sinh học phân tử

Trong khi Di truyền học tập trung vào chức nănsg của các gen, Hóa sinh quan tâm nhiều đến vai trò của protein trong tế bào, Sinh học phân tử chủ yếu nghiên cứu mối quan hệ gen và protein

Bài giảng học phần Sinh học phân tử

(TS Nguyễn Văn Duy, tổng hợp và biên soạn)

Mục lục

Chương 1: Giới thiệu

Chương 2: Cấu trúc phân tử

Chương 3: Tách nucleic acid

Chương 4: Nhân gen PCR

Chương 5: Lai phân tử

Chương 6: Giải trình tự

Chương 7: Công nghệ DNA tái tổ hợp

Chương 8: Biểu hiện gen

Phụ lục: Thuật ngữ

Tài liệu tham khảo

Chương 1: Giới thiệu

Sinh học phân tử ra đời từ sự kết hợp của các nhà vật lý học, hóa học cấu trúc,

vi sinh vật học và di truyền học Năm 1953, Watson và Crick khám phá ra cấu trúc xoắn kép của DNA, đánh dấu sự ra đời chính thức của sinh học phân tử, mở ra cánh cửa mới cho công nghệ sinh học hiện đại

1 Sinh học phân tử là gì?

Sinh học phân tử là một nhánh của sinh học nghiên cứu sự sống ở mức độ phân

tử Đối tượng nghiên cứu chủ yếu là nucleic acid và protein

Phạm vi nghiên cứu của Sinh học phân tử có phần giao thoa với các ngành khác trong sinh học đặc biệt là Di truyền học và Hóa sinh Trong khi Di truyền học tập trung vào chức nănsg của các gen, Hóa sinh quan tâm nhiều đến vai trò của protein trong tế bào, Sinh học phân tử chủ yếu nghiên cứu mối quan hệ gen và protein Làm thế nào đế gen biểu hiện thành protein? Có những mối tương tác gì giữa các hệ thống cấu trúc khác nhau trong tế bào, bao gồm mối quan hệ qua lại giữa quá trình tổng hợp của DNA, RNA và protein? Cơ chế nào điều hòa các mối tương tác này?

2 Lịch sử sinh học phân tử

Nguồn gốc ra đời sinh học phân tử bắt đầu từ những năm 1930 khi đồng thời các nhà vật lý học, hóa sinh cấu trúc và di truyền học cùng quan tâm đến một vấn đề: chức năng của các gen Năm 1953, Watson và Crick khám phá ra cấu trúc xoắn kép của DNA, đưa sinh học phân tử bước vào giai đoạn cổ điển với nhiệm vụ giải thích các nguyên lý cơ bản: đơn vị di truyền, thông tin di truyền và cơ chế phân tử của biểu hiện gen Cho đến những năm 1970, những vấn đề ấy đã cơ bản được giải quyết Nhiệm vụ của các nhà sinh học phân tử lúc ấy là ứng dụng những kỹ thuật sinh học phân tử để giải quyết những vấn đề còn lại trong các lĩnh vực khác nhau của sinh học Giai đoạn này gọi là thời kỳ "Đi vào phân tử", đánh dấu sự ra đời của hàng loạt các ngành mới

tiếp cận ở mức độ phân tử như miễn dịch phân tử, di truyền phân tử, tiến hóa phân tử, Từ những năm 1980, sinh học phân tử đi vào "Giai đoan genomics" khi các nhà khoa học quan tâm mạnh mẽ đến mối tương tác giữa các gen trong hệ gen Các phương pháp mới như giải trình tự trên quy mô lớn, proteomics, microarrays, tin sinh học được thử nghiệm và ứng dụng rộng rãi để nghiên cứu hệ gen học (genomics), hệ protein học (proteomics) và mong muốn ứng dụng trong liệu pháp gen và chuẩn đoán các bệnh lây nhiễm và di truyền cũng như tìm cách chữa trị những căn bệnh thế kỷ: ung thư!

3 Đề cương học phần

3.1 Thông tin về học phần

Tên học phần: Sinh học phân tử

Số tín chỉ:

Đào tạo trình độ: Đại học

Cho sinh viên năm thứ: 3

Học phần tiên quyết: Hóa sinh học, Tế bào học, Di truyền học, Vi sinh đại cương

Phân bổ tiết giảng của học phần:

- Nghe giảng lý thuyết: 23 tiết

- Làm bài tập trên lớp: 5 tiết

- Thảo luận: 8 tiết

- Thực hành, thực tập (phòng thí nghiệm): 15 tiết

- Tự nghiên cứu: 9 tiết

Khoa/Viện, Bộ môn quản lý học phần: Bộ môn Công nghệ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường

3.2 Tóm tắt nội dung và mục tiêu học phần

Học phần sinh học phân tử đòi hỏi sinh viên nắm vững những nguyên lý cơ bản trong sinh học phân tử (thông tin di truyền, đơn vị di truyền, cơ chế phân tử), có kiến thức và kỹ năng thành thạo về các phương pháp sinh học phân tử cơ bản (tách chiết nucleic acid, PCR, thao tác gen cho nhân dòng và biểu hiện gen, phân tích trình tự DNA), tiếp cận các phương pháp hiện đại trên thế giới (công nghệ DNA tái tổ hợp, phân tích cấu trúc và biểu hiện của hệ gen), và có hiểu biết thực tế về ứng dụng của sinh học phân tử trong y dược và thủy sản ở Nam Trung Bộ và Việt Nam

7 Công nghệ DNA tái tổ hợp

8 Phân tích biểu hiện gen

Chương 2: Cấu trúc phân tử

Các đại phân tử sinh học bao gồm protein, nucleic acid, lipid và carbohydrate Cho đến những năm 1950, cấu trúc của các thành phần cơ bản trong tế bào đã được hiểu rõ Trong vòng nửa thế kỷ sau đó, những cấu trúc phân tử mới lần lượt được khám phá như protein, DNA, virus, kênh ion, ribosome

1 Cấu trúc protein

Protein là những đại phân tử được cấu tạo theo nguyên tắc đa phân mà các đơn phân là amino acid Chúng kết hợp với nhau thành một mạch dài nhờ các liên kết peptide, tạo ra chuỗi polypeptide, có thể xoắn cuộn hoặc gấp trong không gian

Amino acid - Đơn phân của protein

Protein là một hợp chất đại phân tử được tạo thành từ rất nhiều các đơn phân là các amino acid Amino acid được cấu tạo bởi ba thành phần: một là nhóm amino (-

NH2), hai là nhóm carboxyl (-COOH) và cuối cùng là nguyên tử carbon trung tâm đính với 1 nguyên tử hydro và nhóm biến đổi R quyết định tính chất của amino acid Có tất

cả 20 amino acid đã biết trong thành phần của các loại protein khác nhau trong cơ thể sống Các amino acid trùng hợp thành chuỗi polypeptide như sau:

Cấu trúc không gian

Có 4 bậc cấu trúc của protein:

 Cấu trúc bậc một: Các amino acid nối với nhau bởi liên kết peptide hình thành

nên chuỗi polypepetide Đầu mạch polypeptide là nhóm amino của amino acid thứ nhất

và cuối mạch là nhóm carboxyl của amino acid cuối cùng Cấu trúc bậc một của protein có vai trò tối quan trọng vì trình tự các amino acid trên chuỗi polypeptide sẽ thể hiện tương tác giữa các phần trong chuỗi polypeptide, từ đó tạo nên hình dạng lập thể của protein và quyết định tính chất và chức năng của protein

 Cấu trúc bậc hai: Là sự sắp xếp đều đặn các chuỗi polypeptide trong không

gian Chuỗi polypeptide thường không ở dạng thẳng mà xoắn lại tạo nên cấu trúc xoắn

α và cấu trúc nếp gấp β, được cố định bởi các liên kết hydro giữa những amino acid ở gần nhau Các protein sợi thường gồm nhiều xoắn α, trong khi các protein cầu có nhiều nếp gấp β hơn

 Cấu trúc bậc ba: Các xoắn α và phiến gấp nếp β có thể cuộn lại với nhau thành

từng búi có hình dạng lập thể đặc trưng cho từng loại protein Cấu trúc không gian này

có vai trò quyết định đối với hoạt tính và chức năng của protein Cấu trúc này lại đặc biệt phụ thuộc vào tính chất của nhóm -R trong các mạch polypeptide Ví dụ, nhóm -R của cystein có khả năng tạo cầu nối disulfur (-S-S-), nhóm -R của prolin cản trở việc hình thành xoắn, từ đó vị trí của chúng sẽ xác định điểm gấp, hay những nhóm -R ưa nước thì nằm phía ngoài phân tử, còn các nhóm kị nước thì chui vào bên trong phân tử

 Cấu trúc bậc bốn: Khi protein có nhiều chuỗi polypeptide phối hợp với nhau

thì tạo nên cấu trúc bậc bốn của protein Các chuỗi polypeptide liên kết với nhau nhờ các liên kết yếu như liên kết hydro

Cấu trúc không gian 3D của protein triose phosphate isomerase

Chức năng của protein

Protein cấu

trúc

Cấu trúc, nâng

đỡ

Collagen và Elastin tạo nên cấu trúc sợi rất bền của

mô liên kết, dây chẳng, gân Keratin có trong, lông, móng Protein tơ nhện, tơ tằm tạo nên độ bền vững của tơ nhện, vỏ kén

Enzyme Xúc tác phản

ứng sinh học

Các enzyme thủy phân trong dạ dày phân giải thức

ăn, enzyme Amylase trong nước bọt phân giải tinh bột chín, enzyme Pepsin phân giải protein, enzyme Lipase phân giải lipid

Hormone Điều hòa hoạt

động sinh lý

Hormone Insulin và Glucagon do tế bào đảo tụy thuộc tuyến tụy tiết ra có tác dụng điều hòa hàm lượng glucose trong máu động vật có xương sống

Protein vận

chuyển

Vận chuyển các chất

Huyết sắc tố Hemoglobin có chứa trong hồng cầu động vật có xương sống có vai trò vận chuyển oxy từ phổi theo máu đi nuôi các tế bào

Protein vận

động

Vận động tế bào và cơ thể

Actinin, Myosin có vai trò vận động cơ Tubulin có vai trò vận động long, roi của các sinh vật đơn bào

Protein thụ

quan

Cảm nhận, đáp ứng kích thích Thụ quan màng của các tế bào thần kinh

Protein dự trữ Dự trữ chất

dinh dưỡng

Albumin lòng trắng trứng giúp cho phôi phát triển Casein trong sữa mẹ cung cấp amino acid cho con Trong hạt cây có chứa nguồn protein dự trữ cần cho nảy mầm

2 Cấu trúc DNA

Deoxyribonucleic acid (DNA) là một phân tử nucleic acid mang thông tin di truyền mã hóa cho các protein hoặc các chức năng khác ở tất cả các sinh vật, bao gồm virus

Trong những tế bào sinh vật nhân thật (eukaryote), DNA nằm trong nhân tế bào trong khi ở các tế bào prokaryote, DNA không được màng nhân bao bọc, vẫn nằm trong tế bào chất Ở những bào quan sản sinh năng lượng như lục lạp và ty thể, cũng như ở nhiều loại virus cũng mang những phân tử DNA đặc thù

Mỗi phân tử DNA được tạo thành từ hai chuỗi polynucleotide, chúng liên kết với nhau và uốn quanh 1 trục tương tự 1 chiếc thang dây xoắn Cấu trúc này được gọi

là cấu trúc xoắn kép (double helix) do Watson & Crick khám phá năm 1953

Mỗi chuỗi polynucleotide chính là do các phân tử nucleotide liên kết với nhau thông qua liên kết phosphodieste giữa gốc đường của nucleotide này với gốc phosphate của nucleotide tiếp theo

Mỗi nucleotide được tạo thành từ một phân tử đường ribose, một gốc phosphate

và một base (nucleobase) Trong DNA chỉ có 4 loại nucleotide và những loại này khác

nhau ở thành phần nucleobase Do đó tên gọi của các loại nucleotide xuất phát từ gốc nucleobase mà nó mang: Adenine (A), Thymine (T), Cytosine (C), và Guanine (G) Trong đó, A và G là các purine (có kích thước lớn) còn T và C là pyrimidine, (có kích thước nhỏ hơn)

Trong môi trường dịch thể, 2 chuỗi polynucleotide của 1 phân tử DNA liên kết với nhau bằng liên kết hydro Do cấu tạo hoá học của các nucleobase mà liên kết hydro chỉ hình thành giữa 2 loại nucleobase nhất định là A với T (qua 2 liên kết hydro) và C

với G (bằng 3 liên kết hydro) Đó thực chất là liên kết giữa một purine và một pyrimidine nên khỏang cách tương đối giữa 2 chuỗi polynucleotide được giữ vững Nguyên tắc hình thành liên kết trên được gọi là nguyên tắc bổ sung và nó phổ biến trên mọi loài sinh vật

3 Cấu trúc RNA

Ribonucleic acid (RNA) là một loại nucleic acid nhưng khác DNA ở chỗ có dạng mạch đơn hoặc mạch vòng, chứa đường ribose thay vì deoxyribose và Uracil thay

Ở một số loài mà không có DNA (như virus), thì RNA đóng vai trò là vật chất

di truyền RNA chủ yếu nằm trong tế bào chất, có cấu tạo đa phân do nhiều đơn phân

photphoric acid H3PO4, một trong bốn loại nitơ base (hợp chất base có chứa nguyên tử nitơ): Adenine (A), Guanine (G), Uracil (U), Cytosine (C) Các ribonuleotide được liên kết với nhau bằng liên kết cộng hóa trị giữa đường của ribonucleotide này với H3PO4của ribonucleotide kế tiếp, tạo thành chuỗi polyribonucleotide

RNA có vai trò trong các quá trình phiên mã và dịch mã thông tin di truyền và được chia làm ba loại chính:

sợi polynucleotide dạng thẳng, có chức năng sao chép thông tin di truyền từ gen cấu trúc đem đến ribosome là nơi tổng hợp protein

polynucleotide có từ 80 đến 100 ribonucleotit tự xoắn như hình chạc ba nên một số đoạn có nguyên tắc bổ sung A-U; G-C Có những đoạn không có nguyên tắc bổ sung, những đoạn này tạo thành các thùy tròn Một trong các thùy tròn mang bộ ba đối mã Một sợi mút của sợi RNA 3' gắn với một acid amin và đầu mút tự do 5' Mỗi tRNA chỉ vận chuyển một loại amino acid ứng với bộ ba đối mã mà nó mang Các amino acid sẽ được vận chuyển đến ribosome để tổng hợp protein

xoắn tương tự tRNA Nó cùng với các phân tử protein cấu trúc nên ribosome

Bên cạnh ba loại RNA trên đã được nghiên cứu khá kỹ, vai trò của một số loại RNA khác mới được phát hiện vào những năm cuối thế kỷ 20 hay đầu thế kỷ 21

Chúng điều khiển hoạt động gen hoặc tham gia vào các quá trình phát triển, biệt hoá tế bào như RNAi (RNA interference) hay microRNA, tham gia phản ứng đọc sửa thông tin di truyền trên phân tử mRNA (hiện tượng RNA editing) hay quyết định tính bền vững của mRNA (các ribonuclease)

4 Cấu trúc hệ gen

Hệ gen (hệ gen) là toàn bộ các gen trong một cá thể sinh vật Nó chứa mọi thông tin di truyền đặc trưng cho từng loài, thậm chí cho từng cá thể trong loài Hệ gen có thể bao gồm các phân tử DNA hoặc RNA

Ở các sinh vật nhân thật (eukaryote), 99% hệ gen nằm trong nhân tế bào và phần còn lại nằm trong một số bào quan như ty thể và lạp thể Đa số hệ gen vi khuẩn và phần hệ gen chứa trong các bào quan thường có kích thước nhỏ và ở dạng vòng khép kín Ngược lại, phần hệ gen trong nhân thường rất lớn và phân bố trên các nhiễm sắc thể dạng thẳng

Hệ gen ty thể của người: gồm 22 gen tRNA, 2 gen rRNA, và 13 vùng mã hóa protein

Hệ gen của bào quan mã hóa cho một số, không phải tất cả, các protein được tìm thấy trong bào quan Do có nhiều bào quan trong một tế bào, cho nên có nhiều hệ gen

của bào quan trên một tế bào Mặc dù bản thân hệ gen của bào quan là duy nhất Nhưng nó cấu tạo gồm một chuỗi lặp lại1 liên quan với mỗi chuỗi không lặp lại2 của nhân Về nguyên tắc, các gen bào quan được phiên mã và dịch mã bởi các bào quan

Kết quả bước đầu so sánh hệ gen giữa các loài sinh vật với nhau đã cho thấy có

ba đặc điểm nổi bật: 1) các gen phân bố trong hệ gen không theo qui luật, 2) kích thước của hệ gen thay đổi không tỷ lệ thuận (tương quan) với tính phức tạp của loài, 3) số lượng nhiễm sắc thể cũng rất khác nhau ngay giữa những loài rất gần nhau

4.1.Thành phần và đặc điểm của hệ gen

Kích thước hệ gen thay đổi mạnh giữa các loài Ví dụ, đối với sinh vật bậc cao, kích thước hệ gen chứa từ 109 bp (động vật có vú) đến 1011 bp (thực vật) Khác với tế bào tiền nhân (prokaryote), các gen trong hệ gen của eukaryote thường tồn tại nhiều bản sao và thường bị gián đoạn bởi các đoạn mã mù không mang thông tin di truyền (các intron)

Tỉ lệ các gen hoạt động trong hệ gen cũng khác nhau trong sinh giới Không

phải tất cả các đoạn DNA trong hệ gen đều tương ứng với các gen (mã hóa cho protein hoặc một sản phẩm cần thiết cho hoạt động sống của tế bào) Một gen được xem là một đoạn DNA mã hóa cho một sản phẩm cần thiết đối với hoạt động sống của tế bào Rõ ràng rằng không phải chỉ có DNA mã hóa cho protein mà cả các DNA mã hóa cho rRNA, tRNA và các loại RNA khác tham gia vào những phương thức kiểm soát hoạt động của hệ gen cũng được xác định là gen Từ những năm 1970, bằng các thí nghiệm gây bão hòa đột biến người ta đã có thể xác định được số gen nằm trên một đoạn nhiễm sắc thể Ngày nay, nhờ các kỹ thuật phân tích DNA và RNA hiện đại (Southern blot, Northern blot, microarray, ) các nhà khoa học có thể xác định số gen hoạt động trong

một tế bào Ví dụ: ở tế bào nấm men S cerevisiae (sinh vật eukaryote bậc thấp) có

khoảng 4.000 gen hoạt động, còn tế bào động vật có vú khoảng 10.000-15.000 gen Như vậy, nếu độ dài trung bình của một gen khoảng 10 kb thì tổng số chiều dài các gen hoạt động trong một tế bào cũng chỉ chiếm 1-2% hệ gen Hay nói cách khác, chỉ một phần rất nhỏ hệ gen mang thông tin di truyền cần thiết cho hoạt động sống của tế bào

Vậy phần hệ gen còn lại có vai trò gì, và tính phức tạp của loài có liên quan gì với kích thước hệ gen hay không?

Số lượng gen của sinh vật nhân chuẩn rất khác nhau, thay đổi từ 6.000-40.000 nhưng không

tương quan với kích thước hệ gen hoặc độ phức tạp của cơ thể

4.2 Tính phức tạp của hệ gen

Kết quả nghiên cứu động học của các phản ứng lai được tiến hành giữa genomic DNA với cDNA (complementary DNA-DNA bổ sung), giữa DNA với mRNA… cho thấy hầu hết các gen hoạt động đều nằm trong thành phần DNA không lặp lại Như vậy, thành phần này có ý nghĩa rất quan trọng trong việc đánh giá tính phức tạp của hệ gen Hay nói cách khác, dựa vào thành phần DNA không lặp lại có thể biết được kích thước hệ gen cũng như mức độ tiến hóa của loài Nếu như kích thước hệ gen (ở trạng thái đơn bội) được coi là một thông số động học (ký hiệu C), thì giá trị này đặc trưng cho từng loài và không phải luôn luôn tỷ lệ thuận với tính phức tạp của loài Ngược lại, giá trị C phản ánh các đặc điểm sau: - Số lượng DNA mã hóa cho các sản phẩm cần thiết đối với hoạt động sống của cơ thể rất nhỏ so với số lượng DNA có trong hệ gen -

Có sự biến đổi rất lớn của giá trị C giữa một số loài mà tính phức tạp của chúng không khác nhau nhiều

Đường cong biểu diễn động học của phép lai nucleic acid C 0 t 1/2 phụ thuộc vào độ phức tạp của hệ gen (genome) Sự hồi tính của DNA thường có dạng đường cong C0t (C: nồng độ DNA, t: thời gian), đường cong biểu diễn đồ thị phân số của DNA được tái liên kết (1-C/C0) theo log của C0t Hình trên trình bày đường cong C0t của một số hệ gen đơn giản Các đường cong có dạng tương tự nhau, nhưng giá trị C0t1/2 của mỗi đường là khác nhau Các hệ gen trong hình đại diện cho các nguồn DNA khác nhau (PolyU:PolyA, thực

khuẩn thể MS2, thực khuẩn thể T4 và vi khuẩn E coli).

Hệ gen vi khuẩn được xem là chỉ chứa các đoạn DNA không lặp lại và các gen thường tồn tại bản sao đơn Ngược lại, hệ gen của eukaryote thường chứa các gen có hai hoặc nhiều bản sao Hơn nữa, trình tự nucleotide của các bản sao này có thể không giống nhau hoàn toàn mặc dù sản phẩm protein mà chúng mã hóa có cùng một chức năng Các bản sao tương đồng của một gen được xếp chung vào một nhóm gọi là một

họ gen (gene family) Như vậy, ngoài các gen có một bản sao giống như ở vi khuẩn, hệ gen của eukaryote còn chứa các họ gen Hầu hết các gen mã hóa cho protein đã được phân lập đều nằm trong các họ gen khác nhau Các gen trong một họ thường hoạt động theo thời gian và không gian Điều đó có nghĩa, mỗi thành viên trong họ thường hoạt động ở một thời điểm nhất định trong quá trình hình thành và phát triển cá thể hoặc

hoạt động trong các mô chuyên biệt Khi một thành viên trong họ bị đột biến (bất hoạt) thì thành viên khác có thể hoạt động thay thế

4.3 Tính biến đổi trong hệ gen và sự trao đổi giữa các hệ gen

Nói chung, hệ gen có cấu trúc và tổ chức bền vững DNA của hệ gen thường không bị biến đổi bởi sự phát triển vô tính, nhưng thỉnh thoảng các trình tự của chúng cũng có thể bị chuyển chỗ trong gen, bị cải biến, khuếch đại hoặc thậm chí biến mất, như là một trường hợp tự nhiên Trao đổi chéo trong phân bào giảm nhiễm là một trong những nguyên nhân gây ra biến đổi của hệ gen Tuy nhiên, điều này xảy ra chủ yếu trong tế bào sinh dục mà không có trong các tế bào soma

Việc sắp xếp lại hệ gen chủ yếu là do các yếu tố di truyền di chuyển một cách tự

do trong hệ gen và được gọi tên chung là các yếu tố vận động (transposable elements, transposons) Các yếu tố di truyền vận động được xếp vào ba nhóm chính tùy thuộc vào tính độc lập của chúng:

 Nhóm thứ nhất gồm các yếu tố có khả năng di chuyển giữa các vị trí khác nhau trong hệ gen

 Nhóm thứ hai gồm các yếu tố có khả năng ghép vào và tách ra khỏi hệ gen để tồn tại độc lập trong tế bào (các episome như plasmid F, bacteriophage)

 Nhóm thứ ba chỉ di chuyển dưới sự kiểm soát của tế bào ở những giai đoạn sinh trưởng phát triển nhất định để sắp xếp khởi động một số gen đặc biệt (hình

thành cassette hoạt động ở nấm men S cerevisiae, ký sinh trùng đơn bào

Trypanosome)

Sự di chuyển của các yếu tố ở nhóm thứ hai và thứ ba liên quan tới tái tổ hợp tương đồng hoặc tái tổ hợp ở các vị trí đặc hiệu Mặc dù không có khả năng tồn tại độc lập bên ngoài hệ gen, nhóm thứ nhất tự kiểm soát sự di chuyển của chúng trong hệ gen

và không đòi hỏi sự tương đồng giữa chúng với vị trí ghép vào Chính các yếu tố di truyền có khả năng di chuyển giữa các vị trí trong một hệ gen hoặc giữa các hệ gen

khác nhau đã góp phần làm đa dạng di truyền giữa các cá thể trong loài Việc sắp xếp lại hệ gen sẽ dẫn đến những thay đổi sau:

 Tạo ra các gen mới cần thiết cho sự biểu hiện trong các trường hợp đặc biệt

 Sự tái sắp xếp có thể đáp ứng cho việc mở hoặc đóng gen Đây cũng chính là cơ chế của sự điều hòa biểu hiện gen

Các hệ gen còn có thể trao đổi gen tạo ra các hệ gen tái tổ hợp tự nhiên Ví dụ điển hình là sự di chuyển DNA từ hệ gen vi khuẩn sang hệ gen thực vật được nghiên

cứu khá kỹ đối với tương tác giữa Argobacterium tumefaciens hoặc A rhizogenes với

hầu hết các cây hai lá mầm Hiện tượng di chuyển DNA này gây những biến đổi về mặt

di truyền, biểu hiện ở việc xuất hiện các khối u trên thân cây (A tumefaciens) hoặc mọc rất nhiều rễ tơ (A rhizogenes) tại nơi bị nhiễm vi khuẩn

Chương 3: Lịch sử nghiên cứu và tách nucleic acid

Các nucleic acid được tách chiết thường là DNA hệ gen, mRNA hoặc DNA plasmid để sử dụng cho các nghiên cứu và phân tích tiếp theo

1 Lịch sử nghiên cứu nucleic acid

Năm 1953, Watson và Crick khám phá ra cấu trúc xoắn kép của DNA, đánh dấu

sự ra đời chính thức của sinh học phân tử, mở ra cánh cửa mới cho công nghệ sinh học hiện đại

Nucleic acid là những hợp chất cao phân tử đóng vai trò hết sức quan trọng trong hoạt động sống của mọi cơ thể sinh vật Chúng tham gia vào các quá trình cơ bản của sự sống như sinh tổng hợp protein, sinh trưởng, sinh sản và di truyền

Trong một thời gian dài các nhà hóa học và các nhà nghiên cứu về sinh lý dinh dưỡng đã coi protein, lipid và carbonhydrate là ba chất quan trọng nhất tạo nên cơ thể sống Quan điểm cho rằng nucleic acid là những cấu tử trơ của nhân và tế bào chất đã mãi mãi lãng quên từ khi chất thứ tư này – nucleic acid được chứng minh là chất quan trọng hơn so với các chất trước đó

Năm 1869, lần đầu tiên nhà hóa sinh học trẻ tuổi người Thụy Sĩ Friedrich Miescher (1844 -1895) đã phát hiện nucleic acid trong nhân tế bào Ông đã đặt tên là nuclein vì nhận thấy nó tồn tại ở trong nhân tế bào (nucleus)

Đối tượng nghiên cứu của Miescher là những bạch cầu (lymphocytes) Khi dùng acid kết tủa dịch chiết xuất từ nhân của tế bào mủ lấy từ bông băng bỏ đi (bằng cách dùng enzyme phân hủy protein của dịch dạ dày là pepsin để tiêu hóa các phần khác giàu protein của tế bào) ông đã vô cùng ngạc nhiên nhận thấy rằng, nhân tế bào chứa một chất không phải mỡ, không phải carbonhydrate, cũng không phải protein Nó cũng không giống một chất sống nào đã biết và chứa phosphor và nitơ, hòa tan thì cho tính acid Từ "nucleic acid" là do Altman đề nghị năm 1889 (ông đã phát hiện ra rằng đối

tượng thuận tiện tốt nhất để chiết rút chất nuclein là những đầu tinh trùng của cá hồi)

Và thực chất mỗi đầu tinh trùng của cá hồi hoàn toàn tương ứng với một nhân tế bào

Để điều chế chế phẩm nucleic acid, Miescher đã hòa tan phần đầu của tinh trùng (tế bào sinh dục đực) trong dung dịch muối nồng độ cao, sau đó bằng cách thêm nước vào

đã gây ra kết tủa nucleic acid ở dạng sợi Cần phải giữ chế phẩm lạnh do đó trong các ngày đông tháng giá của mùa đông, ông đã làm việc trong phòng không sưởi

Thực tế, lịch sử nghiên cứu hóa học của nucleic acid gắn liền với tên tuổi của Felix Hoppe - Seiler (1825-1895), nhà sinh lý học và hoá học rất nổi tiếng người Đức

vì chính ở phòng thí nghiệm của ông ở Tübingen, Miescher đã làm việc với danh nghĩa

là người học trò và cộng tác viên khoa học trẻ Mặc dù Miescher là một cộng tác viên

vô cùng cẩn thận và đầy triển vọng song Hoppe - Seiler vẫn thấy cần thiết phải đích thân lặp lại thí nghiệm xem có đúng là một chất mới hay không Kết quả thực nghiệm không những khẳng định thành tựu của Miescher mà còn thu được thêm nhiều dẫn liệu mới rất đặc trưng Hoppe - Seiler còn phát hiện trong nhân tế bào nấm men cũng có chất nuclein giống như ở tế bào bạch cầu

Người kế tục phát triển công trình của Miescher là nhà hóa sinh học (hóa học hữu cơ) người Đức Albrecht Kossel (1853 - 1927) Năm 1882, ông đã phân tích nucleic acid ra những phần nhỏ chứa acid phosphoric, đường và base chứa nitơ (Kossel

đã tách được hai pyrimidine và đặt tên là cytosine và thymine, cũng như hai purine với tên adenine và guanine) Do công trình này ông đã đạt giải Nobel về y và sinh lý học vào năm 1910 Một pyrimidine khác là uracil cũng đã được phát hiện sau này

Trong những năm đầu của thế kỷ XX (1900 - 1932), nhà hóa sinh học người Mỹ gốc Nga Phoebus Aaron Theodore Levene (1869 - 1940) đã xác định được đơn vị cấu tạo của nucleic acid là các nucleotide (hay mononucleotide) và phân biệt được hai loại nucleic acid: deoxyribonucleic acid (DNA) và ribonucleic acid (RNA)

Như vậy, cho đến năm 30 của thế kỷ XX này, người ta đã biết được thành phần của các nucleic acid Levene đã đoán trước 4 nucleotide khác nhau liên quan đến RNA

là adenylic acid (chứa adenine), guanilic acid (chứa guanine), cytidilic acid (chứa

cytosine) và uridic acid (chứa uracil) Ông cũng giả thiết 4 nucleotide tiếp theo liên quan đến DNA là deoxyadenilic acid, deoxyguanilic acid, deoxythymidilic acid (chứa thymidine) và deoxycytidilic acid (chứa cytosine)

Do các giả thiết này của Levene tỏ ra phù hợp với hiểu biết của hóa học cho nên chúng sớm được các nhà hóa học chấp nhận Nhưng cho đến thời kỳ đầu những năm

1950, chúng vẫn chưa được chứng minh rõ ràng khi nhà hóa sinh học người Anh Alexander Robertus Todd (1907-1997) chưa tổng hợp được các nucleotide phù hợp một cách chính xác với các công thức của Levene Todd đã xác nhận được rằng các chất này thực tế giống các hợp chất đã thu nhận được từ nucleic acid Với công trình này, Todd đã được trao giải thưởng Nobel về hóa học năm 1957

Trong những năm 1949 - 1953 nhà sinh học người Mỹ gốc Áo Erwin Chargaff (1905 - 2002) khi phân tích DNA đã phát hiện sự cân bằng của các base trong DNA: số nhóm purine bằng số nhóm pyrimidine (purine/pyrimidine = 1), số nhóm adenine bằng

số nhóm thymine (adenine/thymine = 1), số nhóm guanine bằng số nhóm cytosine (guanine/cytosine = 1) Về sau này người ta đã đặt quy tắc mang tên ông về tổng lượng các loại nucleotide cấu tạo nên các DNA

Trong những năm đầu thập niên 1950, hai nhà vật lý học người Anh, Maurice Hugh Frederick Wilkins (1916 - 2004) cùng với Rosalind Franklin (1920 - 1958) bắt đầu tiến hành các nghiên cứu đầu tiên về cấu trúc DNA Wilkins là con trai của một bác sĩ người New Zealand chuyên học vật lý và vào thời kỳ đầu cuộc Chiến tranh Thế giới thứ hai, ông làm việc cho sự phát triển bom nguyên tử Nhưng sau cuộc Thế chiến này, ông dùng tất cả sức lực của mình cho công việc nghiên cứu DNA và đã trở thành một trong những nhà bác học tiên phong trong lĩnh vực này nên được coi là nhà lý sinh

học Wilkins và Franklin đã áp dụng phương pháp nhiễu xạ Rơnghen (X-ray

diffraction) vào việc nghiên cứu cấu trúc tinh thể của DNA (lấy từ tuyến ức bê, thymus) Với những bức ảnh chụp cấu trúc tinh thể DNA có dạng chữ thập, hai tác giả này gợi ý rằng DNA có thể gồm hai hoặc ba mạch đơn bện xoắn với nhau

Năm 1953, từ các nghiên cứu của mình kết hợp với các kết quả nghiên cứu trước đó của Chargaff và Wilkins, hai nhà khoa học ở trường Đại học Tổng hợp Cambridge là Francis Harry Compton Crick (England; 1916-2004) và James Dewey Watson (USA; 1928-2003) đã xây dựng thành công mô hình chuỗi xoắn kép của phân

tử DNA Với công trình này, Watson và Crick đã được trao giải thưởng Nobel về y học

và sinh lý học năm 1962 Từ đó Crick đã xây dựng một chuỗi xoắn kép DNA bằng đồng trong vườn nhà ông ở trung tâm Cambridge, sau đó đã viết: "Người ta hỏi tôi là khi nào thì sẽ mạ vàng"

Cùng với việc nghiên cứu cấu trúc DNA, các nhà khoa học cũng đã nỗ lực tìm hiểu vai trò và các chức năng sinh học của nó Vào năm 1944, nghĩa là sau 75 năm kể

từ khi phát hiện DNA trong nhân tế bào năm 1869, nhà vi khuẩn học người Mỹ Oswwald Theodore Avery (1877 - 1955) đã chứng minh DNA là chất liệu di truyền khi

bổ sung DNA chiết xuất từ chủng độc (chủng không độc của phế cầu khuẩn

Diplococcus pneumoniae biến thành chủng độc gây viêm phổi và làm chết chuột bắt

nguồn từ thí nghiệm biến nạp của F Grifith năm 1928) vào môi trường nuôi cấy và kết hợp với việc xử lý bằng DNase Điều đó chứng tỏ DNA quyết định tính chất di truyền của phế cầu khuẩn

Năm 1952, Alfred Day Hershey (1908 - 1997) và Martha Chase (1927 - 2003) cho biết, bằng đồng vị phóng xạ có thể theo dõi sự di chuyển của protein và DNA của virus (cơ sở là DNA chứa phosphor, protein chứa lưu huỳnh mà không chứa phosphor;

vì vậy DNA virus có thể được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ phosphor, còn protein virus được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ lưu huỳnh) Khi đánh dấu một số hạt virus

ở phần protein và một số hạt virus ở phần DNA rồi đưa vào môi trường nuôi cấy vi

khuẩn chủ E coli thì thấy DNA virus nhanh chóng thâm nhập vào tế bào chủ, còn phần

protein thì không Thí nghiệm cũng đã chứng minh tầm quan trọng về mặt di truyền của DNA

Năm 1955, nhà hóa sinh học Mỹ Fraenkel-Konrad (1910 - ) đã chia virus ra làm hai phần và sau đó nối được hai phần đó lại, phần protein không gây nhiễm (không

chui vào tế bào vật chủ) còn phần DNA thì gây nhiễm Thí nghiệm của Krauss trên hồng cầu người chứng minh sự liên quan giữa cấu trúc hóa học của protein với vai trò

di truyền của DNA (khi đưa DNA chiết xuất từ hồng cầu non của người lành vào tủy xương bệnh nhân thiếu máu hình lưõi liềm (có HbS không bình thường) thì thấy hemoglobin bình thường được tổng hợp Điều đó chứng tỏ DNA quyết định cấu trúc đặc hiệu của protein

Các thí nghiệm sau đó của các nhà khoa học đã chú trọng vào việc tổng hợp DNA Năm 1956 Severo Ochoa (1905 - 1993) và Arthur Kornberg (1918 - ) - hai nhà

khoa học người Mỹ đã tổng hợp DNA in vitro bằng cách trộn enzyme DNA polymerase I được chiết xuất từ E coli với các dNTP, DNA khuôn (DNA tự nhiên) và

Mg++, DNA thu được không khác DNA tự nhiên Hai nhà khoa học này đã được nhận giải thưởng Nobel về y học và sinh lý học vào năm 1959

Năm năm sau khi công bố công trình cấu trúc xoắn kép của DNA vào năm

1958, Matthew Stanley Meselson (1930 - ) và Franklin William Stahl (1928 - ) đã chứng minh bằng thực nghiệm dự đoán trên là hoàn toàn có cơ sở Bằng cách nuôi vi

khuẩn E coli ở môi trường chứa nitơ nặng 15N sau đó bằng 14N bình thường rồi theo

dõi qua các thế hệ, xem sự thay đổi tỷ trọng của DNA qua máy ly tâm siêu tốc (siêu ly tâm); hai nhà khoa học đã xác định được cơ chế tái sinh bán bảo tồn của DNA

Về việc nghiên cứu RNA, cho đến cuối những năm 30 của thế kỷ XX, các nhà khoa học vẫn nghĩ rằng DNA là đặc trưng của các tế bào động vật, còn RNA chỉ có thể gặp được ở trong nấm men và các tế bào thực vật Nguồn quan trọng nhất của DNA lúc này là tuyến ức (thymus), còn đối với RNA là nấm men

Các nghiên cứu chính xác hơn sau này đã cho thấy cả hai loại nucleic acid đều

có mặt trong tất cả các tế bào động vật và thực vật

Năm 1939, các nhà nghiên cứu Torbjorn Oskar Caspersson (Thụy điển; 1910 - 1997) và Jean Brachet (Bỉ; 1909 - 1998) đã chứng minh sự tổng hợp mạnh mẽ protein trong bào tương cùng xảy ra với sự tổng hợp manh mẽ RNA

Năm 1956, S Ochoa (nhà hóa sinh học người Mỹ) đã dùng enzyme RNA

polymerase được chiết xuất từ vi khuẩn Azobacter vineladni để tổng hợp RNA in vitro

Năm 1956, George Emile Palade (1912 - ) đã chứng minh microsome có chứa những hạt có nhiều RNA gọi là thể ribo tức là ribosome (55% RNA, còn lại là protein)

Năm 1961, Francois Jacob (1920 - ) và Jacques Lucien Monod (1910 - 1976) nêu vấn đề có một loại RNA khác có đặc điểm chuyển hóa nhanh chóng và có cấu tạo tương tự DNA Đó là mRNA, là chất trung gian chuyển thông tin từ DNA đến chuỗi polypeptide được tổng hợp

Trước đó vào năm 1958, M B Hoagland (nhà hóa sinh học người Mỹ) đã nghiên cứu vấn đề đưa amino acid vào ribosome Ông đã xác định là trước khi tham gia tổng hợp protein, amino acid được kết hợp với RNA vận chuyển (tRNA) để vận chuyển amino acid từ bào tương vào ribosome Với những phương pháp thí nghiệm khác nhau các phòng thí nghiệm của Marshall Warren Nirenberg (1927 - ), Har Gobind Khorana (1922 - ) và Ochoa đã xác định được các bộ ba mật mã của toàn bộ 20 amino acid vào những năm 1961 - 1965

Do vai trò quan trọng của nucleic acid trong hoạt động sống của cơ thể sinh vật, cho nên việc nghiên cứu nucleic acid ngày càng được chú trọng Từ những năm 70 của thế kỷ XX trở lại đây, nhất là trong 10 năm cuối của thế kỷ và những năm đầu của thế

kỷ XXI này, hiểu biết về nucleic acid ngày càng được mở rộng

2 Nguyên lý chung

Tách chiết nucleic acid nhằm thu nhận DNA hệ gen, mRNA hoặc DNA plasmid với lượng đủ lớn, đủ tinh sạch và ở trạng thái nguyên vẹn để sử dụng cho các nghiên cứu và phân tích tiếp theo Nó bao gồm các bước chính như: phá vỡ các thành phần tế bào, tinh sạch, đánh giá chất lượng và đo nồng độ,

3 Tách RNA so với tách DNA

Tách RNA là bước đầu tiên để thu nhận mẫu cho các phân tích tiếp theo như

Northern blot, phép thử bảo vệ nuclease, RT-PCR, lập bản đồ RNA, dịch mã in vitro

hay xây dựng thư viện cDNA

Khi làm việc với RNA, một phân tử sợi đơn không bền nhiệt bằng DNA, lại dễ

bị phân hủy bởi RNase luôn sẵn có trong phòng thí nghiệm và tay người, nên các thao tác thí nghiệm đòi hỏi nhiều kỹ năng hơn

Trước hết, là vấn đề xử lý với RNase Để giảm thiểu tác động của RNase, chúng

ta luôn phải đeo găng tay, sử dụng pipett, ống nghiệm và dụng cụ sạch RNase Các enzyme này có thể được xử lý bằng dung dịch DEPC, tuy nhiên khi sử dụng dung dịch này phải hết sức thận trọng vì nó có tiềm năng gây ung thư

Thứ hai, là bảo quản RNA sau khi tách Có nhiều cách bảo quản Trong thời gian ngắn, chúng ta có thể sử dụng dung dịch 0.1 mM EDTA hoặc đệm TE (10 mM Tris, 1mM EDTA) trong nước sạch RNase Trong thời gian dài, RNA thường bền ở -80°C trong dung dịch EDTA hoặc ở -20°C trong ethanol 96%

Thứ ba, RNA có thể được kết tủa với alcohol hoặc LiCl Kết tủa RNA với alcohol (ethanol hoặc isopropanol) yêu cầu một nồng độ tối thiểu của các ion hóa trị I như Na+, K+, NH4+ Sau khi điều chỉnh nồng độ muối, RNA có thể được kết tủa với 2,5 lần thể tích ethanol hay 1 lần thể tích isopropanol, trộn đều, ủ lạnh ở -20° C trong vòng 15 phút

Chương 4: Nhân gen PCR

Phương pháp PCR (polymerase chain reaction-phản ứng tổnghợp dây chuyền nhờ polymease) là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất trong lĩnh vực Sinh học phân tử Phương pháp này do Kary Mullis phát minh vào năm 1983 và được giới thiệu lần đầu tiên tại Hội thảo lần thứ 51 ở Cold Spring Harbor vào năm

1986 và ông đã nhận được giải thưởng Nobel Hoá học vào năm 1993

Phương pháp PCR cho phép tổng hợp rất nhanh và chính xác từng đoạn DNA riêng biệt Đây thực sự là phương pháp hiện đại và thuận tiện cho việc xác định sự có mặt của một gen nào đó trong tế bào với độ chính xác cao

1 Nguyên lý của PCR

Phương pháp này dựa trên sự khám phá hoạt tính sinh học ở nhiệt độ cao của DNA polymerase được tìm thấy trong các sinh vật ưa nhiệt (vi khuẩn sống trong các suối nước nóng) Phần lớn các DNA polymerase chỉ làm việc ở nhiệt độ thấp Nhưng

ở nhiệt độ thấp, DNA xoắn chặt vì vậy DNA polymerase không có nhiều khả năng làm biến tính phần lớn các phần của phân tử Nhưng các polymerase chịu nhiệt này hoạt động ở nhiệt độ rất cao, có thể lên đến 100oC Ở nhiệt độ này DNA (dạng thẳng) sẽ bị biến tính Các thành phần chủ yếu của phản ứng PCR bao gồm:

1.1 DNA mẫu (DNA template)

Đây là mẫu DNA sinh học mà chúng ta muốn khuyếch đại Phản ứng PCR tối

ưu xảy ra trên DNA thật tinh sạch nhưng phản ứng PCR vẫn cho kết quả tốt với DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào Lượng mẫu DNA sử dụng có khuynh hướng giảm khi sử dụng các enzyme DNA polymerase cho hiệu quả cao (<100ng) Lượng DNA mẫu nếu cao quá phản ứng PCR sẽ không xảy ra PCR còn cho phép khuyếch đại

cả những mẫu DNA không được bảo quản tốt, các mẫu DNA đã bị phân hủy từng phần như ở các vết máu để lâu ngày, tinh dịch đã khô, tóc, móng tay của người chết

1.2 Mồi (primer)

Mồi là những đoạn DNA sợi đơn ngắn và cần thiết cho việc xúc tiến phản ứng dây chuyền tổng hợp DNA Chúng nhận ra phần DNA cần được nhân lên, bắt cặp bổ sung với một đầu của DNA mẫu và tạo ra vị trí bắt đầu tái bản Các mồi này có chiều ngược nhau, bao gồm một mồi xuôi (forward primer) và một mồi ngược (reverse primer)

Mồi là yếu tố quan trọng nhất của phản ứng PCR, quyết định hiệu quả của phản ứng Do đó việc thiết kế mồi cần được tuân thủ một số nguyên tắc nhất định:

+ Cả hai mồi trong một phản ứng PCR phải có nhiệt độ nóng chảy (Tm) gần như nhau bởi vì chúng được ủ ở cùng một nhiệt độ

+ Kích thước tối thiểu của mồi là 18 base (thông thường là 18-24 base) để quá tr.nh lai xảy ra tốt hơn

+ Mồi phải đặc hiệu có nghĩa là nó phải đặc trưng cho trình tự DNA cần được khuyếch đại, một mồi chỉ bám vào một vị trí nhất định trên gen

+ Không có nút cài tóc (hairpin loop): trong mỗi một mồi cần tránh tr.nh tự đối xứng bậc hai (palindromic sequences) có thể làm tăng cấu trúc sợi bên trong ổn định do

đó hạn chế việc mồi bám vào DNA mẫu

+ Tránh sự bổ sung giữa hai mồi: sự bổ sung giữa hai mồi sẽ làm tăng sản phẩm primer dimer

+ Trật tự các base cũng ảnh hưởng đến sự ổn định việc bám của mồi dưới nhiệt

độ cao Hai trong ba base ở đầu 3’ của mồi nên là G hoặc C, v G và C có 3 liên kết hydro do đó sự polymer hoá sẽ tốt hơn

+ Khoảng cách tối ưu giữa hai mồi: đây là một ứng dụng rất đặc trưng, nhưng đối với phần lớn các thử nghiệm PCR chẩn đoán, tốt nhất khoảng cách giữa hai mồi khi

đã bám vào DNA khuôn là 150-500 base

1.3 Enzyme polymerase chịu nhiệt

Vào thập niên 1960, nhà Vi sinh vật học Thomas Brock đã đến Công viên Quốc gia Yellowstone (Bang Wyoming, Mỹ) để nghiên cứu các vi sinh vật ưa nhiệt sống trong suối nước nóng 80-95 oC Ông đã phát hiện một loài vi khuẩn phát triển mạnh ở

nhiệt độ cao, có tên là Thermus aquaticus Hai mươi năm sau, các nhà khoa học của tập

đoàn Cetus (Tập đoàn Công nghệ Sinh học California) đã nhận thấy rằng DNA

polymerase từ Thermus aquaticus (Tagpolymerase) có khả năng giải quyết vấn đề của

enzyme biến tính sau mỗi chu kỳ DNA polymerase chịu nhiệt sử dụng cho phản ứng PCR lần đầu tiên được bán trên thị trường là Tag-polymerase

Từ đó đến nay, một số vi sinh vật chịu nhiệt khác đã được khám phá và người ta

đã tách chiết thêm được các DNA polymerase chịu nhiệt để sử dụng cho phản ứng PCR như Vent- polymerase (Tlipolymerase), Pfu- polymerase, rTth

1.4 Các loại nucleotid

Trong phản ứng PCR, bốn loại nucleotid thường được sử dụng ở dạng deoxynucleotid: dATP, dCTP, dGTP, dTTP với nồng độ cân bằng trong một phản ứng (200µM/loại nucleotid)

1.7 Ion Mg 2+

Nồng độ ion Mg2+ cũng là một yếu tố ảnh hưởng mạnh đến phản ứng PCR và nó tuỳ thuộc vào từng phản ứng Nồng độ ion Mg2+ tối ưu là 150-200 µM Người ta thấy rằng nếu nồng độ DNA quá cao thì enzyme polymerase sẽ gây ra nhiều lỗi hơn

2 Quy trình PCR

Có 3 giai đoạn chính trong phản ứng PCR và chúng được lặp đi lặp lại nhiều lần (chu kỳ) (thường từ 25 đến 75 chu kỳ)

2.1 Giai đoạn biến tính (denaturation)

Trong giai đoạn này phân tử DNA mẫu bị biến tính ở nhiệt độ cao (thường là từ 94-95 oC, lớn hơn nhiệt độ nóng chảy của phân tử) trong vòng 30 giây đến 1 phút, tất

cả các liên kết hydro giữ hai mạch của phân tử bị bẻ gãy và tạo thành các DNA sợi đơn

2.2 Giai đoạn lai (hay bắt cặp) (hybridization)

Nhiệt độ được hạ thấp ( thường từ 40-70 oC, thấp hơn nhiệt độ nóng chảy của mồi được sử dụng khoảng từ 3-5 oC) cho phép các mồi bám vào các phân tử DNA sợi đơn, đánh dấu phần DNA cần được khuyếch đại Giai đoạn này kéo dài từ 30 giây đến một phút (còn được gọi là giai đoạn ủ)

Nếu nhiệt độ quá thấp thì các mồi sẽ gây nên nhiều lỗi và kết quả là sẽ tạo nên nhiều sản phẩm phụ Nếu nhiệt độ quá cao thì phản ứng sẽ không có kết quả Công thức để xác định nhiệt độ nóng chảy (Tm) một cách tương đối là Tm=4(G+C) + 2(A+T)

2.3 Giai đoạn kéo dài (elongation)

Nhiệt độ được tăng lên đến 72oC giúp cho DNA polymerase xúc tác tổng hợp DNA tốt nhất Công việc của DNA polymerase là di chuyển dọc theo DNA sợi đơn và

sử dụng nó làm khuôn để tổng hợp sợi DNA mới bổ sung với DNA mẫu bằng cách kéo dài các phần đã được đánh dấu bởi các mồi Thời gian của giai đoạn này phụ thuộc vào kích thước của DNA mẫu, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút

Ở giai đoạn này của chu kỳ cuối cùng, thời gian được tăng thêm vài phút để các sợi DNA chưa được sao chép xong hoàn thành qúa trình tổng hợp Sau mỗi chu kỳ, số bản sao của DNA mẫu lại được tăng gấp đôi Đây là sự nhân bản theo cấp số nhân

Như vậy cứ 1 phân tử DNA mẫu, sau phản ứng PCR với n chu kỳ sẽ tạo thành 2n bản sao phân tử DNA.

Ưu điểm của phương pháp PCR là chỉ cần một thời gian ngắn đã cho một số lượng DNA theo mong muốn Sản phẩm của phản ứng PCR được phân tách trên gel agarose đã nhuộm ethimidium bromide và quan sát dưới máy chiếu tia UV

Phương pháp RT-PCR: Taq-polymerase không có hoạt tính với RNA vì vậy

phản ứng PCR không thể sử dụng để khuyếch đại RNA một cách trực tiếp Tuy nhiên

có thể sử dụng kết hợp enzyme sao chép ngược (reverse transcriptase-RT) với PCR để khuyếch đại RNA Phản ứng này sử dụng khả năng của enzyme sao chép ngược để sao chép RNA thành DNA bổ sung sợi đơn và từ DNA bổ sung sợi đơn thành DNA bổ

sung sợi kép Sau đó DNA bổ sung sợi kép sẽ được khuyếch đại nhờ Taq-polymerase

Sản phẩm của phản ứng RT-PCR là các phân tử DNA sợi kép tương ứng với phân tử RNA khuôn mẫu RNA tế bào tổng số tách chiết từ mô hoặc tế bào được sử dụng làm khuôn mẫu cho phản ứng sao chép ngược Ưu điểm của phương pháp này là cho phép nghiên cứu các mRNA với hàm lượng rất thấp mà các phương pháp như Northern blot không thể thực hiện được

3 Ứng dụng của PCR

PCR được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như tạo dòng phân tử, kỹ thuật

di truyền, phát hiện chẩn đoán các bệnh (do virus, vi khuẩn, ký sinh trùng ) cho kết quả rất chính xác, di truyền học để sản xuất các marker phân tử, nghiên cứu sự phát sinh các đột biến , đấu tranh chống tội phạm, nghiên cứu phát hiện mối quan hệ giữa người chết với người sống hoặc giữa các nhóm dân tộc Mặt khác, việc phân tích trình

tự và thành phần nucleotid của DNA có giá trị rất lớn trong việc định loại các loài sinh vật

Chương 5: Lai phân tử

Chúng ta đã quen thuộc với khái niệm "lai" (hybridization) ở mức độ cá thể trong chọn giống vật nuôi và cây trồng Lai phân tử là lai các nucleic acid hoặc các phân tử protein với nhau

là sự bắt cặp (annealing) Sự bắt cặp này có thể đảo ngược bằng cách tăng nhiệt độ

(94-98oC) đối với các phân tử sợi đôi của DNA (hoặc RNA hay DNA:RNA) để phá vỡ các

cặp trở lại, gọi là sựa hồi tính (renaturation)

Phương pháp lai nucleic acid đầu tiên là Southern blot được E Southern phát minh vào năm 1975, cho phép nghiên cứu DNA của bộ gen, kiểm tra kết quả chuyển gen hoặc kiểm tra sự có mặt của một gen nào đó trong bộ gen của tế bào Sau đó, cách thức tương tự đã được cải tiến để cho ra đời phương pháp Northern blot để lai RNA Tiếp theo, đối với phép lai các phân tử protein (ở đây dựa trên nguyên lý kết hợp kháng nguyên - kháng thể) người ta gọi là lai Western blot

Liệu rằng có phương pháp Eastern blot không nhỉ?

Một phương pháp lai phân tử khác là lai tại chỗ, trong đó, trình tự nucleic acid

cần tìm nằm ngay trong tế bào hay trong mô Lai tại chỗ cho phép nghiên cứu nucleic acid mà không cần qua giai đoạn tách chiết chúng ra khỏi mô, tế bào Các ứng dụng

của kiểu lai này rất đa dạng đi từ kĩ thuật định vị gen trên nhiễm sắc thể, phát hiện dòng vi khuẩn tái tổ hợp trong phương pháp tạo dòng đến việc nghiên cứu một mRNA chuyên biệt trong tế bào và mô Phương pháp này ít tốn kém hơn là lai Southern blot, mẫu dò được đánh dấu bằng huỳnh quang thay cho mẫu dò đánh dấu phóng xạ Tùy từng loại tế bào và mô có thể thực hiện các phương pháp lai tại chỗ khác nhau

2 Southern blot

Phương pháp này được E M Southern mô tả đầu tiên tại đại học Edingburgh vào năm 1975, dùng để phát hiện các phân tử DNA quan tâm trên màng lai nitrocellulose

Nguyên lý của Southern blot là lai axit nucleic theo nguyên tắc bổ sung và sử

dụng màng lai nitrocellulose có khả năng tiếp nhận DNA

Sự ra đời của phương pháp điện di trên gel vào đầu thập niên 1970 đã cho phép các đoạn DNA được cắt bởi enzyme giới hạn có thể được phân tách dựa trên kích thước của chúng Sau đó, người ta tìm cách chuyển các đoạn DNA phân tách từ gel lên màng lai nitrocellulose Phương pháp này được E M Southern mô tả tại đại học Edingburgh vào năm 1975 Nó đơn giản và hiệu quả Mặc dù cho đến nay đã được cải tiến nhưng phương pháp này vẫn đang được sử dụng ở nhiều phòng thí nghiệm sinh học phân tử trên thế giới với thay đổi không đáng kể

Phương pháp Southern blot được thiết kế để xác định sự có mặt, kích thước, số lượng bản sao, tính đồng dạng của một phân tử DNA trong hỗn hợp Ví dụ, Southern blot có thể được sử dụng để phát hiện một gen quan tâm trong cả hệ gen nguyên vẹn

Quy trình Southern blot bao gồm các bước cơ bản sau:

- Cắt DNA bằng enzyme giới hạn thích hợp

- Điện di sản phẩm cắt trên gel agarose

- Làm biến tính DNA (thông thường khi nó còn ở trên gel) Ví dụ: có thể nhúng DNA vào trong dung dịch NaOH 0.5M DNA sợi kép sẽ được tách thành DNA sợi đơn

- Các DNA sợi đơn được chuyển lên màng lai Thông thường màng lai được sử dụng là màng nitrocellulose Người ta cũng có thể sử dụng màng nylon Màng nitrocellulose điển hình có khả năng tiếp nhận 100µg DNA/cm2, trong khi màng nylon

có khả năng tiếp nhận 500µg DNA/cm2 Mặt khác màng nylon có khả năng giữ DNA chắc hơn và ít đứt gãy hơn

- Cố định phân tử lai DNA trên màng với mẫu dò (probe) có đánh dấu Quá trình này dựa trên nguyên tắc bổ sung Người ta thường sử dụng P32, biotin/streptavidin hoặc một mẫu dò phát quang sinh học

- Định vị các phân tử lai DNA - mẫu dò Nếu sử dụng mẫu dò đánh dấu phóng

xạ thì dùng phương pháp phóng xạ tự ghi (autoradiograph) để xác định Nếu sử dụng biotin/streptavidin thì dùng phương pháp so màu Nếu sử dụng mẫu dò phát quang sinh học thì phát hiện bằng sự phát quang

Các ứng dụng quan trọng của Sourthern blot:

- Lập bản đồ giới hạn của một gen

- Phát hiện sự đa dạng trình tự của cùng một gen ở các chủng hay các cá thể khác nhau qua sự so sánh bản đồ giới hạn

- Phát hiện các đột biến mất đoạn, đột biến điểm hay tái tổ hợp trên một gen vì chúng làm thay đổi bản đồ giới hạn

3 Northern blot

Người ta đã dùng một phương pháp tương tự với Southern blot để phát hiện các phân tử RNA quan tâm gọi là Northern blot

Phương pháp Northern blot cho phép phát hiện sự có mặt, kích thước, trọng lượng phân tử của RNA ở trong các mẫu khác nhau Đây là một phương pháp rất tốt để phân tích sự biểu hiện của gen khi chúng ta cần so sánh hai mẫu Nó rất nhạy nên chúng ta có thể điện di một lượng lớn RNA tổng số hoặc mRNA trên gel

Northern blot bao gồm các bước cơ bản sau:

- RNA được phân tách bằng điện di trên gel agarose

- RNA cố định trên màng được lai với mẫu dò DNA sợi đơn (hoặc RNA) có đánh dấu phóng xạ hoặc được gắn với một enzyme (alkalin phosphatase hoặc horseradish peroxidase) tạo thành phân tử lai nucleic acid sợi kép

- Vị trí của mẫu dò được phát hiện nhờ kỹ thuật phóng xạ tự ghi nếu nó được đánh dấu phóng xạ Nếu mẫu dò được gắn với enzyme thì đem ủ với một cơ chất không màu Enzyme liên kết với nó sẽ biến đổi thành một sản phẩm màu có thể nhìn thấy hoặc phát ra ánh sáng để phát hiện trực tiếp bằng phim X quang

- Protein được phân tách bằng điện di trên gel SDS-PAGE

- Các protein được chuyển sang màng lai nitrocellulose, giữ nguyên vị trí như đã phân tách trên gel

- Ủ màng lai đã cố định protein với một kháng thể sơ cấp (primary antibody) Kháng thể sơ cấp là một kháng thể đặc hiệu, sẽ bám vào protein và tạo thành một phức hợp protein-kháng thể đối với protein quan tâm

- Sau đó, ủ màng lai với một kháng thể thứ cấp (secondary antibody) có enzyme (alkalin phosphatase hoặc horseradish peroxidase) đi kèm Kháng thể thứ cấp sẽ bám vào kháng thể sơ cấp giống như kháng thể sơ cấp đã bám vào protein

- Tiếp tục ủ màng lai trong một hỗn hợp phản ứng đặc hiệu với enzyme, sẽ phát hiện thấy các băng ở bất kỳ nơi nào có mặt phức hợp protein quan tâm-kháng thể sơ cấp- kháng thể thứ cấp-enzyme

- Đặt một phim nhạy cảm với tia X lên màng lai để phát hiện các điểm sáng phát

ra do enzyme

5 Kỹ thuật điện di

Nhiều phương pháp trong hóa sinh và sinh học phân tử có sử dụng kỹ thuật điện

di Điện di trên gel thường được dùng để phân tách DNA, RNA, oligonucleotide, protein

Nguyên lý của việc điện di, chẳng hạn DNA, là khi ở trong điện trường, do tích điện âm nên các phân tử DNA dịch chuyển về phía anode với tốc độ dịch chuyển khác nhau Về nguyên tắc, việc phân tách các chất trong điện di dựa trên trọng lượng, điện tích cũng như cấu hình của các chất Sau khi biến tính DNA, các phân tử hầu như đồng nhất về cấu hình, vì vậy tốc độ chạy phụ thuộc chủ yếu vào trọng lượng phân tử Các đoạn DNA càng lớn thì dịch chuyển càng chậm Kết quả là từ một điểm chung (gọi là giếng), các đoạn DNA khác nhau dịch chuyển về một hướng tạo thành một làn (lane),

và trên làn đó có các băng (band) DNA khác nhau tương ứng với trọng lượng phân tử của chúng

Đối với các phân tử protein, do tích điện bề mặt khác nhau nên nếu điện di trong gel không gây biến tính thì chúng dịch chuyển theo các hướng khác nhau với tốc độ khác nhau phụ thuộc cả khối lượng phân tử lẫn điện tích bề mặt Tuy nhiên, nếu điện di trong gel sau khi xử lý bằng SDS thì do bề mặt protein trở nên tích điện âm đồng nhất

nên chúng dịch chuyển về anode với tốc độ khác nhau hầu như chỉ phụ thuộc khối lượng phân tử

Thông thường có thể sử dụng gel agarose và gel polyacrylamide nhưng gel agarose cho phép phân tách nucleic acid lớn hơn 1 kb, còn gel polyacrylamide thường dùng để phân tách các đoạn nucleic acid nhỏ hơn 1 kb

Chương 6: Giải trình tự

Giải trình tự DNA là phương pháp xác định trật tự của các base (A, T, G, C) trong một phân tử DNA Đây là thông tin về cấu trúc gen và thông tin mã hóa chức năng của sản phẩm protein tương ứng

1 Nguyên lý

Trong khi phương pháp Maxam-Gilbert sử dụng việc đánh dấu hóa học đặc hiệu các nucleotide, phương pháp dideoxy của Sanger làm dừng một cách đặc hiệu sự tổng hợp DNA bằng DNA polymerase nhờ sử dụng các dideoxynucleotide

2 Các phương pháp cổ điển

Các phương pháp xác định trình tự nucleotide cổ điển có thể chia thành hai nhóm: phương pháp hóa học của Allan Maxam và Walter Gilbert và phương pháp sinh tổng hợp của Frederick Sanger

Trong khi phương pháp Maxam-Gilbert sử dụng việc đánh dấu hóa học đặc hiệu các nucleotide, phương pháp dideoxy của Sanger làm dừng một cách đặc hiệu sự tổng hợp DNA bằng DNA-polymerase nhờ sử dụng các dideoxynucletiode Do thao tác đơn giản và các nguyên liệu được thương mại hóa dưới dạng các bộ chế sẵn (kit) nên gần đây hầu như để xác định trình tự nucleotide người ta chỉ sử dụng phương pháp dideoxy Còn phương pháp Maxam-Gilbert như là phương pháp kiểm chứng sự nối dài primer, S1 mapping và xác định trình tự nucleotide đoạn đặc hiệu tương đối ngắn Trong cả hai phương pháp, người ta đều cần cắt ngắn các đoạn DNA vừa phải để giải trình tự dần Từ kết quả các đoạn DNA sau một loạt lần giải trình tự người ta có thể ghép nối để có trình tự nucleotide hoàn chỉnh

Nguyên tắc cơ bản của phương pháp Dideoxy dựa vào hoạt động của enzyme

gắn các nucleotide vào mạch đơn DNA đang tổng hợp ở vị trí 3' có chứa nhóm OH tự

do, khi gặp nucleotide không có nhóm 3'-OH thì phản ứng tổng hợp bị dừng lại Đặc trưng của phương pháp là sử dụng dideoxynucleotide để làm ngừng phản ứng tổng hợp DNA một cách ngẫu nhiên Trong phản ứng sử dụng đoạn DNA mồi là đoạn DNA mạch đơn có kích thước 20 nucleotide

Phương pháp được chia làm 4 phản ứng thực hiện riêng rẽ có DNA khuôn, DNA mồi, đầy đủ các loại dNTP (deoxynucleotide), enzyme Taq polymerase, dung dịch đệm và các điều kiện phản ứng thích hợp đồng thời có bổ sung thêm khoảng 1% một loại ddNTP (dideoxynucleotide) cho mỗi phản ứng khác nhau Các dideoxynucleotide bị mất 2 nguyên tử oxy ở carbon thứ 3 và carbon thứ 4 Do đó khi mạch DNA đang tổng hợp bị gắn 1 ddNTP thì không có nhóm 3'-OH ở nucleotide cuối cùng nên mạch đang tổng hợp không được kéo dài tiếp tục phản ứng tổng hợp sẽ dừng lại

Chính do lượng ddNTP được đưa vào với một lượng nhỏ so với lượng dNTP nên thỉnh thoảng mới có một ddNTP được sử dụng ngẫu nhiên làm phản ứng tổng hợp DNA dừng lại Kết quả sẽ tổng hợp được các đoạn nucleotide có kích thước dài ngắn khác nhau Để xác định trình tự, người ta điện di kết quả thu được trên gel

độ khác nhau trên bản gel Lúc này thực hiện phản ứng hiện hình phóng xạ có thể quan sát được các đoạn mạch đơn DNA bằng các vạch trên bản gel Tổng hợp kết quả sẽ thu được trình tự sắp xếp các nucleotide của đoạn gen

3 Các phương pháp hiện đại

Giải trình tự hiện đại áp dụng các chiến thuật giải trình tự trên quy mô lớn, có thể giải toàn bộ nhiễm sắc thể thay vì chỉ từng đoạn 300-1000 nucleodtide như trước đây Mặt khác, những nhân tố khác đòi hỏi các phương pháp mới cần đáp ứng là nhanh, tiết kiệm chi phí, chính xác và tự động hóa

Bên cạnh kỹ thuật sử dụng các gel để phân ly các phân tử DNA có độ dài khác nhau, các kỹ thuật mới liên quan đến phát hiện huỳnh quang của các nucleotide được đánh dấu, phân tích trình tự DNA bằng khối phổ, điện di mao quản hoặc lai với các đoạn oligonucleotide được tổng hợp nhân tạo Những tiến bộ nhanh chóng trong lĩnh vực kính hiển vi điện tử cho phép quan sát chi tiết cấu trúc bề mặt của phân tử nucleic acid và phân biệt từng nucleotide Ngoài ra, kỹ thuật lai sử dụng tấm chip gắn cố định các oligonucleotide cho phép phân biệt được hơn 50.000 phân tử DNA khác nhau Trong tương lai gần, kỹ thuật lai này có thể gắn hàng nghìn oligo trên một tấm chip nhỏ và trình tự nucleotide được phân tích tự động bằng các chương trình của máy tính Điều đó cho phép xác định trình tự một cách nhanh chóng

Trên các máy đọc tự động hiện đại, thông thường bốn loại nucleotide được đánh dấu bằng các chất phát huỳnh quang khác nhau Đầu đọc laser trong máy sẽ kích hoạt các chất này khiến chúng hấp thụ và phát ra các màu, mỗi màu ứng với một loại nucleotide và được hiển thị bằng một đỉnh Thông thường, phản ứng gắn nucleotide vào sợi DNA tổng hợp trên sợi khuôn mẫu được thực hiện bằng PCR Hai loại nucleotide dGTP và dTTP được thay thế bằng dITP và dUTP nhằm hạn chế sự trùng lặp các đỉnh Sản phẩm PCR thường được tinh sạch, loại bỏ các nucleotide và primer thừa trước khi đưa vào máy đọc tự động Trình tự đọc được trên máy tự động thường dài khoảng 600-1.000 bp Ưu điểm của phương pháp này là kết quả đọc được đưa trực tiếp vào chương trình máy tính, giảm bớt sai sót do đọc bằng mắt gây ra Hơn nữa, phản ứng PCR không đòi hỏi lượng DNA khuôn mẫu (dạng sợi đôi) nhiều nhưng các sợi đơn DNA cần đọc lại được khuếch đại lên rất nhiều lần

Trình tự hệ gen cũng như các loại DNA được xác định ngày càng nhiều ở các sinh vật khác nhau Do đó, việc lưu trữ số liệu, phân tích, so sánh và sắp xếp chúng đã thúc đẩy hình thành một hướng nghiên cứu mới đó là tin sinh học (bioinformatics) Mối liên quan mật thiết giữa trình tự nucleotide và protein đã khiến lĩnh vực mới này phát triển rất nhanh chóng Ba ngân hàng dữ liệu chính hiện nay lưu trữ hầu hết các thông tin về DNA là EMBL (thuộc European Informatics Institute), GenBank (thuộc

US National Centre for Biotechnology Information) và DDBJ (thuộc DNA Database Bank of Japan) Một ngân hàng dữ liệu khác lưu trữ thông tin về protein là Swiss

4 Ứng dụng

Giải trình tự mở ra các hướng đi mới trong nghiên cứu các quá trình sinh học, phân loại sinh vật cũng như ứng dụng trong chuẩn đoán bệnh và phân tích pháp y

Chương 9: Công nghệ DNA tái tổ hợp

1 Mở đầu

Vào năm 1973, một nhóm các nhà khoa học đã tạo ra cơ thể sinh vật đầu tiên với các phân tử DNA tái tổ hợp Theo đó, Cohen (ĐH Stanford, Mỹ) và Boyer (ĐH California, Mỹ) cùng các cộng sự đã đưa được một đoạn DNA từ một plasmid này vào một plasmid khác, tạo ra một plasmid hoàn toàn mới, plasmid tái tổ hợp Sau đó, họ

đưa plasmid tái tổ hợp vào trong các tế bào E coli Trong một thời gian ngắn, các tác

giả này đã dùng các phương pháp giống nhau để gắn các gen từ hai loại vi khuẩn khác nhau, cũng như để chuyển các gen từ ếch vào vi khuẩn Các thí nghiệm này đánh dấu một cuộc cách mạng vô cùng quan trọng trong lịch sử nghiên cứu khoa học của nhân loại Công nghệ DNA tái tổ hợp là một tập hợp các kỹ thuật phân tử để định vị, phân lập, biến đổi và nghiên cứu các đoạn DNA Thuật ngữ tái tổ hợp được dùng thường xuyên do mục tiêu của nó là phối hợp DNA từ hai nguồn xa nhau Ví dụ: các gen từ hai nguồn vi khuẩn khác nhau có thể được liên kết lại, hoặc một gen người có thể được đưa vào nhiễm sắc thể vi khuẩn Công nghệ DNA tái tổ hợp (còn gọi là công nghệ di truyền, công nghệ gen hay kỹ thuật gen…) hiện nay bao gồm một mạng lưới các kỹ thuật phân tử được dùng để phân tích, biến đổi và tái tổ hợp hầu như mọi trình tự DNA

Công nghệ DNA tái tổ hợp đã biến đổi sâu sắc phương thức nghiên cứu gen Trước đây, thông tin về cấu trúc và tổ chức của gen thu được bằng cách kiểm tra biểu hiện kiểu hình của chúng, nhưng những kỹ thuật mới đã tạo ra khả năng tự đọc các trình tự nucleotide Trước đây, các nhà di truyền phải chờ đợi sự xuất hiện các đột biến ngẫu nhiên hoặc cảm ứng để phân tích hiệu quả của sự sai khác di truyền, ngày nay họ

có thể tạo ra đột biến ở các điểm nhất định một cách chính xác và xem chúng thay đổi kiểu hình như thế nào Công nghệ DNA tái tổ hợp đã cung cấp các thông tin mới về cấu trúc và chức năng của gen và đã thay đổi nhiều khái niệm cơ bản của di truyền học

Ví dụ: trong khi mã di truyền được xem là rất phổ biến, thì bây giờ chúng ta còn biết

rằng các mã không phổ biến cũng tồn tại trong DNA ty thể Trước đây, chúng ta nghĩ rằng tổ chức của các gen eukaryote giống với prokaryote, nhưng bây giờ chúng ta biết rằng nhiều gen eukaryote bị gián đoạn bởi các intron Ngày nay, chúng ta đã biết đầy

đủ hơn về các quá trình tái bản, phiên mã, dịch mã, biến đổi RNA (RNA processing) và điều hòa gen thông qua việc sử dụng các kỹ thuật tái tổ hợp DNA Các kỹ thuật này cũng được dùng trong nhiều trong nhiều lĩnh vực khác, bao gồm hóa sinh học, vi sinh vật học, sinh học phát triển, sinh học thần kinh, tiến hóa và sinh thái học

Công nghệ DNA tái tổ hợp cũng được ứng dụng để tạo ra nhiều sản phẩm thương mại, chẳng hạn: thuốc, hormone, enzyme và các giống cây trồng-vật nuôi Một nền công nghiệp hoàn toàn mới, công nghiệp công nghệ sinh học, đã phát triển chung quanh việc sử dụng các kỹ thuật này để tạo ra các sản phẩm mới Trong y học, các kỹ thuật tái tổ hợp DNA được dùng để thăm dò bản chất của ung thư, chẩn đoán các bệnh

di truyền và nhiễm trùng, sản xuất thuốc và điều trị các rối loạn di truyền Kỹ thuật gen cho thấy một loạt cơ hội, mở ra các phương thức cần thiết (mà trước đây có thể không được) gần như là hiển nhiên Vấn đề cơ bản đó là các gen có kích thước quá nhỏ và có hàng ngàn gen ở trong mỗi tế bào Thậm chí, khi quan sát trên kính hiển vi mạnh nhất, thì DNA xuất hiện như là một sợi dây bé xíu, các nucleotide riêng rẽ không thể thấy, và không có một dấu hiệu nào về các đường nét vật lý ở chỗ bắt đầu và kết thúc của một gen

Để minh họa vấn đề này, chúng ta hãy xem xét một ví dụ đặc trưng về di truyền phân tử như sau: Giả thiết rằng chúng ta muốn phân lập một gen đặc biệt của người và đặt nó vào trong vi khuẩn để sản xuất một lượng lớn các protein người đã được mã hóa Vấn đề đầu tiên là tìm được gen mong muốn Genome đơn bội của người chứa khoảng 3,3 tỷ cặp base của DNA

Giả sử gen mà chúng ta muốn phân lập dài 3.000 bp Như vậy, gen đích của chúng ta chỉ chiếm một phần triệu của genome; vì thế để tìm kiếm gen của chúng ta trong một genome đồ sộ như thế là khó khăn hơn rất nhiều so với việc tìm kiếm một cây kim trong một đống cỏ khô Nhưng thậm chí, nếu chúng ta có thể định vị gen, thì