng phân lập thể được tính theo 2n (n là số carbon bất đối)

Hình 1: Đồng phân lập thể của alanine

Hầu hết các acid amin khác hấp thụ tia cực tím ở bước sóng (λ) khoảng từ 220 -280

nm Đặc biệt cùng nồng độ 10-3M, trong bước sóng khoảng 280 nm tryptophan hấp thụ ánh sáng cực tím mạnh nhất, gấp 4 lần khả năng hấp thụ của tyrosine (hình 2.8) và phenylalanine

là yếu nhất Phần lớn các protein đều chứa tyrosine nên người ta sử dụng tính chất này để định lượng protein

Hình 2: Phổ hấp thụ ánh sáng cực tím của tryptophan và tyrosine

5 Tính lưỡng tính:

Trong phân tử acid amin có nhóm carboxyl -COOH nên có khả năng nhường proton (H+) thể hiện tính acid, mặt khác có nhóm amin-NH2 nên có khả năng nhận proton nên thể hiện tính base Vì vậy acid amin có tính chất lưỡng tính

Trong môi trường acid, acid amin ở dạng cation (tích điện dương), nếu tăng dần pH acid amin lần lượt nhường proton thứ nhất chuyển qua dạng lưỡng cực (trung hoà về điện),

và tiếp tục tăng pH acid amin sẽ nhường proton thứ hai chuyển thành dang anion (tích điện âm) Vì vậy đôi khi người ta coi nó như một di-acid

II Thu nhận acid amin:

A Tinh sạch protein trước khi thu nhận acid amin:

1 Giới thiệu:

Phân tích acid amin của protein là một trong những phương pháp tốt nhất và chính xác nhất để định lượng protein Sự cần thiết của việc thu nhận mẫu ở nồng độ cao và không

bị nhiễm là một vấn đề cần giải quyết để xác định cấu tạo protein Nhiều phương pháp hiện

có để loại bỏ chất đệm, muối ra khỏi protein như phương pháp kết tủa hoặc sắc ký lỏng cao

áp đảo pha (RP-HPLC) gây thất thoát protein nhiều, làm việc đánh giá nồng độ thực trở nên khó khăn Sau đây là hai phương pháp thường dùng để thu hồi protein từ chất đệm: phương pháp lọc gel, cột vi xoáy tốc độ cao, và sự hấp thu vào màng poly vinylidene difluoride (PVDF) trong hộp chuẩn bị mẫu ProSorb

2 Nguyên liệu:

2.1 Thiết bị:

1 Cột vi xoáy tốc độ cao (Việc lựa chọn kích cỡ thích hợp của cột vi xoáy quan trọng cho thể tích mẫu Mẫu thể tích càng nhỏ thì nên chọn cột nhỏ)

1 Nước HPLC (luôn dùng chất phản ứng và nước có chất lượng tốt nhất)

2 Trifluoroacetic acid (TFA)

3.1 Chuẩn bị cột macrospin (mẫu 50-150 µL)

1 Cột macrospin cần được chuẩn bị cơ bản theo đề nghị của nhà sản xuất Lắp cột nhẹ nhàng để thu hồi gel ở đáy cột Hydrate hóa gel với 500 µL nước HPLC trong 15 phút ở nhiệt

độ phòng (phần trăm mẫu thu hồi được tăng khi thời gian hydrate hóa tăng cột vi xoáy), sau

đó ly tâm cột trong 4 phút ở 2000g để làm cân bằng cột

2 Rửa cột 3 lần với 500 µL nước để bảo đảm sự cân bằng

3 Thấm khô phần ngoài cột để loại ẩm và đặt nó vào một ống mới Đối với cột macrospin, thêm 50-150 µL mẫu vào đỉnh, cẩn thận đặt mẫu vào giữa cột

4 Ly tâm ống 4 phút ở 2000g, rửa cột với ít nhất 200 µL nước

5 Lấy mẫu đã tinh sạch ra và r ú t chân không ở tốc độ cao đến khô trước khi thủy phân (Khi mẫu chứa nồng độ protein hoặc peptide cao với thể tích thích hợp, không cần tinh sạch mẫu thêm, chỉ cần pha loãng mẫu với nước HPLC đến một dung dịch muối không ảnh hưởng đến quá trình phân tích.)

3.2 Cột vi xoáy (mẫu 5-25 µL)

1 Giống như đối với cột macro, rút gel khô đến đáy thùng Làm ướt với 50 µL nước và

ly tâm 3 phút, ở 1000g để cân bằng cột Để có kết quả tốt nhất, rửa cột 3 lần với 200µL nước

Để ly tâm những cột này, đặt chúng trực tiếp vào một máy ly tâm vi mô hoặc dùng một ống

ly tâm rỗng 1.7 mL

2 Sau khi cột đã cân bằng, thấm khô để loại bỏ ẩm bám bên ngoài cột.

3 Thêm 5-25 µL mẫu vào đỉnh cột, cẩn thận đặt mẫu vào giữa cột

4 Đặt cột vào một ống mới, xoay ống 3 phút ở 1000g Sau khi ly tâm, mẫu đã tinh sạch

ở trong ống và sẵn sàng để sử dụng

3.3 Chuẩn bị hộp mẫu ProSorb

1 Đảm bảo rằng mẫu đựng trong dung dịch 0.1% TFA để đạt kết quả tốt nhất (Acetonitrile (ACN) với nồng độ hơn 15% cản trở mẫu dính vào PVDF, vì vậy những phần của HPLC nên pha loãng với nước cất hoặc 0,1% TFA để giảm nồng độ của ACN xuống nhỏ hơn 15%) Nếu thể tích ít hơn 100 µL, pha loãng mẫu thành 100 µL với 0.1% TFA Nếu mẫu

có chất tẩy, pha loãng để nồng độ chất tẩy thấp hơn giá trị trong bảng 1 vì chất tẩy có thể ảnh hưởng sâu sắc đến sự kết dính protein vào màng PVDF Bảng 1 tóm tắt nồng độ của chất tẩy có thể chứa trong mẫu trước khi kết dính vào màng Ngoài ra, nếu mẫu chứa lượng chất tẩy lớn hơn lượng tối đa trong bảng 1, có thể thêm một lượng nhỏ methanol vào mẫu trước khi cho mẫu vào hộp mẫu ProSorb)

Bảng 1: Hàm lượng chất tẩy tối đa

Chất tẩy Nồng độ tối đa (v/v hoặc w/v)

2 Đặt thiết bị ProSorb vào một giá ống nghiệm thích hợp

3 Làm ướt màng PVDF trong hồ nhỏ với 10 µL methanol (hộp mẫu ProSorb nên được chuẩn bị kỹ như chỉ dẫn của nhà sản xuất, dùng nước MilliQ cho mọi bước làm sạch để giảm lượng acid amin còn sót lại.)

4 Cho mẫu vào hồ nhỏ (100 đến 400 µL thể tích), để cho mẫu chảy qua màng (Thao tác với mẫu nên cẩn thận vì protein và peptide có thể dính vào ống thủy tinh hoặc nhựa Nếu mẫu nhỏ, có thể giảm thiểu tổn thất ở cartridge bằng cách cho 100 µL dung dịch đệm vào màng ướt trước khi cho mẫu vào Mẫu có thể thêm trực tiếp vào dung dịch đệm.)

5 Đảm bảo rằng mẫu hồ nhỏtiếp xúc hoàn toàn với chất hấp thụ và sự chuyển chất lỏng bắt đầu

6 Thêm những mẫu thử thể tích nhỏ, nếu cần (đổi chất hấp thụ sau mỗi 750 µL)

7 Rửa màng với 100 µL 0.1% TFA 2 lần.

8 Lấy mẫu và làm khô màng PVDF

3.4 Thu nhận mẫu đã thủy phân trên màng PVDF

1 Đặt màng PVDF vào đáy của ống thủy phân

2 Thủy phân như bình thường Sau khi acid đã được làm khô từ mẫu thủy phân, thêm 10

µg methanol Chiết 2 lần với 50 µL dung dịch gồm 20% MeOH, 0,1N HCl và chuyển đến ống Eppendorf 0,5mL

3 Đặt ống Eppendorf vào thùng PICOTAG và làm khô nó

4 Pha loãng với dung dịch đệm loãng và lọc, dùng một cột vi xoáy Mẫu đã sẵn sàng để phân tích acid amin

B Thu nhận acid amin bằng thủy phân protein:

1 Thủy phân bằng acid:

Để thu nhận acid amin, phương pháp thường được dùng nhất là thủy phân bằng dung dịch HCl 6N dư ở nhiệt độ 100-120oC trong 24 giờ Sản phẩm thu được chủ yếu là các acid amin dưới dạng tự do dưới dạng hydrogenclorate Một số acid amin như serine và threonine

bị phá hủy một phần, tryptophan bị phá hủy hoàn toàn, glutamine và asparagines bị phân hủy thành acid glutamic, acid aspartic và NH4+

2 Thủy phân bằng kiềm:

Người ta còn có thể thu nhận acid amin bằng phương pháp thủy phân với dung dịch NaOH, bằng cách đun nóng trong nhiều giờ Sản phẩm thu được hầu hết là các acid amin nhưng đều bị racemic hóa, các acid amin cysteine, serine, threonine bị phá hủy nhưng tryptophan không bị phá hủy Vì vậy, phương pháp thủy phân bằng kiềm thường chỉ dùng để xác định tryptophan

3 Thủy phân bằng enzyme:

Để thu nhận chế phẩm acid amin, ngày nay việc thủy phân bằng enzyme được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khoa học khác nhau do việc sử dụng enzyme có nhiều ưu điểm

Các enzyme thủy phân protein thành các acid amin hay các peptide có phân tử lượng thấp được gọi chung là peptidhydrogenlase Có nhiều loại peptidhydrogenlase, chúng được phân biệt nhờ tính đặc hiệu khác nhau với liên kết peptid Một số loại cắt đứt liên kết peptide

ở đầu tận cùng của chuỗi polypeptide được gọi là exopeptidase như carboxypeptidase phân giải liên kết peptide đầu C tận cùng, aminopeptidase phân giải liên kết peptide đầu N tận

cùng Một số khác chỉ cắt đứt ở giữa chuỗi polypeptide được gọi là các endopeptidase như pepsin, tripsin…

III Định lượng acid amin bằng phương pháp sắc ký:

Người ta có thể dùng nhiều phương pháp sắc ký khác nhau, ở đây chỉ giới thiệu nguyên tắc của một số phương pháp thông dụng để phân tích acid amin

1) Sắc ký giấy

Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào sự phân bố giữa hai pha dung môi: dung môi cố định và dung môi di động Dung môi cố định thường là nước giữ ở giấy sắc ký (trong điều kiện bảo hoà hơi nước, giấy có thể giữ 15-22% nước tính theo trọng lượng giấy) Dung môi di động thường là một dung môi hữu cơ bảo hoà nước di chuyển trên tờ giấy theo mao dẫn kéo theo các chất trong dung dịch Tốc độ di chuyển của từng chất không giống nhau và mỗi chất được đặc trưng bởi một trị số nhất định gọi là Rf

Trong đó: - a là khoảng cách chuyển dịch của chất phân tích

- b là khoảng cách chuyển dịch của dung môi

Có nhiều kiểu sắc ký giấy khác nhau, đó là sắc ký một chiều đi lên, sắc ký một chiều đi xuống, sắc ký vòng nằm ngang và sắc ký hai chiều Loại giấy thường dùng là Whatman số 1 và Schleicher-Schull 2044 a và b, dung môi gồm các chất như 4 Butanol:1 Acetic acid: 5 Nước (dùng cho chiều thư nhất); 3 Phenol: 1 Nước (dùng cho chiều thứ hai)

2 ) Sắc ký lớp mỏng

Nguyên tắc của phương pháp này dựa trên lý thuyết của sắc ký giấy, nghĩa là cũng dựa trên sự phân bố các chất giữa hai pha: chất hấp phụ được tráng rộng trên một phiến kính tạo thành một lớp mỏng và pha di động là dung môi thích hợp Dung môi di chuyển làm dịch chuyển các chất trong mẫu thử Các chất hấp phụ thường dùng là silicagel, alumin oxyt, sephadex ,v.v được kết hợp với thạch cao (gypse) để dán vào phiến kính

3) Sắc ký khí

Nguyên tắc của phương pháp này là lợi dụng tính chất khó bay hơi của các acid amin nên có thể sử dụng chương trình nhiệt để chuyển chúng thành các dẫn xuất (thường là N-acetyl-amin) Cho tác dụng acid amin với cồn amylic và HBr khan, sau đó cho tác dụng hỗn hợp này với anhydrid acetic Cột thường dùng là loại Chromosorb W (60-80 mesh) có một lớp polyetylenglycol 1% (carbowax 1564 hoặc 6000) Chương trình nhiệt giữa 125o C và

155oC, tốc độ chảy 60-240 mL/phút

IV Một vài phương pháp cụ thể

A Phân tích acid amin bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp sau phản ứng tạo dẫn xuất với 1-fluoro-2,4-dinitrophenyl-5-L-alanine amide (thuốc thử Marfey)

1 Giới thiệu

Việc tạo dẫn xuất của acid amin kèm theo việc phân tích sắc ký lỏng cao áp có đảo pha (RP-HPLC) được xem là phương pháp thích hợp nhất để phân tích acid amin Các bước tạo dẫn xuất không chỉ cần thiết cho sự tương tác với pha không phân cực và ổn định, mà còn cần cho việc đo quang

Thuốc thử Marfey 1-fluoro-2,4-dinitrophenyl-5-L-alanine amide hoặc fluoro-2,4-dinitrophenyl)-amino]propanamide được sử dụng để tách và xác định cấu hình acid amin Thuốc thử phản ứng hóa học với nhóm amino của đối hình acid amin để tạo ra dẫn xuất ổn định mà có thể tách bằng phương pháp RP-HPLC (hình 1) Dinitronphenyl alanine amid hấp thu mạnh bước sóng 340 nm (ε = 30000 M-1 cm-1), điều này cho phép đầu dò xác định được ở phạm vi subnmol

(S)-2-[(5-Việc tạo dẫn xuất với thuốc thử Marfey cũng được dùng để định lượng 19 L-acid amin thường gặp Ưu điểm của thuốc thử Marfey là:

1 Có khả năng tạo sắc phổ trên bất kỳ thiết bị phân tích HPLC nào mà không cần phải tăng nhiệt độ cột phản ứng

2 Những dung môi không tinh khiết khác khó dò được bước sóng 340 nm

3 Phát hiện cả sự có mặt của proline khi chạy cột sắc ký đơn

4 Tạo dẫn xuất acid amin ổn định

Kỹ thuật đo đơn giản này đem lại cho những nhà phân tích acid amin một phương pháp hiệu quả và rẻ tiền Việc tạo dẫn xuất với thuốc thử Marfey còn có những ứng dụng trong các lĩnh vực hóa sinh, trong đó có việc xác định cơ chất và sản phẩm trong những phản ứng enzyme của acid amin

Hình 3: Thuốc thử Marfey (I) và L,L- dẫn xuất từ L-acid amin

và thuốc thử (II)

2 Nguyên liệu-Thiết bị:

2.1 Thủy phân protein

• Ống nghiệm bằng thủy tinh chịu nhiệt kích thước 25-50 x 5 mm

• Ống nghiệm thủy tinh có nắp khoen siết chặt

• Dung dịch HCl 6N

2.2 Phản ứng thu nhận dẫn xuất

• dd acid amin chuẩn

• Bộ kit thử L-acid amin chuẩn LAA21

• Thuốc thử Marfey Lưu ý: thuốc thử Marfey là dẫn xuất của trinitrobenzene, chất nghi ngờ là có khả năng gây ung thư nên cần thận trọng khi sử dụng

1-fluoro-2,4-• HPLC grade triethylamine, methanol, acetone và dimethyl sulfoxide (DMSO)

2.3 Phân tích sắc ký:

• Hệ thống vận chuyển dung môi: bất kỳ thiết bị phân tích bằng sắc ký lỏng cao

áp nào cũng có thể sử dụng để thu nhận dẫn xuất của acid amin

• Cột sắc ký: cột silicat C8 chuyển đổi pha, ví dụ như: LiChrospher 100 RP 8 (250 x 4.6 mm; 5 μm from Macherey-Nagel), Aquapore RP 300 (220 x 4.6 mm; 7 μm from Perkin-Elmer), Nucleosil 100-C8 (250 x 4.6 mm; 5 μm from Macherey-Nagel), or Vydac C8 (250 x 4.6 mm; 5 μm from The Separations group)

• Đầu dò UV/vis kèm theo ô chứa chất lỏng dài 0.5-1 cm, thể tích 3-5 µL Dẫn xuất của acid amin được phát hiện ở 340 nm

• Tổng hợp peak: các phần mềm máy tính được dùng để tổng hợp và định lượng peak của acid amin

• Dung môi: phải được chuẩn bị với HPLC grade và phải được loại khí

 Dung môi A: 13 mM trifluoroacetic acid (TFA) cùng với 4% (v/v)

tetrahydrofuran trong nước

 Dung môi B: Acetonitrile (50% v/v) trong dung môi A

3 Phương pháp:

3.1 Thủy phân protein:

 Lấy vào lọ thủy tinh nhỏ 50-500 pmol mẫu protein hoặc 20 μL dung dịch acid amin chuẩn chứa 2.5 μmol/mL mỗi 17 acid amin, sau đó làm khô dưới áp suất nhẹ trong thiết bị cô đặc SpeedVac

 Đặt những lọ thủy tinh mẫu trên vào lọ thủy tinh có nút khoen chặt chứa 200

 Thêm 50 μL hỗn hợp theo tỉ lệ triethylamine : methanol : nước = 1 : 1 : 2 vào

lọ đã làm khô rồi trộn vortex thật đều, sau đó đem làm khô

 Chuẩn bị dung dịch thuốc thử cho phản ứng tạo dẫn xuất (18.4mM) bằng cách cho 5 mg thuốc thử Marfey vào 1 mL dung dịch acetone

 Cho hỗn hợp acid amin đã làm khô hoặc mẫu protein đã thủy phân vào 100 μL triethylamine 25% v/v, rồi thêm vào 100 μL dung dịch thuốc thử Marfey và trộn vortex thật đều

 Ủ lọ thủy tinh đó ở 40oC trong 60 phút trong điều kiện khuấy trộn nhẹ và tránh ánh sáng để phản ứng tạo dẫn xuất xảy ra

 Sau khi ủ, thêm vào hỗn hợp 20 μL dung dịch HCl 2N Khi này phản ứng kết thúc Làm khô hỗn hợp dưới áp suất nhỏ

 Bảo quản hỗn hợp ở -20oC trong bóng tối cho đến khi sử dụng

 Thêm vào mẫu đã làm khô 1mL dung dịch dimethyl sulfoxide (DMSO) 50% v/v

3.3 Phân tích sắc ký:

 Thêm dung môi A và dung môi B vào hệ thống phân tích sắc ký lỏng cao áp theo hướng dẫn của nhà sản xuất

 Cân bằng cột chạy sắc ký và đầu dò với 90% dung môi A và 10% dung môi B

 Đem mẫu đi phân tích ở nhiệt độ phòng; nếu cần có thể pha loãng với dung môi A bằng cách thêm vào cột 20 μL (50-1000 pmol)

 Rửa giải cột với hàm lượng dung môi A và B như bảng 2 Việc phân tích dẫn xuất 2,4-dinitrophenyl-5-L-alanine amide của 18 L-acid amin thường gặp và acid cysteic thu được kết quả trong 120 phút (hình 4)

Bảng 2: Chương trình HPLC cho sự phân giải dẫn xuất acid amin với thuốc thử

 Xác định những yếu tố ảnh hưởng đối với mỗi acid amin từ khu vực đỉnh của biểu đồ sắc phổ ở những hàm lượng 100, 250, 500 và 1000 pmol.

 Khi quá trình phân tích sắc ký kết thúc, rửa cột và bơm vào methanol đã loại khí 20% v/v để bảo quản Trước khi sử dụng lại, làm sạch với 100% methanol

Hình 4: Sự tách dẫn xuất 2,4-dinitrophenyl-5-L-alanine amid của L-acid amin bằng phương pháp HPLC Thuốc thử Marfey tạo dẫn xuất từ lượng 20 μ L hỗn hợp acid amin chuẩn Thiết bị: cột LiChrospher 100 RP 8 (250 x 4.6 mm ; 5 μm from Macherey-Nagel); mẫu chứa 100 pmol dẫn xuất của 18 L-acid amin; dung môi A chứa 13mM acid trifluoroacetic cùng tetrahydrofuran 4% v/v trong nước; dung môi B chứa acetonitrile 50% v/v trong dung môi A; tốc độ chảy 1mL/phút; đầu dò bước sóng 340 nm; cột rửa giải với lượng dung môi B trong dung môi A phù hợp Dẫn xuất acid amin được biểu thị bằng những chữ cái, ví dụ acid cysteic được ký hiệu là CYA, còn cysteine là Cs FFDA đặc trưng cho đỉnh của thuốc thử; đỉnh không có ký hiệu tượng trưng cho thuốc thử phụ

có liên quan, như được chỉ trong quá trình chạy sắc phổ riêng lẻ trong thuốc thử riêng.

4 Chú ý:

 Để phân tích acid amin khi acid này đóng vai trò là cơ chất hay sản phẩm trong phản ứng enzyme, việc tách protein từ acid nucleic là cần thiết Thêm dung dịch acid perchloric 4M vào dịch cô đặc cuối cùng nồng độ 1M và ủ trên đá trong ít nhất

15 phút Khi thêm cùng một thể tích dung dịch KOH 2M ở trạng thái lạnh, acid

perchloric chuyển thành muối KClO4 Sau khi ly tâm 15 phút ở 4oC, ta thu chất nổi trên bề mặt, đem làm khô rồi sử dụng cho quá trình tạo dẫn xuất.

 Việc tách hoàn toàn dung dịch HCl ra khỏi hỗn hợp là rất quan trọng cho phản ứng giữa các acid amin và thuốc thử Marfey

 Tỉ lệ giữa thuốc thử Marfey và tổng lượng acid amin không nên vượt quá tỉ lệ 3:1

 Trong suốt quá trình thu nhận dẫn xuất, màu của hỗn hợp phản ứng chuyển từ vàng sang cam rồi đỏ

 Trong quá trình acid hóa, màu của hỗn hợp chuyển sang vàng

 Hỗn hợp acid amin sẽ giữ được tính chất ổn định trong hơn 1 tháng khi bảo quản ở -20oC trong bóng tối Trong dung dịch DMSO 50% v/v, dẫn xuất thu được sẽ

ổn định trong 72 giờ ở -4oC và hơn 6 tuần nếu bảo quản ở -20oC

 Để quá trình đạt hiệu suất cao nên sử dụng thiết bị phun HPLC tự động

 Cột phản ứng silicat C8 từ những nhà sản xuất khác nhau sẽ cho kết quả của 19 dẫn xuất acid amin, tuy nhiên, khu vực dốc gradient của dung môi B nên tương tự cho mỗi cột Nếu tính thêm acid S-carboxymethyl-L-cysteine và tryptophan thì 2 acid này tách riêng biệt trong sắc phổ riêng lẻ

 Việc xác định mỗi đỉnh trên biểu đồ sắc phổ được thiết lập bằng việc thêm lượng dư acid amin gấp 3 lần Ô thuốc thử nên được chạy theo từng mẻ với thuốc thử Marfey để xác định peak liên quan Thuốc thử dư sẽ gây cản trở cho việc tách riêng peak của arginine và glycine Lysine và tyrosine được tách riêng như những dẫn xuất không thể thay thế

B Xác định hàm lượng acid amin trong thực phẩm bằng phương pháp đảo pha trong phân tích sắc kí với chất dẫn xuất mới butylthiocarbamyl và benzylthiocarbamyl

1 Giới thiệu:

Phân tích acid amin với phương pháp phân tích sắc ký lỏng đảo pha và chiếu UV thường được sử dụng đối với những dụng cụ có độ nhạy cao và nhanh hơn nhiều so với phương pháp phân tích acid amin bằng phương pháp trao đổi ion chuyên dụng Dẫn xuất acid amin phenylthiocarbanyl (PTC) được sử dụng trong phân tích acid amin bằng phương pháp

RP HPLC Đây là phương pháp tốt nhất cho phân tích những dẫn xuất acid amin bậc 2 proline và hydroxy proline Tuy nhiên, nhược điểm chính của nó là đòi hỏi 1 hệ thống hút

chân không và tốn thời gian để loại những sản phẩm phụ được sinh ra trong quá trình và loại thuốc thử dư để tránh nhiễu đối với đỉnh phân tích.

Mặc dù có những tiến bộ trong việc tìm thuốc thử cho thu nhận dẫn xuất vì những dẫn xuất vẫn còn khuyết điểm, các nhà khoa học vẫn cần thuốc thử với những đặc điểm: đơn giản, nhạy, ổn định, có khả năng vay hơi cho phương pháp phân tích acid amin với RP HPLC

và đầu dò UV Dẫn xuất sử dụng trong phương pháp phân tích này rất đa dạng, ngoài phương pháp PTC còn có OPA (dansyl, dabsyl, 4- nitro phenyl thiocarbonyl (NPTC)) Với những dẫn xuất OPA, những sản phẩm acid amin bậc 2 proline, hydro proline không thể phát hiện bởi

vì OPA không phản ứng với acid amin bậc 2 khi có mặt những tác nhân oxi hóa Hơn nữa, dẫn xuất Dansyl được hình trong bóng tối và không bền khi thời gian phản ứng kéo dài, dưới tác dụng của dung môi, ánh sáng và bị nhiễu bởi những đỉnh song vì những sản phẩm phụ trong suốt quá trình dẫn xuất hóa Dẫn xuất dansyl, theo báo cáo thấy rằng nó liên kết với những hợp chất hóa học để tiêu diệt vi khuẩn rất chặt chẽ Nhược điểm của dẫn xuất này là sự vượt mức hàm lượng ure, muối photphat, NH4NO3 sẽ thay đổi pH đệm của phản ứng và gây cản trở cho quá trình

Dẫn xuất hóa với 4- nitro phenyl thiocarbonyl (NPITC) tạo nên sự ổn định của dẫn xuất NPITC – 1 chất rất phù hợp cho phân tích RP-HPLC và đầu dò UV ở 254- 340 nm Nhược điểm của NPITC là sự là sự vượt mức thuốc thử không dễ bị loại bỏ dưới áp lực chân không Trong trường hợp này người ta thường dùng dung môi là toluene để trích ly nó 1 thuốc thử dễ bay hơi hơn trong phương pháp này là BITC, nó là dẫn xuất của 22 acid amin tiêu chuẩn BTC_acid amin được phân tích bằng RP-HPLC và đầu dò UV phát hiện ở bước song 250nm Thuốc thử này cũng rất phù hợp trong phân tích acid amin trong thực phẩm

Ưu điểm của BITC: dễ bay hơi, do đó giảm thời gian phân tích (vì những sản phẩm phụ và thuốc thử dư dễ loại bỏ); khả năng tách dẫn xuất với cystine, cystein, PTC không có khả năng này, những dẫn xuất acid amin bậc 2, proline, hydroxyproline cũng được dò thấy với độ nhạy cảm rất cao Nhưng asparagines và serine thì không thấy rõ và khả năng bền của dẫn xuất BTC ở nhiệt độ phòng chỉ khoảng 8h

BZTC có dạng tương tự BTC (ngoại trừ NPITC) được thu nhận dẫn xuất từ 22 acid amin đối với BZTC thành công và những dẫn xuất này được tách ra hoàn toàn trong pha đảo của cột Nova Thuốc thử BZITC kém bay hơi hơn so với BITC nhưng khả năng bay hơi tương tự PITC Ưu điểm của dẫn xuất BZTC là đạt hiệu quả cao hơn trong phương pháp đảo pha so với dẫn xuất PTC trong cùng điều kiện thí nghiệm

2 Nguyên liệu-Thiết bị:

2.1 Thiết bị:

1 Máy hút chân không

2 Hệ thống phân phối dung môi Spectra-Physics 8800 cùng với hệ thống bài khí và

1 BITC, BZITC, PITC (bảo quản ở 0-5oC)

2 Bolvine serum albumin (BSA), acid amin chuẩn, norleucine Acid amin chuẩn bảo quản ở nhiệt độ phòng còn BSA được giữ ở 2-8oC

3 HPLC – grade acetonitrile, CH3OH, tetra hydrofuran (giữ ở nhiệt độ phòng)

2 Chuẩn bị dung dịch đệm: gồm hỗn hợp acetonitrile-methanol-triethylamine với tỉ

lệ 10:5:2 chứa L-norleucine (nồng độ 2.5 µmol/mL) với vai trò như chất chuẩn bên trong, được bảo quản ở 0-5oC và phải chuẩn bị lại sau khoảng thời gian rất ngắn

3 Phương pháp:

3.1 Quá trình thủy phân BSA và mẫu thực phẩm:

1 Cho BSA (4mg) và bột đậu nành đã nghiền hoặc mẫu trứng đã đồng hóa (0,2g) lần lượt vào ống nghiệm 5ml và 25ml với nắp vặn có lỗ và màng ngăn

2 Thêm 0,5ml và 15ml HCl 6M chứa 0,1% phenol vào ống nghiệm 5ml và 25ml, theo thứ tự

3 Sau khi vặn nắp chặt, đâm 2 kim tiêm bằng thép không rỉ qua màng ngăn

4 Nối 1 kim ngập trong dung dịch với nitơ khô cung cấp, kim còn lại nối vào bơm chân không

5 Rút chân không bằng bơm chân không trong 5 phút, đồng thời sục khí nitơ vào

6 Tháo kim nối với bơm chân không trước khi tháo kim nối với nitơ

7 Cẩn thận tháo nắp có lỗ, thay bằng nắp không có lỗ vì những lỗ nhỏ có thể tạo thành khi áp suất cao.

8 Thủy phân ở 145oC trong 4 giờ

9 Làm khô bã BSA với nitơ ở 50oC, hòa tan với 5ml HCl 0,01M Mẫu đã sẵn sàng cho quá trình tạo dẫn xuất

10 Lọc bã đậu nành và trứng, sấy với thiết bị sấy thùng quay Hòa tan và điều chỉnh tới 50ml HCl 0.01M

11 Dùng sắc ký trao đổi cation để làm sạch dung dịch thủy phân đậu nành và trứng

12 Cho 5ml dung dịch thủy phân đi qua cột trao đổi cation 100 x 13 mm (Dowex 5 x 8) với vận tốc 6 giọt/phút để giữ lại acid amin ở nhựa trao đổi ion

13 Rửa cột nhiều lần với 20ml nước

14 Tách rửa acid amin trên cột trao đổi cation với 40ml dung dịch ammonia 4M, tốc

độ 6 giọt/phút

15 Làm khô dung dịch đã tách rửa trong thiết bị sấy thùng quay ở 50oC, hòa tan bằng dung dịch HCl 0,01M và điều chỉnh thể tích đến 50ml Mẫu đã sẵn sàng cho quá trình tạo dẫn xuất