giáo trình thực tập vi sinh vật học

3 Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm LỜI NHÀ XUẤT BẢN Là khoa học nghiên cứu về các đặc điểm sinh học của các vỉ sinh vật - sinh vật có kích thước hiển vi và siêu hiển vi, Vĩ sinh vậ

DAM SAO MAI (CHU BIEN), TRINH NGQC NAM,

BUI HONG QUAN, LE HỒNG THÍA, ĐÀO HỒNG HÀ

Gió: 56.000đ

SAO MAI, TRINH NGQC NAM, BÙI HỎNG QUAN

LE HONG THIA, DAO HONG HA

Thực tập

VI SINH VẬT HỌC

NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP

TP HO CHi MINH

3 Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm

LỜI NHÀ XUẤT BẢN

Là khoa học nghiên cứu về các đặc điểm sinh học của các vỉ sinh vật - sinh vật có kích

thước hiển vi và siêu hiển vi, Vĩ sinh vật học có nhiệm vụ nghiên cứu các đặc điểm cơ bản vẻ hình

thải, cấu tạo, di truyền hoạt động sinh vật hóa học; nghiên cứu sự phân bố của vi sinh vật trong te

nhiên và mỗi quan hệ giữa chúng với môi trường và các sinh vật khác; nghiên cứu các biện pháp thích hợp đề sử dụng hiệu quả nhất vi sinh vật có lợi cũng như các biện pháp tích cực nhằm ngăn ngừa các vi sinh vật có hại

Cuốn sách "Thực tập Vi sinh vật học" được nhóm tác giả: TS Đàm Sao Mai (chủ biê

Trịnh Ngọc Nam, Lê Hồng Thía, Đào Hằng Hà, Bùi Hồng Quân biên soạn khá công phu, là một

tực rất đáng trân trọng trong việc giới thiệu các phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, tập trung vào các thí nghiệm nghiên cứa, xác định các vi sinh vật dùng trong công nghiệp thực phẩm và các phương pháp kiêm nghiệm vi sinh thực phẩm Sách cung cáp cho người đọc kiến thức thực hành cơ bản về vi sink hoc thực phẩm một cách toàn điện thông qua việc trình bày các kĩ thuật kinh điền Bén cạnh đó, sách còn trình bày một số kĩ thuật phân tích hiện đại dựa trên nguyên tắc sinh học phân tử như PCR hoặc sử đụng test thie mhanh bằng hệ thống API He thống bài thí nghiệm được

bồ trí hợp l, kiến thức của bài trước làm nền cho bài sau Trong mỗi bài đều có phần nhắc lại lí thuyết trọng tâm, giúp người đọc nắm được cơ sở lí thuyết của thí nghiệm Trình tự thao tác được trình bày cặn kẽ, hợp lí và mình họa rõ ràng Các bài thí nghiệm thực hiện qua nhiều công đoạn đều có sơ đồ trình tự thí nghiệm, giúp người đọc hình dưng rõ ràng tiễn trình thí nghiệm Ngoài ra,

phần Phụ lục có chỉ tiêu vi sinh của một số sản phẩm thực phẩm theo Tiêu chuẩn Việt Nam giúp

người đọc thông tin về giới han an toàn vì sinh trong thực phẩm Sách đáp ứng được những đòi hỏi

cơ bản của công tác hướng dẫn thực hành: cung cấp cơ sở lí thuyết cơ bản, dự trù nguyên liệu, hóa chất, chuẩn bị dụng cụ, hướng dẫn trình tự tiến hành và các thao tác chuyên môn đặc biệt của thí

nghiệm, vì thí nghiệm vi sinh là thí nghiệm tỉnh tế, nhạy cảm, đòi hỏi sự cẩn trọng và độ chính xác

cao

Trên cơ sở kế thừa, nâng cao, đổi mới nội dung kiến thức, cuồn sách này thể hiện kết quả

tình thần làm việc khoa học nghiêm túc của các tác giả Trong quá trình biên soạn, các tác giả đã tham khảo, chọn lọc nhiều tài liệu, tuân thủ nguyên tắc trình bày rõ ràng, lôgích Vì vậy, cuốn sách

là một tài liệu khoa học, hệ thống và cơ bản, rất có ích cho giáo viên hướng dẫn thực hành cũng

như sinh viên ngành công nghệ thực phẩm

Nhà xuất bản Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh trân trọng giới thiệu cuốn

sách "Thực tập Vi sinh vật học " đến đông đảo bạn đọc

NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP

THANH PHO HO CHi MINH

Thực tập Vĩ sinh vật học 4

LỜI MỞ ĐẦU

“Xung quanh chúng ta, ngoài các sinh vật lớn mà chúng ta có thé nhin thay được, còn có vô

vàn vi sinh vật nhỏ bé, muốn nhìn thấy chúng phải sử dụng kinh hiển vì, người ta gọi chúng là vi

sinh vật Vì sinh vật phân bồ rộng rãi trong tự nhiên và ảnh hưởng, rất lớn đến đời sống của con

người và mọi sinh vật khác Ngành khoa học nghiên cứu về hoạt động sống của các vỉ sinh vật được gọi là Vĩ sinh vật học

Vi sinh vat học phát triển rất nhanh, với nhiều lĩnh vực khác nhau: vỉ khuẩn học, nắm học,

tio học, virus học hay y sinh vi sinh vat hoc, vi sinh vật học thú y, vi sinh công nghiệp, vi sinh

nông nghiệp, vi sinh môi trường Mỗi lĩnh vực có đối tượng riêng, cần đi sâu nghiên cứu; song ở mức độ nhất định, các chuyên ngành trên đều có những điểm cơ bản giống nhau

Phương pháp pha chế môi trường nuôi cấy

Phuong pháp nuôi cấy vi sinh vật

Phương pháp quan sát vi sinh vật bằng kính hi

Phương pháp nhuộm màu vi sinh vật

Phương pháp phân lập vi sinh vật

Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật

Khảo sát sự sinh trưởng của vi sinh vật Đường cong sinh

trưởng của vi sinh vật

Khảo sắt sự ảnh hướng của các yếu tố môi trường đến sự sinh

trưởng của vi sinh vật

Khảo sát đặc tính sinh hóa của vĩ sinh vật

Kiểm soát sự sinh trưởng của vỉ sinh vật

Xác định khả năng phân giai cellulose và hoat tinh enzyme

Định lượng ví sinh vat bing phương pháp đêm trực tiếp 101 Định lượng tổng VK hiếu khí trong thực phẩm bằng phương

Phương pháp phân tích dinh lugng Escherichia coli trong thye pham 132

Phuong phap phan tich Salmonella spp trong thực phẩm 141 Phương pháp phân tích dinh luong Bacillus cereus trong thực phẩm 149

Phương pháp phân tích dinh lugng Staphylococcus aureus trong,

Phương pháp phân tích Vibrio cholerae trong thực phẩm 163

Phuong phap phan tich Clostridium perfringens trong thyre pham „175

Phương pháp phân tích vi sinh vật trong thực phẩm bằng phương,

XXác định nhanh vĩ sinh vật rong thực phẩm bằng hệ thống

Thực tập Vĩ sinh vật học 6

Phụ lục

Bang tra MPN dùng cho loạt 9 ống ở ba nồng độ liên tỉ

‘Thuong quy kỹ thuật định tính và bán định lượng độc tổ vi nắm aflatoxin

“Thường quy kỹ thuật định danh nắm mốc aspergillus flavus, aspergillus

niger, aspergillus fumigatus trong thyc pham

“Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7042:2002 Bia hơi —

định kỹ thuật So/f drinks —.Specjficarion Hee 206

“Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7044:

“Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7045:

Wine ~ Specjfication 208

Các chỉ tiêu vi sinh vật của sữa tươi tiệt trùng TCVN 7028:2002

Tiêu chuẳn Việt Nam TCVN 7108:2002 Sản phẩm sữa bột dành cho trẻ đến 12 tháng

kỹ thuật Dried milk for infants up-to 12 months age — Speciffeation 209

“Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5538:2002 (Soát xét lần 1) Sữa bột - quy định

ky thuat Milk powder — Speification oe

Tiêu chuẳn Việt Nam TCVN 7030:2002 Sữa chua — quy định kỹ thuật

Yoghurt — Specification -

Tiêu chuẳn Việt Nam TCVN 5539.2002 (Soát xét lần 1) Sữa đặc có đường —

quy định kỹ thuat Sweetened condensed milk — Specification

“Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7029:2002 Sữa hoàn nguyên tiệt trùng — quy

định kỹ thugt Sterilized reconstituted milk — Specification

Tiêu chudn Vigt Nam TCVN 7028:2002 Sữa trời tiệt tring — quy định kỹ

thuat Sterilized fresh milk — Specification oe

“Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7049:2002 Thịt chế biến có xử lý nhỉ

định kỹ thuật heat Treated processed meat — Specification

“Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7050:2002 Thi

định kỹ thuật Non — heat treated processed meat ~ Specification

“Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7048:2002 Thịt hộp - quy định kỹ

thuat Canned meat Specification ca

Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7046 : 2002 Thịt tươi quy định kỹ thuật

Fresh meat Specification

210

Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 7

NHỮNG QUY TÁC AN TOÀN TRONG PHÒNG THÍ

NGHIỆM VI SINH VẬT

Thao tác an toàn là yêu cầu cực kỳ quan trọng đối với thí nghiệm vi sinh vat Vi

sinh vật có kích thước nhỏ bé mà mắt thường không nhìn thấy được Trong quá trình làm thí nghiệm, chúng ta thường thao tác với số lượng rất lớn và đậm đặc tế bào vi sinh vật

Bên cạnh những giống, loài vi sinh vật có ích là những giống, loài có khả năng gây bệnh và

có hại đối với sức khỏe con người Mặt khác, trong quá trình thí nghiệm chúng ta cũng, phải sử dụng nhiều loại hóa chất, trong đó có những hóa chất có độc tính Chính vì thé,

người làm thí nghiệm trong phòng thí nghiệm vi sinh vật cần tuân thủ các quy tắc cơ bản

sau đây

1.NHỮNG QUY ĐỊNH CHUNG

- Những người không có nhiệm vụ không được vào phòng thí nghiệm

~ Khi vào phòng thí nghiệm phải mặc áo blouse (cài khuy kín), cột tóc gọn gàng

- Không nói chuyện ồn ào, giữ gìn trật tự Không ăn uống, hút thuốc trong phòng

kiểm nghiệm

- Mang khẩu trang, găng tay khi thao tác với vi sinh vật và hóa chất

- Trên bàn thí nghiệm chỉ để vật dụng thí nghiệm, số ghi chép, giấy ghi chép Tất cả các vật dụng cá nhân, áo khoác, túi xách, sách vở phải dé đúng nơi quy định

- Trước và sau khi kết thúc thí nghiệm, phải sát trùng mặt bàn bằng các hóa chất sát trùng cồn 70% hoặc dung dịch khuẩn khác (lysol 5%, amphyl 10%, chlorox 10%) đã chuẩn bị sẵn và lau khô bằng giấy vệ sinh

- Cần ghi chú tên chủng, ngày tháng thí nghiệm, người làm thí nghiệm lên tất cả các hộp petri, ống nghiệm

- Tuyệt đối không để canh trường hay vật phẩm có vi sinh vật dính lên quần áo,

sách vở và dụng cụ cá nhân Đồng thời cũng phải chú ý bảo vệ da và quần áo khỏi bị dính hóa chất và thuốc nhuộm

8 Thực tập Vĩ sinh vật học

- Tat cả các vật liệu bị nhiễm bản, môi trường chứa hoặc nhiễm vi sinh vật cần phải

được khử trùng trước khi vứt bỏ hoặc sử dụng lại Các dụng cụ, bình chứa nhiễm vi sinh vật cần được ngâm vào dung địch diệt khuẩn (nước javel) trước khi rửa và tái sử dụng

- Kết thúc thí nghiệm phải vệ sinh các thiết bị, dụng cụ đã sử dụng theo đúng quy trình va sắp xếp vào đúng nơi quy định

- Rửa tay sạch sẽ trước khi rời phòng thí nghiệm

- Tất cả các trường hợp tai nạn phải báo cáo cho cán bộ hướng dẫn thí nghiệm đẻ

kịp thời xử lý

Il MỘT SỐ LƯU Ý VỚI SINH VIÊN NHẢM ĐẠT KET QUA TOT TRONG THYC HANH VI SINH VAT

1 Trước khi thực hành

- Cần đọc trước nội dung toàn bài để hình dung được khối lượng công việc sẽ làm

- Hiểu rõ nguyên tắc, mục đích của các thí nghiệm

~ Đọc cẩn thận cách tiến hành thí nghiệm

2 Trong giờ thực hành

- Ghi chú cẩn thận những căn đặn của giảng viên về các thao tác và quy trình thực hành

- Thực hiện thí nghiệm theo đúng hướng dẫn của giảng viên

Trong quá trình thí nghiệm có những thao tác, công đoạn không rõ cần hỏi lại giảng viên hướng dẫn

~ Ghi chép cẩn thận các chú ý quan trọng của thí nghiệm và kết quả của mỗi thí nghiệm

Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 9

Bài 1

THIẾT BỊ, DỤNG CỤ PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH

VẬT VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP TIỆT TRÙNG VI SINH VẬT

1 THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT HỌC

1 Tủ sấy (vacuum oven): điều chỉnh nhiệt độ từ 60”C - 200°C, dùng đẻ sấy khô, khử trùng các loại dụng cụ chịu được sức nóng khô, chủ yếu là dụng cụ thủy tỉnh, kim loại

Tùy vào đối tượng cần khử khuẩn mà sấy ở chế độ nhiệt và thời gian khác nhau, thường

sấy ở 160”C trong 2 giờ, hoặc 180”C trong 30 phút

Hình 1.1 Tử sáy

2.Tủ Ấm (ineubator or etuve): nhiệt độ từ 20”C — 60”C, có chế độ ôn định nhiệt

độ, được sử dụng để nu‹ vi sinh vật tại nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trường và phát triển của chúng Tùy vào đối tượng nuôi cấy mà ủ ở nhiệt độ khác nhau để vi sinh vật có thể phát triển tốt Ví du: coliform 30°C trong 24 ~ 48 gid, E coli thích hợp ở 44`C trong 24

—48 giờ

3 Tit lanh hay ti mat (freezer); dùng bảo quản môi trường đã pha chế, gidng vi khuẩn, các chế phẩm sinh học (vaccin, huyết thanh, đĩa giấy kháng sinh ) hóa chất, thuốc thử đễ phân hủy ở nhiệt độ thường

4 Nồi hấp ướt (autoclave): Thiết bị này cấp nhiệt bằng hơi nước ở áp suất cao

(hơi nước bão hòa ở áp suất cao), được sử dụng để hấp khử trùng môi trường, một số nguyên liệu và dụng cụ thí nghiệm, Tùy đối tượng mà sử dụng ở chế độ nhiệt độ và áp suất

thích hợp thường dùng ở 121 ”Œ/1 atm trong 15 phút; 127 “C/1.5 atm trong 30 phút với môi trường đất; hay 117”C/0.8 atm trong 15 phút với môi trường chứa nhiều đường, môi trường

sữa

Bảng 1.2 Tương quan giữa áp suất hơi (chỉ số của áp kế nôi hắp) và nhiệt độ

(Chi số áp kế của nội ápJ0,0 [02 |04 [03 ]06 [07 [08 [09 ]i0 ]i5 |20

suất (atm)

Nhiệt độ sôi nước(C) |100 J105 [H19 [H12 [H14 [D6 [17 [19 Hội |T27 ]134

Nhiệt độ sôi nước (CF) |212 |221 |230 |2344 |237 |24i |243 |246 |250 |261 |273

Hình 1.2 Nỗi hấp cao áp (Autoclave)

5 Cân phân tích điện tử (analytical balance): cân trọng lượng từ 100 ug — 200 g

Độ chính xác 10” g Can ky thudt (technical balance): độ chính xác 102g Dùng cân hóa chất, môi trường Trong quá trình sử dụng, không đặt trọng lượng quá khoảng cân lên cân.

Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 11

Hình 1.3 Cân phân tích (A4) và cân kỹ thuật (B)

6 Tủ cấy vô khuẩn có đèn cực tim (flux laminar): có không gian vô trùng được

sử dụng để thao tác với vi sinh vật nhờ hệ thống đèn tử ngoại và bộ phận thôi khí vô trùng

Hình 1.4 Tủ cấy vô tràng

7 Máy ly tâm (centrifuge): dùng tách các chất ở các pha rắn - lỏng ra khỏi nhau như tách sinh khối tẾ bào ra khỏi môi trường nuôi cấy, tách hồng cầu, enzyme Khi sử dung, các ống ly tâm cần đặt đối xứng và nhất thiết là phải có khối lượng bằng nhau

Hình 1.5 Máy ly tâm

8, Máy lắc (shaker): Thiết bị dùng để nuôi cấy, nhân giống vi sinh vật bằng cách

lắc các bình nuôi cấy theo các chiều khác nhau (lắc vòng và lắc ngang) một cách đều đặn

để tăng lượng oxy hòa tan trong môi trường

Hình 1.6 Máy lắc

9 Kính hién vi (microscope): có vai trò rất quan trọng nghiên cứu vi sinh vật

Dùng nghiên cứu, quan sát tế bào vỉ sinh vật về đặc điềm hình thái, sinh lý nhờ vào khả năng phóng đại của kính (sẽ giới thiệu chỉ tiết ở bài sử dụng kính hiển vì)

Hình 1.7 Kính hiển vi quang hoc

10 Máy đo pH (pH meter): đo pH dung dịch, môi trường nuôi cấy vi sinh vật

Hinh 1.8 May do pH dé ban (4), may do pH cam tay (B)

Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 13

11 Máy cất nước (single/ double water stills): dùng để cất nước

+

12 Bể ỗn nhiệt (water bath): chứa nước và được cài đặt ở nhiệt độ nhất định để

ổn định nhiệt độ cho những thí nghiệm cần sự ôn định về nhiệt độ

Hình 1.10 Bề ổn nhiệt

13 Nồi lên men (fermenter/bioreactor): thiết bị lên men nuôi cấy vi sinh vật

trong điều kiện tối ưu hóa và điều chỉnh được các thông số môi trường nuôi cây

14 Thực tập Vĩ sinh vật học

14 Các thiết bị khác như: máy đếm vi sinh vật, máy quang phỏ, sấy đông khô

15 Dụng cụ thí nghiệm

Dựng cụ thủy tỉnh có nhiều loại với nhiều kích cỡ khác nhau như bình tam giác,

ống nghiệm, đĩa petri, lam kính, đũa thủy tỉnh, que trang, ống đong, cốc đong, bình định

mức Yêu cầu phải sạch, trong, trung tính Trước khi dùng đựng môi trường phải được

sấy khô, làm nút bông và khử trùng trong tủ sấy khô

- Phiến kinh (lame): ding làm tiêu bản quan sát hình thái, sinh lý tế bao vi sinh vat

- Lá kính (lamelle): dùng để đậy lên vết bôi trên tiêu bản cố định vi sinh vật trong quá trình nghiên cứu

- Hộp lồng (đĩa petri): dùng để nghiên cứu các đặc điểm hình thái, đặc điểm nuôi

cấy và phân lập của tế bào vi sinh vật

~ Que gạt (que trải): là dụng cụ để phân lập vi sinh vật theo phương pháp trải đĩa

- Que cấy: gồm có ba loại Que cấy đầu tròn: dùng để thao tác vi sinh trên đối

tượng đơn bào như vi khuẩn, nắm men Que cấy nhọn: dùng cấy sâu trên môi trường rắn

Que cấy móc: dùng để lấy khuẩn ty hay một đoạn tơ ni

- Pipette Pasteur: dùng để lấy dung dich môi trường nuôi cấy

Các dựng cụ mới cần được ngâm nước hoặc dung dịch H;SO; loãng trong 24 giờ

Sau đó mới rửa lại bằng nước hoặc xà phòng nhiều lần cho đến khi pH trung tính

Các dụng cụ đã qua sử dụng còn chứa môi trường và vi sinh vật, cần khử trùng rồi

mới rửa sạch bằng xà phòng, phơi và sấy khô

+ Hòa tan 60 g KzCrO; vào 700 ml nước cất, đặt bình vào chậu nước để tránh bị

bỏng khi bổ sung axit

+ Bồ sung từ từ 66 ml dung dịch axit H›SO¿ vào dung dịch KạCrO; trên đến khi tan

hết,

Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 15

+ Bồ sung nước cất vừa đủ 1000 ml, Bảo quản trong bình tối màu, tránh ánh sáng

để dùng dan,

- Dụng cụ sạch khi đưa lên ánh sáng không có vết mờ và vết bợn

- Các dụng cụ khác như: đèn cồn, giá ống nghiệm que cấy, kẹp, kéo, bơm tiêm

nhựa, đầu tuýp, bếp điệ

II CÁC PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG VI SINH VẬT

1 Nguyên tắc

Diệt trùng hay khử trùng là phương pháp nhằm ức chế hoặc loại bỏ, cuối cùng là

giết chết các vi sinh vật không mong muốn

Người ta thường khử trùng bằng hai phương pháp chính

2 Phương pháp

4) Phương pháp lý học

Nhiệt khô

- Đối với dụng cụ cấy kim loại, đôi khi cả thủy tỉnh, phương pháp thường dùng là

đốt: đốt trực tiếp trên ngọn lửa hoặc nhúng cồn đốt

- Đối với dụng cụ thủy tỉnh có thể gói giấy và sấy ở 160°C trong 1-2 giờ hoặc 180°C trong 30 phuit Dụng cụ đưa vào sấy phải chịu được nhiệt độ cao và không buộc dây nhựa hoặc thun

~ Phương pháp Pasteur: chỉ diệt vi khuẩn gây bệnh (ký sinh), không điệt bào tử

vi khuẩn hoại sinh Phương pháp này không điệt hoàn toàn mảm bệnh mà chỉ chọn một vải

vi sinh vật đối kháng mạnh nhất Vì vậy, phải biết nhiệt độ và thời gian diệt trùng cho từng, loại vi sinh vật Phương pháp này thường dùng nhiệt độ 70-75°C trong thời gian 10-15 phút

Diệt trùng bức xạ

- Tia tử ngoại hay UV: chỉ sát trùng bề mặt, không xuyên sâu vào mẫu vật

16 Thực tập Vĩ sinh vat hoc

- Đối với khử trùng không khí thì thiết bị khử trùng là một máy lọc khí có trang bị màng lọc hay hấp phụ vi khuẩn

b) Phương pháp hóa học

- Chat sát khuẩn ngoài da: xà phòng, cồn, iode, phẩm màu (phân lớn phẩm màu có

tác dụng sat khuan nhu: xanh methylene)

- Chat điệt khuẩn và tẩy uế: phenol, formol, hợp chất cloi

Ill THUC HANH CHUAN Bi DUNG CU THi NGHIEM

- Nút bông có độ chặt vừa phải đảm bảo độ kín và thuận tiện trong quá trình thao tác mở hoặc đậy Kích thước phần bên trong ống nghiệm của nút khoảng 1,5-2 cm, phần bên ngoài khoảng 0,5 cm Đầu của nút bông nhẫn, không gap nếp hoặc xù tơ bông

- Bao giấy phải trùm kín được phần nút bông của ống nghiệm với độ chặt vừa phải Mép giấy bên trong và ngoài phải được gap chéo đề thuận tiện cho quá trình tháo ra hoặc đậy hai

2 Chuan bi dia petri

Đĩa petri chủ yếu dùng để nuôi cấy, phân lập các chủng vi sinh vật hoặc làm các

test chẩn đoán, kháng sinh đồ khoanh giấy, các thử nghiệm tính cạnh tranh giữa các chủng

vi sinh trên môi trường thạch đỉnh dưỡng, mà qua đó ta có thể quan sát được hình thái tính chất khuẩn lạc của quần thể vi sinh vật

Trước khi sử dụng đĩa petri được rửa sạch, sấy khô sau đó bao gói và sấy hoặc háp tiệt trùng.

Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 17

3 Chuẩn bị pipette

Dùng để đong, hút dung dịch cần có độ chính xác cao Có rất nhiều loại pipette thủy tỉnh khác nhau nhu pipette Pasteur, pipette có chia vạch thông thường được thiết kế cho phù hợp với mục đích nghiên cứu Hiện nay, trong các phòng thí nghiệm nghiên cứu

về vi sinh vật gây bệnh đều nghiêm cấm hut pipet bing mồm, thay vì thế người ta dùng qua boa bing cao su, quả bóp hút an toàn ba van, hoặc dùng pipette hút tự động (pipette aid) hoặc micropipette

Các pipette thủy tỉnh trước khi sử dụng, cần rửa sạch, nhét bông không thắm nước vào đuôi của Pipette để tránh tạp nhiễm khi sử dụng Pipette được bao gói bằng giấy hoặc đặt chung trong ống chứa pipette sau đó đem sấy hoặc hấp tiệt trùng

4 Chuẩn bị bình tam giác

Thường sử dụng đẻ chuẩn độ, chứa dựng môi trường, dung địch, nuôi cấy vỉ sinh vật, thực hiện các phản ứng Bình tam giác, thường có thể tích từ S0 ml đến 10 lít tủy theo

dung dịch chứa để chọn loại bình thích hợp Trước khi sử dụng, bình tam giác cần được rửa sạch, sấy khô va bao gói Nút đậy của bình có thể làm bằng bông không thấm nước Yêu cầu của nút đậy phải có độ chặt vừa phải, dầu của nút đậy phải tới phần cổ của bình đảm bảo độ kín và tránh tạp nhiễm tối đa

1V NHỮNG DIEM CAN LUU Y

- Không làm vụn bông không thấm khi làm nút đậy cho các dụng cụ như ống

nghiệm, bình tam giác

~ Khi nút bông gòn vào đuôi pipette, độ chặt phải vừa đủ, phải kiểm tra khả năng hút dung dich cua pipette sau khi nút xong

~ Kích thước nút đậy của ống nghiệm, bình tam giác phải phù hợp, tiện dụng

v BAO CAO THUC TAP

- Trình bày yêu cầu của việc bao gói dụng cụ nuôi cấy vi sinh vật

~ Công dụng và cách sử dụng các dụng cụ, thiết bị phòng thí nghiệm vi sinh vật

ệt trùng dụng cụ và môi trường nuôi cấy vi sinh vật

- Trinh bày phương pháp

18 Thực tập Vi sinh vat hoc

Bai2

PHUONG PHAP PHA CHE MOI TR

NUOI CAY VI SINH VAT

I NGUYEN TAC

Các chất dinh dưỡng là những hợp chất tham gia vào quá trình trao đổi chất nội

bào Môi trường đinh dưỡng là hỗn hợp gồm các chất dinh dưỡng và các chất có nhiệm vụ duy trì thế oxy hóa - khử, áp suất thảm thấu của tế bao va sy én định độ pH của môi trường

'Yêu cầu của môi trường đinh dưỡng: có đủ các chất dinh dưỡng cần thiết; có độ pH thích hợp; có độ nhớt nhất định; không chứa các yếu tố độc hại: hoàn toàn vô trùng đảm bảo sự phát triển ôn định của vi sinh vật

Phân loại môi trường đỉnh dưỡng: người ta dựa trên các cơ sở khác nhau để phân loại môi trường

a) Phân loại theo nguôn gốc

- Môi trường tự nhiên: dịch nước chiết thịt, nước chiết khoai tây, máu động vật

~ Môi trường nhân tạo: Czapeck, Hansen, EMB

~ Môi trường bán tự nhiên: Potato glucose agar (PGA), giá đậu đường

b) Phân loại theo trạng thái vật lý

- Môi trường lỏng: dạng lỏng, không có agar hay các chất làm giá thẻ khác trong

©) Phân loại theo công dựng

~ Môi trường phân lập

- Môi trường tăng sinh

~ Môi trường lưu giữ giống

~ Môi trường thử nghiệm sinh hóa

Môi trường nuôi cấy vi sinh vật được pha chế theo nguy:

- Dựa trên cơ sở nhu cầu về các chất dinh dưỡng và khả năng đồng hóa các chất dinh dưỡng của từng loại sinh vật

Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 19

“Tên dụng cụ, thiết bị mỗi l

a) Môi trường nuôi cấy vi khuẩn

Môi trường cao thịt - peptone

20 Thuc tap Vi sinh vat hoc

b) Môi trường nuôi cấy nắm men

Môi trường Hansen

- Glucose, maltose (hoặc đường kính): 50 g

e) Môi trường nuôi cấy nắm mốc

Môi trường Czapek

4d) Môi trường nuôi cấy xạ khuẩn

Môi trường Gauze |

Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 21

pH 7,2 + 7.4 khử trùng 1 atm trong thời gian 30 phút

4) Môi trường nuôi cấy tảo

Môi trường Tamiya

- Nude cat dit 1000 ml

Thanh phan vi lugng AS

II TIỀN HÀNH THÍ NGHIỆM

Làm môi trường để thực hiện việc phân lập, nhân giống, giữ giống vi sinh vật, đồn;

thời để nuôi cấy và nghiên cứu các đặc điểm sinh học của chúng

Các bước chế tạo môi trường dinh dưỡng:

1 Chuẩn bị dụng cụ

Tắt ca các dụng cụ cần sử dụng trong suốt quá trình pha chế môi trường phải đượ:

chuẩn bị đầy đủ Các dụng cụ được rửa sạch, tráng bằng nước cất, sấy khô trước khi sì dụng

2 Cân đong hóa chất pha chế môi trường

Cân, đong thật chính xác từng thành phần môi trường và pha chế theo đúng trình tì hướng dẫn trong tài liệu Dùng đĩa cân nhựa hoặc cốc thủy tỉnh để cân đong các loại hó

22 Thực tập Ví sinh vat hoc

chất đễ hút âm

3 Phối chế tạo môi trường nuôi cấy

- Các thành phần của môi trường được hòa tan riêng rẽ trong nước cắt trước khi phối

trộn

~ Phối trộn các thành phần theo trình tự nhất định tránh sự tương tác trực tiếp của các thành phần có thẻ phản ứng tạo kết tủa với nhau Phối trộn dựa trên nguyên tắc thẻ tích tăng dần

- Sau khi phối chế các thành phần, cần tiến hành lọc môi trường qua giấy lọc, bông thấm nước (đối với môi trường lỏng) hoặc vải màn (đối với môi trường đặc) đề làm trong

môi trường, đảm bảo việc quan sát vi sinh vật được dễ dàng

- Đối với môi trường rắn, sau khi phối trộn các thành phần, phải tiền hành nấu sôi

môi trường đề làm tan hoàn toàn agar trước khi phân phối vào dụng cụ chứa

4 Điều chỉnh độ pH của môi trường

~ Muốn điều chỉnh độ pH của môi trường có thể dùng HCI 10% hay NaCl 10%

Ngoài ra có thể dùng một số hóa chất khác như: HạPO¿, H;SO¿, KOH, NaHCO3, Na›CO:

~ Muốn kiểm tra độ pH của môi trường nên dùng máy đo pH (pH-metre) Phương pháp này nhanh nhạy và cho độ chính xác cao Trong phòng thí nghiệm có thể dùng chỉ thị

màu xanh bromotomol hay giấy quỷ để đo pH Phương pháp này tiện lợi, nhanh nhưng

không cho độ chính xác cao

5 Phân phối môi trường vào dụng cụ chứa

~ Môi trường sau khi pha chế xong thường được phân phối môi trường vào ống nghiệm, bình tam giác Trình tự phân phối gồm các bước sau

+ Môi trường cần được đun cho hóa chat lỏng rồi dé qua phéu thủy tỉnh vào các dụng

cu

+ Tay trái giữ dụng cụ chứa môi trường, tay phải kẹp nút bông và kéo ra

+ Nhanh tay rót môi trường vào dụng cụ và đậy nút bông lại

ôi với ống nghiệm: Nếu dùng môi trường làm thạch nghiêng thì lượng môi trường cần được phân phối chiếm 1⁄4 thể tích của ống nghiệm Nếu làm thạch đứng thì lượng môi trường cần được phân phối từ 1/2 - 1⁄3 thẻ tích ống nghiệm

~ Viết nhãn môi trường trên dụng cụ chứa, bao gồm các thông tin:

+ Tên môi trường

Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 23

trường được phân phối vào dụng cụ chứa (xem Bài 1)

„.- Đối với môi trường có các thành phần dễ bị biến tính ở nhiệt độ cao (vitamin, chất

kháng sinh, chất kích thích sinh trưởng ), cần hấp tiệt trùng môi trường trước, sau đó bỗ

sung các thành phần này sau khi hấp xong

~ Một số loại môi trường không được hắp tiệt trùng theo quy định của nhà sản xuất

(vi du: méi trudng Selenit cystine broth, Xylose lysin deoxycholate agar, Chromocult coliform agar ), cần chuẩn bị nước cắt vô trùng trước, sau đó pha chế và sử dụng ngay

Hình 2.1 Mội số dạng môi trường trong ông nghiệm và hộp petri

7 Làm thạch nghiêng, thạch đứng, đỗ thạch vào đĩa petri

~ Làm thạch nghiêng: cần tiến hành ngay sau khi khử trùng môi trường vừa kết thúc

và môi trường chưa đông đặc Ông nghiệm được đặt nghiêng có định trên giá đỡ Phần

24 Thực tập Vĩ sinh vat hoc

đình nghiêng phải cách nút đậy 3-5 em Phần đáy phải có một phần thạch đứng 0,5-1 cm

~ Làm thạch đứng: đặt các ống nghiệm đã có môi trường làm thạch đứng vào giá,

để yên cho đến khi môi trường nguội và đông đặc

- Đỗ thạch vào đĩa petri: môi trường vô trùng chứa trong ống nghiệm hoặc bình tam giác được rót vào phần đáy của đĩa petri Toàn bộ quy trình đỗ thạch vào đĩa petri đều thực hiện trong tủ cấy vô trùng hoặc trong phạm vi vô trùng của ngọn lửa đèn cồn

8,Kiểm tra độ vô trùng và bảo quản

- Môi trường sau khi pha chế xong, được đặt ở điều kiện nhiệt độ phòng 24 giờ Sau thời gian này kiểm tra độ vô trùng của môi trường bằng cách quan sát trạng thái môi trường

1V NHỮNG DIEM CAN LUU Y

- Khi pha chế môi trường rắn hoặc bán rắn, thành phần agar trong môi trường có thể

bổ sung sau khi điều chỉnh pH của môi trường

- Đối với môi trường rắn hoặc bán rắn, cần phải nấu sôi để làm tan agar hoàn toàn

trước khi phân phối vào dụng cụ chứa

- Khi điều chỉnh pH, cần dùng từng lượng nhỏ các dung dịch điều chỉnh (dung địch NaOH, HCI) để tránh vượt quá pH cần pH môi trường cần được kiểm tra trước và sau khi

hấp tiệt trùng

Š môi

~ Các thao tác phân phối môi trường vào dụng cụ phải nhanh, gọn, khéo léo

trường không dính lên miệng dụng cụ hoặc nút bông và việc phân phối cần thực hiện xong trước khi môi trường bị đông đặc

v BAO CÁO THỰC TẬP

~ Trình bày khái niệm môi trường và phân loại môi trường nuôi

vi sinh vật

- Trình bày quy trình pha chế môi trường nuôi cấy vi sinh vật

~ Yêu cầu của môi trường trong đĩa petri, ống nghiệm thạch nghiêng và thạch đứng

- Giải thích tạo sao không phân phối môi trường vào đĩa petri trước khi khử trùng?

- Dia petri chứa môi trường trước khi cấy vi sinh vật nên đặt úp hay ngừa? Tại sao?

Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 25

hoạt động và phát triển của vi sinh vật Hai khâu này luôn gắn bó với nhau trong quá trình

nghiên cứu và ứng dụng vỉ sinh vật

1 Mục đích của việc nuôi cấy

- Phát hiện sự có mặt của vi sinh vật trong các nguyên liệu và vật phẩm cần nghiên cứu

~ Tiến hành việc nhân giống các vi sinh vật một cách nhanh chóng

- Bảo tồn các giống vi sinh vật thuần khiết

~ Nghiên cứu các đặc tính sinh học và sự phát triển của từng loại vỉ sinh vật

2 Nguyên tắc nuôi cấy vi sinh vật

- Mọi thao tác nuôi cấy đều phải thực hiện trong điều kiện vô trùng để tránh tạp

nhiễm các vi sinh vật không mong muốn từ môi trường ngoài

~ Môi trường và dụng cụ nuôi cấy đều phải được khử trùng triệt dé

~ Duy trì tốt các điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, độ ảm ánh sáng, oxy ) đễ vi sinh vật

phát triển thuận lợi

II DỤNG CỤ, MÔI TRƯỜNG VÀ HÓA CHÁT

STT nhóm, rink viên) Đơnvitính | Số lượng

Dụng cụ dùng chung

9— [Tủ cấy vô trùng Cái 1

26 Thực tập Vi sinh vật học

2 Môi trường, hóa chất

~ Môi trường nuôi cấy vi sinh vật: đã được chuẩn bị ở Bài 2, bao gồm các loại

+ Môi trường cao thịt — peptone: nuôi cấy vi khuẩn

+ Môi trường Hansen: nuôi cấy nắm men

+ Môi trường Czapeck: nuôi cấy nắm mốc

- Cồn 96°

3 Chủng giống vi sinh vật

~- Nắm mốc: Aspergillus niger, Aspergillus oryzea

- Nam men: Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces vini

- Vikhuan: Escherichia coli, Bacillus subtilis

4 Nguyên liệu khác

- Giấy lọc

- Bông không thắm

- Bông thấm nước

II TIEN HÀNH THÍ NGHIỆM

1, Cấy truyền vi sinh vật trên môi trường lỏng

Cấy truyền là phương pháp lấy vi sinh vật từ ống nghiệm này sang một ống nghiệm khác Trước khi cấy, tiến hành dán nhãn phi: tên loại vi sinh vật ngày cấy vào thành ống nghiệm bên dưới nút ống nghiệm

a) Céy truyén bang pipette Pasteur

- Khir tring pipette Pasteur qua ngọn lửa đèn cồn

ống giống gốc, dùng ngón tay út phải mở nút bông của dng gidng, ho

- Cho pipette Pasteur vào ống giống lỏng để lấy địch vi khuẩn (dịch dâng lên trong

pipette tir tir theo lye mao dẫn), nhanh chóng đặt ngón tay trỏ phải lên đầu pipette, rat

pipette ra khỏi ống, đặt ống giống vào giá

- Cầm ống môi trường mới bằng tay trái, mở nút bằng ngón tay út phải, khử khuẩn

miệng ống, cho pipette vào tới khi đầu pipette chạm vào môi trường và dé chảy ra vài giọt dịch chứa vi khuẩn Rút pipette ra, khử trùng miệng ống, đậy nút

~ Đặt pipette vào bình đựng thuốc sát khuẩn

b) Cấy truyên bằng que cấy vòng

- Tay trái cầm hai ống nghiệm: 1 ống giống; 1 ống môi trường.

Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 27

- Tay phải cầm que cấy và khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn cho đến khi nóng đỏ

dây cấy

~ Dùng ngón út và ngón áp út kẹp nút Ống nghiệm vào lòng bản tay xoay nhẹ, kéo nút ống nghiệm ra

~ Hở nóng để khử trùng không khí ở miệng hai ông nghiệm

~ Đợi khi que cấy vừa nguội, khéo léo đưa que cấy tiếp xúc với khuân lạc trong ống giống

~ Rút que cấy ra, không để que cấy chạm vào thành ống nghiệm và đưa vào ông, môi trường Khi đầu que cấy chạm vào môi trường thì lắc khẽ que cấy cho vi khuân tan trong môi trường

~ Khử trùng lại phần không khí nơi miệng hai ông nghiệm rồi đậy nút lại

~ Thao tác khử trùng ống hút bắt đầu thực hiện ở đầu nhỏ của ống hút sau khi đã

tháo giấy bao gói

ào dung dịch sunfocromic dé khir tring

28 Thực tập Vi sinh vật học

2 Phương pháp cấy truyền trên môi trường thạch

a) Cấy truyền trên ống nghiệm thạch nghiêng

Phương pháp này dùng để cấy truyền các vi sinh vật hiếu khí; gồm các thao tác như sau:

~ Dán nhãn ghi: tên loại vi sinh vật, ngày cấy vào thành ống nghiệm

- Sử dụng que cấy đầu tròn thực hiện các thao tác cấy

- Tay trái cầm hai ống nghiệm: 1 ống giống; 1 ống môi trường

- Tay phải cầm que cấy và khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn cho đến khi nóng đỏ dây cấy

~ Dùng ngón út và ngón áp út kẹp nút đậy ống nghiệm vào lòng bản tay xoay nhẹ, kéo nút đậy ra

- Hơ nóng để khử trùng không khí ở miệng hai ống nghiệm

- Đợi khi que cấy vừa nguội, khéo léo đưa que cấy tiếp xúc với khuẩn lạc trong ống giống

- Rút que cấy ra, không để que cấy chạm vào thành ống nghiệm và đưa vào ống môi trường đẻ thực hiện thao tác cấy:

- Hòa giống ở đầu que cấy vào giọt nước ở đáy ống nghiệm

~ Nhẹ nhàng lướt que cấy trên mặt thạch theo các kiểu:

+ Hình chữ chỉ

+ Hình vòng xoắn

+ Hình vạch ngang song song

- Khử trùng lại phần không khí nơi miệng hai ống nghiệm rỉ

- Khử trùng lại que cấy sau khi đã sử dụng xong

* Đối với nắm mốc hoặc các vi sinh vật đa bào sinh bảo từ khác, khi cấy trên ống

nghiệm thạch nghiêng, dùng que cấy móc vô trùng lấy bào tử từ ống giống, Cầy truyền bảo

tử sang ống nghiệm môi trường mới theo hai cách:

- Cay điểm: cắm ngập đầu que cấy thành ba điểm cách đều nhau trên bề mặt thạch

- Cấy gõ: đưa que cây có mang bào tử vào ống nghiệm môi trường, gõ nhẹ lưng que

cấy vào thành ống nghiệm đối diện với mặt thạch đề rải bào tử xuống.

' Công nghệ sinh học & Thực phẩm 29

Hình 3.2 Cáp truyền trên ống nghiệm thạch nghiêng b) Cấy trên Ống nghiệm thạch đứng

~ Phương pháp này dùng để cấy các vi sinh vật ky khí

- Sử dụng que cấy đầu nhọn

~ Sau khi lấy giống vỉ sinh vật, dùng que cấy này đâm sâu vào phần khối thạch hình trụ

= Dam sat day ống nghiệm và đâm thành ba đường: một đường chính giữa, hai

ng sát thành Ông tùy yêu câu

~ Đường cấy phải thẳng, nhẹ nhàng để không gây nứt, vỡ môi trường

Hình 3.3 Phương pháp cây trên thạch đứng

30 Thuc tap Vi sinh vat hoc

c) Cay truyén trén thach dia

- Dung que cay đầu tròn hoặc que trải thủy tỉnh

- Dùng que cấy đầu tròn lấy vi sinh vật băng tay phải theo đúng quy cách đã hướng dẫn ở trên

- Tay trái cầm hộp petri khẽ hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn còn Sau đó đẻ cách đèn côn chừng 1-2 cm, khẽ mở nghiêng một bên hộp (phân hơ lửa) sao cho vừa đủ đề cho que cay vao

- Nhẹ nhàng nhanh chóng lướt que cấy trên mặt thạch theo một trong các kiêu sau:

+ Theo hình zích zắc trên toàn bộ mặt thạch

+ Theo những đường song song

+ Theo hình zích zắc 3 hoặc 4 góc

- Khi dùng que trải, hut sẵn một lượng khoảng 0,1 dịch vi sinh vật nhỏ lên trên bé

mặt thạch đĩa Khử trùng que trải thủy tĩnh băng cách nhúng vào côn và đôt trên ngọn lửa Làm nguội que trải và trải đều giọt dung địch vi sinh vật lên khắp bề mặt môi trường

Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 31

Hình 3.5 Cáp truyền bằng que trải trên thạch đĩa

3 Các điều kiện nuôi cấy của vi sinh vật

~ Nhiệt độ: phụ thuộc vào từng loại vi sinh vật Duy trì sự ồn định của nhiệt độ đó bang tu ui vi sinh vat

6 ẩm: để duy trì độ ẩm, trong quá trình nuôi cần đảm ảo đủ lượng nước khi làm ào phòng nuôi hoặc dé

môi trường Trong kiện cần thiết có thể phun nước vô khuải

nước bốc hơi trong tủ ấm

- Oxy: đối với vi sinh vật hiểu khí, cung cấp thường xuyên và đầy đủ oxy Lớp môi

trường nuôi cấy có độ dày vừa phải Các bình chứa môi trường được lắc thường xuyên

trong quá trình nuôi để cung cấp thêm oxy cho vỉ sinh vật Nếu nuôi cấy trong môi trường

có khối lượng lớn phải tiến hành sục khí thường xuyên hay định kỳ Đối với vi sinh vật ky khí: hạn chế sự tiếp xúc với oxy bằng cách đồ lên bÈ mặt môi trường parafin, dầu vaselin

hoặc trích sâu vào môi trường đặc, nuôi cấy trong bình hút chân không nuôi trong ống

nghiệm đặc biệt, sau khi rút hết không khí và hàn kín lại, đun sôi môi trường trong một thời gian đẻ loại hết oxy Để nguội 45°C Dùng pipette cấy vi sinh vật vào đáy ống nghiệm

Làm nguội nhanh rồi đổ vaselin lên bề mặt để hạn chế sự tiếp xúc với oxy

4, Quan sát vi sinh vật sau khi nuôi cay

Sau khi nuôi ở thời gian và nhiệt độ thích hợp cho mỗi loại vi sinh vật ta thầy:

~ Trong môi trường lỏng: vi khuẩn phát triển sẽ làm đục môi trường

32 Thực tập Vĩ sinh vật học

- Trong môi trường đặc ở thạch nghiêng: nắm men, vi khuẩn phát triển sẽ tạo nên

vệt nỗi trên mặt thạch trong hay trắng đục Nắm mốc sẽ tạo nên những sợi mảnh từ vết cấy

- Trong môi trường thạch đứng: các vỉ khuẩn ky khí phát triển ở đáy của cột môi

trường

IV NHUNG DIEM CAN LƯU Ý

có bề mặt khô, phẳng Nếu ống môi trường còn đọng nước

ng nghiệm, tránh nước làm hon vết cấy

~ Môi trường thạch ph:

cần dựng ống mới cấy vào

- Khi tiến hành cấy truyền tránh chạm đầu que cấy dùng để lấy vi khuẩn vào bắt

- Khi cấy truyền vi khuẩn, dùng tay trái cầm hai ống nghiệm:

xa và Ống môi trường ở gần người thao tác Trước và sau khi cấy truyền xong phải hơ que cấy trên ngọn lửa đèn cồn để vô trùng que cấy

V BÁO CÁO THỰC TẬP

- Trinh bay phương pháp cấy truyền vi khuẩn, nắm men, nắm mốc

- Nêu các điều kiện nuôi ủ nắm men và vi khuẩn sau khi gieo cấy

- Dia petri sau khi cấy vi sinh vật nên đặt úp hay ngửa mặt thạch? Giải thích?

- Khi cấy truyền vi sinh vật trên ống thạch nghiêng, giải thích tại sao phải ria que

cấy ngược từ đáy ống nghiệm lên phía trên?

Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 33

Bị PHƯƠNG PHÁP QUAN SÁT VI SINH VẬT BẰNG KÍNH

5) Kinh hién vi doi pha

Ánh sáng thường bị đổi pha và biên độ dao động bởi cấu trúc đặc biệt của tụ quang kính vật kính và thị kính Chức năng: dùng quan sát rõ nét các cấu trúc nhỏ như tiên mao, các lớp màng

©) Kính hiển vi huỳnh quang

Chùm tia tử ngoại chiếu vào tiêu bản đã nhuộm màu bằng các chất huỳnh quang Trong tế bào, các cấu trúc khác nhau sẽ phát quang với màu sắc khác nhau Chức năng:

quan sát và phân biệt được các cấu trúc khác nhau trong té bao vi sinh vật

Vật kính (quay về phía vật quan sát) và thị kính (quay về phía mắt nhìn) Mỗi bộ

phân này là một hệ thống thấu kính hội tụ phức tạp, mẫu vật cần quan sát AB được đặt trước

vật kính một khoảng cách lớn hơn tiêu cự của vật kính một chút Ảnh thật đảo ngược AˆB` của vat sẽ thu được ở bên kia vật kính, nằm trong khoảng tiêu cự của thị kính Thị kính hoạt động như một kính lúp Qua thị kính, người ta sẽ thấy ảnh ảo A'"B`" được phóng to lên của ảnh thật A"B'.

34 Thực tập Vi sinh vật học

'Vật kính b Mat

Hình 4.1 Nguyên tắc quang học của kính hiển vi

ào vi sinh vật, ký sinh

Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 35

~ Hệ thống cơ học: giá kính gồm chân kính, thân kính, trụ đỡ và xoay thị kính, 6

gắn và xoay vật kính, bản kính, thanh trượt đi chuyển tiêu bản, ốc đi chuyên thanh trượt, kẹp giữ tiêu bản, ốc di chuyển tụ quang kính, ốc điều chỉnh sơ thô cấp, ốc điều chỉnh thứ cấp (vi cắp)

b) Nguyên tắc hoạt động của kính hiễn vỉ quang học

- Vật kính là hệ thống quang học phức tạp gồm một số thấu kính, trực tiếp phóng

đại mẫu vật Các thấu kính sắp xếp theo thứ tự, thấu kính nhỏ ngoài cùng hướng vào tiêu bản có độ phóng đại lớn nhất Độ phóng đại của kính phụ thuộc tiêu cự, tức bán kính cong

của thấu kính Thấu kính càng cong, tiêu cự càng ngắn thì khả năng phóng đại càng lớn

Có hai loại vật kính:

+ Vật kính khô độ phóng đại nhỏ như x4, x10, x15, x40

+ Vật kính dầu có độ phóng đại lớn như x90, x100

~ Thị kính cũng có cấu tạo phức tạp, gồm hai thấu kính, một hướng về mắt người

xem, một hướng về vật kính Thị kính phóng đại một lần nữa ảnh đo vật kính thu vào, làm ảnh to lên, xem rõ hơn

Độ phóng đại của kính = độ phóng đại của vật kính x độ phóng đại của thị kính

Ví dụ: Độ phóng đại của vật kính: x 100, độ phóng đại của thị kính: x10 Như v:

độ phóng đại của kính: 100 x 10 = 1000 lần

Năng suất phân ly của kính quan trọng hơn độ phóng đại, và là tiêu chuẩn chính đẻ

chọn kính hiển vi Năng suất phân ly (độ phân giải) của kính hiển vi là đại lượng cho biết khả năng phân biệt hai điểm của vật quan sát nằm sát nhau Nếu khoảng cách giữa hai

điểm nằm càng sát nhau mà vẫn có thể phân biệt được thì năng suất phân ly của kính càng cao

Khoảng cách này phụ thuộc chiều dài sóng ánh sáng sử dụng và số lượng tỉa sáng

đi vào vật kính, được biểu hiện bằng công thức:

%

2nsinơ

trong đó:

2: độ dài bước sóng phát ra từ mẫu vật;

n: chỉ số chiết quang của môi trường giữa mẫu vật và vật kính;

không đi vào được vật kính Vật kính có độ phóng đại lớn thì đường kính của thấu kính

càng nhỏ lượng tia sáng đi vào được vật kính rất ít, nên không thấy rõ ảnh Đẻ hạn chế

nhược điểm này ta dùng đầu soi có chiết suất ánh sáng gần bằng thủy tỉnh Thủy tỉnh và

đầu soi được xem như một môi trường đồng nhất Ánh sáng đi qua không bị khúc xạ nên tập trung đầy đủ vào vật kính, giúp xem rõ ảnh

Low High Oil

power power immersion

10 x 40 100 x Đô phóng đai

0.25 0.65 1.25 Đô mở 6.8 mm 5 ta

73mm 42 mm _ Khoang cach lam viéc

Hình 4.3 7ương quan giữa độ phóng đại của vật kính với khoảng cách làm việc từ vật

kính đên tiêu ban vi sinh vat

Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 37

Không có dâu soi kính

~~ én tw quang

Iris diaphragm

"Nguồn sáng Hình 4.4 Nguyên lý của vật kính dầu

II DỤNG CỤ, MÔI TRƯỜNG VÀ HÓA CHÁT

STT Ten dung ae Đơn vị tính | Số lượng

1 | Giá ống nghiệm Cái I

2 | Ông nghiệm 18 Cai 1

Dung cu ding chung T1_[ Noi hip cao ap Cai 1

12 | Tủcấy vô trùng Cái 1

: Aspergillus niger, Aspergillus oryzea

- Nấm men: Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces vini

tắm phiến kính \ nh vật được nuôi trên môi trường thạch khi làm tiêu bản, nhỏ sẵn

ọt nước muối sinh lý lên phiến kính, sau đó hòa sinh khối vi sinh vật vào giọt nước

- Đặt lá kính lên giọt canh trường thật nhẹ nhàng tránh không tạo thành bọt khí giữa hai

tắm kính, Muốn vậy để một mép lá kính tiếp xúc với phiến kính rồi từ từ hạ lá kính xuống

~ Đưa tiêu bản lên quan sát trên kính hiển vi ở vật kính x10 rồi x40

Chủ ý

~ Nếu giọt địch nhiều quá, tràn ra phần ngoài tiếp xúc của phiến kính và lá kính ta

dùng giấy thấm bớt nước đi

- Nếu cần quan sát tiêu bản lâu thì dùng vazơlin bôi quanh mép lá kính để giọt dich khỏi bị khô

b) Làm tiêu bản giọt treo

Loại tiêu bản này dùng để theo dõi sự sinh sản, sự hình thành bào tử, kha nang di động và phản ứng của té bao vi sinh vật với các loại kích thích

có phần lõm hình tròn ở giữa

~ Dùng phiến kính đặc bi

- Bôi vazolin quanh phần lõm của phiền kính

~ Cho 1 giọt canh trường lên giữa lá kính

- Thận trọng xoay ngược lá kính cho giọt canh trường xuống phía dưới rồi đặt lên

phần lõm của phiến kính,

- Chú ý không để giọt canh trường lan rộng hay chạm vào phần đáy của phần lõm

trên phiến kính

- Đặt tiêu bản lên quan sát trên kính hiện vi ở vật kính x10 rồi x40

Uu điểm của loại tiêu bản này so với tiêu bản giọt ép là giúp ta quan sắt tế bảo vỉ sinh vật sống đễ đàng hơn và lâu hơn

Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 39

Hình 4.5 Tiêu bản giọ! ép và tiêu bản giọt treo

2 Sử dụng kính hiễn vi quan sát tiêu bản vi sinh vật sống,

Bước 2: Đặt tiêu bản vào mâm kính

- Trước khi đặt tiêu bản vào mâm kính, phải chọn mặt phải, mặt trái của tiêu bản Mặt phải của tiêu bản thường có dán lamen, án nhãn (nếu có lamen và nhãn) hoặc làm giảm bớt độ lóa của gương khi dễ nghiêng soi ra ánh sáng (nếu không có lamen, không có nhân)

~ Để mặt phải của tiêu bản lên trên, tay phải mở kẹp tiêu bản, tay trái cằm phía đầu nhãn tiêu bản, đặt tiêu bản vào mâm kính và tay phải thả kẹp giữ tiêu bản ra Tiêu bản được giữ chặt vào xe đầy, trên mâm kính

- Dùng ốc xe đẩy để điều chỉnh sao cho mẫu vật nằm đúng vào trục kính (giữa lỗ mâm

kính)

Chú ý: Có thể dùng điểm sáng của hộp tụ quang để làm điểm chuẩn khi điều chinh

mẫu vật về điểm trục kính, nếu mẫu vật quá nhỏ

Bước 3: Quan sát

Nguyên tắc bất buộc khi quan sát là phải quan sát được ở vật kính có độ phóng đại

nhỏ, rồi mới chuyển sang quan sát ở vật kính có độ phóng đại lớn hơn kể nó

4) Xem tiêu bản ở vat kinh x10

- Hạ tụ quang kính xuống dưới (tức tăng khoảng cách tụ quang với tiêu bản, thị trường mờ đi)