Sinh học phân tử - Chương V.doc

Sinh học phân tử

Chương V Cỏc cơ chế gõy biến đổi DNA

I Đột biến

1 Đặc điểm của đột biến

- Đột biến là những thay đổi đột ngột cú khả năng di truyền trong vật chất ditruyền (DNA), đột biến bao gồm cả 2 nội dung là những thay đổi trong vật chất ditruyền và quỏ trỡnh làm thay đổi nú

- Một cơ thể sinh vật cú biểu hiện kiểu hỡnh khỏc thường do kết quả của đột biếngọi là thể đột biến (mutant)

- Thay đổi kiểu gen bao gồm thay đổi số lượng nhiễm sắc thể, cấu trỳc nhiễm sắcthể, nhúm gen liờn kết và nhỏ nhất là thay đổi trong 1 gen Chỳng ta sẽ đề cập đếnđột biến gen, nhiều đột biến do thay đổi 1 cặp bazơ, thay cặp này bằng cặp khỏc, lặplại, tăng hoặc mất chỉ 1 vaỡ nu(đột biến điểm)

- Đột biến là nguyờn nhõn chớnh tạo ra tất cả cỏc biến dị di truyền, làm cơ sở chotiến húa

- Nếu khụng cú đột biến thỡ tất cả cỏc gen chỉ tồn tại ở một dạng, sẽ khụng cú tồntại nhiều alen, bởi vậy việc phõn tớch di truyền sẽ khụng thể tiến hành được và mộtđiều vụ cựng quan trọng là sinh vật sẽ khụng thể tiến húa, khụng thể thớch ứng đượcvới sự thay đổi của mụi trường

- Đột biến tự nhiờn (spontaneous mutation) là đột biến xảy ra khụng rừ nguyờnnhõn, do sai sút trong tỏi bản DNA Đột biến nhõn tạo (induced mutation) xảy ra do

cơ thể sinh vật được tiếp xỳc với cỏc tỏc nhõn gõy đột biến do con người xử lý như:tia phúng xạ ion, tia tử ngoại, những húa chất phản ứng tơng tác với DNA và RNA

- Tần số sai sút nhận thấy từ cỏc nucleotit khi tỏi bản dự đoỏn khoảng 10-5, 1 chu

kỳ đọc sửa sai (proofreading) nhờ hoạt tớnh exonuclease 3’-5’ của DNA polymerase

sẽ giảm tần số sai sút xuống cũn 10-10 (10-5x10-5) Thờm một số cơ chế khỏc cú thểlàm giảm tỷ lệ sai sút xuống hơn nữa

- Tần số đột biến ở vi khuẩn trong tự nhiờn từ 10-8 -10-10 nu/1 thế hệ, cũn ở sinhvật nhõn thật là từ 10-7 – 10-9 nu/1 thế hệ

- Đột biến xảy ra ngẫu nhiờn khụng định hướng theo mụi trường (tỏc nhõn gõyđột biến), mặc dầu chỳng ta quan sỏt nhiều quẩn thể sinh vật ngày một trở lờn chốnglại thuốc trừ sõu như loại ruồi nhà chống lại DDT, vi sinh vật chống lại khỏng sinhnếu dựng liờn tục Điều đú khụng phải do mụi trường định hướng đột biến mà trongquần thể ngẫu nhiờn cú đột biến chống chịu, đột biến này sẽ tồn tại, sinh sụi nảy nở

và tạo thành quần thể thế hệ sau Việc chọn lọc chủng vi khuẩn khỏng khỏng sinhstreptomicine từ quần thể vi khuẩn được xử lý streptomicine là một vớ dụ minhchứng cho điều đú Cỏch làm như sau: pha loóng từng tế bào nuụi trongStreptomicine, số ớt tế bào cú đột biến khỏng sẽ sống cũn phần lớn sẽ chết

- Biểu hiện của đột biến thể hiện từ rất nhỏ đến biến đổi cả hỡnh thỏi hoặc làmsinh vật chết

- Gen là một đoạn DNA mó húa một chuỗi polypeptide, bất kỳ đột biến nào xảy

ra trong nội bộ gen sẽ tạo thành dạng mới hoặc alen mới của gen rồi cú thể tạo ra

protein mới Những gen chứa những đột biến nhỏ muốn phát hiện phải dùng kỹ thuậtđặc biệt gọi là (isoallele).

- Đột biến có thể trội hoặc lặn, ở cơ thể đơn bội như virus, vi khuẩn thì cả 2 dạngtrội và lặn đều được biểu hiện ra kiểu hình, còn ở cơ thể nhị bội đột biến trội hoặc lặnchỉ được phát hiện ra qua phân tích quần thể đời sau hoặc chuyển được chúng vềtrạng thái đồng hợp tử, hầu hết đột biến lặn ở nhị bội không thể biểu hiện trừ một sốđột biến nằm trên nhiễm sắc thể giới tính

- Dạng đột biến dễ phân tích nhất là đột biến gây chết có điều kiện, chúng chết trongmôi trường này nhưng tồn tại trong môi trường khác Có 3 dạng đột biến này là:+ Đột biến dinh dưỡng thụ động là đột biến xảy ra ở vi sinh vật làm cho nó chỉ sốngđược trong môi trường tối thiểu

+ Đột biến mẫn cảm nhiệt độ là đột biến chỉ biểu hiện trong một phạm vi nhiệt độ nhấtđịnh, có sản phẩm gen nhưng không bền ở ngoài ngưỡng nhiệt độ trên Cũng có thểđột biến ở điều kiện nhiệt độ này thì bình thường nhưng ở điều kiện khác thì biểuhiện đột biến

+ Đột biến mẫn cảm ức chế là đột biến bù lại cho những đột biến khác dẫn đến trởthành bình thường hoặc gần bình thường khi cùng có thêm 1 đột biến nữa

- Hầu hết các đột biến biểu hiện hiệu quả kiểu hình là do kết quả của hoạt tính sản phẩmgen bị giảm đi hoặc do không có hoạt tính sản phẩm của gen Điều này do hiệu quảchọn lọc lâu đời tính thích ứng tối ưu của dạng dại (allele dại)

- Đột biến có thể xảy ra ở bất kỳ tế bào hoặc trạng thái nào trong chu kỳ tế bào, nếu xảy

ra ở tế bào soma, tế bào này không sinh giao tử thì chỉ có ở mô đó, và có thể đượctruyền qua sinh sản vô tính như ví dụ đối với giống táo Delicious và giống cam navel.Nếu đột biến trội xảy ra trong tế bào phôi thì hiệu quả của đột biến có thể được biểuhiện ngay ở con cháu, tuy nhiên nếu là đột biến lặn thì vẫn không biểu hiện ra

- Đột biến hemoglobin Hemoglobin là một đại phân tử có mặt trong hồng cầu có nhiệm

vụ vận chuyển oxy từ phổi đến tất cả các mô khác nhau của cơ thể Có 2 kiểuhemoglobin ở người là dạng F khi trong trạng thái trẻ sơ sinh (new born) và dạng Akhi người đã trưởng thành Hemoglobin A gồm 2 chuỗi  giống nhau và 2 chuỗi ,còn dạng F gồm 2 chuỗi  và 2 chuỗi  Mỗi chuỗi được mã hóa bởi 1 gen đặc trưng.Chuỗi  chứa 141 axit amin, chuỗi  và  chứa 146 axit amin, các chuỗi này khágiống nhau về trình tự chuỗi axit amin, cho nên người ta cho rằng chúng đều xuất phát

từ 1 gen chung Có nhiều biến dạng hemoglobin được phát hiện chủ yếu là từHemoglobin A Một trong chúng là đột biến tế bào hồng cầu lưỡi liềm là Hemoglobin

S (alen S, Hbs

/HBs

) là một dạng biến đổi của chuỗi  Phân tử này kết tủa khi bị thiếuoxy, hình thành lên thể ác tính làm biến đổi hình thái tế bào hồng cầu tạo thành hìnhlưỡi liềm (h×nh 1.5)

H×nh 1.5 §ét biÕn hång cÇu thµnh h×nh lìi liÒm

2 Cơ sở phân tử của đột biến

- Watson và Crick đã mô tả chuỗi xoắn kép DNA, đề xuất cơ chế sao chép DNAbán bảo toàn trên cơ sở ghép cặp đặc thù bazơ để giải thích quá trình truyền đạttrung thành thông tin di truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác Hai ông còn đềxuất một cơ chế giải thích đột biến tự nhiên và cấu trúc bazơ nitơ không bấtbiến Nguyên tử hydro có thể rời từ ví trí NH2 hoặc chuyển đến ví trí 0 của 1purine hoặc pyrimidine để tạo thành bazơ hiếm, thí dụ nguyên tử H từ nhómamin trở thành NH hoặc H đến kết hợp với O thành OH trong vòng nitơ, quátrình này gọi là (tautomeric –shift, sự trôi dạt nguyên tử H (h×nh 2.5)

- Thí dụ Thymine và Guanine dạng bình thường là dạng keto khi chuyển thànhtrạng thái hiếm enol, chúng có thể lần lượt được kết hợp với dạng keto củaGuanine và Thymine bằng 3 liên kết hydro

Có 3 dạng đột biến điểm:

- Tương tự adenine và cytosine bình thường ở dạng amino khi trở thành dạnghiếm imino chúng có thể lần lượt kết hợp với dạng amino của cytosine vàadenine bằng 2 liên kết hydro (h×nh 3.5) Điều này trái với bình thường là T=A,GC Các trạng thái tautomeric thường tồn tại một thời gian ngắn, tuy nhiênnếu xuất hiện vào lúc tái bản, thì quá trình nhận nhầm và đột biến dễ xảy ra Kếtquả có thể tạo ra sự thay thế một bazơ purine hoặc pyrimidine dạng này bằngbazơ purine hoặc pyrimidine khác (đây gọi là quá trình transition, quá trìnhchuyển tiếp hay quá trình quá độ (hoán vị)

- Quỏ trỡnh thay thế cặp bazơ liờn quan đến việc thay thế 1 purine bằng 1pyrimidine và ngược lại gọi là quỏ trỡnh transversion (sự chuyển qua).

- Thờm hoặc bớt một vài cặp bazơ gọi là đột biến thay đổi khung đọc mó (frameshift mutation) (hình 4.5)

Hỡnh 3.5 Hiện tượng ghộp cặp đụi nhầm của cỏc bazơ hiếm cú thể sẽ

dẫn đến ghộp bất bỡnh thường A = C và G  T.

Hỡnh 4.5 Sơ đồ do đột biến thờm 1 cặp bazơ làm thay đổi khung đọc mó và tạo

ra chuỗi protein bị biến đổi

- Có thể tóm tắt một số khả năng biến

đổi làm thay thế các nu trong phân tử

DNA tái bản trình bầy ở hình 5.5

Hỡnh 5.5 Sơ đồ cỏc khả năng biến đổi

bazơ xẩy ra, mũi tờn đường liền là giữa

bazơ Pu –Pu và giữa Py-Py, đường đứt

giữa Pu - Py và ngược lại

3 Hậu quả của đột biến DNA

- Hậu quả của đột biến tuỳ thuộc vào nơi xẩy ra đột biến và kiểu đột biến xẩy ra

- Đột biến điểm xẩy ra ở đoạn DNA phiên mã sẽ:

+ Làm biến đổi thành codon khác nhng mã hoá cùng một acid amin so với trớc gọi là

đột biến câm (Synonymous or silent mutation)

+ Biến đổi thành codon khác rồi mã hoá một acid amin khác (missense mutation)+ Biến đổi codon từ mã hoá cho một acid amin thành một codon dừng dịch mã sẽ tạo

ra protein ngắn lại (nonsense mutation)

- Đột biến xẩy ra ở đoạn không phiên mã gồm các vùng mà enzyme RNA polymerase

và những protein khác bọc lấy mới cho phép quá trình phiên mã tiến hành sẽ ảnh hởng

đến cờng độ phiên mã, lợng mRNA và protein sinh ra Dới góc độ RNA thì các vùng

bị ảnh hởng bao gồm:

+ vị trí bọc ribosome của mRNA vi khuẩn

+ vị trí cắt 5’ và 3’ để kết nối các exon của mRNA sinh vật nhân chuẩn

+ những vị trí điều hoà quá trình dịch mã và định vị mRNA trong tế bào

Các dạng đột biến này rất khó phát hiện so với những đột biến xẩy ra ở vùng mãhoá và ảnh hởng không nhiều đến biểu hiện kiểu hình sinh vật

4 Ung th là hậu quả của đột biến

U ác tính hay u ung th là tập hợp các tế bào đợc sinh ra từ một tế bào gốc bấtbình thờng Tế bào ung th khác với tế bào bình thờng bởi nhiều đặc tính nh: tốc độphân chia nhanh hơn, xâm lấn lãnh địa của những tế bào mới khác, có tốc độ trao đổichất cao hơn và có hình dạng bất thờng Nguyên nhân là do một số yếu tố điều khiển

sự phát triển của tế bào bình thờng trong tế bào ung th bị biến đổi Rất nhiều loại tếbào có khả năng trở thành tế bào ung th Một số đợc truyền từ cha mẹ qua dòng tế bàophôi, nhng hầu hết là do đột biến tế bào soma gây lên

Có nhiều tác nhân gây ra tế bào ung th và có 2 loại đột biến gây ung th là độtbiến những gen trực tiếp sinh ra ung th và đột biến những gen ức chế đặc tính gây ung

th Loại đầu có 2 đặc điểm là thờng gen đột biến ung th sinh ra protein ung th trong tếbào khối u và chỉ cần một alen đột biến cũng gây lên khối u Còn đột biến gen mấtchức năng ức chế ung th là đột biến lặn, tạo ra protein làm mất một phần hoặc mất hếtkhả năng ức chế ung th Đồng thời để phát triển thành ung th thì cần phải có cả 2 alencủa locus gen cùng bị đột biến

Loại đột biến tiền ung th (proto-oncogene) chia ra làm 2 loại: loại 1 chỉ gây ung

th nếu sản phẩm protein của nó đợc hoạt hoá khi có mặt của một tín hiệu điều hoà phùhợp nh chất nhận yếu tố sinh trởng, protein truyền tín hiệu và chất điều hoà phiên mã.Loại 2 sản phẩm gen đột biến hoạt động ức chế khả năng phá huỷ những tế bào bị saihong, kết quả là gây tế bào ung th

Bình thờng có một số gen có chức năng điều khiển chu kỳ phân chia tế bào bìnhthờng, những gen này bị đột biến dẫn đến tế bào phân chia bất thờng và gây ra ung th

5 Tỏc nhõn lớ húa gõy đột biến

a Tỏc nhõn vật lý

1 Tia phúng xạ, tia X quang, tia , tia vũ trụ, tia cực tớm, phúng xạ ion như X quang,

cú bước súng 0.1-1nm, cú năng lượng cao dựng trong chẩn đoỏn y học vỡ chỳng cúkhả năng xuyờn qua mụ Trong quỏ trỡnh xuyờn, chỳng va đập vào cỏc nguyờn tử,giải phúng ra electron tạo ra cỏc ion tớch điện dương, những ion này đập vào phõn

tử khỏc lại giải phúng ra electron (điện tử)

2 Tia cực tớm (UV) cú năng lượng thấp được hấp thụ bởi cỏc bazơ purine vàpyrimidine biến nú thành dạng hoạt húa và kớch động Vỡ năng lượng của tia này

thấp nên khả năng đâm xuyên vào mô chậm chạp thường chỉ xuyên được vào lớp

bề mặt tế bào của sinh vật đa bào, nên nó thướng có tác dụng gây đột biến đối vớisinh vật đơn bào DNA hấp phụ tối đa tia UV ở bước sóng 254 nm và tại bước sóngnày gây tần số đột biến cao Cơ chế hấp phụ UV và gây tạo chất dễ hoạt hóa (h×nh6.5), khi cytosine + UV + H2O sẽ tạo thành cytosine hydrat, khi có 2 thymine nằmgần cạnh nhau + UV sẽ tạo thành thymine C5= C5 Thymine (thymine dimer), dạngnày gây lên quá trình ghép nhầm hoặc làm chấm dứt quá trình tái bản

Hình 6.5 Tác động của tia UV làm biến đổi bazơ pyrimidine thành dạng hiếm

b Tác nhân hóa học chia làm 5 nhóm

1 Hơi độc hoặc hơi sulfur (mustard gas hoặc sulfur mustard) (b¶ng 1.5), có tácdụng alkyl hoá bazơ

Bảng 1.5 Hơi độc có tác dụng gây biến đổi các bazơ cua DNA

2 Bazơ tương đồng như: 5 BU (5 Bromouracil) và 2AP (2 aminopurine), tác dụnglàm tăng tần số ghép cặp nhầm, 5 BU là bazơ tương đồng với thymine, còn Br ở vị trí

C5 tương tự như nhóm –CH3 ở C5 trong thymine Sự có mặt Br làm thay đổi phân bốđiện tích, làm tăng khả năng chuyển vị nguyên tử hydro Ở trạng thái keto bền, 5 BUghép cặp với Adenine, sau khi có chuyển vị hydro thành dạng enol thì 5BU lại ghépcặp với Guanine (Hình 3.5) Hiệu quả gây đột biến của 5BU tương tự như quá trìnhtautomeric shift (h×nh 7.5)

Hình 7.5 Cơ chế tạo đột biến điểm do hiện tượng trôi dạt tautomeric tạo bazơ hiếm gây quá

trình ghép cặp đôi nhầm

Nếu 5BU tồn tại ở trạng thái hiếm enol như một Nu 3 phosphate tại thời điểm

nó gắn nhập vào mạch DNA, nó sẽ gắn vào guanine mạch gốc và gây ra hiện tượngtransition (hoán vị) từ GC AT (h×nh 8.5) Nếu 5BU kết gắn với Adenine dạng keto,sau khi tautomeric shift sẽ biến thành dạng enol, quá trình sao chép sau đó sẽ tạo rahoán vị từ A-T thành GC (hình 11.26b) Do vậy 5BU gây ra quá trình hoán vị theo 2hướng AT GC, nên có thể tạo ra cả 2 hướng đột biến trên

Hình 8.5 Sơ đồ tác động của dạng enol 5BU kèm theo

quá trình tái bản DNA gây nên đột biến

3 HNO2 tác động vào DNA trong cả lúc tái bản và không tái bản, bằng cách oxyhóa khử gốc amin của các bazơ, A, G, và C (h×nh 9.5) Thí dụ làm adenine biếnthành hypoxanthine, chất này sẽ ghép cặp với cytosine hơn là với thymine, còncytosin đảo thành uracine sẽ ghép cặp với adenine thay vì bình thường ghép vớiguanine Quá trình khử amin của Guanine sẽ biến thành xanthine, chất này ghépcặp với cytosine giống như Guanine Do vậy khử amin của Guanine không tạođược đột biến giống như đối với adenine và cytosine HNO2 gây đột biến hoán vịtheo 2 hướng ATGC.

4 Thuốc nhuộm acridine là proflavin và hàng loạt các hợp chất có tên gọi là

ICR-170, ICR-191 là những chất có tác dụng gây đột biến rất mạnh, có thể tạo ra cácđột biến thêm mất cặp bazơ ICR có chứa phần acridine gồm những chuỗi có kíchthước khác nhau, các chất này thường là tác nhân alkyl hóa Acridine tích điệndương tự xen vào giữa cặp bazơ xếp chồng nhau (h×nh 10.5), làm tăng độ cứngchắc và thay đổi tính ổn định của chuỗi xoắn kép, tạo ra những thắt nút nhẹ trongphân tử DNA Khi phân tử DNA có chứa acridine xen vào mà tái bản sẽ xẩy ratăng thêm hoặc mất đi cặp bazơ kết quả sẽ tạo ra đột biến

Hình 9.5 Cơ chế gây đột biến do tác động của HNO2: a) biến đổi adenine thành hypoxanthine làm cặp AT biến thành GC; b) biến đổi cytosine thành uracine làm cặp GC biến thành AT; biến đổi guanine thành xanthine dẫn đến là AT biến thành GC và ngược lại.

Hình 10.5 Quá trình chèn xen của acridine proflavin vào chuỗi xoắn kép DNA tại đó cặp bazơ có

thể được tăng thêm hoặc mất đi dẫn đến đột biến.

5 Tác nhân alkyl hóa và hydroxyl hóa như: MMS, EMS (methyl và ethyl methanesulfonate, nitroguanidine (NTG), chúng có tác dụng gây đột biến mạnh bằng cáchchuyển gốc methyl và ethyl vào bazơ làm quá trình ghép cặp bình thường bị đảo lộndẫn đến đột biến thay thế bazơ của purine hoặc pyrimidine bằng bazơ khác cùngnhóm Thí dụ: Ethyl hóa tại vị trí 7N vào 6-O do chất EMS tạo thành 7 ethylguanine sẽ ghép cặp với thymine(h×nh 11.5 vµ 12.5)

Hình 11.5 Giả thuyết gây đột biến do EMS (a) làm Guanine ghép nhầm với Thymine; (b)do

NH 2 OH làm Adenine ghép nhầm với Cytosine

Sản phẩm alkyl hóa các bazơ khác có tác dụng hoạt hóa quá trình sửa chữagiống như tạo thành 2 thymine Những sai sót hiếm hoi này xảy ra trong quá trìnhsửa chữa sẽ tạo thành đột biến kiểu transverion và frameshift Một số hợp chất có 2nhóm alkyl hoạt hóa gây bắt chéo (cross-link) sợi đơn DNA hoặc phân tử ADNlàm nhiễm sắc thể bị gẫy, tạo ra đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể Alkyl hóa ít gâyđột biến đặc thù như chất tương đồng và HNO2 hoặc acridine Nó có thể tạo ra tất

cả các kiểu đột biến với tần xuất rất khác nhau, phụ thuộc vào hóa chất và nồng độ

6 Nitrosoguanidine (NTG) gây lên hàng loạt các đột biến liên kết gần nhau trong 1mẩu nhiễm sắc thể đang tái bản trong khi bị xử lý, nên ít được sử dụng trongnghiên cứu di truyền

7 Hydroxylamine NH2OH, ngược với nhóm alkyl có tác dụng gây đột biến đặc thù,tuy nhiên cơ chế chính xác vẫn chưa rõ, nó hydroxyl hóa nhóm amin của cytosine(h×nh 11.5 b) tạo thành hydroxylaminocytosine, chất này ghép cặp với adeninetạo thành đột biến hóan vị GC AT

8 Những đột biến do HNO2 và bazơ tương đồng gây lên đột biến kiểu transition, cóthể chia ra làm 2 loại: loại 1 là những thể có cặp AT ở tại nơi bị đột biến, sẽkhông bị đột biến đảo ngược bởi hydroxylamine, loại thứ 2 có cặp GC tại điểmđột biến sẽ bị đảo ngược bởi hydroxylamine Bởi vậy hydroxylamine được dùng

để xác định tính đặc thù của đột biến xảy ra từ AT GC hoặc GC AT hoán vị

Hình 12.5 Cơ chế tác động gây đột biến của một số tác nhân alkyl hoá a) Tác động của EMS (ethyl methanesulfonate) biến guanine thành 7-ethylguanine sẽ ghép cặp bất thường với thymine; b) Tác động của NH2OH (hydroxylamine) biến cytosine thành hydroxylaminocytosine sẽ ghép nhầm với adenine.

II Các nguyên nhân gây biến đổi DNA ë vi sinh vËt

1 Tái tổ hợp ở E.coli tạo biến đổi DNA

Thông tin di truyền của vi khuẩn được tàng trữ trong 1 nhiễm sắc thể chính,trung bình dài khoảng 5 Mb, chứa vài nghìn gen và có thể có hoặc không cã thể ditruyền ngoài nhiễm sắc gọi là episome hoặc plasmid Plasmid biến động theo kíchthước dài từ 1 – 200 kb, có tu 3 gen đến hàng trăm gen Có tế bào vi khuẩn chứa đến

11 loại plasmid khác nhau Episome là nhân tố di truyền ngoài nhiễm sắc thể của vikhuẩn như thùc khuÈn thÓ lamda (phage lambda) hoặc yếu tố giới tính F Episome cóthể tái bản độc lập với nhiễm sắc thể ký chủ hoặc là mét đơn vị thành phần gắn vàonhiễm sắc thể ký chủ Nhiễm sắc thể cña vi khuẩn khác với nhiễm sắc thể sinh vậtnhân thật ở chỗ nó chỉ gồm các nucleoid Nucleoid là vùng chứa DNA, thường chứahơn 2 bản nhiễm sắc thể vi khuẩn giống hệt nhau

Tái tổ hợp DNA ở vi khuẩn xảy ra qua 3 quá trình:

a Biến nạp ở vi khuẩn (transformation)

Là quá trình những gen, dưới dạng một đoạn DNA hòa tan, được chuyển từdòng tế bào vi khuẩn này sang dòng tế bào vi khuẩn khác, các đoạn DNA này có thể

từ tế bào sống hoặc đã chết Các đoạn DNA này được hòa tan trong môi trường ngoài

có thể thâm nhập vào tế bào chỉ khi tế bào vi khuẩn nhận có vùng tiếp nhận trên bềmặt màng (competent cell) Khi vào bên trong, các đoạn này thường thay thế bằngcách tái tổ hợp với vùng DNA ngắn tương đồng của tế bào chủ Quá trình biến nạpđược chia thành các bước (h×nh 13.5) nh sau:

+ Gắn sợi DNA kép nạp vào bề mặt vị trí tế bào tiếp nhận

+ Hấp thụ DNA cho, lúc này DNA cho có khả năng chống lại DNase

+ Biến đổi sợi DNA kép cho, thành sợi đơn DNA nhờ enzym phân rã exonuclease.+ Gắn (cộng hóa trị) toàn bộ hoặc một phần sợi đơn DNA cho vào thay thế đoạn tươngứng trong nhiễm sắc thể nhận, tạo sợi DNA lai có 2 sợi đơn cơ bản có trình tự tươngđồng nhau trừ trình tự gen a/a+, ở chỗ này gọi là DNA dị hợp kép (heteroduplex) làtrạng thái trung gian quan trọng trong quá trình đột biến, tái tổ hợp và sửa chữa DNA,chúng phân ly trong quá trình tái bản

Phân ly và biểu hiện kiểu hình của những gen cho gắn vào hoặc những gen tái

tổ hợp Ở các thế hệ tế bào sau sẽ tạo ra một số biến đổi DNA hoặc thể biến nạp

Hình 13.5 Sơ đồ biểu diễn hai bước chính hấp thụ và kết gắn đoạn gen ngoại trong quá trình chuyển nạp gen ở vi khuẩn Pneumococus a) Hấp thụ DNA trên bề mặt màng tại đây nhờ enzyme exonuclease liên kết màng hoặc DNA translocase kéo một sợi đơn DNA ngoại vào trong tế bào sử dụng năng

lượng tạo ra nhờ quá trình phân rã sợi đơn DNA còn lại Đoạn DNA ngoại mang chỉ thị di truyền a+ ;

Nhiễm sắc thể tế bào chủ chỉ chứa một đoạn DNA mang chỉ thị alen a b) Sợi đơn DNA ngoại gắn xen

vào nhiễm sắc thể và đẩy một sợi đơn DNA của nhiễm sắc chủ ra ngoài Sợi đơn ngoại ghép cặp bazơ

bổ sung với hầu hết các bazơ của đoạn sợi đơn chủ tiếp nhận trừ vị trí a Sự ghép lỗi xảy ra tại vị trí a+ /

a tại đây sợi đơn DNA ngoại mang alen a+ còn sợi đơn DNA của chủ mang alen a Lúc này phân tử

DNA được gọi là phân tử dị hợp kép, làm trung gian trong quá trình đột biến tái tổ hợp và sửa chữa DNA Khi tái bản lần sau sẽ phân ly tạo nên thể vi khuẩn biến nạp.

-b Chuyển nạp (transduction)

Là quá trình chuyển vật chất di truyền từ một vi khuẩn này sang một vi khuẩnkhác thông qua phage vector Trong trường hợp chuyển nạp có giới hạn hay chuyêntính thì chỉ có một số gen của vi khuẩn là được chuyển nạp vì phage có một vị trí đặchiệu có khả năng xâm nhập được vào nhiễm sắc thể của ttes bào ký chủ và chỉ nhữnggen của vi khuẩn nằm ở gần vùng đó sẽ được chuyển nạp Bacteriophage lambda là

vector chuyển nạp chuyên tính mang gen gal và bio của vi khuẩn Do vậy vector loại

này luôn chứa 2 phần (một phần của thùc khuÈn thÓ và một phần là của vi khuẩn ký

chủ E.coli)

• Chuyển nạp rộng (generalized transduction)

Trường hợp chuyển nạp rộng thì thùc khuÈn thÓ có thể gắn vào hầu hết và bất

cứ nơi nào trên nhiễm sắc thể ký chủ, do đó mà hầu hết các gen của tế bào ký chủ đều

có thể được chuyển nạp cùng với virus sang tế bào vi khuẩn khác Các thùc khuÈn thÓchuyển nạp thường thiếu một hoặc một số chức năng của phage bình thường nên cóthể không tái bản được trong tế bào ký chủ mới trừ khi có sự trợ giúp của mét thùckhuÈn thÓ trî gióp (phage helper) bình thường khác Trường hợp chuyển nạp rộng, th×thùc khuÈn thÓ được chia thành 2 loại dựa trên cơ sở phản ứng của chúng với tế bào vikhuẩn Thùc khuÈn thÓ gây độc (virulent phage) thường xuyên nhân lên và phân rã tếbào sau lây nhiễm Thùc khuÈn thÓ ôn hòa (temperate phage) tồn tại giữa 2 trạng tháisống sau lây nhiễm (hình 14.5)

Quá trình gây nhiễm của thực khuẩn thể vào tế bào vi khuẩn có thể xẩy ra như sau:

- Cách thứ nhất ph©n r· (lytic pathway): Sau khi chui được vào tế bào vi khuẩn chúngtiến hành sinh sản và phân rã tế bào ký chủ giống như trường hơp cña thùc khuÈn thÓgây độc

- Cách thứ 2 g¾n xen (lysogenic pathway): Sau khi xâm nhập vào tế bào vi khuẩn,nhiễm sắc thể của thùc khuÈn thÓ kết gắn vào nhiễm sắc thể của vi khuẩn ký chủ và táibản giống như bất kỳ những đoạn DNA nào khác của nhiễm sắc thể ký chủ

Chuyển nạp rộng được thông qua bởi một số thùc khuÈn thÓ độc tính và thùckhuÈn thÓ ôn hòa nào đó mà nhiễm sắc thể của nó không kết gắn vào tại những vùngđặc thù trên nhiễm sắc thể ký chủ Không phải tất cả các thùc khuÈn thÓ gây nhiễmđều có thể làm trung gian cho quá trình chuyển nạp Ví dụ: Các thùc khuÈn thÓ T (T2,T4, T6) phân giải DNA chủ và sử dụng lại các nucleotide đơn này để tổng hợp lênDNA của thùc khuÈn thÓ, cho nên DNA của ký chủ không tồn tại để lắp ghép khôiphục lại ở thế hệ sau Loại thùc khuÈn thÓ khác có thể không phân giải được DNA của

ký chủ,vì nhiễm sắc thể của ký chủ quá lớn cho quá trình lắp ghép toàn bộ, chúng sẽkhông có thể hình thành lên những thể chuyển nạp

Sau khi thùc khuÈn thÓ chuyển đẩy (tiêm) ®o¹n DNA ký chủ vào tế bào nhận,đoạn DNA đó có thể kết gắn vào nhiễm sắc thể tế bào nhận tương tự như quá trìnhbiến nạp chỉ khác là đoạn DNA gắn vào đó là sợi kép, hoặc tồn tại tự do ở trong tế bàochất và khi đó đoạn đó không tái bản được nên chỉ truyền cho một thế hệ tế bào Khi

đó các gen nằm trong đoạn được chuyển nạp có thể biểu hiện Tế bào mang đoạn nàyđược gọi là những thể chuyển nạp không thành (thui) lúc này chúng có một số phần lànhị bội có thể được sử dụng để tiến hành thử nghiệm đối xứng đề nghiên cứu nhữngđột biến khác nhau có thể xảy ra trên một gen hay nhiều gen khác nhau

• Chuyển nạp đặc thù vị trí (specilized transduction)

Thông qua thực khuẩn ôn hòa mà nhiễm sắc thể của nó có khả năng gắn tại mộthoặc một vài vị trí đính đặc thù trên nhiễm sắc thể ký chủ Nhiễm sắc thể của phage ônhòa thuộc kiểu này có cả 2 khả năng:

- Tự tái bản độc lập cùng với nhiễm sắc thể cña tế bào ký chủ

- Tái bản đoạn được kết gắn vào nhiễm sắc thể tế bào ký chủ và tái bản cùng vớinhiễm sắc thể ký chủ

Do vậy người ta gọi những thùc

khuÈn thÓ thuộc kiểu này là episome hoặc

yếu tố F trong vi khuẩn, khi đó tế bào vi

khuẩn có chức năng này như giới tính đực

(cho) F là một phân tử DNA vòng có chứa

khoảng 94.000 cặp basse, bằng khoảng

2,5% tổng lượng DNA của nhiễm sắc thể

ký chủ E.coli, khoảng 1/3 số gen trong F

liên quan đến việc chuyển vật liệu di

truyền đực sang cho cái (tế bào vi khuẩn

không có yếu tố F)

Hình 15.5 Sơ đồ quá trình kết gắn và cắt của

nhiễm sắc thể thực khuẩn thể lambda Khi

nhiễm sắc thể lambda bắt đầu xâm nhiễm, thì

nó là một phân tử DNA mạch thẳng chứa trình

tự các gen từ A đến R Sau khi lây nhiễm

chúng chuyển thành sợi vòng Khi lamda đi

theo hướng ôn hoà chúng tiến hành trao đổi và

kết gắn DNA của mình vào DNA nhiễm sắc

thể tế bào chủ tại vị trí đặc thù giữa pp’ trên

nhiễm sắc thể của phage và vị trí kết gắn

lambda bb’ của nhiễm sắc thể vi khuẩn Quá

trình kết gắn nhờ sản phẩm của gen int biến vi

khuẩn trở thành trạng thái prophage và trình

tự của gen lambda sẽ là p’-CIII R-A-J-p.

- Cơ chế kết gắn tái tổ hợp DNA cña thùc

khuÈn thÓ vào DNA nhiễm sắc thể E.coli(h×nh 15.5) tạo thành nhiễm sắc thể vi khuẩn

tỏi tổ hợp prophage Trong prophage, những gen cú liờn quan đến quỏ trỡnh tỏi bản củavirut, làm tan ró tế bào vi khuẩn thỡ sẽ bị ức chế hoặc ngừng hoạt động Vi khuẩn nàomang prophage được gọi là vi khuẩn lysogenic Vi khuẩn lysogenic sẽ miễn dịch vớiquỏ trỡnh xõm nhiễm lần sau của cựng 1 virut.

- Khi thực khuẩn thể ụn hũa trải qua trạng thỏi phõn chia tế bào hiếm với tần suấtkhoảng 1/105 thì từ trạng thỏi prophage có thể chuyển sang trạng thỏi thực khuẩn thể

độc lập và nhiễm sắc thể ký chủ riờng biệt (trạng thỏi lytic state) Quỏ trỡnh trờn cú thểđược kớch thớch bởi tia UV, như vậy thực khuẩn thể phải cắt ra khỏi nhiễm sắc thể tếbào ký chủ nhưng theo những vị trớ đặc thự, thường là chớnh xỏc Đụi khi quỏ trỡnh cắtxảy ra khụng phải ở chỗ gắn ban đầu mà ở một nơi khỏc sẽ xảy ra trường hợp mộtphần DNA của thực khuẩn thể cũn lại trờn nhiễm sắc thể vi khuẩn, ngược lại một phầnDNA của vi khuẩn bị cắt theo thực khuẩn thể (hình 16.5)

Hỡnh 16.5 Sơ đồ biểu diễn quỏ trỡnh hỡnh thành

thể chuyển nạp đặc thự chứa gen dg Quỏ trỡnh

xảy ra giống như hỡnh 15.5 trừ trường hợp tỏi tổ

hợp khụng xảy ra tại vị trớ tương đồng giữa bp’ và

pb’ thay vào đú tỏi tổ hợp xảy ra giữa một vị trớ

trong vựng gen gal của nhiễm sắc thể ký chủ và

một vị trớ ở trong vựng chứa từ gen F đến gen J

trờn nhiễm sắc thể lambda Kết quả nhiễm sắc thể

lambda được ngắt ra sẽ gồm một đoạn DNA chủ

chứa vựng gen gal và phần gen J của lambda nằm

lại ở nhiễm sắc thể ký chủ

- Chỉ những gen nằm gần vị trớ thực khuẩn thể kết gắn mới cú thể bị cắt ra cựng vớithực khuẩn thể, một đoạn ngắn ở cả 2 phớa Vớ dụ thực khuẩn thể  gắn vào vựng giữa

gen gal cần cho việc sử dụng đường lactose làm năng lượng và gen bio cần cho việc

tổng hợp biotin của nhiễm sắc thể vi khuẩn Lamda như thế thường chỉ chuyển nạp chỉ

thị gal và bio Cũn thực khuẩn thể chuyển nạp chuyờn tớnh 80 thỡ lại kết gắn vào vựng

gần những gen trp của vi khuẩn (cần để tổng hợp a.amin triptophan) thì lại chuyển nạp

chỉ thị trp

Hình 17.5 a) Sơ đồ mô tả quá trình kết gắn nhiễm sắc thể  dg mang gen gal + vào nhiễm sắc thể ký

chủ mang gen gal- để hình thành nên thể biến nạp nhị bội gal+/gal- b) Nhờ sự kết gắn nhiễm sắc thể  +

trợ giúp để hình thành nên nhiễm sắc thể ký chủ lai chứa thể vi khuẩn  + /dg kép Thể vi khuẩn này dưới tác động của tia UV sẽ tạo ra một Hft chứa 50% gen của dg và 50% của  + Nếu như tế bào chủ lúc này được nhiễm với đơn thể dg sẽ thu được tỷ lệ tế bào nhiễm phage thấp, còn nếu như tế bào ký chủ được lây nhiễm cả hai dg và  + sẽ thu được tỷ lệ tế bào nhiễm phage cao và tất cả các tế bào nhiễm đều mang cả hai phage dg và  + Nếu tỷ lệ phage/ vi khuẩn đủ lớn thì vi khuẩn nhận cũng bị nhiễm cả  kiểu dại, genome của  dại sẽ gắn xen vào vị trí đính của  bình thường tạo ra thể chuyển nạp mang một  + prophage và một dg (hình 8.6b) Lúc này thể chuyển nạp sẽ trở thành thể lưỡng bội

từng phần gal + /gal - gọi là thể dị hợp (gal + /gal - heterogenote) và chứa gal + (exogenote, đoạn DNA cho)

và gal - (endogenote, nhiễm sắc thể nhận) Thể lưỡng bội từng phần gal + /gal - này thường kém bền vững, chúng phân li thành những tế bào gal - với tần số khoảng 1/1000 tế bào phân chia do bị cắt bỏ nhiễm sắc thể dg Vì  dg không thể tái bản khi không có mặt của phage trợ giúp, vì thế  dg thường bị đào thải Tái tổ hợp có thể xảy ra giữa gal + exogenote và gal - endogenote nhằm chuyển gal + cho gal -

endogenote để tạo thành thể chuyển nạp gal + bền vững Vì sự có mặt của những gen  kiểm tra khả năng miễn dịch của những nhiễm sắc thể vi khuẩn chứa  dg cho nên thể chuyển nạp lưỡng bội từng phần sẽ miễn dịch đối với sự xâm nhiễm của  này Nếu thể chuyển nạp chứa  dg và  + kép (hình 8.6b) bị kích hoạt bởi tia uv chúng sẽ sinh ra 50% thể chứa dg và 50% thể chứa  + ; cả hai prophage