GIỚI THIỆU VỀ HEMOCHROMATOSIS NGUYÊN PHÁT Hereditary hemochromatosis - Hemochromatosis nguyên phát là bệnh di truyền nhiễm sắc thể thường với đặc điểm rối loạn chuyển hoá sắt.. Bệnh biể
Trang 1ĐẠI HỌC Y KHOA PHAM NGỌC THẠCH
Bộ môn Hóa Sinh - Sinh Học Phân Tử
THỰC TẬP
(Tài liệu lưu hành nội bộ)
Năm học: 2014 - 2015
Trang 2CHẨN ĐOÁN HEMOCHROMATOSIS BẰNG
RFLP
I GIỚI THIỆU VỀ HEMOCHROMATOSIS NGUYÊN PHÁT (Hereditary hemochromatosis)
- Hemochromatosis nguyên phát là bệnh di truyền nhiễm sắc thể thường với đặc điểm rối loạn chuyển hoá sắt Bệnh biểu hiện bằng việc rối loạn hấp thụ sắt tại niêm mạc ruột non (tá tràng) Gia tăng sắt ở mô có thể làm tử vong nếu không được chẩn đoán kịp thời
- Hemochromatosis là bệnh di truyền hay gặp, chiếm từ 1/200 đến 1/400 dân số Bắc Âu, với số người lành mang bệnh ước tính là 1/8 đến 1/10 người
- Sắt lắng đọng chính trong nội tạng như gan, tụy đưa đến rối loạn chức năng và bệnh như xơ gan, tiểu đường Ngoài ra còn gây gia tăng sắc tố melanin ở da
- Gen HFE nằm trên nhánh ngắn của nhiễm sắc thể số 6 giải mã ra protein HFE tham gia vào quá trình điều hòa việc hấp thu sắt của cơ thể Protein HFE - 348 acid amin gồm 3 phần chính: 3 thành phần 1, 2, 3, phần xuyên màng tế bào và phần bên trong màng tế bào (Hình 1)
- Chức năng protein HFE: tác động tương hổ với một số trên bề mặt tế bào
HOOC
HOOC
NH 2
NH 2
Ngoại
bào
Tế bào chất
His 63 → Asp
Cys 282 → Tyr Màng tế
bào
Hình 1: Cấu trúc và cơ chế xuyên màng của Protein
HFE
Trang 3tiết từ gan để điều hòa lượng sắt hấp thu từ thực phẩm và phóng thích sắt dự trữ; tác động tương hổ với transferrin receptor để điều hòa sắt nhưng cơ chế chưa biết rõ ràng
Đột biến C282Y:
Đây là đột biến hay gặp nhất (Zhang và cộng sự, 2003) Cystein ở vị trí 282 bị thay thế bởi Tyrosin, gây nên:
o Ngăn chặn tạo thành cầu nối S-S giữa C282 và C255, từ đó làm cho phần 3 không thể liên kết được với beta-2-microglobulin
o Do đó ngăn chặn không cho protein HFE xuyên màng Việc điều hòa hấp thu sắt bị rối loạn
- Khi nghiên cứu ở chuột bị khuyết gen HFE hay beta-2-microglobulin đều
bị gia tăng sắt trong cơ thể như bệnh Hemochromatosis ở người
- Bệnh cảnh lâm sàng của Hemochromatosis di truyền là: Xơ gan, tiểu đường, suy tim, tăng sắc tố da, thấp khớp và loãng xương ở nam giới Bệnh khởi phát vào 40 tuổi ở nam và vào 50 tuổi ở nữ U gan là biến chứng quan trọng ở người già
- Người bình thường có 4g sắt trong cơ thể, chứa trong hồng cầu (1,5 - 3g) và trong các mô khác Khoảng 0,5 g được dự trữ trong tế bào gan Hemochromatosis có thể gây ứ đọng đến 50 g sắt trong cơ thể, trong đó 1/3 là chứa trong gan
- Định lượng nồng độ Ferritin/huyết thanh, độ bão hòa Transferrin/huyết thanh (là 1ß globulin chuyên chở sắt của huyết tương), và sinh thiết gan được xử dụng để chẩn đoán Hemochromatosis nguyên phát
Đột biến H63D:
- Histidin bị thay thế bởi Aspartic ở vị trí 63, làm cho phần 2 của protein HFE không thể liên kết với thụ thể transferrin (TfR: Transferrin Receptor),
do đó không ức chế sự hấp thụ sắt, gây gia tăng hấp thụ sắt của tế bào ruột non
- Hai đột biến này giúp phát hiện bệnh sớm khi chưa có biểu hiện lâm sàng
- Phát hiện bệnh sớm rất cần thiết để điều trị kịp thời bằng cách rút máu điïnh kỳ trước khi nội tạng bị hư hại bởi sắt
Trang 4II PHƯƠNG PHÁP RFLP CHUẨN ĐOÁN Hemochromatosis NGUYÊN PHÁT:
- Trong vùng gần C282, DNA bình thường có một điểm bị cắt bởi enzym Rsa1 (Rhodopseudomonas sphaeroides), đột biến C282Y tạo 1 điểm cắt thứ hai
- Dùng 2 đoạn mồi khuyếch đại đoạn DNA chứa C282 gồm 390 đôi base Sau đó đem ủ với enzym Rsa1
- Có 3 trường hợp xảy ra khi điện di trên gel agarose (hình 2):
Người bình thường: có 2 đoạn 250 và 140 đôi base
Dị hợp tử: có 4 đoạn là 140ø, 250, 111 và 29 đôi base
Đồng hợp tử: có 3 đoạn là 250, 111 và 29 đôi base
RSa1
C282
140 250 RSa1 RSa1
C282Y
29 111 250
RSa1
RSa1
5’ G T A C 3’
3’ C A T G 5’
250
140
111
Trang 5III TIẾN HÀNH PHẢN ỨNG:
Lưu ý: Phải đeo găng tay cao su trong khi thực hành thí nghiệm
Sử dụng mẫu DNA bệnh nhân do bộ môn cung cấp Xác định bệnh nhân
này có liên quan tới Hemochromatosis tại đột biến Cys282Tyr ?: là người bình
thường (-\-); người bệnh dị hợp tử [Heterozygotes(-\H)]; người bệnh đồng hợp tử [Homozygotes(H\H)]
1 Khuyết đại vùng C282 bằng PCR
Tube eppendorf chạy PCR do bộ môn cung cấp cho mỗi nhóm chứa 5 µl DNA để trong đá
Thêm vào tube 20 µl mix đã pha sẵn
Thành phần của mix trong 20 µl:
2,5 µl Tampon Taq 10x (Tris – HCl, pH 8,5)
2 µl MgCl2 (25 mM)
2,5 µl Primers G176 A/B (50 ng/µl)
0,5 µl dNTP’s (10 mM)
0,1 µl Taq polymerase (5 U/µl)
12,4 µl H2O cất vô trùng
Vortex tube eppendorf trong 5 giây để bảo đảm sự trộn đều các thành phần trong dung dịch
Quay ly tâm tube eppendorf trong 10 giây ở máy ly tâm nhỏ (microfuge) Lưu ý sự cân bằng các tube khi quay ly tâm
Đặt tube eppendorf vào máy PCR và sử dụng chương trình sau đây:
94oC 3 phút
94oC 30 giây (Denaturation) (tách rời hai chuỗi )
55oC 30 giây (Hybridization) (xác nhập cặp mồi vô chuỗi) 30 chu kỳ
72oC 1 phút (Elongation) (kéo dài chuỗi)
72oC 3 phút
4oC 3 phút
Trang 6 Khi tất cả các tube đã được đặt trong máy Thermal Cycler Nhấn nút khởi động máy
Sau khi chương trình hoạt động kết thúc, tiếp tục thực hiện bước tiếp
theo
2 Tác động của Enzym phân cắt Rsa1
Lấy 20 µl sản phẩm của PCR cho vào tube eppendorf có chứa 2 µl Rsa1
Quay ly tâm tube eppendorf trong 10 giây ở máy ly tâm nhỏ
Ủ tube eppendorf trong 30 phút ở 37oC
3 Điện di các đoạn DNA trên thạch agarose
Dùng máy điện di mini có chứa dung dịch TBE 0,5% (Tris– acetate 0,04M, EDTA 0,001M, pH 8) và một miếng thạch agarose 2%
Thêm vào tube 2 µl dung dịch xanh bromophenol Trộn đều (bằng cách hút pipette lên xuống nhiều lần) và ly tâm trong 10 giây
Lấy 20 µl dung dịch trên cho vào giếng trên thạch agarose
Lấy 20 µl dung dịch thang đo 100bp (ladder) cho vào giếng tiếp theo
Chạy điện di ở dòng điện một chiều, 100 Volt trong 30 phút
Xem kết quả thạch agarose dưới ánh sáng đèn UV, chụp hình thạch agarose và ghi chú trên hình những băng DNA được quan sát
Biện luận kết quả
